Articolo metodologico

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

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DOI:

10.3791/67020

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27 settembre 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Abstract

Gli organelli cellulari, come i mitocondri e i lisosomi, mostrano strutture dinamiche. Nonostante la maggiore risoluzione della microscopia elettronica a trasmissione per l'analisi strutturale, la microscopia ottica è essenziale per la visualizzazione di organelli dinamici mediante marcatura specifica del bersaglio. Il seguente protocollo descrive un metodo che combina la microscopia ottica ed elettronica correlativa a due colori (CLEM) per osservare le interazioni tra mitocondri e lisosomi. In questo studio, i mitocondri sono stati marcati con mEosEM (Mito-mEosEM) e i lisosomi con TMEM192-V5-APEX2. I risultati ottenuti dalle immagini CLEM ci permettono di osservare i cambiamenti nelle interazioni tra mitocondri e lisosomi in condizioni di stress esterno. Il trattamento con bafilomicina (BFA), che inibisce la funzione lisosomiale, ha determinato un aumento del contatto tra mitocondri e lisosomi, portando alla formazione di mitocondri frammentati intrappolati all'interno dei lisosomi. Al contrario, il trattamento con U18666A, che inibisce l'esportazione di colesterolo dai lisosomi, ha causato che i lisosomi fossero circondati da mitocondri, indicando una forma distinta di interazione. Questo studio presenta un metodo efficace per osservare le interazioni tra mitocondri e lisosomi in cellule fisse. Inoltre, l'imaging CLEM con sonde a due colori offre un potente strumento per future indagini sulla dinamica degli organelli e sulle loro implicazioni per la funzione e la patologia cellulare.

Introduzione

I mitocondri e i lisosomi sono i principali organelli legati alla membrana che sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi cellulare. I mitocondri sono organelli cellulari altamente dinamici modulati da eventi di fissione e fusione1. In generale, i mitocondri sono indicati come la centrale elettrica della cellula e sono noti per il loro ruolo importante nella fosforilazione ossidativa, nella produzione di ATP e nello stoccaggio di metaboliti come il calcio2. Oltre al loro ruolo nel metabolismo energetico, i mitocondri sono coinvolti in una serie di altri processi di segnalazione cellulare, tra cui apoptosi3,4, segnalazione del calcio5,6 e metabolismo lipidico7,8. Allo stesso modo, i lisosomi sono organelli cellulari altamente dinamici che svolgono molteplici ruoli come centri di riciclaggio cellulare per mantenere la pulizia cellulare attraverso la degradazione delle proteine, l'autofagia, l'endocitosi e la fagocitosi9. Oltre al loro ruolo nella degradazione, i lisosomi svolgono anche ruoli nella fisiologia cellulare come il rilevamento dei nutrienti, l'omeostasi10, il metabolismo lipidico11 e la dedifferenziazione cellulare12.

Nonostante l'esistenza di numerosi studi sulle funzioni dei singoli organelli cellulari, la nostra recente ricerca si è concentrata sul crosstalk meno compreso tra mitocondri e lisosomi, che ha dimostrato di influenzare sia la fisiologia cellulare che la patologia. I contatti tra mitocondri e lisosomi sono stati osservati in vari tipi di cellule, tra cui cellule tumorali, neuroni e cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)13, e sono osservati principalmente in condizioni di stress cellulare o in malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson13,14 e malattia di Charcot-Marie-Tooth15. Il contatto tra mitocondri e lisosomi svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi metabolica attraverso lo scambio di ioni (ad esempio, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 tra i due organelli. Inoltre, il contatto tra mitocondri e lisosomi svolge un ruolo cruciale nel controllo di qualità degli organelli cellulari. Ad esempio, i mitocondri danneggiati possono essere presi di mira per la degradazione attraverso il processo di mitofagia, in cui vengono inghiottiti dagli autofagosomi e consegnati ai lisosomi per la degradazione. Di conseguenza, la rimozione dei mitocondri disfunzionali può essere facilitata prima che causino ulteriori danni alla cellula o ai mitocondri normali. Questa interazione tra mitocondri e lisosomi è fondamentale per mantenere l'omeostasi cellulare e prevenire l'accumulo di organelli disfunzionali. Pertanto, solo i mitocondri danneggiati vengono rimossi selettivamente, consentendo ai mitocondri sani di funzionare in modo ottimale all'interno della cellula.

La microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) è una tecnica di imaging che ha recentemente ricevuto attenzione come metodo di ricerca combinando i vantaggi della microscopia ottica (LM) e della microscopia elettronica (EM) per fornire informazioni strutturali dettagliate su scale diverse. In CLEM, un campione viene prima sottoposto a imaging utilizzando LM per identificare specifiche regioni di interesse, seguito da fasi di preparazione del campione EM come la fissazione, la disidratazione e l'inclusione. Lo stesso campione viene quindi osservato al microscopio elettronico. Sebbene i metodi CLEM su cellule vive siano stati riportati di recente19,20,21,22, rimane difficile combinare accuratamente immagini ottiche di campioni biologici altamente dinamici con immagini di microscopia elettronica di cellule fisse in un unico piano. Per organelli altamente dinamici come i mitocondri e i lisosomi, la loro localizzazione precisa può cambiare man mano che vengono osservati dal vivo al microscopio ottico e continuano a muoversi anche durante il breve tempo di ritardo richiesto per la fissazione.

Pertanto, in questo protocollo, sono stati impiegati due diversi tag molecolari che rimangono attivi anche all'interno di soluzioni fissative per visualizzare l'interazione tra mitocondri e lisosomi, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi metabolica attraverso lo scambio di ioni (ad esempio, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 tra questi organelli. I costrutti TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM sono stati utilizzati per osservare le interazioni tra mitocondri e lisosomi in cellule in coltura sia a livello EM che LM. Per i mitocondri, il tag mEosEM è stato scelto per la sua capacità di preservare il segnale di fluorescenza durante la preparazione del campione EM in una soluzione fissativa e OsO423. Per i lisosomi, il tag APEX2, una proteina di circa 28 kDa, è stato utilizzato per studiare la localizzazione di una proteina specifica sia a livello EM che LM24. In presenza di perossido di idrogeno, il substrato di APEX2, Amplex-Red, forma un polimero insolubile che può essere osservato al microscopio confocale nella posizione target. In questo protocollo, il CLEM a due colori è stato utilizzato per visualizzare la struttura delle interazioni tra lisosomi e mitocondri in cellule fisse.

Protocollo

Il flusso di lavoro passo-passo per la preparazione del campione è mostrato in Figura 1.

1. Coltura cellulare e trasfezione

  1. Coltura di cellule HeLa a una densità di 1 × 105 cellule in piastre di coltura con fondo a griglia in vetro da 35 mm contenenti DMEM con il 10% di siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina e streptomicina a 37 °C.
  2. Il giorno dopo la semina delle cellule, co-trasfettare le cellule al 30%-40% di confluenza con i plasmidi TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM utilizzando il reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore (1 μg ciascuno di DNA plasmidico TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM con 3 μL di reagente di trasfezione). Dopo la trasfezione, trattare le cellule con DMSO o U18666A (2 μg/mL) e Bafilomicina A1 (100 nM) per 18 ore.

2. Imaging microscopico confocale

  1. Dopo aver trattato le cellule con bafilomicina e U18666A per 18 ore, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere immediatamente 250 μl di soluzione fissativa calda (30 °C-37 °C) (2,5% glutaraldeide e 2% paraformaldeide in soluzione di cacodilato di sodio 0,1 M [pH 7,0]) mediante pipettaggio delicato. Rimuovere immediatamente il fissativo, sostituirlo con 1,5 ml di fissativo fresco e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Quindi, lavare le cellule per 3 x 10 minuti in 1 mL di tampone di cacodilato di sodio 0,1 M ghiacciato.
    NOTA: I fumi di aldeidi sono tossici. Tutti gli esperimenti devono essere condotti in una cappa aspirante ventilata.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione fredda di glicina 20 mM per estinguere l'aldeide e incubare su ghiaccio per 10 min. Lavare 3 x 10 min in tampone freddo 0,1 M di cacodilato di sodio.
  3. Preparare una soluzione fresca contenente 300 μM di Amplex-Red aggiungendo 10 mM di H2O2 a una soluzione di cacodilato 0,1 M. Aggiungere 500 μl di soluzione Amplex-Red alla piastra del campione e incubare per 5 minuti con ghiaccio.
  4. Rimuovere la soluzione Amplex-Red e risciacquare 3 x 10 minuti con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M.
  5. Dopo la colorazione con Amplex-Red, utilizzare un microscopio confocale per visualizzare l'area intorno alle cellule di interesse in modalità di scansione a tessere 3 x 3. Cattura sia il contrasto interferenziale differenziale (DIC) che il segnale di fluorescenza per identificare e registrare la griglia e le lettere sulla parabola utilizzando un obiettivo 40x (o 60x).
    NOTA: Queste immagini panoramiche fungono da mappa per identificare specifiche cellule bersaglio nei campioni incorporati in plastica.
  6. Immagine delle cellule target ad alto ingrandimento utilizzando un obiettivo 40x (o 60x) e acquisizione di un'immagine Z-stack.
    NOTA: Questa immagine ad alto ingrandimento viene sovrapposta a un'immagine del microscopio elettronico per creare un'immagine correlata.

