Articolo metodologico

Immunodosaggio fluorescente a flusso laterale basato su nanosfere di punti quantici

DOI:

10.3791/67000

⸱

28 giugno 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shanghai Skin Disease Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Dermatology, Shanghai Skin Disease Hospital, Institute of Dermatology, School of Medicine, Tongji University, 3Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di nanosfere a punti quantici (QDNB) e il rilevamento di biomarcatori di malattia utilizzando strisce di immunodosaggio a flusso laterale basate su QDNB. I risultati del test possono essere valutati qualitativamente sotto l'illuminazione a luce UV e misurati quantitativamente utilizzando un lettore di strisce fluorescenti entro 15 minuti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I punti quantici, noti anche come nanocristalli semiconduttori, sono nuove etichette fluorescenti per l'imaging e il rilevamento biologico. Tuttavia, i coniugati punto-anticorpo quantici di piccole dimensioni (~10 nm), preparati attraverso laboriose procedure di purificazione, mostrano una sensibilità limitata nel rilevare alcuni marcatori di malattia in tracce utilizzando strisce di immunodosaggio a flusso laterale. In questo articolo, presentiamo un metodo per la preparazione di nanosfere di punti quantici (QDNB) utilizzando un metodo di evaporazione dell'emulsione in un'unica fase. Utilizzando il QDNB così preparato, è stato fabbricato un test immunologico a flusso laterale fluorescente per rilevare i biomarcatori della malattia utilizzando come esempio la proteina C-reattiva (CRP). A differenza delle nanoparticelle a singolo punto quantico, i coniugati nanobead-anticorpo a punto quantico sono più sensibili come etichette di immunodosaggio a causa dell'amplificazione del segnale incapsulando centinaia di punti quantici in una nanosfera composita polimerica. Inoltre, le dimensioni maggiori dei QDNB facilitano la separazione per centrifugazione quando si coniugano i QDNB con gli anticorpi. Il test immunologico a flusso laterale fluorescente basato sui QDNB è stato fabbricato e la concentrazione di CRP nel campione è stata misurata in 15 minuti. I risultati del test possono essere valutati qualitativamente sotto l'illuminazione a luce UV e misurati quantitativamente utilizzando un lettore fluorescente entro 15 minuti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le strisce per immunodosaggio a flusso laterale (LFIA) fungono da strumenti cruciali per il rilevamento rapido presso il punto di cura 1,2, in particolare nello screening delle malattie durante le epidemie. Tuttavia, le tradizionali strisce reattive LFIA a base di oro colloidale mostrano una bassa sensibilità di rilevamento e forniscono solo risultati qualitativi3. Per migliorare la sensibilità di rilevamento di LFIA, sono emerse varie nuove nanoparticelle, tra cui il lattice colorato 4,5, le nanoparticelle fluorescentidi conversione 6, le microsfere fluorescenti risolte nel tempo 7,8 e i punti quantici 9,10,11. I punti quantici (QD)12,13, noti anche come nanocristalli semiconduttori, offrono lunghezze d'onda di emissione regolabili, un'ampia gamma di eccitazione e un'elevata efficienza di luminescenza, rendendoli etichette ideali per l'imaging biologico.

Tuttavia, il segnale di fluorescenza emesso dai singoli punti quantici rimane debole, con conseguente sensibilità di rilevamento relativamente bassa nei saggi immunologici. L'incapsulamento di numerosi punti quantici all'interno di microsfere può amplificare i segnali e migliorare la sensibilità dei saggi immunologici basati su punti quantici. Vari metodi, come l'autoassemblaggio strato per strato 14,15,16,17,18, il metodo di rigonfiamento19,20 e l'incapsulamento con microsfere di silice 21,22,23,24, sono stati impiegati per incapsulare i punti quantici all'interno delle microsfere. Ad esempio, le etichette di nanosfere di silice funzionalizzate con punti quantici possono essere ottenute aumentando il carico QD per immunoreazione a sandwich25. Un essiccatore a spruzzo dotato di un atomizzatore a ultrasuoni è stato utilizzato anche per preparare nanosfere QD-BSA26 su scala nanometrica. Tuttavia, i metodi sopra menzionati soffrono di complesse fasi multiple, estinzione della fluorescenza e bassa produttività.

