Questo protocollo descrive l'applicazione della tecnica chirurgica utilizzata per trasferire embrioni di suino clonati tramite laparotomia nelle scrofette.
Articolo metodologico
Chirurgia di trasferimento di embrioni tramite laparotomia nelle scrofette
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare la tecnica chirurgica per il trasferimento di embrioni di suino clonati nell'ovidotto, un metodo ampiamente utilizzato nella produzione di suini geneticamente modificati per la ricerca biomedica. Nove scrofette sono state sottoposte a sincronizzazione ormonale e laparotomia per il trasferimento di embrioni clonati prodotti mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) in fasi fino a 4 cellule il giorno 2 all'ovidotto. La diagnosi gestazionale è stata condotta tramite esame ecografico 30 giorni dopo l'intervento chirurgico di trasferimento. Sei delle nove scrofette operate hanno mostrato segni di gravidanza all'esame ecografico. Tuttavia, poiché non vi è stata alcuna progressione nello sviluppo fetale come valutato dall'ecografia, le scrofette sono state sottoposte a necroscopia a 60 giorni per la raccolta di materiale biologico e la valutazione del sistema riproduttivo. Sono state osservate aderenze nelle corna uterine, nelle ovaie e negli ovidotti. Dal lume uterino di due delle scrofette eutanasiate, sono state ottenute una e quattro strutture embrionali con età gestazionale compresa tra 12 e 20 giorni. Nonostante l'assenza di suinetti vivi, probabilmente attribuita al basso tasso di efficienza del trasferimento di embrioni di suini clonati, che è influenzato da vari fattori, tra cui il numero e la qualità degli embrioni trasferiti, la tecnica chirurgica presentata si è dimostrata rapida e sicura.
Introduzione
I suini sono un eccellente modello sperimentale per la ricerca biomedica grazie alle loro somiglianze anatomiche, fisiologiche e genetiche con gli esseri umani1. Questi animali sono stati spesso utilizzati nella ricerca relativa allo xenotrapianto, con l'intenzione di produrre organi, cellule o tessuti che promuovono un basso rischio di rigetto quando trapiantati nell'uomo. La ricerca sugli xenotrapianti mira ad aumentare l'offerta di organi per il trapianto umano, riducendo così la lista d'attesa dei pazienti2.
La produzione di suini per lo xenotrapianto prevede diverse fasi, tra cui la produzione di cloni da cellule suine geneticamente modificate. Dopo la produzione in vitro di embrioni clonati geneticamente modificati, gli embrioni vengono trasferiti nel sistema riproduttivo di una scrofa con un ciclo estrale sincronizzato per preparare la fisiologia uterina alla ricezione e alla gestazione del nuovo concetto3.
Il trasferimento di embrioni nei suini può essere effettuato con metodi non invasivi o invasivi4. Tra i metodi non invasivi c'è il trasferimento transcervicale, che non richiede alcun intervento chirurgico. Tuttavia, questo metodo è limitato al trasferimento di embrioni nelle fasi di sviluppo successive (ad esempio, stadi di morula o blastocisti) e non consente la determinazione precisa del sito di inserimento del catetere o della deposizione di embrioni5. La laparoscopia e la laparotomia sono considerate metodi invasivi di trasferimento degli embrioni. La laparoscopia è meno invasiva ma richiede apparecchiature specifiche e costose, e la sua efficienza varia notevolmente (da meno del 20% a oltre l'80%) a causa di vari fattori come la difficoltà di manipolare le strutture riproduttive e il tipo di catetere utilizzato 4,6. Pertanto, il trasferimento per laparoscopia è ancora meno efficiente rispetto ai metodi di trasferimento chirurgico per laparotomia4.
La chirurgia di trasferimento degli embrioni nelle scrofe tramite laparotomia è una procedura relativamente semplice e veloce, che in genere richiede circa 30 minuti. Tuttavia, dovrebbe essere eseguito in un centro chirurgico dotato di un apparecchio per anestesia inalatoria e di un'équipe specializzata. Per i ceppi di suini commerciali (come Landrace, Large White o i loro incroci), sono necessarie attrezzature speciali come paranchi per il sollevamento delle scrofette e un tavolo chirurgico ampio e robusto a causa del notevole peso degli animali (circa 130-150 kg).
Affinché l'intervento chirurgico abbia successo, gli embrioni devono essere valutati in anticipo per il loro stadio di sviluppo. Si consiglia di trasferire embrioni fino a 4 cellule nella tuba uterina. Gli embrioni in stadi superiori a 4 cellule, come le morelle e le blastocisti, dovrebbero essere trasferiti nel corno uterino 7,8.