3. Preparazione del campione per il blocco EM

  1. Dopo l'imaging LM, aggiungere 1 mL di tetrossido di osmio ridotto all'1% (preparato contenendo il 3% di ferrocianuro di potassio in tampone cacodilato 0,3 M con un volume uguale di tetrossido acquoso di osmio al 2%) per la postfissazione a 4 °C per 1 ora, quindi risciacquare per 3 x 10 minuti con acqua distillata a 4 °C.
    NOTA: I fumi di tetrossido di osmio sono tossici. Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in una cappa aspirante ventilata.
  2. Sciacquare 3 x 10 minuti con acqua distillata a temperatura ambiente, quindi disidratare in una serie di etanolo graduato per 15 minuti ogni volta (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%) a temperatura ambiente.
  3. Mescolare l'etanolo con la resina epossidica in rapporti di volume di 3:1, 1:1 e 1:3, preparando un totale di 300 μl di ciascuna miscela. Versare ogni resina epossidica nel piatto, lasciandolo incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Quindi, utilizzare la resina epossidica al 100% per l'impregnazione notturna.
  4. Preparare la capsula di inclusione o la provetta per PCR riempiendola con resina epossidica fresca, posizionare la provetta o la capsula capovolta sulla regione di interesse e metterla in forno a 60 °C per 48 ore per polimerizzare.

4. Sezionamento e imaging TEM

  1. Dopo che la resina epossidica si è completamente polimerizzata, separare il vetro inferiore dal blocco polimerico immergendolo in azoto liquido.
  2. Posizionare il blocco del campione nel portacampioni dell'ultramicrotomo e posizionarlo nel blocco di rifilatura. Usa una lama di rasoio per tagliare la resina in una forma trapezoidale o rettangolare attorno all'oggetto di interesse.
  3. Posizionare il blocco del campione rifilato nel portacampioni e regolare la lama diamantata. Assicurarsi che il bordo anteriore del blocco campione sia perfettamente parallelo al bordo della lama diamantata.
  4. Utilizzando un ultramicrotomo, tagliare sezioni ultrasottili a circa 60-70 nm dalle cellule piatte incorporate. Raccogli le sezioni seriali su una griglia a fessura rivestita di formvar e asciugale su una piastra calda.
  5. Colorare la sezione con la macchia di contrasto per 2 minuti e il citrato di piombo per 1 minuto.
  6. Posizionare la griglia nel portacampioni TEM per l'osservazione. Identificare la cellula target di interesse in base all'immagine DIC del microscopio ottico. Immagine dell'intera area della cella utilizzando immagini affiancate e sovrapposte con ingrandimento di 1.700x.

5. Stitching di immagini utilizzando imageJ Fiji.

  1. Per iniziare lo stitching delle immagini, avvia imageJ Fiji25 e fai clic su File | Nuovo | TrakEM2 (vuoto) | Seleziona la cartella di archiviazione per creare un nuovo progetto TrakEM226 (Figura 2A1).
  2. Aprire il set di dati dell'immagine del riquadro trascinando e rilasciando i dati dell'immagine del riquadro non elaborati nell'area di lavoro (Figura 2A2).
  3. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Allinea | Monta tutte le immagini in questo livello | elastico (corrispondenze di blocchi non lineari), quindi fare clic su OK per accettare i valori predefiniti dei parametri rimanenti (Figura 2A3).
  4. Fare clic con il tasto destro del mouse e selezionare Esporta | Crea un'immagine piatta per creare un'immagine cucita, quindi fai clic su File | Salva con nome per salvare l'immagine.