Nel nostro precedente lavoro27, è stato riportato un metodo di evaporazione emulsione-solvente per incapsulare punti quantici all'interno di nanosfere polimeriche. Questa tecnica di preparazione è semplice, mantiene l'efficienza fluorescente dei QD, garantisce un'elevata efficienza di incapsulamento e consente una produzione facilmente scalabile. Diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato con successo strisce LFIA utilizzando QDNB preparati con questo metodo per applicazioni, tra cui il rilevamento di tossine alimentari 28,29,30, il rilevamento di biomarcatori di malattie infettive 31,32 e il monitoraggio ambientale33.

Questo protocollo presenta fasi di preparazione specifiche per le nanosfere di punti quantici (QDNB), la coniugazione di QDNB e anticorpi, la preparazione di LFIA basata su QDNB e la misurazione della proteina C-reattiva (CRP) in campioni di plasma umano.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board dello Shanghai Skin Disease Hospital (n. 2020-15). Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono campioni di sangue umano sono state condotte in un laboratorio di biosicurezza di livello II. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione delle nanosfere QDs

NOTA: Per la sintesi di nanosfere QD, è stata utilizzata una tecnica di evaporazione emulsione-solvente per sintetizzare nanosfere QD, con un rapporto tra fase oleosa e fase acquosa di 1:5. La mini emulsione viene generata tramite ultrasuoni e le nanosfere vengono solidificate attraverso l'evaporazione del solvente (cloroformio). L'idrossido di sodio è stato utilizzato per catalizzare l'idrolisi dei gruppi anidridici sulla superficie delle nanosfere, convertendoli in gruppi carbossilici.

  1. Preparazione di soluzioni in fase oleosa e in fase acquosa
    1. Preparare 1 mL di fase oleosa: 0,4 mL di soluzione di poli (stirene-anidride co-maleica) (PSMA) (50 mg/mL), 0,1 mL di soluzione di QDs (100 mg/mL), riempire qualsiasi volume inferiore a 1 mL con cloroformio.
    2. Preparare 5 mL di fase acquosa: soluzione acquosa SDS (0,5 % in peso).
  2. Preparazione dell'emulsione e solidificazione
    1. Aggiungere 1 mL di fase oleosa e 5 mL di fase acquosa a una fiala (15 mL) e posizionare la fiala su un agitatore magnetico. Accendere l'agitatore magnetico.
    2. Dopo che le fasi dell'olio e dell'acqua sono completamente miscelate, trasferire immediatamente il pallone all'ultrasonicazione programmata (60 s, un impulso di 3 s seguito da una pausa di 3 s, 50% di ampiezza) e accendere l'alimentazione.
    3. Osservare la soluzione dopo l'ultrasuoni. La soluzione inizialmente di colore cremisi è passata a una fase opalescente che conserva ancora un sottotono rossastro.
    4. Riposizionare la fiala sull'agitatore magnetico a temperatura ambiente, mescolando continuamente per una notte. Il cloroformio è stato gradualmente evaporato e l'emulsione si è solidificata in nanosfere composite.
  3. Modifica della superficie delle nanosfere
    1. Aggiungere 0,1 mL di idrossido di sodio 0,1 mM alla sospensione di nanosfere per 1 ora. I gruppi anidridici sulla superficie delle nanosfere vengono idrolizzati in gruppi carbossilici.
  4. Purificazione di nanosfere
    1. Spegnere l'agitatore magnetico e spostare le nanosfere solidificate in una provetta da centrifuga. Centrifugare la provetta a 13523 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
    2. Aggiungere il volume iniziale di acqua deionizzata alla precipitazione, coprire il tubo con il suo coperchio, immergerlo nel bagno d'acqua ad ultrasuoni e mantenere l'immersione fino a quando il precipitato non è completamente disperso.
    3. Ripeti i passaggi 1.4.1-1.4.2 due volte e, infine, trasferisci le nanosfere nella bottiglia di vetro. Conservarlo a 4 °C fino al momento dell'uso.
  5. Caratterizzazione di nanosfere
    1. Caratterizzare le dimensioni e la morfologia delle nanosfere QDs utilizzando l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)22.
      NOTA: Diverse dimensioni di nanosfere possono essere ottenute modificando la proporzione tra la soluzione di QD e la soluzione di PSMA. La dimensione delle nanosfere QDs può essere determinata anche attraverso la diffusione dinamica della luce (DLS)27.

