Combinazione di imaging ed elettrofisiologia per visualizzare e registrare le depolarizzazioni di diffusione nei topi

Sommario

Questo protocollo dimostra la combinazione di imaging ed elettrofisiologia per rilevare in modo affidabile la diffusione delle depolarizzazioni nei topi adulti a seguito di una lieve lesione cerebrale traumatica.

Abstract

Diffusione Le depolarizzazioni (SD) sono eventi massicci nel cervello che spesso non vengono rilevati a causa della loro lenta propagazione attraverso la materia grigia. Poiché il rilevamento SD può essere sfuggente, viene confermato in modo ottimale utilizzando più metodi. Questo protocollo descrive i metodi per combinare l'imaging e l'elettrofisiologia per rilevare le SD in un modo che la maggior parte dei laboratori può adottare in modo affidabile e semplice. Le SD si verificano a seguito di lesioni cerebrali traumatiche, ictus, emorragie subaracnoidee, ischemia ed aura emicranica. Storicamente, le SD sono state registrate utilizzando amplificatori CC, che possono risolvere il lento spostamento extracellulare e la depressione nell'attività ad alta frequenza. Tuttavia, gli amplificatori CC sono quasi impossibili da utilizzare per registrazioni croniche in vivo. Questo protocollo utilizza un amplificatore CA comune per registrazioni elettrofisiologiche in vivo per confermare la depressione ad alta frequenza, insieme all'imaging non invasivo necessario per rilevare l'onda di propagazione della SD. Questi metodi possono essere adottati e/o modificati in modo affidabile per la maggior parte degli approcci sperimentali per confermare la presenza o l'assenza di SD a seguito di lesione cerebrale.

Introduzione

Le depolarizzazioni diffuse (SD) sono associate a varie condizioni neurologiche, tra cui lesioni cerebrali traumatiche (TBI), ictus, emorragie subaracnoidee, ischemia e aura emicranica¹. Le SD sono state implicate nella progressione del danno tissutale negli ictus e nei TBI². L'esatto meccanismo alla base della progressione della perdita di tessuto rimane poco chiaro^3,4. Tuttavia, le SD si verificano quando le richieste metaboliche dei neuroni non sono soddisfatte con ossigeno e glucosio sufficienti, poiché la funzione della pompa sodio-potassio ATP-dipendente diventa inadeguata a mantenere i gradienti ionici. Per comprendere il ruolo delle SD nella perdita di tessuti, sono necessarie tecniche precise per misurarle e studiarle, il che è fondamentale per far progredire le conoscenze scientifiche. Le SD sono eventi neurologici significativi che spesso possono passare inosservati a causa di limitazioni del disegno sperimentale e/o della strumentazione.

Il ruolo della diffusione delle depolarizzazioni (SD) nella progressione delle lesioni è attualmente in fase di chiarimento, ma il loro ruolo nelle lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) rimane poco chiaro. Studi recenti che utilizzano le tecniche descritte in questo manoscritto hanno dimostrato che le SD vengono avviate in modelli murini mTBI a cranio chiuso, anche quando non vi è alcun danno tissutale o sanguinamento evidente^{5, 6}. Questi studi suggeriscono che le SD possono contribuire a disturbi neurologici acuti e neuroinfiammazione. Inoltre, la presenza di SD indotte da mTBI è stata strettamente associata a deficit comportamentali acuti^6,7. Pertanto, è probabile che le SD siano avviate in tutti i modelli di trauma cranico, ma il loro ruolo rimane difficile da accertare senza conferma. Confermare la presenza di SD è fondamentale per valutare accuratamente i risultati degli mTBI.

Le depolarizzazioni di diffusione (SD) sono identificate da un calo significativo del potenziale extracellulare, noto come "DC shift", e da una depressione dell'attività ad alta frequenza⁸. Lo "spostamento CC" richiede in genere pochi secondi per risolvere (~10 s)⁹. Per catturare lo "spostamento CC", sono necessari un amplificatore CC ed elettrodi a filo d'argento. Tuttavia, l'elettrofisiologia in vivo viene solitamente eseguita con amplificatori CA, progettati per filtrare gli eventi a bassa frequenza per ridurre gli artefatti di movimento. Sfortunatamente, questo filtraggio a bassa frequenza rimuove anche lo "spostamento CC". Inoltre, l'argento è tossico e inadatto per registrazioni croniche. Gli amplificatori CA comunemente usati possono rilevare la depressione dell'attività ad alta frequenza, ma senza il "DC shift" di accompagnamento, confermare la presenza di una SD è difficile.