6. Ridimensionamento dell'immagine a fluorescenza

  1. Aprire il software di ingrandimento delle foto (vedere la tabella dei materiali). Clicca su File | Apri e seleziona l'immagine a fluorescenza.
  2. Inserisci la larghezza e l'altezza in modo che abbiano le stesse dimensioni dell'immagine del microscopio elettronico e seleziona l'algoritmo da applicare nel metodo di ridimensionamento (Figura 2B1).
  3. Clicca su File | Salva con nome per salvare l'immagine ridimensionata.

7. Registrazione di immagini basate su punti di riferimento con il plugin Big Warp

  1. Apri ImageJ Fiji e trascina e rilascia il micrografo a fluorescenza ridimensionato (immagine FM) e il micrografo elettronico cucito (immagine EM).
  2. Clicca su Plugin | Visualizzatore BigData | Big Wrap per avviare la registrazione, quindi fare clic sul menu a discesa per selezionare l'immagine FM come immagine in movimento e l'immagine EM come immagine di destinazione (Figura 2C1).
    NOTA: Ogni immagine FM ed EM avrà tre nuove finestre popup (BigWrap moving image, BigWrap fixed image e Landmarks) per visualizzare i punti di riferimento.
  3. Confrontare le immagini FM ed EM utilizzando funzioni quali lo zoom (rotellina del mouse), la rotazione dell'immagine (spostando il mouse tenendo premuto il pulsante sinistro) e lo spostamento (spostando il mouse tenendo premuto il pulsante destro), quindi premere la barra spaziatrice sulla tastiera per attivare la modalità Punto di riferimento e premere il pulsante sinistro del mouse per contrassegnare almeno tre punti di riferimento identificati nelle immagini FM ed EM ( Figura 2C2, punti rosa e freccia rossa).
  4. Dopo aver contrassegnato tutti i punti di riferimento identificati, vai su File | Esportazione di immagini in movimento | OK e apparirà una nuova finestra popup con l'immagine FM trasformata (Figura 2C3).
    NOTA: La finestra popup appena creata è un'immagine FM trasformata in base al punto di riferimento. Rivedere l'allineamento e apportare le modifiche, se necessario, aggiungendo o modificando i punti di riferimento e ricalcolando la trasformazione.
  5. Clicca su File | Salva con nome per salvare l'immagine FM trasformata.

8. Sovrapposizione di immagini CLEM

  1. In ImageJ, trascinare e rilasciare l'immagine FM trasformata e l'immagine EM unita.
  2. Clicca sull'immagine | Tipologia | Colore a 8 bit per impostare lo stesso tipo di immagine sia per le immagini LM che EM (Figura 2D1).
    NOTA: L'immagine EM deve essere convertita due volte nel seguente ordine: 8 bit -> Colore RGB -> Colore a 8 bit.
  3. Clicca sull'immagine | Colore >| Unisci canali per combinare le immagini in un'immagine composita selezionando le immagini FM ed EM dal menu a discesa, rispettivamente (Figura 2D2).
  4. Clicca su File | Salva con nome per salvare l'immagine CLEM.

Risultati

Per visualizzare le interazioni tra mitocondri e lisosomi utilizzando questo protocollo CLEM a due colori, abbiamo impiegato Mito-mEosEM e TMEM192-V5-APEX2. Le cellule fissate sono state innanzitutto analizzate mediante microscopia ottica, seguita da campionamento e imaging al microscopio elettronico. I risultati delle immagini correlate sono mostrati in Figura 3A,B e Figura 4A. Seguendo il protocollo descritto in precedenza, abbiamo verificato se fosse possibile osservare i cambiamenti nell'interazione tra mitocondri e lisosomi in condizioni di stress esterno.

Il trattamento delle cellule con BFA, un inibitore della V-ATPasi lisosomiale, inibisce l'autofagia, provocando una riduzione della qualità mitocondriale e un aumento delle interazioni tra mitocondri e lisosomi27. In cellule trattate con BFA, abbiamo osservato mitocondri intrappolati all'interno dei lisosomi (Figura 3B), rispetto a cellule di controllo trattate con DMSO (Figura 3A). Sebbene sia difficile distinguere nei micrografici elettronici da soli i mitocondri elettrondensi frammentati e i compartimenti cellulari all'interno dei lisosomi, essi possono essere facilmente distinti nelle immagini correlate (Figura 3B1,B2). La struttura di alterazione mitocondriale (Figura 3A1,A2; freccia blu) osservata nei mitocondri di cellule trattate con DMSO non è correlata ai lisosomi, e la struttura nell'immagine di fluorescenza che sembra essere un lisosoma intrappolato all'interno di un grande mitocondrio è in realtà una struttura in cui il mitocondrio circonda il lisosoma (Figura 3A2; freccia rossa).