2. Preparazione di coniugati anticorpali QDNB

  1. Attivazione di gruppi carbossilici
    1. Aggiungere 100 μL di QDNB preparato (10 mg/mL) in 200 μL di tampone fosfato (PB, 20 mM, pH 6,0), quindi aggiungere 6 μL di EDC (20 mg/mL).
    2. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente su un mixer rotante.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela a 13523 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
    4. Aggiungere 100 μl di PB (20 mM, pH 6,0) alla precipitazione, coprire la provetta con il coperchio e immergere la provetta nel bagno d'acqua a ultrasuoni operativo fino a quando il precipitato non è completamente disperso.
  2. Coniugazione di anticorpi e nanosfere
    1. Disperdere 100 μg di anticorpo in 200 μL di PB (20 mM, pH 6,0) e aggiungere la sospensione QDNB attivata ottenuta dalla fase 2.1 nella soluzione anticorpale.
    2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti con rotazione continua. Rimuovere gli anticorpi in eccesso mediante centrifugazione a 6010 x g per 5 minuti (a temperatura ambiente), quindi scartare con cura il surnatante.
  3. Blocco delle nanosfere
    1. Aggiungere 200 μL di soluzione di caseina all'1% (in tampone PB 20 mM, pH 7,4) al residuo (ottenuto al punto 2.2.2), coprire la provetta con il suo coperchio e immergerla nel bagno d'acqua a ultrasuoni operativo fino a quando il residuo non è completamente disperso.
    2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 ore con rotazione continua.
      NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è bloccare tutti i siti non reagiti sulla superficie di QDNB.
  4. Stoccaggio di coniugati
    1. Aggiungere 100 μL di soluzione conservante (20 mM di tampone PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trealosio, 6% saccarosio, 0,1% S9, pH 7,4) alla miscela e conservare a 4 °C per un uso successivo.

3. Preparazione di strisce per immunodosaggio a flusso laterale

NOTA: La striscia immunocromatografica è composta da una membrana in nitrocellulosa (NC), un tampone per campioni, un tampone coniugato, un tampone assorbente e un pannello in cloruro di polivinile (PVC) (Figura 1). Tutte le soluzioni devono essere preparate e utilizzate immediatamente. Si raccomanda di preparare le strisce di immunodosaggio a flusso laterale in una stanza bianca con umidità controllata.

