Method Article

Assemblaggio di organoidi retinici con microglia

DOI:

10.3791/67016

⸱

July 26th, 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microglia sono cellule immunitarie uniche residenti nella retina, che svolgono un ruolo cruciale in varie malattie degenerative della retina. La generazione di un modello di co-coltura di organoidi retinici con microglia può facilitare una migliore comprensione della patogenesi e del progresso dello sviluppo delle malattie retiniche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A causa della limitata accessibilità della retina umana, gli organoidi retinici (RO) sono il miglior modello per lo studio della malattia retinica umana, che potrebbe rivelare il meccanismo dello sviluppo retinico e l'insorgenza della malattia retinica. Le microglia (MG) sono macrofagi residenti unici nella retina e nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono funzioni immunitarie cruciali. Tuttavia, gli organoidi retinici mancano di microglia poiché la loro origine di differenziazione è il sacco vitellino. La patogenesi specifica della microglia in queste malattie della retina rimane poco chiara; Pertanto, la creazione di un modello di organoide retinico incorporato nella microglia risulta essere necessaria. Qui, abbiamo costruito con successo un modello co-coltivato di organoidi retinici con microglia derivate da cellule staminali umane. In questo articolo, abbiamo differenziato le microglia e poi le abbiamo co-coltivate con organoidi retinici nella fase iniziale. Come incorporazione di cellule immunitarie, questo modello fornisce una piattaforma ottimizzata per la modellazione delle malattie retiniche e lo screening dei farmaci per facilitare la ricerca approfondita sulla patogenesi e il trattamento delle malattie retiniche e correlate al SNC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Essendo la fonte limitata della retina umana, la differenziazione delle cellule staminali umane in organoidi retinici tridimensionali (3D) rappresenta un promettente modello in vitro per la simulazione della retina1. Contiene diversi tipi di cellule nella retina, tra cui fotorecettori, cellule gangliari retiniche, cellule bipolari, cellule di Müller, cellule orizzontali e astrociti2. Questo modello consente l'emulazione e lo studio sia dei meccanismi di sviluppo retinico che della patogenesi delle malattie retiniche. Tuttavia, a causa del metodo di differenziazione direzionale, gli organoidi retinici sono stati derivati dal neuroectoderma3, mancando di molti altri tipi di cellule originate da diversi strati germinali, come le microglia dal sacco vitellino e le cellule perivascolari dal mesoderma 4,5,6.

Attualmente, molte malattie della retina, come la retinite pigmentosa7, il glaucoma8 e il retinoblastoma9, hanno dimostrato di essere strettamente correlate alla microglia all'interno della retina. Tuttavia, a causa della mancanza di adeguati modelli di ricerca, i meccanismi specifici che illustrano la relazione tra la microglia e queste malattie rimangono ancora poco chiari. Mentre i topi sono serviti come modello favorevole per lo studio delle malattie retiniche, studi recenti hanno evidenziato differenze significative tra microglia di topo e umane in termini di durata della vita, tasso di proliferazione e assenza di geni omologhi umani10,11. Questi risultati hanno suggerito che le conclusioni tratte dai modelli murini potrebbero non essere del tutto affidabili, sottolineando l'importanza di costruire organoidi retinici umani contenenti microglia.

Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati vari metodi per la differenziazione 3D di organoidi retinici12,13. Per facilitare l'operazione di co-coltura delle microglia all'interno degli organoidi retinici, abbiamo selezionato un metodo di differenziazione che prevede una transizione dalla coltura aderente a quella in sospensione. Questo approccio consente con successo di incorporare le microglia negli organoidi retinici, mantenendoli per almeno 60 giorni14.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. La linea cellulare H9 di HESC proveniva dal WiCell Research Institute. Preriscaldare il terreno di coltura cellulare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti prima dell'esperimento.