Successivamente, abbiamo testato gli effetti dell'U18666A (2 µg/mL per 18 h), un noto inibitore di NPC1 che blocca il movimento del colesterolo fuori dai lisosomi28. Le cellule trattate con U18666A hanno mostrato un aumento dell'interazione diretta tra mitocondri e lisosomi (Figura 4). Inoltre, i contatti tra mitocondri e lisosomi nei campioni trattati con U18666A erano diversi rispetto a quelli nei campioni trattati con BFA. In cellule HeLa trattate con BFA, il mitocondrio frammentato è completamente intrappolato nel lisosoma, una morfologia di mitofagia precedentemente descritta12,29. Tuttavia, nel gruppo trattato con U18666A, alcuni lisosomi positivi per TMEM192 sembrano essere inglobati dal mitocondrio (Figura 4D,E)30,31.

Flusso di lavoro per la preparazione e l'analisi delle cellule: transfezione, marcatura con APEX2, microscopia confocale, analisi con microscopia elettronica a trasmissione.
Figura 1: Panoramica schematica della CLEM basata su microscopia elettronica a trasmissione mediante l'uso di una sonda fluorescente con marcatura genetica. (A) Le cellule HeLa sono state coltivate in piatti per colture con fondo a griglia in vetro da 35 mm. (B) Le cellule fissate sono state marcate con Amplex-Red tramite la proteina APEX2. (C) Le immagini di fluorescenza sono state acquisite mediante un microscopio confocale. È stata utilizzata una piattaforma motorizzata e la funzione di scansione a tasselli per acquisire un'immagine panoramica generale e un'immagine ad alta risoluzione della cellula bersaglio. L'immagine più ampia funge da mappa di navigazione per identificare la posizione della cellula bersaglio nei campioni inclusi in plastica. (D) Proseguire con la post-fissazione e l'inclusione dopo disidratazione. (E) L'inclusione è stata effettuata utilizzando un tubo PCR o una capsula BEEM riempiti con resina, posizionati sulla cellula bersaglio presente sul coverslip. (F) Dopo la polimerizzazione della resina, la rimozione del coverslip ha lasciato una traccia della griglia impressa sulla superficie inferiore del blocco. (G) La cellula bersaglio è stata identificata grazie al modello impresso sulla superficie della resina, e la cellula bersaglio è stata sezionata a uno spessore di circa 60 nm mediante ultramicrotomo. (H) Le sezioni seriali sono state raccolte su griglie di rame con slot rivestite in formvar. (I) Le griglie sono state analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Abbreviazioni: TEM = microscopia elettronica a trasmissione; CLEM = microscopia correlative di luce ed elettroni; ROI = regione di interesse. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma di elaborazione delle immagini: assemblaggio delle immagini, ridimensionamento della fluorescenza, registrazione dei punti di riferimento, sovrapposizione CLEM.
Figura 2: Elaborazione delle immagini e generazione dell'immagine CLEM utilizzando ImageJ Fiji. (A1) Interfaccia grafica principale di Fiji e TrakEM2. (A2) Importazione del set di dati di immagini a riquadri acquisito con TEM a 1.700x di ingrandimento. (A3) Allineamento ed esempio di un'immagine assemblata mediante il metodo di allineamento delle immagini di TrakEM2. (B1-B3) Conversione di una microfotografia ottica di piccole dimensioni in immagini di grandi dimensioni e alta qualità utilizzando un software di ingrandimento fotografico. (C1-C3) Flusso di lavoro per la registrazione tra immagini di microscopia ottica e immagini di microscopia elettronica mediante il software del plug-in Big Wrap. (D1-D3) Processo di sovrapposizione di un'immagine FM trasformata e di un'immagine EM per sintetizzare un'immagine microscopica correlata. Abbreviazioni: TEM = microscopia elettronica a trasmissione; CLEM = microscopia correlative tra luce ed elettroni; FM = microscopia a fluorescenza. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma di microscopia confocale, TEM e CLEM; localizzazione di mitocondri e lisosomi; analisi della struttura cellulare.