  1. Preparazione della membrana NC
    1. Preparare la soluzione di rivestimento della linea di test (linea T) e della linea di controllo (linea C): diluire l'anticorpo di cattura CRP e le IgG anti-coniglio di capra con PB a una concentrazione finale di 1 mg/mL.
    2. Posizionare correttamente il pannello in PVC e rimuovere la carta protettiva situata a 25 mm dal bordo del pannello in PVC. Allineare e far aderire la membrana NC lungo il bordo inferiore della carta protettiva rimanente al pannello in PVC.
    3. Erogare le soluzioni di rivestimento T-line e C-line sulla membrana NC a una velocità di getto di 1 μL/cm, assicurandosi che sia posizionata a 20 mm di distanza dal bordo superiore, formando una linea di prova (1 mm di larghezza).
    4. Posizionare la membrana NC in condizioni con un'umidità inferiore al 30% e un intervallo di temperatura di 18-26 °C per l'essiccazione. Il tempo di asciugatura deve essere di almeno 24 ore.
      NOTA: Assicurarsi che i bordi superiore e inferiore della membrana NC siano a filo con i bordi corrispondenti delle aree adiacenti. Le membrane NC non devono essere toccate con le mani. L'umidità durante questa fase deve essere controllata nell'intervallo compreso tra il 45% e il 65%. Prima di procedere, la soluzione di rivestimento T-line, la soluzione di rivestimento C-line e la membrana NC devono essere bilanciate alla stessa temperatura.
  2. Preparazione del tampone coniugato
    1. Immergere il tampone coniugato nella soluzione di trattamento del tampone coniugato (20 mM di tampone PB, pH 7,4, 1%BSA).
    2. Mettere il tampone coniugato imbevuto in un forno di essiccazione per il trattamento di essiccazione (temperatura ambiente) durante la notte.
    3. Far aderire delicatamente il tampone coniugato modificato sul pannello in PVC.
    4. Diluire la soluzione preparata di coniugato anticorpo QDNB con la soluzione conservante (20 mM di tampone PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trealosio, 6% saccarosio, 0,1% S9, pH 7,4).
    5. Erogare la soluzione coniugata di anticorpi QDNB sul tampone coniugato a una velocità di getto di 1 μL/cm e asciugare il tampone coniugato per 24 ore.
      NOTA: Il rapporto di diluizione specifico deve essere regolato in base all'obiettivo di rilevamento.
  3. Preparazione del tampone per campioni
    1. Immergere il tampone del campione nella soluzione di trattamento del tampone del campione (20 mM di tampone PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trealosio, 6% saccarosio, 0,1% S9, pH 7,4).
    2. Immergere il tampone per campioni imbevuto in un forno di essiccazione (45 °C) e asciugare per 24 ore.
  4. Assemblaggio della carta e taglio a strisce
    1. Come mostrato nella Figura 1, posizionare successivamente la carta assorbente (tampone assorbente), il tampone coniugato e il tampone campione sul pannello in PVC con membrana NC.
    2. Tagliare la carta in strisce di 3,8 mm di larghezza.
  5. Imballaggio delle strisce
    1. Racchiudere le strisce reattive in una cassetta di plastica e sigillare una busta di alluminio che contiene un essiccante.

4. Operazione di analisi e valutazione qualitativa

NOTA: Si raccomanda di condurre operazioni che coinvolgono campioni di sangue umano in un laboratorio di biosicurezza di livello II. I campioni di plasma umano sono stati ottenuti da un laboratorio clinico (da soggetti umani anonimizzati). Tipicamente, il sangue umano è stato raccolto utilizzando una provetta a vuoto EDTA e il plasma è stato isolato secondo il protocollo standard34. Centrifugare a 3.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente per la separazione al plasma. Raccogliere lo strato superiore di plasma giallo utilizzando una pipetta e conservare il plasma in una provetta da 1,5 ml a -80 °C fino al momento dell'uso.

  1. Pipettare 10 μL di campione di plasma o soluzione di calibrazione in 1 mL di tampone PBS contenente lo 0,1% di Tween 20. Quindi, trasferire 100 μl del campione diluito preparato sul tampone del campione della striscia reattiva.
  2. Dopo un'esecuzione di 15 minuti, osservare i segnali di fluorescenza della linea T e della linea C sotto esposizione alla luce ultravioletta per ottenere risultati qualitativi.
  3. Inserire la strip card in un lettore di saggi fluorescenti a flusso laterale per ottenere le intensità di fluorescenza per l'analisi quantitativa.
    NOTA: In questo esempio, viene impiegato il metodo del dosaggio immunologico a sandwich35,36; Una linea rossa (linea di controllo) indica un risultato negativo, mentre le due linee rosse (linee di test e linee di controllo) indicano un risultato positivo. L'assenza della linea di controllo indica che il test condotto non è valido.