Sebbene gruppi di ricerca in tutto il mondo stiano eseguendo la produzione e il trasferimento chirurgico di embrioni di maiale clonati geneticamente modificati, non esistono ancora protocolli ben definiti che dimostrino questa procedura attraverso i video. Questo approccio è fondamentale per il successo della gestazione, poiché la tecnica richiede una deposizione precisa degli embrioni nella posizione esatta dell'ovidotto, che comporta la localizzazione dell'ostio tubarico e l'introduzione della pipetta contenente gli embrioni. Questa tecnica può essere meglio compresa attraverso video esplicativi dell'intera procedura. Pertanto, questo articolo mira a dimostrare l'intervento chirurgico di laparotomia per il trasferimento di embrioni clonati nell'ovidotto delle scrofette, un prerequisito essenziale per la futura produzione di suini geneticamente modificati da utilizzare per xenotrapianti o altri scopi correlati.
Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali nella Ricerca del College of Veterinary Medicine and Animal Science dell'Università di San Paolo, numero di protocollo 6088030523. Nove scrofette di sette mesi provenienti dall'allevamento di suini Água Branca, situato nella città di Itu, nello stato di San Paolo, in Brasile, sono state utilizzate subito dopo il secondo rilevamento dell'estro9. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione degli animali
- Digiunare gli animali per 12 ore e limitare l'accesso all'acqua per 4 ore prima della procedura chirurgica.
- Utilizzando un ago da 40 mm x 12 mm, aspirare 10 mg/kg di ketamina e 0,2 mg/kg di midazolam nella stessa siringa da 50 ml. Collegare la siringa a un set per la somministrazione endovenosa per facilitare la somministrazione del farmaco, mantenendo una distanza di sicurezza dall'animale e consentendogli di muoversi liberamente.
- Somministrare il farmaco pre-anestetico tramite iniezione intramuscolare nel muscolo trapezio, caudale al condotto uditivo esterno.
- Cannulare la vena auricolare con un catetere da 20 G e collegarla a un set di somministrazione di macrogocce per la fluidoterapia intraoperatoria con soluzione di NaCl allo 0,9% alla velocità di 10 mL/kg/h.
- Indurre l'anestesia con 4 mg/kg di propofol per via endovenosa (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
- Eseguire l'intubazione orotracheale dell'animale utilizzando un laringoscopio e un tubo orotracheale di misura 9 con una cuffia10.
- Mantenere l'anestesia con inalazione di isoflurano dall'1,5% al 2%. Inoltre, monitorare l'anestesia valutando parametri fisiologici come la frequenza cardiaca, che deve essere mantenuta tra i 100 e i 120 battiti al minuto, la saturazione di ossigeno, che deve essere mantenuta tra il 99% e il 100%, il rilassamento muscolare, l'assenza di movimento e la valutazione dei riflessi.
NOTA: Anche la temperatura corporea deve essere monitorata e controllata, rimanendo tra 37,5 e 38,5 °C. Quando necessario, oltre all'isoflurano, il propofol può essere utilizzato per mantenere il controllo dei parametri. Il fentanil cloridrato deve essere somministrato come analgesico alla dose di 0,02 mg/kg ogni 20 minuti. Tutti i parametri devono essere registrati ogni 5 minuti. - Somministrare analgesia perioperatoria con una singola dose di 0,002 mg/kg di fentanil per via endovenosa e 4 mg/kg di tramadolo cloridrato per via intramuscolare nel muscolo gluteo o trapezio.
- Posizionare gli elettrodi cardiaci sulla regione toracica per il monitoraggio intraoperatorio della frequenza cardiaca. Registra la frequenza cardiaca, la temperatura rettale e la saturazione di ossigeno ogni 5 minuti.
2. Procedura chirurgica
- Posizionare la doratura sul tavolo chirurgico in decubito dorsale.
- Coprire le zampe dell'animale con guanti procedurali per ridurre al minimo la contaminazione del campo chirurgico.
- Eseguire la depilazione addominale caudale ventrale tra il penultimo paio di ghiandole mammarie utilizzando un tagliacapelli chirurgico.
- Eseguire l'antisepsi cutanea preoperatoria con uno spazzolino antisettico impregnato di clorexidina, effettuando movimenti circolari dalla regione della cicatrice ombelicale all'ultimo paio di ghiandole mammarie. Rimuovere la clorexidina con un impacco pulito e inumidito.
- Assicurarsi che il chirurgo e l'assistente eseguano l'antisepsi chirurgica e indossino camici e guanti chirurgici sterili per l'intervento chirurgico.
NOTA: L'animale deve essere preparato per l'intervento chirurgico in un'area di preparazione separata dal sito chirurgico. - Preparare il tavolo operatorio con gli strumenti appropriati e precedentemente sterilizzati elencati nella Tabella dei Materiali.
- Eseguire l'antisepsi finale del campo chirurgico utilizzando una garza sterile e un antisettico alla clorexidina, pulendo la regione a lisca di pesce, iniziando dal sito dell'incisione ed espandendosi lateralmente.
- Ripetere questa procedura tre volte con l'antisettico alla clorexidina, quindi ripetere la procedura con la clorexidina alcolica.
- Coprire completamente l'animale con un telo chirurgico sterile e, utilizzando le forbici, creare un'apertura rettangolare nel telo chirurgico, di circa 10 x 20 cm², se il telo non è fenestrato.