1. Generazione di microglia umane

  1. Coltivare le hESC in terreno di coltura con cellule staminali fino a quando la densità cellulare raggiunge l'80%-90%. Seminare almeno 1 x 106 celle in ogni pozzetto.
  2. Aspirare il terreno di coltura delle cellule staminali e sciacquare le cellule con 1x DPBS (1 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti). Il passaggio successivo richiede 2 x 107-1 x 108 celle. Se non è sufficiente, combina celle di 2-5 pozzetti per eseguire i passaggi seguenti.
  3. Dissociare le colonie di cellule staminali utilizzando la soluzione di EDTA 0,5 mM per circa 5 minuti in un incubatore a 37 °C (1 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti).
  4. Controllare la morfologia della colonia dopo 5 minuti. Quando i bordi della colonia sono leggermente arricciati con spazi vuoti allentati, le cellule sono pronte per essere differenziate e aspirare l'EDTA. In caso contrario, incubare le cellule a 37 °C per altri 1-2 minuti. Non incubare per più di 8 minuti.
  5. Sciacquare delicatamente le cellule in ciascun pozzetto utilizzando 6 mL di Medium A (Tabella 1) con 6 μL di soluzione di inibitore ROCK 10 mM di Y-27632. Picchiettare delicatamente il fondo del piatto per aiutare a sciacquare le cellule. Imposta il giorno come giorno 0.
    NOTA: Non pipettare le cellule. Le cellule formeranno corpi embrioidi (EB) il giorno successivo.
  6. Dopo 24 ore, osservare le cellule al microscopio per confermare la formazione di EB. Raccogliere gli EB in una provetta centrifuga da 15 mL con una pipetta da 10 mL e attendere che gli EB si depositino sul fondo in 5 minuti.
  7. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere gli EB con 6 mL di terreno A fresco e trasferirli in un nuovo pozzetto a bassa adesione di una piastra a 6 pozzetti. Coltura in un'incubatrice a 37 °C.
    NOTA: Lo scopo del trasferimento del pozzetto il giorno 1 è quello di ridurre l'influenza di un gran numero di cellule morte durante il processo di formazione dell'EB, che può influenzare lo stato di crescita cellulare.
  8. Rinfrescare il terreno A fresco ogni giorno fino al giorno 4 (6 ml/pozzetto di piastra a 6 pozzetti).
  9. Il giorno 4, rivestire un piatto di 10 cm con 3 mL di soluzione di gelatina di pesce allo 0,1% per almeno 1 ora in un'incubatrice al 5% di CO2, 37 °C.
    NOTA: Se il tempo di rivestimento è inferiore a 1 ora, è difficile eseguire i seguenti passaggi.
  10. Raccogliere con cura gli EB in una provetta centrifuga da 15 mL con una pipetta da 10 mL e attendere che gli EB si depositino sul fondo entro 5 minuti.
  11. Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0,1% e sciacquare una volta il piatto da 10 cm con 5-6 ml di 1x DPBS. Rimuovere il DPBS.
  12. Risospendere delicatamente gli EB con 15 mL di Medium B (Tabella 1) nella provetta centrifuga da 15 mL e trasferirli nel piatto rivestito da 10 cm. Coltura in incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 1 settimana.
    NOTA: Nei primi 7 giorni, non spostare il piatto.
  13. Rinfrescare con Medium B fresco una volta alla settimana fino al giorno 49 (piatto da 15 ml/10 cm) ed esaminare le cellule al microscopio una volta alla settimana.
    NOTA: Dopo il giorno 49, diverse cellule secretorie possono essere trovate nel surnatante nella piastra di coltura.
  14. Centrifugare le celle surnatanti a 200 x g per 5 minuti a RT.
  15. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere le cellule con 2 mL di terreno B fresco e trasferirle in un nuovo pozzetto a bassa adesione di una piastra a 6 pozzetti. Incubare in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C.
    NOTA: Nei prossimi 7 giorni, non spostare la piastra. La microglia potrebbe aderire al fondo del pozzetto a bassa aderenza.
  16. Il giorno 56, sostituire con il mezzo C (Tabella 1) (2 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti). La microglia aderisce al fondo del pozzetto a bassa aderenza e apparirà ramificata al microscopio.
    NOTA: Cambiando il terreno C ogni 3 giorni (2 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti), la microglia potrebbe essere coltivata nel terreno C per circa 15 giorni.