Risultati

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Le procedure di preparazione del QDNB sono illustrate schematicamente nella Figura 1A. La fase oleosa contenente QD e polimero in cloroformio è stata miscelata con la fase acquosa ed è stata ottenuta una mini-emulsione mediante sonicazione. L'emulsione è stata solidificata mediante evaporazione graduale del cloroformio. La micrografia elettronica a trasmissione (TEM) di QDNB è presentata nella Figura 2A. I QDNB hanno una morfologia sferica, con diametri medi di 96 nm, misurati su 50 QDNB nelle immagini TEM. Le nanoparticelle QD sono chiaramente osservate all'interno delle nanosfere, indicando il successo dell'incapsulamento. La Figura 2B e la Figura 2D mostrano rispettivamente gli spettri di fluorescenza e assorbimento del QDNB.

Il QDNB e l'anticorpo sono stati coniugati utilizzando la chimica della carbodiimmide, come mostrato nella Figura 1B. Il coniugato anticorpo QDNB è stato utilizzato per preparare LFIA basata su QDNB. La struttura di LFIA è illustrata nella Figura 1C. Se l'antigene CRP è presente nel campione, i coniugati QDNB-anti-CRP si accumulano sulla linea del test.

Come mostrato nella Figura 3, la misurazione viene eseguita aggiungendo 100 μl di campione diluito al foro del campione. Dopo un tempo di reazione di 15 minuti, i risultati del test possono essere letti qualitativamente sotto l'illuminazione a luce UV. I risultati quantitativi possono essere ottenuti utilizzando un lettore di strisce fluorescenti e la concentrazione del campione può essere calcolata utilizzando un'equazione di calibrazione incorporata nel software del lettore di strisce37,38.

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Figura 1: Illustrazione del test immunologico fluorescente a flusso laterale basato su nanosfere di punti quantici. (A) Procedure per la preparazione del QDNB. (B) Principio dei coniugati QDNB-anticorpo. (C) Principio dell'LFIA basato su QDNB per la rilevazione della CRP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Caratterizzazione dei QDNB. (A) Immagine TEM dei QDNB. Barra di scala: 100 nm. (B) Spettri di emissione fluorescente di QDNB. (C) Spettri di assorbimento di QDNB. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Procedure di immunodosaggio a flusso laterale per la PCR. (A) Illustrazione della rilevazione. (B) Fotografie di strisce LFIA basate su QDNB che rilevano campioni di CRP in un intervallo compreso tra 0 e 30 mg/L alla luce UV. (C) Lettore fluorescente per la quantificazione dei risultati. (D) Fotografia dei risultati quantitativi. (E) Rilevamento della proteina C-reattiva (CRP) mediante trasformazione logistica seguita da regressione lineare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di nanosfere a punti quantici (QDNB)27 e l'uso di QDNB per la preparazione di saggi immunologici a flusso laterale fluorescenti (LFIA). Viene dimostrata la misurazione qualitativa e quantitativa della CRP nei campioni. Questo LFIA basato su QDNB può essere applicato anche ad altri biomarcatori di malattie 25,32, tossine alimentari29,30, virus16,27 e altro ancora.

Le fasi critiche di questo protocollo sono la preparazione di QDNB e coniugati QDNB-anticorpi. La dimensione delle particelle di QDNB e il contenuto di QD nelle nanosfere dovrebbero essere ottimizzati per ottenere QDNB altamente fluorescenti con bassi segnali di fondo nella LFIA. Le coppie di anticorpi di cattura e rilevamento sono fondamentali per il test immunologico e devono essere sottoposte a screening per le migliori corrispondenze da vari fornitori. La coniugazione dell'anticorpo con QDNB deve essere ottimizzata, compreso il rapporto anticorpo/QDNB, il pH tampone e i reagenti bloccanti. In particolare, l'aggregazione di QDNB e anticorpi deve essere evitata ottimizzando il pH del tampone, la concentrazione di sale e il tempo di reazione nelle procedure di coniugazione.