- Posizionare il telo chirurgico sul penultimo paio di ghiandole mammarie inguinali. Posizionare 4 morsetti Backhaus per fissare il telo chirurgico sulla pelle dell'animale.
- Incidere la pelle con un bisturi, creando un'incisione di circa 10 cm di lunghezza.
- Ottenere l'emostasi dei vasi sottocutanei con una pinza emostatica e/o una sutura riassorbibile di dimensione 2.
- Sezionare il tessuto sottocutaneo con le dita o con l'ausilio di forbici a punta fine, approfondendo l'incisione fino a raggiungere la linea alba nella muscolatura addominale.
NOTA: Palpare la linea mediana dell'addome per sentire la linea alba come una zona più rigida e fibrosa; Osservare la separazione dei muscoli retti dell'addome e notare il cambiamento nella consistenza dei tessuti durante la dissezione per identificare accuratamente la linea alba 11. - Con la pinza Allis, afferrare la muscolatura e sollevarla per praticare un'incisione a pugnalata nella linea alba con un bisturi.
- Inserire il dito indice nell'incisione per valutare la presenza di aderenze. Estendere l'incisione sulla linea alba caudalmente e cranialmente con forbici smussate/smussate o fini/smussate con attenzione per evitare di ferire altri organi e strutture sottostanti.
- Praticare un'incisione di lunghezza sufficiente in modo che l'unica mano del chirurgo possa essere inserita nella cavità addominale per localizzare ed esteriorizzare le corna uterine e/o le ovaie. Un divaricatore Gosset può essere utilizzato per facilitare l'ingresso nella cavità addominale e la sutura della muscolatura in un unico strato al termine della procedura.
- Se una delle corna uterine si trova prima delle ovaie, seguirla delicatamente fino a raggiungere la punta delle corna uterine e l'ovaio omolaterale. Durante questa procedura, valutare la presenza di liquido all'interno dell'utero, che può compromettere la gestazione.
- Dopo aver individuato l'ovaio, tirarlo delicatamente ed esporlo con cura. Valutare la presenza di follicoli pre-ovulatori, corpi lutei emorragici, corpi lutei ciclici e corpi albici per valutare se la sincronizzazione della scrofa è quella prevista.
- Rimuovere delicatamente le fimbrie della tuba uterina che copre l'ovaio, estrofrangere la mucosa e individuare l'ostio della tuba uterina.
NOTA: Se il chirurgo ha difficoltà ad identificare l'ostio delle fimbrie, si può praticare una tasca sull'ampolla dell'ovidotto con un ago da sutura a corpo tondo, evitando di perforare i vasi sanguigni, per inserire il catetere Tomcat contenente gli embrioni. - Inserire con cautela un catetere Tomcat contenente gli embrioni nell'ostio delle fimbrie fino a raggiungere la regione dell'ampolla della tuba uterina.
- Collegare una siringa da 1 ml al catetere Tomcat per spingere il liquido contenente l'embrione nella tuba uterina. Copri l'ovaio con le fimbrie e rimettilo nella cavità addominale.
- Individuare il corno uterino controlaterale e l'ovaio e ripetere i passaggi 2.17-2.21.
- Riposizionare le strutture all'interno della cavità addominale e aggiungere 1 L di soluzione salina o soluzione di lattato di Ringer riscaldata (39 °C) per prevenire aderenze prima di iniziare l'addominorrafia.
- Sutura la muscolatura addominale con sutura riassorbibile misura 2 in punti a "X" (Sultano) interrotti.
- Approssimare il tessuto sottocutaneo con una sutura continua a materasso utilizzando una sutura riassorbibile misura 2.
- Chiudere la pelle con una sutura di nylon misura 2 in punti semplici interrotti, graffette chirurgiche o adesivo etil-cianoacrilato. In questa procedura, abbiamo optato per l'uso dell'adesivo.
- Pulire la ferita chirurgica con una garza imbevuta di perossido di idrogeno e asciugare con un impacco per migliorare la fissazione dell'adesivo chirurgico sulla ferita chirurgica. Applicare la rifamicina o l'unguento di Pearson, coprire con una garza e, infine, applicare l'adesivo chirurgico.
NOTA: La ferita deve rimanere chiusa con una medicazione per 5 giorni.
3. Cure postoperatorie
- Valutare gli animali per segni di dolore clinico caratteristico per almeno i successivi 3 giorni consecutivi, secondo la scala proposta da Luna et al.12.
