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Articolo metodologico

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

1.7K visualizzazioni

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DOI:

10.3791/67020

⸱

27 settembre 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Abstract

Gli organelli cellulari, come i mitocondri e i lisosomi, mostrano strutture dinamiche. Nonostante la maggiore risoluzione della microscopia elettronica a trasmissione per l'analisi strutturale, la microscopia ottica è essenziale per la visualizzazione di organelli dinamici mediante marcatura specifica del bersaglio. Il seguente protocollo descrive un metodo che combina la microscopia ottica ed elettronica correlativa a due colori (CLEM) per osservare le interazioni tra mitocondri e lisosomi. In questo studio, i mitocondri sono stati marcati con mEosEM (Mito-mEosEM) e i lisosomi con TMEM192-V5-APEX2. I risultati ottenuti dalle immagini CLEM ci permettono di osservare i cambiamenti nelle interazioni tra mitocondri e lisosomi in condizioni di stress esterno. Il trattamento con bafilomicina (BFA), che inibisce la funzione lisosomiale, ha determinato un aumento del contatto tra mitocondri e lisosomi, portando alla formazione di mitocondri frammentati intrappolati all'interno dei lisosomi. Al contrario, il trattamento con U18666A, che inibisce l'esportazione di colesterolo dai lisosomi, ha causato che i lisosomi fossero circondati da mitocondri, indicando una forma distinta di interazione. Questo studio presenta un metodo efficace per osservare le interazioni tra mitocondri e lisosomi in cellule fisse. Inoltre, l'imaging CLEM con sonde a due colori offre un potente strumento per future indagini sulla dinamica degli organelli e sulle loro implicazioni per la funzione e la patologia cellulare.

Introduzione

I mitocondri e i lisosomi sono i principali organelli legati alla membrana che sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi cellulare. I mitocondri sono organelli cellulari altamente dinamici modulati da eventi di fissione e fusione1. In generale, i mitocondri sono indicati come la centrale elettrica della cellula e sono noti per il loro ruolo importante nella fosforilazione ossidativa, nella produzione di ATP e nello stoccaggio di metaboliti come il calcio2. Oltre al loro ruolo nel metabolismo energetico, i mitocondri sono coinvolti in una serie di altri processi di segnalazione cellulare, tra cui apoptosi3,4, segnalazione del calcio5,6 e metabolismo lipidico7,8. Allo stesso modo, i lisosomi sono organelli cellulari altamente dinamici che svolgono molteplici ruoli come centri di riciclaggio cellulare per mantenere la pulizia cellulare attraverso la degradazione delle proteine, l'autofagia, l'endocitosi e la fagocitosi9. Oltre al loro ruolo nella degradazione, i lisosomi svolgono anche ruoli nella fisiologia cellulare come il rilevamento dei nutrienti, l'omeostasi10, il metabolismo lipidico11 e la dedifferenziazione cellulare12.

Nonostante l'esistenza di numerosi studi sulle funzioni dei singoli organelli cellulari, la nostra recente ricerca si è concentrata sul crosstalk meno compreso tra mitocondri e lisosomi, che ha dimostrato di influenzare sia la fisiologia cellulare che la patologia. I contatti tra mitocondri e lisosomi sono stati osservati in vari tipi di cellule, tra cui cellule tumorali, neuroni e cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)13, e sono osservati principalmente in condizioni di stress cellulare o in malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson13,14 e malattia di Charcot-Marie-Tooth15. Il contatto tra mitocondri e lisosomi svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi metabolica attraverso lo scambio di ioni (ad esempio, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 tra i due organelli. Inoltre, il contatto tra mitocondri e lisosomi svolge un ruolo cruciale nel controllo di qualità degli organelli cellulari. Ad esempio, i mitocondri danneggiati possono essere presi di mira per la degradazione attraverso il processo di mitofagia, in cui vengono inghiottiti dagli autofagosomi e consegnati ai lisosomi per la degradazione. Di conseguenza, la rimozione dei mitocondri disfunzionali può essere facilitata prima che causino ulteriori danni alla cellula o ai mitocondri normali. Questa interazione tra mitocondri e lisosomi è fondamentale per mantenere l'omeostasi cellulare e prevenire l'accumulo di organelli disfunzionali. Pertanto, solo i mitocondri danneggiati vengono rimossi selettivamente, consentendo ai mitocondri sani di funzionare in modo ottimale all'interno della cellula.

La microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) è una tecnica di imaging che ha recentemente ricevuto attenzione come metodo di ricerca combinando i vantaggi della microscopia ottica (LM) e della microscopia elettronica (EM) per fornire informazioni strutturali dettagliate su scale diverse. In CLEM, un campione viene prima sottoposto a imaging utilizzando LM per identificare specifiche regioni di interesse, seguito da fasi di preparazione del campione EM come la fissazione, la disidratazione e l'inclusione. Lo stesso campione viene quindi osservato al microscopio elettronico. Sebbene i metodi CLEM su cellule vive siano stati riportati di recente19,20,21,22, rimane difficile combinare accuratamente immagini ottiche di campioni biologici altamente dinamici con immagini di microscopia elettronica di cellule fisse in un unico piano. Per organelli altamente dinamici come i mitocondri e i lisosomi, la loro localizzazione precisa può cambiare man mano che vengono osservati dal vivo al microscopio ottico e continuano a muoversi anche durante il breve tempo di ritardo richiesto per la fissazione.

Pertanto, in questo protocollo, sono stati impiegati due diversi tag molecolari che rimangono attivi anche all'interno di soluzioni fissative per visualizzare l'interazione tra mitocondri e lisosomi, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi metabolica attraverso lo scambio di ioni (ad esempio, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 tra questi organelli. I costrutti TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM sono stati utilizzati per osservare le interazioni tra mitocondri e lisosomi in cellule in coltura sia a livello EM che LM. Per i mitocondri, il tag mEosEM è stato scelto per la sua capacità di preservare il segnale di fluorescenza durante la preparazione del campione EM in una soluzione fissativa e OsO423. Per i lisosomi, il tag APEX2, una proteina di circa 28 kDa, è stato utilizzato per studiare la localizzazione di una proteina specifica sia a livello EM che LM24. In presenza di perossido di idrogeno, il substrato di APEX2, Amplex-Red, forma un polimero insolubile che può essere osservato al microscopio confocale nella posizione target. In questo protocollo, il CLEM a due colori è stato utilizzato per visualizzare la struttura delle interazioni tra lisosomi e mitocondri in cellule fisse.

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Protocollo

Il flusso di lavoro passo-passo per la preparazione del campione è mostrato in Figura 1.

1. Coltura cellulare e trasfezione

  1. Coltura di cellule HeLa a una densità di 1 × 105 cellule in piastre di coltura con fondo a griglia in vetro da 35 mm contenenti DMEM con il 10% di siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina e streptomicina a 37 °C.
  2. Il giorno dopo la semina delle cellule, co-trasfettare le cellule al 30%-40% di confluenza con i plasmidi TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM utilizzando il reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore (1 μg ciascuno di DNA plasmidico TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM con 3 μL di reagente di trasfezione). Dopo la trasfezione, trattare le cellule con DMSO o U18666A (2 μg/mL) e Bafilomicina A1 (100 nM) per 18 ore.

2. Imaging microscopico confocale

  1. Dopo aver trattato le cellule con bafilomicina e U18666A per 18 ore, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere immediatamente 250 μl di soluzione fissativa calda (30 °C-37 °C) (2,5% glutaraldeide e 2% paraformaldeide in soluzione di cacodilato di sodio 0,1 M [pH 7,0]) mediante pipettaggio delicato. Rimuovere immediatamente il fissativo, sostituirlo con 1,5 ml di fissativo fresco e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Quindi, lavare le cellule per 3 x 10 minuti in 1 mL di tampone di cacodilato di sodio 0,1 M ghiacciato.
    NOTA: I fumi di aldeidi sono tossici. Tutti gli esperimenti devono essere condotti in una cappa aspirante ventilata.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione fredda di glicina 20 mM per estinguere l'aldeide e incubare su ghiaccio per 10 min. Lavare 3 x 10 min in tampone freddo 0,1 M di cacodilato di sodio.
  3. Preparare una soluzione fresca contenente 300 μM di Amplex-Red aggiungendo 10 mM di H2O2 a una soluzione di cacodilato 0,1 M. Aggiungere 500 μl di soluzione Amplex-Red alla piastra del campione e incubare per 5 minuti con ghiaccio.
  4. Rimuovere la soluzione Amplex-Red e risciacquare 3 x 10 minuti con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M.
  5. Dopo la colorazione con Amplex-Red, utilizzare un microscopio confocale per visualizzare l'area intorno alle cellule di interesse in modalità di scansione a tessere 3 x 3. Cattura sia il contrasto interferenziale differenziale (DIC) che il segnale di fluorescenza per identificare e registrare la griglia e le lettere sulla parabola utilizzando un obiettivo 40x (o 60x).
    NOTA: Queste immagini panoramiche fungono da mappa per identificare specifiche cellule bersaglio nei campioni incorporati in plastica.
  6. Immagine delle cellule target ad alto ingrandimento utilizzando un obiettivo 40x (o 60x) e acquisizione di un'immagine Z-stack.
    NOTA: Questa immagine ad alto ingrandimento viene sovrapposta a un'immagine del microscopio elettronico per creare un'immagine correlata.