Figura 3: Immagini CLEM dei siti di contatto mitocondriali e lisosomiali trattati o non trattati con bafilomicina A1. Cellule HeLa sono state co-trasfettate con Mito-mEosEM (mitocondri; verde) e TMEM192-APEX2 (lisosomi; rosso) e successivamente colorate con il colorante Amplex-Red. (A) Cellule HeLa non trattate. Le informazioni molecolari ottenute dal segnale fluorescente (pannello sinistro) e le informazioni ultrastrutturali ottenute mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (pannello centrale) sono state sovrapposte (pannello destro) in base al segnale e alla morfologia mitocondriali. (A1,A2) In cellule HeLa non trattate, la membrana interna mitocondriale risulta interrotta (freccia blu), oppure i mitocondri e i lisosomi sono molto vicini tra loro (freccia rossa). (B1,B2) In cellule HeLa trattate con bafilomicina A1 per 18 h, è stata osservata mitofagia, caratterizzata dall’intrappolamento di mitocondri non degradati all’interno dei lisosomi (freccia verde). Barre della scala = 1 µm (A1,A2,B1,B2). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Immagini al microscopio confocale, TEM e CLEM di mitocondri (verde) e lisosomi (rosso) in cellule.
Figura 4: Immagini CLEM dei siti di contatto tra mitocondri e lisosomi trattati con U18666A (A) Immagini CLEM a due colori di cellule HeLa esprimenti Mito-mEosEM e TMEM192-V5-APEX2 (marcate con Amplex-Red) sottoposte a trattamento con U18666A (2 µg/mL per 18 h). (A1,A2) Le frecce rosse indicano i siti di contatto tra mitocondri e lisosomi. Barre della scala = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) La freccia rossa indica l'aspetto di una fusione interorganellare tra mitocondri e lisosomi ottenuta mediante immagini seriali. Barre della scala = 500 nm (B1-B3). Barre della scala = 1 µm (C1-C3). (D,E) Immagini TEM ad alta magnificazione dei siti di fusione tra mitocondri e lisosomi. Vengono utilizzati colori fittizi per distinguere il mitocondrio (verde) dal lisosoma (rosso). Barre della scala = 100 nm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive CLEM a due colori per osservare l'interazione di mitocondri e lisosomi in cellule fissate utilizzando tag mEosEM e APEX2 geneticamente codificati. Negli ultimi decenni, i progressi della microscopia hanno notevolmente migliorato la capacità di osservare i cambiamenti nelle reti di organelli32,33 e lo studio delle interazioni degli organelli è diventato sempre più interessante. La microscopia a super-risoluzione è stata utilizzata per osservare i cambiamenti nei contatti altamente dinamici tra mitocondri e lisosomi 34,35,36. Tuttavia, nonostante l'uso della microscopia a super-risoluzione, è difficile distinguere le variazioni nello spessore delle membrane mitocondriali interne ed esterne (circa 22 nm) e delle giunzioni cristae (circa 28 nm)37. La microscopia elettronica a trasmissione ha il vantaggio di poter osservare la struttura di campioni biologici ad altissima risoluzione ma ha lo svantaggio che le immagini possono essere visualizzate solo in bianco e nero, rendendo difficile distinguere gli organelli in immagini complesse. Nel nostro protocollo, abbiamo utilizzato un metodo CLEM che combina i vantaggi della microscopia ottica ed elettronica per monitorare l'interazione di due diversi organelli colorandoli con colori diversi. In particolare, il CLEM a due colori è uno strumento prezioso per osservare e analizzare la mitofagia, il processo di degradazione mitocondriale all'interno dei lisosomi, come mostrato nella Figura 3.