Le depolarizzazioni a diffusione (SD) possono anche essere rilevate utilizzando varie tecniche di imaging. Più comunemente, le SD vengono visualizzate con l'imaging a contrasto laser speckle, che misura il flusso sanguigno cerebrale attraverso il cranio intatto¹⁰. Le SD influenzano significativamente la vascolarizzazione cerebrale e il flusso sanguigno. Nella maggior parte delle specie diverse dai topi, le SD inducono un'onda di iperperfusione che si propaga con il bordo anteriore della SD¹¹. Le SD possono anche essere visualizzate utilizzando indicatori fluorescenti di calcio o glutammato¹², anche se ciò richiede il caricamento di tessuti con coloranti o indicatori fluorescenti geneticamente codificati^12,13. È interessante notare che le SD possono essere osservate ad occhio nudo grazie ai segnali ottici intrinseci (iOS) associati a SD¹⁴. iOS sono segnali complessi composti da molecole autofluorescenti come NAD(P)H e FADH^15,16, gonfiore dei tessuti¹⁷ e potenziali cambiamenti nel flusso sanguigno cerebrale. Nonostante la loro complessità, i segnali iOS sono affidabili e possono essere catturati in mice¹⁸. Questo protocollo descrive il metodo per l'imaging di iOS perché questa tecnica può essere implementata in qualsiasi laboratorio senza la necessità di virus specializzati o animali transgenici.

L'obiettivo generale di questo metodo è confermare sperimentalmente la presenza o l'assenza di una depolarizzazione diffusa (SD) a seguito di una lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) utilizzando l'imaging simultaneo e l'elettrofisiologia. L'elettrofisiologia in vivo, facilitata da amplificatori avanzati, è una tecnica comunemente usata. Tuttavia, questi amplificatori non sono in grado di rilevare il caratteristico "DC shift". Pertanto, le tecniche di imaging, come descritto in questo protocollo, vengono impiegate per confermare con sicurezza la presenza o l'assenza di SD. Il vantaggio di combinare l'imaging e l'elettrofisiologia è che l'imaging può rilevare la propagazione della SD, mentre l'elettrofisiologia può identificare la depressione ad alta frequenza associata.

Nel complesso, questo metodo è adatto per studiare la presenza di depolarizzazioni diffuse (SD) a seguito di una lesione cerebrale traumatica (TBI). La sua applicazione potrebbe migliorare la comprensione della funzione della rete corticale dopo trauma cranico e SD. Questo protocollo può essere adattato da un modello di impatto cranico chiuso ad altri modelli, come l'impatto corticale controllato, la percussione di fluidi o la caduta di peso. L'implementazione di questo protocollo in più laboratori potrebbe chiarire il ruolo delle SD in diverse gravità del trauma cranico. È possibile utilizzare qualsiasi modello di trauma cranico stabilito, seguito dalle procedure di imaging ed elettrofisiologia iOS descritte in questo protocollo.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto (IACUC) presso l'Università del New Mexico. I topi C57BL/6J sono stati ottenuti da una fonte commerciale. Un numero uguale di topi maschi e femmine è stato utilizzato nella fascia di età di 8-14 settimane. Tutti i topi pesavano circa 20 g. I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. Il file supplementare 1 contiene l'elenco delle abbreviazioni.