Rispetto ad altri metodi di preparazione per le nanosfere di punti quantici, questo protocollo presenta i vantaggi di semplicità, facilità d'uso e alta produttività. Inoltre, le nanosfere composite polimeriche sono biocompatibili, a differenza delle nanosfere di silice, che di solito richiedono ulteriori modifiche della superficie con i polimeri. Tuttavia, i QDNB preparati utilizzando questo protocollo non sono monodispersi come quelli preparati utilizzando nanosfere modello di polimero19 o silice21 . La dimensione delle particelle dei QDNB varia solitamente da 70 nm a 200 nm.

Le strisce di immunodosaggio a flusso laterale (LFIA) basate su QDNB sono preparate in modo simile ad altre LFIA fluorescenti. A causa delle elevate rese quantistiche dei QD e dell'amplificazione del segnale dei QDNB, l'LFIA basato su QDNB che utilizza questo protocollo è più sensibile di altri LFIA basati su microsfere fluorescenti, come le microsfere fluorescenti risolte nel tempo e le microsfere di fluoresceina. Inoltre, la stabilità del QDNB è superiore alla fluoresceina tradizionale, fornendo agli LFIA basati su QDNB un tempo di conservazione più lungo.

Tuttavia, il cadmio sulla superficie dei punti quantici è soggetto a chelazione con gruppi sulfidrilici nelle proteine, specialmente in ambienti acquosi. Evitare l'uso di alte concentrazioni di proteine è fondamentale per la stabilità delle LFIA basate su QDNB. Il cadmio è tossico e il suo utilizzo è limitato in alcune situazioni, rendendo necessaria la preparazione di punti quantici privi di cadmio con elevate rese quantistiche e stabilità.

In sintesi, viene fornito un metodo versatile per la preparazione di nanosfere di punti quantici in un unico passaggio ed è scalabile per la produzione industriale. Utilizzando i QDNB così come preparati, sono state create strisce di immunodosaggio fluorescenti a flusso laterale per il rilevamento qualitativo e quantitativo dei biomarcatori di malattia. Il QDNB ideale per LFIA è una nanosfera di piccole dimensioni incapsulata con numerosi QD senza quenching di fluorescenza.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pengfei Zhang è uno dei fondatori di Shanghai Kundao Biotech e ha potenziali interessi finanziari con questa società.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal Progetto del Comitato per la Scienza e la Tecnologia di Shanghai (STCSM) (22S31902000) e dal Programma di incubazione della ricerca clinica dell'Ospedale per le malattie della pelle di Shanghai (NO. lcfy2021-10).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(dimetilammino)propil)-N'-etilcarbodiimmide cloridratoSigma-Aldrich03450
Carta assorbente Kinbio BiotechCH37K
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichB2064
CaseinaSigma-AldrichC8654
CdSe/ZnS quantum dotSuzhou Mesolight Inc.CdSe/ZnS-625
CholoroformSino Pharm10006818
anticorpo CRPHytest Biotech4C28
Lettore di saggi fluorescenti a flusso lateraleSuzhou Helmence Precision InstrumentFIC-H1
Cuscinetto in fibra di vetroKinbio BiotechSB06
IgG anti-coniglio di capraSangon BiotechD111018
Membrana in nitrocellulosa SatoriousCN140
Poli(stirene-anidride maleica) copolimero Sigma-Aldrich S458066
IgG di coniglioSangon BiotechD110502
Sodio dodecil solfatoSino Pharm30166428
Idrossido di sodioSino Pharm10019718

Riferimenti

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