NOTA: Questa scala si basa sui diversi comportamenti esibiti dai suini quando sperimentano diversi livelli di dolore, come la postura, l'interazione e l'interesse per l'ambiente, l'attività, l'appetito e l'attenzione all'area interessata. Il punteggio va da 0 a 3, a seconda del tipo di comportamento esibito, per ogni parametro valutato. Al termine della valutazione, la somma di tutti i punteggi riflette l'intensità del dolore provato dall'animale, dove 0 rappresenta nessun dolore e 18 rappresenta un dolore molto intenso12. - Somministrare una singola dose di 15 mg/kg di amoxicillina e 0,4 mg/kg di meloxicam al 2% sia per via intramuscolare (nel muscolo gluteo o cervicale) una volta al giorno per 3 giorni come cura postoperatoria per prevenire il dolore, i processi infiammatori e le infezioni.
NOTA: Se il punteggio del dolore è uguale o superiore a 6 sulla scala del dolore utilizzata (punteggio da 0 a 18), somministrare 5.000 mg/animale di dipirone di sodio per via intramuscolare (nel muscolo gluteo o cervicale) una volta al giorno in aggiunta all'antinfiammatorio e all'antibiotico. In alternativa, eseguire l'analgesia come indicato nelle linee guida IACUC locali. - Il 6° giorno dopo l'intervento, rimuovere l'adesivo chirurgico per la pulizia della ferita con una garza imbevuta di soluzione alcolica di clorexidina al 2% e applicare l'unguento topico di Pearson fino al 10° giorno, quando si consiglia la rimozione della sutura o la rimozione delle graffette chirurgiche, se utilizzate.
4. Diagnosi gestazionale ecografica della gravidanza
- Eseguire la valutazione ecografica transaddominale della gravidanza con un dispositivo a ultrasuoni (gamma di frequenza da 4,5 a 8,5 MHz) 30 giorni dopo l'intervento chirurgico di trasferimento dell'embrione.
- Applicare il gel per ultrasuoni sulla sonda e posizionarla vicino alla regione addominale inguinale, rivolta medialmente.
NOTA: La visualizzazione di vescicole embrionali anecoiche arrotondate, dovute al liquido nel lume uterino, indica la gestazione. La mancata visualizzazione del liquido intrauterino, o la presenza di liquido intrauterino senza la delineazione delle vescicole embrionali, suggerisce l'assenza di gestazione.
5. Eutanasia degli animali
NOTA: All'esame ecografico sopprimere le scrofette che non presentavano feti di dimensioni e aspetto corrispondenti all'età gestazionale.
- Utilizzando un ago da 40 mm x 12 mm, prelevare 15 mg/kg di ketamina e 2 mg/kg di midazolam nella stessa siringa da 50 ml collegata a un set di somministrazione endovenosa e somministrare per via intramuscolare nel muscolo trapezio nella regione cervicale caudale al condotto uditivo esterno, come farmaco preanestetico.
- Incannulare la vena auricolare con un catetere da 20 G e indurre l'anestesia con 4 mg/kg di propofol per via endovenosa in bolo fino a quando non si verifica la bradicardia (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
- Successivamente, somministrare da 10 a 20 ml di cloruro di potassio al 19,1% per via endovenosa. Confermare l'arresto cardiopolmonare osservando l'assenza di movimenti respiratori, le mucose pallide, la perdita del riflesso corneale e l'assenza di battiti cardiaci posizionando uno stetoscopio sulla regione cardiaca.
- Raccogliere qualsiasi tipo di contenuto intrauterino (tessuto embrionale, secrezioni liquide o mucose) da femmine sottoposte a necroscopia13 e inviarlo per l'analisi microbiologica per rilevare possibili agenti patogeni e anche per la caratterizzazione genotipica dei cloni (se necessario). Controllare visivamente la presenza o l'assenza di corpi lutei, cisti ovariche, secrezioni anomale e la presenza di aderenze nell'utero, nelle ovaie e negli ovidotti14.
Risultati
Questo articolo ha lo scopo di dimostrare l'intervento di laparotomia per il trasferimento di embrioni clonati nell'ovidotto delle scrofette. Tutti gli animali sono rimasti in un piano anestetico adeguato, senza incidenti intraoperatori o complicazioni durante il recupero in anestesia. Le scrofette impiegavano, in media, 2-3 ore per alzarsi dopo la fine dell'intervento.
Tutte le procedure chirurgiche sono durate, in media, 44 minuti. Nove scrofette sono state sottoposte a intervento chirurgico, con una media di 185 embrioni clonati trasferiti per scrofetta, per un totale di 1.664 embrioni trasferiti bilateralmente (Tabella 1). La localizzazione delle ovaie, la loro esteriorizzazione e l'introduzione del catetere Tomcat contenente gli embrioni nell'ostio dell'ovidotto corrispondevano ai momenti più delicati dell'intervento. Le ovaie di tutte le scrofette sono state ispezionate durante l'intervento chirurgico e tutte presentavano follicoli emorragici ovulati di recente, in linea con quanto previsto per il protocollo di sincronizzazione dell'estro eseguito, che mirava a effettuare trasferimenti di embrioni poco dopo l'ovulazione. Tutte le procedure si sono svolte senza incidenti intraoperatori.