1. Preparazione del cranio per l'imaging e l'elettrofisiologia

1. Anestetizzare l'animale in una scatola di induzione dell'isoflurano con isoflurano al 2%-3% in ossigeno al 100%, garantendo una corretta profondità di anestesia senza sussulti dovuti al pizzico della zampa.
2. Somministrare analgesici preoperatori (buprenorfina a lento rilascio, 3,25 mg/kg, SQ) prima di inserire l'animale in un telaio stereotassico e mantenere l'anestesia (isoflurano al 2%).
3. Aggiungi un unguento oftalmico e mantieni la temperatura corporea dell'animale con un termoforo che ha un feedback sulla temperatura corporea.
4. Radere i peli sopra il cranio dove si troverà l'incisione, lungo la linea mediana dalla fessura oculare alla lambda.
5. Rimuovere i peli tagliati prima di sterilizzare la pelle con uno scrub e una soluzione antisettica e disinfettante. Terminare con etanolo al 70% e ripetere tre volte per garantire un sito chirurgico sterile.
6. Utilizzando una lama di bisturi #10, praticare un'incisione lungo la linea mediana da rostrale a caudale, immediatamente seguita dall'applicazione di colla cianoacrilica di grado medico sull'incisione. Allargare la pelle lateralmente per esporre il cranio.
7. Aggiungi un'altra goccia o due di colla cianoacrilica sul cranio per aggiungere ulteriore protezione al cranio.
   NOTA: L'applicazione della colla è sensibile al tempo poiché il cranio inizierà a opacizzarsi se esposto all'aria per più di 10 s. Ciò oscurerà la visualizzazione della SD attraverso i metodi di imaging.
8. Mentre la colla si asciuga, utilizzare forbici chirurgiche sterili per aumentare le dimensioni dell'incisione sul cervelletto. Una volta che la colla è solidificata, iniziare l'impianto degli elettrodi a vite del cranio.
   1. Sterilizzare le viti del cranio con uno sterilizzatore a perline per 20-30 s prima dell'impianto.
   2. Posizionare le viti del cranio in una regione distante dal sito di iniziazione SD per mantenere una finestra visiva aperta.
      NOTA: Per le registrazioni croniche nella corteccia visiva primaria, vengono utilizzate tre viti del cranio. La prima vite è posta approssimativamente a y = -6,00 mm dal bregma, nel cervelletto, fungendo da elettrodo di riferimento. Gli elettrodi di registrazione sono posizionati a y = -2,79 mm da bregma e x = ±2,5 mm dalla linea mediana, all'interno degli emisferi sinistro e destro.
   3. Con una punta da trapano da 0,8 mm, praticare dei fori pilota attraverso il cranio. Per garantire l'assenza di danni al tessuto sottostante, l'ideale è -0,5 mm in z. Utilizzare viti #00-90 presaldate a perni d'oro con filo di acciaio inossidabile.
   4. Girare le viti verso il basso nel cranio.1,5-2 giri completi faranno passare la vite attraverso il cranio e a contatto con la superficie corticale.
   5. Avvolgere il filo in eccesso attorno alla vite, lasciando un po' di gioco nel filo per il successivo posizionamento dell'headstage.
   6. Utilizzando le stesse procedure, posizionare le altre viti del cranio.
   7. Una volta che tutte le viti del teschio sono in posizione, collegare tutti i pin dorati al connettore dell'headstage desiderato. Tenere il connettore in posizione utilizzando il braccio stereotassico e tenere i pin del connettore vicini sopra le teste delle viti assicurandosi che i fili non si tocchino.
   8. Sigillare l'intera area con colla cianoacrilica, facendo attenzione a non interrompere l'area di imaging davanti alle viti del cranio.
   9. Accumulare del cemento dentale attorno alla base dei perni d'oro, assicurandosi che i perni d'oro delle viti del cranio non siano collegati ai perni d'oro nello stadio della testa.
   10. Lasciare indurire il cemento dentale prima di rimuovere il connettore dell'headstage.
   11. Rimuovi l'animale dal telaio stereotassico e rimettilo nella gabbia di casa per riprenderlo. Segui le cure postoperatorie standard e tieni gli animali su un termoforo mentre ti riprendi dall'anestesia.
       NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, gli animali sono stati alloggiati da soli e monitorati quotidianamente per il dolore. Segui le linee guida istituzionali locali per l'analgesia. Se si utilizza una buprenorfina a lento rilascio, monitorare il dolore e potenzialmente somministrare una dose aggiuntiva a 72 ore.
9. Rimuovere tutti gli oggetti che potrebbero impigliarsi negli elettrodi, compresi l'alloggiamento e l'arricchimento. Utilizzare biancheria da letto standard con accesso ad libium a cibo e acqua.
   NOTA: Consentire un periodo di recupero di due giorni tra l'intervento chirurgico e la registrazione.