L'imaging di cellule vive viene in genere eseguito in condizioni fisiologiche, consentendo ai ricercatori di osservare i processi cellulari dinamici in tempo reale. Tuttavia, le tecniche di microscopia elettronica spesso richiedono lunghe procedure di preparazione del campione, tra cui la fissazione e la colorazione. Il ritardo tra l'imaging di cellule vive e la preparazione del campione al microscopio elettronico limita la risoluzione temporale della tecnica e può comportare eventi cellulari dinamici potenzialmente mancati. Per superare i limiti del CLEM su cellule vive, abbiamo sviluppato un metodo CLEM a due colori in cui la sonda mEosEM23 e il colorante chimico (Amplex-Red) vengono colorati con l'enzima di marcatura di prossimità APEX238 senza perdere il segnale di fluorescenza anche in ambienti di fissazione difficili. In un precedente studio CLEM su cellule vive39, sono state riscontrate discrepanze tra i segnali di fluorescenza e le immagini EM a causa di problemi di risoluzione temporale nel campionamento TEM dopo l'imaging di cellule vive e limitazioni tecniche nella preparazione del campione. Tuttavia, acquisendo immagini a fluorescenza di cellule fissate per un tempo sufficiente (imaging z-stack di cellule intere ad alto ingrandimento), possiamo risolvere il problema della risoluzione temporale e migliorare la correlazione tra le immagini LM ed EM (Figura 3 e Figura 4).

Un altro fattore chiave per il successo dei risultati CLEM è la modalità di registrazione accurata dell'immagine LM con l'immagine EM. Per fare ciò, abbiamo prima utilizzato una combinazione di modalità di imaging DIC e fluorescenza durante l'imaging al microscopio ottico per creare una mappa di navigazione intorno alle cellule bersaglio. Utilizzando questa mappa di navigazione, abbiamo potuto facilmente identificare le cellule di interesse sull'ultramicrotomo e sul TEM. In secondo luogo, acquisendo immagini di tessere TEM di intere celle ad alto ingrandimento, siamo stati in grado di ottenere molti punti di riferimento che potrebbero essere utilizzati per la registrazione delle immagini. Nella nostra esperienza, maggiore è il numero di punti di riferimento, migliore è la precisione dell'allineamento delle immagini LM ed EM nel plug-in Big Warp.

In questo studio, abbiamo mostrato i domini di interazione dei lisosomi e dei mitocondri con risultati CLEM ad alta risoluzione. Inoltre, la sonda a due colori ha permesso una distinzione precisa tra mitocondri e lisosomi. Tuttavia, questo metodo presenta alcune limitazioni. In primo luogo, se il tempo di reazione durante la marcatura prossimale di Amplex-Red da parte dell'enzima APEX2 è troppo lungo, l'Amplex-Red si diffonderà e si colorerà più ampiamente della posizione della proteina bersaglio38. In secondo luogo, lo spessore (volume dell'asse z) dell'area in cui il lisosoma è inghiottito nei mitocondri è piuttosto piccolo, quindi la fusione delle due membrane degli organelli non può essere determinata in una sezione seriale spessa 50 nm. Inoltre, è una sfida significativa allineare con precisione l'asse z di una sezione ottica mediante microscopio ottico e una sezione meccanica mediante ultramicrotomo. Per superare queste limitazioni, il CLEM a due colori può essere utilizzato in combinazione con la tomografia elettronica convenzionale40 o con la sezione seriale volume-CLEM41.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal programma di ricerca di base KBRI attraverso il Korea Brain Research Institute finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC (24-BR-01-03). I plasmidi TMEM192-V5-APEX2 sono stati gentilmente forniti da Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). I dati TEM sono stati acquisiti presso le strutture di base della ricerca cerebrale nel KBRI.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sostanze chimiche e reagenti
microscopia elettronicaglutaraldeide16200fumi di aldeide sono estremamente tossici. Utilizzare solo in cappa aspirante.
Soluzione di perossido di idrogeno al 30%Merck107210
Soluzione di paraformaldeide al 4%BiosesangPC2031-100-00sono estremamente tossici. Utilizzare solo in cappa aspirante.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Scienze della microscopia elettronica14120
EtanoloMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Trasfezione plasmidica
GlicinaSIGMAG8898
Citrato di piombo 3%Scienze della microscopia elettronica22410
Tetrossido di osmio 4 % soluzione acquosa Microscopiaelettronica Scienze16320Molto tossico. Utilizzare solo in cappa aspirante.
Esacianoferrato di potassio (II) triidratoSIGMAP3289
Sodio cacodilato triidratoSigma-AldrichC0250-500G
Uranile acetatoMicroscopia elettronica Scienze22400
UranyLess EM colorante MicroscopiaelettronicaScienze 22409
Costruzione plasmidi
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
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Riferimenti

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