3. Preparazione del campione per il blocco EM

  1. Dopo l'imaging LM, aggiungere 1 mL di tetrossido di osmio ridotto all'1% (preparato contenendo il 3% di ferrocianuro di potassio in tampone cacodilato 0,3 M con un volume uguale di tetrossido acquoso di osmio al 2%) per la postfissazione a 4 °C per 1 ora, quindi risciacquare per 3 x 10 minuti con acqua distillata a 4 °C.
    NOTA: I fumi di tetrossido di osmio sono tossici. Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in una cappa aspirante ventilata.
  2. Sciacquare 3 x 10 minuti con acqua distillata a temperatura ambiente, quindi disidratare in una serie di etanolo graduato per 15 minuti ogni volta (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%) a temperatura ambiente.
  3. Mescolare l'etanolo con la resina epossidica in rapporti di volume di 3:1, 1:1 e 1:3, preparando un totale di 300 μl di ciascuna miscela. Versare ogni resina epossidica nel piatto, lasciandolo incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Quindi, utilizzare la resina epossidica al 100% per l'impregnazione notturna.
  4. Preparare la capsula di inclusione o la provetta per PCR riempiendola con resina epossidica fresca, posizionare la provetta o la capsula capovolta sulla regione di interesse e metterla in forno a 60 °C per 48 ore per polimerizzare.

4. Sezionamento e imaging TEM

  1. Dopo che la resina epossidica si è completamente polimerizzata, separare il vetro inferiore dal blocco polimerico immergendolo in azoto liquido.
  2. Posizionare il blocco del campione nel portacampioni dell'ultramicrotomo e posizionarlo nel blocco di rifilatura. Usa una lama di rasoio per tagliare la resina in una forma trapezoidale o rettangolare attorno all'oggetto di interesse.
  3. Posizionare il blocco del campione rifilato nel portacampioni e regolare la lama diamantata. Assicurarsi che il bordo anteriore del blocco campione sia perfettamente parallelo al bordo della lama diamantata.
  4. Utilizzando un ultramicrotomo, tagliare sezioni ultrasottili a circa 60-70 nm dalle cellule piatte incorporate. Raccogli le sezioni seriali su una griglia a fessura rivestita di formvar e asciugale su una piastra calda.
  5. Colorare la sezione con la macchia di contrasto per 2 minuti e il citrato di piombo per 1 minuto.
  6. Posizionare la griglia nel portacampioni TEM per l'osservazione. Identificare la cellula target di interesse in base all'immagine DIC del microscopio ottico. Immagine dell'intera area della cella utilizzando immagini affiancate e sovrapposte con ingrandimento di 1.700x.

5. Stitching di immagini utilizzando imageJ Fiji.

  1. Per iniziare lo stitching delle immagini, avvia imageJ Fiji25 e fai clic su File | Nuovo | TrakEM2 (vuoto) | Seleziona la cartella di archiviazione per creare un nuovo progetto TrakEM226 (Figura 2A1).
  2. Aprire il set di dati dell'immagine del riquadro trascinando e rilasciando i dati dell'immagine del riquadro non elaborati nell'area di lavoro (Figura 2A2).
  3. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Allinea | Monta tutte le immagini in questo livello | elastico (corrispondenze di blocchi non lineari), quindi fare clic su OK per accettare i valori predefiniti dei parametri rimanenti (Figura 2A3).
  4. Fare clic con il tasto destro del mouse e selezionare Esporta | Crea un'immagine piatta per creare un'immagine cucita, quindi fai clic su File | Salva con nome per salvare l'immagine.

6. Ridimensionamento dell'immagine a fluorescenza

  1. Aprire il software di ingrandimento delle foto (vedere la tabella dei materiali). Clicca su File | Apri e seleziona l'immagine a fluorescenza.
  2. Inserisci la larghezza e l'altezza in modo che abbiano le stesse dimensioni dell'immagine del microscopio elettronico e seleziona l'algoritmo da applicare nel metodo di ridimensionamento (Figura 2B1).
  3. Clicca su File | Salva con nome per salvare l'immagine ridimensionata.