2. Generazione di RO umane e co-coltura delle RO con la microglia

  1. Coltura delle hESC in terreno di cellule staminali fino a quando la densità cellulare raggiunge l'80%-90%. Seminare almeno 1 x 106 celle in ogni pozzetto.
  2. Aggiungere Dispase (1 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti) alla cellula di coltura. Incubare a 37 °C per 5 min. Aspirare la soluzione di Dispase dal pozzo.
  3. Aggiungere il terreno D (Tabella 1) (1 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti) al pozzetto. Tagliare la cellula in piccoli pezzi con una pipetta da 10 μl.
  4. Raccogliere delicatamente tutti i pezzi di cellule e il terreno in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  5. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  6. Risospendere delicatamente le cellule in 200 μL di matrice fredda. Spostare la provetta da microcentrifuga da 1,5 in un'incubatrice per 20 minuti. Funziona velocemente perché la matrice si solidifica a temperatura ambiente (RT). Dopo 20 minuti nell'incubatrice, la matrice si solidifica.
  7. Preparare una piastra da 10 cm con 15 ml di Medium D. Risospendere la matrice con Medium D e agitare delicatamente la piastra di Petri.
  8. Quindi, metti il piatto in un'incubatrice per 5 giorni. Non spostare la piastra. Impostare il giorno come giorno 0 (RO). Le cellule aderiranno in 3 giorni.
  9. Il giorno 5 (RO) e il giorno 10 (RO), aggiornare il mezzo con il mezzo D.
  10. Il giorno 12 (RO), rimuovere il terreno e aggiungere 3 ml di Dispase a ciascun piatto per 5 minuti.
  11. Aspirare la Dispasi e aggiungere 15 ml di Medium E (Tabella 1).
  12. Raccolta della microglia: il giorno 56 (MGs), aspirare delicatamente il terreno C, aggiungere l'accutasi (1 mL/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C per 3 minuti.
  13. Raccogliere le cellule della microglia in una provetta centrifuga da 15 ml con una pipetta da 5 ml. Centrifugare le celle a 200 x g a RT per 5 min.
  14. Aspirare delicatamente il surnatante e sospendere la microglia con 1 mL di Medium E. Aggiungere la microglia agli RO digeriti il giorno 12.
    NOTA: Il giorno 12 (RO), le celle sono adesive. Il giorno 13 (RO), le cellule si trovano sospese nel mezzo E. Se il mezzo cambia giallo dal giorno 12 (RO) al giorno 19 (RO), aggiornare il mezzo con il mezzo E.
  15. Il giorno 19 (RO), aggregare gli organoidi al centro del piatto facendo roteare delicatamente il piatto. Aspirare delicatamente il terreno E e rinfrescare il terreno con il mezzo F.
  16. Trasferire gli organoidi con Medium F in un nuovo piatto di sospensione.
  17. Cambia il terreno una volta alla settimana e seleziona gli organoidi per gli esperimenti.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La procedura per generare organoidi retinici è descritta nel nostro precedente studio15. Qui, mostriamo i risultati rappresentativi della microglia e della co-coltura di microglia e organoidi retinici.

Qui, dimostriamo ogni fase della differenziazione della microglia (Figura 1A). Il giorno 0 rappresenta la fase della coltura delle cellule staminali. Quindi, le cellule staminali sono state digerite e coltivate per la formazione di EB. Nei primi 4 giorni del processo, le cellule formeranno EB (Figura 1B). Successivamente, trasferiamo gli EB sospesi su piastre aderenti da 10 cm. Dopo circa 7 giorni, le cellule sono simili a quelle mostrate nella Figura 1C. Man mano che la coltura progredisce, le cellule aderenti secernono progenitori ematopoietici nel surnatante (Figura 1D). Questo processo richiede circa 45 giorni. A questo punto, le cellule possono essere raccolte dal surnatante e trasferite su piastre a 6 pozzetti. Nei prossimi 7 giorni, la microglia diventerà matura (Figura 1E) e pronta per ulteriori esperimenti.

Il giorno 12 della differenziazione degli organoidi retinici, le cellule aderenti vengono digerite in coltura in sospensione e il terreno E contenente microglia viene aggiunto agli organoidi retinici. Le microglia migreranno negli organoidi retinici. Al fine di osservare chiaramente la morfologia della microglia, abbiamo aggiunto la trasfezione EGFP-lentivirus nelle hESC, che ha fatto sì che la microglia differenziata esprimesse GFP avesse autofluorescenza (Verde) (Figura 2A-C). Abbiamo anche esaminato la struttura tissutale di organoidi retinici co-coltivati con microglia utilizzando il marcatore cellulare fotorecettore CRX e il marcatore cellulare microgliale IBA1 mediante saggio di immunofluorescenza in organoidi retinici co-coltivati con microglia dopo differenziazione per 50 giorni (Figura 2D).