Nessun animale ha mostrato segni di dolore intenso dopo l'intervento chirurgico, con un punteggio medio del dolore di 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 e 0,33 sulla scala del dolore (che va da 0 a 18) eseguita nei 3 giorni postoperatori per ciascuna delle scrofette operate (Tabella 2). Solo 1 delle scrofette operate presentava accumulo di liquido sottocutaneo (sieroma) il 12° giorno dopo l'intervento, con segni di infezione e infiammazione localizzati vicino alla ferita chirurgica. Dopo aver drenato il fluido con un ago da 40 mm x 1,6 mm guidato da ultrasuoni, applicando impacchi freddi sulla zona infiammata per 30 minuti al giorno per 7 giorni, somministrando ceftiofur (3 iniezioni intramuscolari, con un intervallo di 72 ore tra le iniezioni) e meloxicam al 2% (0,4 mg/kg di SID, per via intramuscolare, per 3 giorni), la ferita si è fistolata e ha drenato il contenuto mucopurulento rimanente, con conseguente miglioramento completo dell'animale. Le altre scrofette operate sono rimaste con la medicazione chirurgica per 5 giorni senza la necessità di cambiarla o rimuoverla per la pulizia della ferita, che è stata eseguita solo dal 6° al 10° giorno dopo l'intervento.
Nelle scrofette 2, 8 e 9, non è stato osservato alcun accumulo di liquidi e formazione di vescicole embrionali nel lume uterino (Figura 1A). Pertanto, la diagnosi gestazionale di questi animali è stata considerata negativa. Le altre scrofette mostravano accumulo di liquido intrauterino e la formazione di vescicole embrionali visualizzate come strutture arrotondate anecoiche ben definite (Figura 1B-D). E' stato possibile identificare, in due delle scrofette riceventi, una regione iperecogena relativa alla struttura embrionale nella fase iniziale di sviluppo all'interno delle vescicole embrionali al 32° giorno di gestazione (Figura 1E,F).
Dopo una diagnosi gestazionale negativa o una non progressione della gestazione, le scrofette sono state soppresse e il sistema riproduttivo è stato analizzato. Nelle scrofette 1, 2, 3 e 4 sono state osservate aderenze nelle regioni delle ovaie, degli ovidotti e delle corna uterine, in misura minore o maggiore, mentre nelle scrofette 8 sono state osservate cisti ovariche (Figura 2). Quattro strutture embrionali, con un'età gestazionale compatibile con circa 12-20 giorni di gestazione, sono state ottenute dall'utero della scrofa 3 e una struttura è stata ottenuta dalla scrofa 7 (Figura 3). L'analisi dei frammenti di tessuto embrionale è risultata negativa per la rilevazione di Parvovirus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae e Circovirus suino di tipo 2 e 3 (PCV2/PCV3), che possono causare morte embrionale o aborti.
Figura 1: Immagini ecografiche dell'utero delle scrofette riceventi dell'embrione 30 giorni dopo l'intervento chirurgico. (A) L'utero della scrofetta 2 senza la presenza di liquido all'interno, caratterizzante una diagnosi gestazionale negativa. L'utero gravido della scrofa 1 (B), della scrofa 3 (C) e della scrofa 4 (D) contenente vescicole embrionali con liquido all'interno (asterischi). L'utero gravido della scrofa 3 (E) e della scrofa 7 (F) mostra una struttura iperecogena (freccia) all'interno della vescicola embrionale, indicando la formazione fetale nella fase iniziale a 32 giorni di gestazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi del sistema riproduttivo. Immagini di uteri, ovaie e ovidotti dopo l'autopsia della scronza 1 (A), della scrostata 2 (B), della scrostata 3 (C), della scrostata 4 (D), della scrostata 5 (E), della scrostata 6 (F), della scrostata 7 (G), della scrostata 8 (H) e della scrostata 9 (I). Le frecce evidenziano le aderenze nelle corna uterine, nelle ovaie e negli ovidotti e le punte di freccia evidenziano le cisti ovariche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagnosi gestazionale. Gli embrioni in fase iniziale rimossi dalla scrofa 3 (A-D) e dalla scrofa 7 (E) presentano una diagnosi gestazionale positiva e strutture iperecogene all'interno delle vescicole embrionali all'esame ecografico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Numero e tipo di embrioni trasferiti per scrofetta, gravidanze diagnosticate e numero di embrioni ottenuti dopo l'autopsia delle scrofette operate. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Valori assegnati a ciascuna delle scrofette operate per quanto riguarda la presentazione dei segni di dolore. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Discussione
Il metodo chirurgico descritto è stato precedentemente eseguito da altri gruppi di ricerca che lavorano con la produzione di suini clonati o suini clonati geneticamente modificati, con segnalazioni di nascite dopo l'implementazione di questa tecnica 15,16,17,18,19,20. I tassi di gravidanza e di natalità degli embrioni SCNT prodotti da varie linee cellulari variano intorno al 20%-30% (su 264 trasferimenti dal 2017), con una media di 3,2 ± 0,4 suinetti nati per figliata 3,21. Diversi fattori sono legati alla bassa efficienza di questa tecnica, tra cui il protocollo di sincronizzazione utilizzato per le scrofe riceventi, la sincronizzazione tra la scrofa ricevente e lo stadio degli embrioni trasferiti, il sito di deposizione degli embrioni, la qualità degli ovociti utilizzati per SCNT e gli embrioni prodotti, la qualità e lo stadio cellulare delle cellule somatiche del donatore di nucleo e il numero di embrioni trasferiti21.