7. Registrazione di immagini basate su punti di riferimento con il plugin Big Warp

  1. Apri ImageJ Fiji e trascina e rilascia il micrografo a fluorescenza ridimensionato (immagine FM) e il micrografo elettronico cucito (immagine EM).
  2. Clicca su Plugin | Visualizzatore BigData | Big Wrap per avviare la registrazione, quindi fare clic sul menu a discesa per selezionare l'immagine FM come immagine in movimento e l'immagine EM come immagine di destinazione (Figura 2C1).
    NOTA: Ogni immagine FM ed EM avrà tre nuove finestre popup (BigWrap moving image, BigWrap fixed image e Landmarks) per visualizzare i punti di riferimento.
  3. Confrontare le immagini FM ed EM utilizzando funzioni quali lo zoom (rotellina del mouse), la rotazione dell'immagine (spostando il mouse tenendo premuto il pulsante sinistro) e lo spostamento (spostando il mouse tenendo premuto il pulsante destro), quindi premere la barra spaziatrice sulla tastiera per attivare la modalità Punto di riferimento e premere il pulsante sinistro del mouse per contrassegnare almeno tre punti di riferimento identificati nelle immagini FM ed EM ( Figura 2C2, punti rosa e freccia rossa).
  4. Dopo aver contrassegnato tutti i punti di riferimento identificati, vai su File | Esportazione di immagini in movimento | OK e apparirà una nuova finestra popup con l'immagine FM trasformata (Figura 2C3).
    NOTA: La finestra popup appena creata è un'immagine FM trasformata in base al punto di riferimento. Rivedere l'allineamento e apportare le modifiche, se necessario, aggiungendo o modificando i punti di riferimento e ricalcolando la trasformazione.
  5. Clicca su File | Salva con nome per salvare l'immagine FM trasformata.

8. Sovrapposizione di immagini CLEM

  1. In ImageJ, trascinare e rilasciare l'immagine FM trasformata e l'immagine EM unita.
  2. Clicca sull'immagine | Tipologia | Colore a 8 bit per impostare lo stesso tipo di immagine sia per le immagini LM che EM (Figura 2D1).
    NOTA: L'immagine EM deve essere convertita due volte nel seguente ordine: 8 bit -> Colore RGB -> Colore a 8 bit.
  3. Clicca sull'immagine | Colore >| Unisci canali per combinare le immagini in un'immagine composita selezionando le immagini FM ed EM dal menu a discesa, rispettivamente (Figura 2D2).
  4. Clicca su File | Salva con nome per salvare l'immagine CLEM.

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Risultati

Per visualizzare le interazioni tra mitocondri e lisosomi utilizzando questo protocollo CLEM a due colori, abbiamo impiegato Mito-mEosEM e TMEM192-V5-APEX2. Le cellule fissate sono state innanzitutto analizzate mediante microscopia ottica, seguita da campionamento e imaging al microscopio elettronico. I risultati delle immagini correlate sono mostrati in Figura 3A,B e Figura 4A. Seguendo il protocollo descritto in precedenza, abbiamo verificato ...

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Discussione

Questo protocollo descrive CLEM a due colori per osservare l'interazione di mitocondri e lisosomi in cellule fissate utilizzando tag mEosEM e APEX2 geneticamente codificati. Negli ultimi decenni, i progressi della microscopia hanno notevolmente migliorato la capacità di osservare i cambiamenti nelle reti di organelli32,33 e lo studio delle interazioni degli organelli è diventato sempre più interessante. La microscopia a super-risoluzione è stata utilizzata per os...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal programma di ricerca di base KBRI attraverso il Korea Brain Research Institute finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC (24-BR-01-03). I plasmidi TMEM192-V5-APEX2 sono stati gentilmente forniti da Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). I dati TEM sono stati acquisiti presso le strutture di base della ricerca cerebrale nel KBRI.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sostanze chimiche e reagenti
microscopia elettronicaglutaraldeide16200fumi di aldeide sono estremamente tossici. Utilizzare solo in cappa aspirante.
Soluzione di perossido di idrogeno al 30%Merck107210
Soluzione di paraformaldeide al 4%BiosesangPC2031-100-00sono estremamente tossici. Utilizzare solo in cappa aspirante.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Scienze della microscopia elettronica14120
EtanoloMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Trasfezione plasmidica
GlicinaSIGMAG8898
Citrato di piombo 3%Scienze della microscopia elettronica22410
Tetrossido di osmio 4 % soluzione acquosa Microscopiaelettronica Scienze16320Molto tossico. Utilizzare solo in cappa aspirante.
Esacianoferrato di potassio (II) triidratoSIGMAP3289
Sodio cacodilato triidratoSigma-AldrichC0250-500G
Uranile acetatoMicroscopia elettronica Scienze22400
UranyLess EM colorante MicroscopiaelettronicaScienze 22409
Costruzione plasmidi
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um filtro per siringaSartorius16534
35 mm Piatto vetrino coprioggetti grigliatoMattekP35G-1.5-14-CGRD
Capsule per inclusione BEEMTed Pella130
Formvar Supported Griglia in rame a fessura singolaTed Pella01705
Coltello diamantatoDiATOMEDU4530
Ultra-microtomoLeicaARTOS 3D
Microscopi
Microscopia confocale invertitaNikonA1 Rsi/Ti-E
Microscopia elettronica a trasmissioneFEITecnai G2
Software e Algoritmi
Fiji/Image JNIH / open sourcehttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp pacchetto softwareNIH / open sourcehttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Software alternativo
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 resize : https://www.on1.com/products/resize-ai/
25% Scienze di I I fumi di ldeide

Riferimenti

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Ristampe e permessi

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Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi
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