figure-results-1
Figura 1: Diagramma schematico e cronologia delle cellule microgliali derivate da hESC. (A) Il protocollo inizia con lo scongelamento e il passaggio delle hESC in una piastra a 6 pozzetti. (B) Gli EB omogenei formati contenenti il mezzo A. (C) Gli EB vengono trasferiti in un piatto rivestito e i progenitori ematopoietici si formano nei giorni 4-56. (D,E) Il giorno 56, il surnatante con le cellule viene raccolto (D) e trasferito in una piastra a 6 pozzetti a bassa adesione per formare microglia il giorno 63 (E). Barra della scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Immagini rappresentative lungo la timeline durante la co-coltura di microglia e organoidi retinici. (A) Immagini rappresentative di cellule microgliali derivate da EGFP-hESC. (B) Co-coltura di microglia EGFP+ con organoidi retinici dopo differenziazione per 18 giorni. (C) Co-coltura di microglia EGFP+ con organoidi retinici dopo differenziazione per 30 giorni. Barra della scala: 300 μm. (D) CRX (marcatore cellulare fotorecettore; rosso) e IBA1 (marcatore microgliale; verde) sono stati utilizzati per rilevare la struttura tissutale di organoidi retinici co-coltivati con microglia dopo 50 giorni di differenziazione. DAPI (blu) colora il nucleo. Barra di scala: 30 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione dei media utilizzati in questo studio. I componenti necessari per preparare un volume di 500 mL di ciascun terreno sono elencati nella tabella. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A causa della limitata disponibilità della retina umana, la nostra attuale comprensione delle risposte infiammatorie retiniche proviene quasi da modelli animali. Per superare questa limitazione, gli organoidi retinici sono stati differenziati. Lo sviluppo di modelli di organoidi retinici è stata un'area di ricerca attiva, con l'obiettivo di ricapitolare la complessità della retina umana per la modellazione delle malattie e lo sviluppo terapeutico. Diversi studi hanno riportato la generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane 1,2,12,13. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli manca della presenza di microglia, che sono note per svolgere ruoli cruciali nello sviluppo della retina e nella patogenesi della malattia. Studi recenti hanno tentato di integrare le microglia in organoidi retinici o in modelli di organoidi cerebrali 16,17,18, ma il metodo dettagliato non è chiaro. Qui, forniamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la co-coltura di microglia con organoidi retinici nella fase iniziale, entrambi derivati dalla stessa linea hESC. Mentre alcuni studi hanno esplorato il ruolo della microglia nelle malattie della retina utilizzando modelli animali o sistemi di coltura cellulare 7,8,9, il modello di co-coltura qui presentato offre un sistema basato sull'uomo più fisiologicamente rilevante per studiare le interazioni microglia-retina e le loro implicazioni nella patogenesi della malattia.

Le fasi critiche sono lo stato cellulare delle cellule staminali umane e la differenziazione delle microglia e degli organoidi retinici. Le microglia e le RO devono essere differenziate passo dopo passo e i reagenti e la piastra corretti (piastra trattata con coltura tissutale o piastra in sospensione) devono essere utilizzati in fasi diverse. Questo modello può aiutarci a capire il processo di come le microglia contribuiscono all'insorgenza di malattie retiniche. Ha implicazioni significative per il futuro screening dei farmaci e le indagini sui meccanismi della malattia. Tuttavia, i metodi che attualmente pubblichiamo presentano ancora alcune limitazioni. A causa del prolungato periodo di differenziazione delle microglia e della mancanza di metodi di crioconservazione adeguati, dovremmo pianificare saggiamente il nostro tempo per la differenziazione delle microglia e degli organoidi retinici per la co-coltura.

Oltre agli organoidi retinici, riteniamo che l'integrazione delle cellule immunitarie in altri modelli di organoidi possa anche favorire lo sviluppo degli organoidi. Pertanto, testare altri sistemi di organoidi è fondamentale. L'integrazione di vari tipi di cellule e organoidi per formare organi completi rappresenta un modello promettente per il futuro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non sono a conoscenza di affiliazioni, affiliazioni, sovvenzioni o partecipazioni finanziarie che potrebbero influenzare l'obiettività di questo studio.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82101145) e dalla Beijing Natural Science Foundation (Z200014).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anticorpo anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02; diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anticorpo Anti-IBA1Abcamab5076; diluizione secondo le istruzioni del produttore
B27Life Tecnologie17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiological Industry04-002-1A
GelatinaSigmaG7041-100GGlutamax solido
Gibco35050-061
H9 linea cellulareWiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco 10828028
MatrixCorning356231
Sistemi RD M-CSF 216-MC-500 
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEMSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
Gibconeurobasale21103-049
Pen/strepGibco15140-122
Terreno di cellule staminali.Stemcell Technologies5990
TaurineSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-mercaptoethanolLife Technologies21985-023

References

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