Secondo il presente studio, l'intervento chirurgico descritto si è dimostrato efficace, veloce e sicuro per l'esecuzione del trasferimento chirurgico di embrioni clonati (fino allo stadio di 4 cellule) nelle scrofette, con conseguente diagnosi gestazionale ecografica positiva e visualizzazione delle strutture embrionali all'interno del lume uterino dopo la necroscopia, con età gestazionale approssimativamente compresa tra 12-20 giorni di gestazione22. Un altro metodo meno invasivo per il trasferimento di embrioni SCNT nell'ovidotto delle scrofe include la laparoscopia. Tuttavia, l'efficienza di questa tecnica varia considerevolmente da meno del 20% a oltre l'80% a causa di vari fattori come l'anatomia delle strutture, il tipo di catetere utilizzato e il sito di deposizione dell'embrione 4,6,23,24,25,26,27. Durante il trasferimento di 2-4 embrioni di suino di blastomero per via laparoscopica attraverso l'infundibolo a 6 scrofe, Wieczorek et al.4 non hanno ottenuto gravidanze positive a 28-31 giorni dopo la procedura, e questo risultato era correlato alle difficoltà nell'inserimento del catetere nell'ovidotto, all'inserimento superficiale del catetere nell'ovidotto e al verificarsi di perforazione dell'infundibolo con il catetere. Pertanto, il metodo di trasferimento degli embrioni tramite laparotomia all'ovidotto delle scrofe sembra ancora essere il più efficiente.
Il rischio chirurgico associato alla procedura di laparotomia per il trasferimento di embrioni nelle scrofe è piccolo; tuttavia, è importante notare la possibilità di ipertermia maligna durante l'anestesia, che si osserva comunemente nei suini commerciali delle razze Landrace e Large White28. In questo caso, nessuna delle scrofette operate ha mostrato segni clinici di ipertermia maligna durante l'anestesia. Esiste anche il rischio di sanguinamento locale minore da vasi più grandi nella regione sottocutanea, che può essere facilmente fermato con una pinza emostatica o sutura con sutura riassorbibile. Può verificarsi anche la possibilità di incidere accidentalmente qualsiasi organo della cavità addominale, come la vescica o le anse intestinali, durante l'incisione con il bisturi in pugnalata e l'incisione di estensione nella linea alba con le forbici. In questo caso, il chirurgo deve prestare molta attenzione durante l'incisione della linea alba e la sutura dei muscoli addominali per evitare di tagliare o lacerare le strutture sottostanti.
La manualità del chirurgo è fondamentale per una corretta manipolazione delle ovaie e un'attenta esteriorizzazione, evitando la rottura dei vasi del peduncolo ovarico. Quando c'è difficoltà nel localizzare l'ovaio, è possibile iniziare la procedura localizzando una delle corna uterine e seguendone l'estensione fino a raggiungere la punta del corno uterino alla giunzione utero-tubarica vicino all'ovaio. Bisogna fare attenzione per evitare aderenze ovariche e uterine dovute a un'eccessiva manipolazione di questi organi. L'idratazione di queste strutture con soluzione di Ringer lattato o soluzione salina a 39 °C durante l'intervento chirurgico può aiutare a prevenire la formazione di aderenze29. La manipolazione della tuba uterina, soprattutto nella regione delle fimbrie, deve essere eseguita molto delicatamente per evitare stiramenti e rotture. Sebbene il trasferimento unilaterale dell'embrione, solo in una delle tube uterine, possa essere eseguito per evitare un'eccessiva manipolazione dell'utero e ridurre i tempi chirurgici, il trasferimento bilaterale può essere più sicuro e vantaggioso, soprattutto nei casi in cui si verifica una rottura accidentale di una delle tube uterine o dubbi sulla deposizione dell'embrione nella posizione corretta. Inoltre, il trasferimento bilaterale è più raccomandato in quanto promuove tassi di gravidanza e numero di suinetti nati più elevati rispetto al trasferimento unilaterale16,30. La presenza di cisti è associata a un ritorno regolare o irregolare all'estro, con fino al 10% delle femmine con cisti ovariche che rimangono in anestro. È correlato a varie cause come lo stress, l'uso di protocolli ormonali o l'eredità genetica31,32. Nel nostro caso, le cisti follicolari si sono verificate nonostante il rispetto della dose e del tempo di somministrazione raccomandati dal produttore dell'ormone per la sincronizzazione del calore.
Saper localizzare l'ostio della tuba uterina mediante l'apertura delle fimbrie è di fondamentale importanza per la corretta deposizione degli embrioni nella sede appropriata. Per evitare errori relativi alla posizione di deposizione dell'embrione, si raccomanda di eseguire una formazione preliminare sul passaggio del catetere Tomcat riempito di soluzione (ad es. acqua) attraverso l'ostio del tubo uterino nei campioni di macello. Quando la pipetta viene introdotta nella posizione corretta, è possibile osservare un aumento del volume della tuba uterina dopo l'iniezione della soluzione. Vale la pena notare che minore è la quantità di liquido trasferito insieme agli embrioni, maggiori sono le possibilità di gravidanza33. Se il chirurgo ha molta difficoltà a trovare l'ostio della tuba uterina, è possibile fare una tasca sull'ovidotto e inserire il catetere attraverso di essa. Sebbene quest'ultimo metodo sia più veloce e comporti una minore manipolazione dell'ovidotto, il chirurgo deve evitare i vasi sanguigni ed essere sicuro che il catetere sia stato inserito correttamente all'interno del lume dell'ovidotto.
Sebbene il rischio di infezioni postoperatorie da questa procedura chirurgica sia basso, può verificarsi a causa di fattori come il livello di pulizia dell'area in cui sono ospitati gli animali, la durata della procedura chirurgica, il mantenimento della medicazione per un tempo adeguato e la corretta prescrizione di farmaci, come la terapia antibiotica preventiva e gli antinfiammatori. L'ipotesi più plausibile per l'insorgenza dell'infezione osservata in una delle scrofette operate è legata alla caduta della medicazione poco dopo che l'animale si è alzato dopo l'anestesia. Sebbene la pulizia quotidiana della ferita chirurgica di questa scrofetta fosse eseguita con una garza imbevuta di soluzione salina e l'applicazione topica dell'unguento di Pearson, tale procedura non era sufficiente per prevenire la contaminazione ascendente, che richiedeva l'applicazione di acqua fredda nel sito, il drenaggio, la terapia antibiotica sistemica e altri 3 giorni di trattamento antinfiammatorio. Anche con l'insorgenza di un'infezione sottocutanea, questa scrofetta ha mostrato segni di gravidanza all'esame ecografico.
Dopo aver utilizzato fili di nylon e graffette chirurgiche per chiudere la pelle in precedenti interventi chirurgici, abbiamo scelto di utilizzare l'adesivo etil-cianoacrilato per ridurre lo stress durante la rimozione dei punti e prevenire eventuali residui di fili o graffette. La presenza di fili o graffette favorisce una piccola infiammazione locale con formazione di pustole. L'adesivo etil-cianoacrilato è già stato utilizzato in modo sicuro nelle procedure chirurgiche, dimostrando di essere efficace, non tossico e battericida34,35. Tutti gli animali hanno mostrato un'eccellente guarigione delle ferite, senza complicazioni, ad eccezione della scrofetta, che ha avuto la medicazione cadere poco dopo l'intervento chirurgico.
Dichiarazioni
Nessuno degli autori rivela alcun conflitto di interessi
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare l'Ospedale Veterinario Equino e l'Ospedale Veterinario dei Ruminanti del College of Veterinary Medicine, Università di San Paolo (FMVZ/USP), San Paolo, Brasile, FAPESP (sovvenzione 2022/11459-3, Fondazione di ricerca di San Paolo), EMS Pharma, CNPq (sovvenzione 405254/2022-9) e allevamento di suini Água Branca, Itu, San Paolo, Brasile.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cannuccia da 0,25 mL | generico-Materiale | chirurgico | |
| Siringa da 1 mL | Descarpack | 341001 | Materiale chirurgico |
| Siringa da 10 mL | Descarpack | 324601 | Materiale chirurgico |
| Siringa da 20 mL | Descarpack | 324801 | Materiale chirurgico |
| Siringa da 3 mL | Descarpack | 324201 | Materiale chirurgico |
| Siringa da 5 mL | Descarpack | 324401 | Materiale chirurgico |
| Siringa da 60 mL | Descarpack | 323201 | Materiale chirurgico |
| Tubo endotracheale da 9 mm | Rusch | 112482-000090 | Materiale chirurgico |
| Allis pinze | generico-Strumento | chirurgico | |
| Amox LA | JA Saú de Registrazione | MAPA animale: 8.781/2004 | Farmaco |
| Bakhaus pinza | generico-Strumento | chirurgico | |
| Catetere 20G | Descarpack | Catetere per l'accesso endovenoso | |
| Cetamin | Agener Uniã o | Registrazione MAPA: SP-000292-5.000011 | anestetico |
| Gel clinico conduttivo | RMC | Registrazione ANVISA: 80122200013 | Materiale chirurgico |
| Dipirone D-500 | Zoetis | Registrazione MAPA: SP0000728-46 | Farmaco |
| farmaceutico Bisturi monouso n. 22 | Wiltex | Registrazione ANVISA: 10150470565 | Strumento chirurgico |
| Spugna-pennello sterile monouso | Rioquimica | 7.89778E+12 | Asepsi chirurgica |
| Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | Ultrasuoni |
| Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Detergente per strumenti chirurgici |
| Fentanil (Fentanest) | Cristá lia | Registrazione ANVISA: 1029800810159 | Anestetico |
| Divaricatore Gosset | generico-Strumento | chirurgico | |
| Halstead-zanzara pinza emostatica | generico-Strumento | chirurgico | |
| Unguento curativo - Unguento Pearson | Pearson SA | Registrazione MAPA: SP0000094-16 | Farmaco farmaceutico |
| soluzione di perossido di idrogeno | Rioquimica | Registrazione ANVISA: 218690015 | Materiale chirurgico |
| Isofluorano | Biochimico | Registrazione ANVISA: 100630222 | Anestetico |
| IV Set di flebo estensore | generico-Fluidoterapia | ||
| IV Set di gocciolamento | Descarpack | 410301 | Fluidoterapia |
| Lactofur (ceftiofur) | Ourofino SA | Registrazione MAPA: SP0000051-50 | |
| Laringoscopio | - | Strumento chirurgico | |
| Maxicam 2% | Ourofino SA | Registrazione MAPA: SP0000051-69 | Farmaco farmaceutico |
| Adesivo per micropori 5 cm x 10 cm | generico | 1530 | Materiale chirurgico |
| Midazolam | Hipolabor | Registrazione ANVISA: 1134301430035 | multidirezionale anestetico |
| Descarpack | 413201 | Ago per fluidoterapia | |
| 40 mm x 1,2 mm | Descarpack | 353601 | Ago sterile per l'applicazione di farmaci e anestetici. |
| Ago 40 mm x 1,6 mm | Wiltex | Registrazione ANVISA: 10150470664 | Ago sterile per l'applicazione di farmaci e anestetici. |
| Porta aghi | generico-Strumento | chirurgico | |
| Nylon 2 sutura trhead | Shalon Medical | N502CTI40 | Materiale chirurgico |
| Penna ordinaria | generica-Penna | normale per prendere appunti | |
| Soluzione fisiologica 0,9% Sacca da 500 ml | JP Farma | MS:1.0491.0070 | Fluidoterapia |
| Acido poliglicolico 2 filo di sutura | Atramat | G4099-75H | Materiale chirurgico |
| Cloruro di potassio | Registrazione ANVISA Samtec | : 1559200010139 | Farmaci parenterali |
| Guanti procedurali | Descarpack | 122401 | Dispositivi di protezione individuale (DPI) |
| Propofol (Provive) | Uniã o Quí mica | ANVISA registrazione: 1049714490057 | Anestetico |
| Ringer soluzione di lattato 500 mL sacca | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Fluidoterapia |
| Riohex 0,5% clorexidina soluzione alcolica Rioquimica | Rioquimica | Chirurgia asepsi | |
| Riohex 2% soluzione di clorexidina con tensioattivo | Rioquimica | 218690356 | Chirurgia asepsi |
| Cuoio capelluto 21 G | Descarpack | 421201 | Materiale chirurgico |
| Copriscarpe | generici-Dispositivi | Protezione Individuale (DPI) | |
| Impacchi sterili | Cremer | Registrazione ANVISA: 10071150065 | Materiale chirurgico |
| Garza sterile | Procitex | Registrazione ANVISA: 80245210083 | Materiale chirurgico |
| Teli chirurgici sterili 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | Materiale chirurgico |
| Teli chirurgici sterili 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | Materiale chirurgico |
| Guanti chirurgici sterili | Mucambo | CA: 39.317 | Dispositivi di protezione individuale (DPI) |
| Stetoscopio | generico-Dispositivi | chirurgici | |
| Cuffia chirurgica | Descarpack | 93201 | Dispositivi di protezione individuale (DPI) |
| Camice chirurgico | Descarpack | 231101 | Dispositivi di protezione individuale (DPI) |
| Mascherina chirurgica | Descarpack | 110701 | Dispositivi di Protezione Individuale (DPI) |
| Forbici chirurgiche smussate-smussate-smussate-generico-Strumento | chirurgico | ||
| chirurgiche affilate-affilate-Strumentazione | chirurgica | ||
| Cucitrice chirurgica | Tradevet-Materiale | chirurgico | |
| Tekbond super colla | Tek Bond | 78072720030 | Materiale chirurgico |
| Termometro | generico-Attrezzatura | chirurgica | |
| Rubinetto a tre vie | Solidor | 374 | Materiale chirurgico |
| Tramadol idrocloride | Agener Uniã o | Registrazione MAPA: SP-000292-5.000002 | Anestetico |
| Medicazione in pellicola trasparente | Skinupper | Registrazione ANVISA: 82307460014 | Materiale chirurgico |
| Adesivo impermeabile 10 cm x 4,5 cm | generico | 364828 | Materiale chirurgico |
Riferimenti
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