2. Rilevamento delle depolarizzazioni di diffusione con l'imaging del segnale ottico intrinseco (iOS) e l'elettrofisiologia AC

1. Anestetizzare gli animali con isoflurano al 2% in ossigeno al 100%.
   NOTA: La parte di imaging di questa procedura dovrebbe richiedere ~5 minuti e la quantità di esposizione all'isoflurano dovrebbe essere costante.
2. Posiziona l'animale in una cornice stereotassica. Attraverso il cono del naso, mantenere l'1%-2% di isoflurano in ossigeno.
   NOTA: È fondamentale mantenere una corretta profondità dell'anestesia, poiché è noto che l'isoflurano riduce le SD. Si raccomanda di mantenere 60-70 respiri/min durante l'esperimento.
3. Posiziona l'animale sotto la fotocamera e assicurati che la fotocamera sia messa a fuoco sulla superficie corticale regolando l'anello di messa a fuoco.
4. Applicare olio minerale sull'area di imaging per aumentare la trasparenza.
5. Accendi i computer, la scheda del pannello LED e le apparecchiature di elettrofisiologia.
   NOTA: Il pannello LED funziona meglio se posizionato di fronte all'animale per illuminare la finestra di imaging mentre le luci dall'alto sono spente. La luce è stata impostata su ~2.400 lux (95% di potenza) con un'impostazione della temperatura fredda di 4000K.
6. Impostazione del carico per iOS utilizzando Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. Premere Live per visualizzare il mouse sotto la telecamera e centrare il cranio dell'animale sotto la telecamera. Chiudere la finestra "Live".
   2. Premere Multi-D Acq.
   3. Nella finestra Acquisizione multidimensionale, selezionare i punti temporali desiderati.
      NOTA: Si consiglia di contare 750 immagini a un intervallo di 250 ms.
   4. Salva le immagini nel percorso del file desiderato e nel prefisso del nome.
7. Collegare i pin d'oro dall'animale al connettore dell'headstage e poi all'headstage.
8. Impostazione del carico per il software Intan.
   1. Fare clic sull'icona Scegli formato file e, nella finestra pop-up, selezionare un file per tipo di segnale Formato. In questo modo il file verrà salvato come ".dat" per un ulteriore utilizzo in MATLAB.
   2. Nella scheda BW in Larghezza di banda hardware, selezionare la larghezza di banda dell'amplificatore di 0,13-500 Hz.
   3. In Selettore di visualizzazione filtro, selezionare WIDE per coprire la gamma più ampia di segnali.
   4. Per selezionare il percorso del file desiderato da salvare, fare clic sull'icona Seleziona nome file.
9. Eseguire l'impatto utilizzando un impattatore elettromagnetico.
   NOTA: Le impostazioni dell'impattatore sono una velocità di impatto di 4 m/s e una deflessione di 5 mm.
   1. Accendere l'impattatore e assicurarsi che la punta si ritragga e si estenda in modo appropriato premendo l'interruttore a 3 vie per ritrarre la punta ed estendere la punta. La punta deve essere estesa prima di posizionare l'animale sotto la punta.
   2. Muovendosi rapidamente, posizionare l'animale su un letto di schiuma e far scorrere il letto sotto la punta.
   3. Allineare la punta dell'impattatore sulla linea mediana e 1 mm di rostrale di bregma.
   4. Abbassare la punta dell'impattatore fino a toccare saldamente la parte superiore della testa dell'animale.
      NOTA: Non spingere la punta verso il basso nella testa.
   5. Spingere la leva per ritrarre la punta dell'impattatore e quindi abbassarla manualmente di 5 mm prima di attivare la leva di impatto.
   6. Rimuovere immediatamente l'animale dal letto di schiuma e posizionarlo sotto la telecamera per l'imaging entro 5 s, poiché la SD viene avviata dall'impatto.
10. Avviare l'imaging iOS facendo clic su Acquisisci! nella finestra Acquisizione multidimensionale. Immagine per 4 minuti per catturare l'intera SD.
11. Avviare la registrazione elettrofisiologica facendo clic sull'icona Registra sul software Intan.
12. Rimuovi l'animale dal cuscinetto di schiuma e consentigli di riprendersi in un'arena aperta o in una gabbia domestica.
    NOTA: Si raccomanda di registrare l'elettrofisiologia per almeno 1 ora per consentire il recupero della funzione della rete corticale.
13. Al termine della registrazione, scollegare l'animale dal tavolino e dal connettore e riposizionare l'animale nella sua gabbia.
    NOTA: Si consiglia di attendere 24 ore tra ogni impatto e sessione di registrazione. L'animale può rimanere nella sua gabbia di casa per tutto il tempo al di fuori delle sessioni di registrazione.

3. Visualizzazione e quantificazione delle immagini iOS

1. In ImageJ^19,20,21,22, apri la pila di immagini facendo clic sulla sequenza File > Importa > immagini.
2. Scorri manualmente le immagini per assicurarti che non ci siano movimenti o altri artefatti.
3. Per generare il grafico della SD, creare una ROI utilizzando il cursore per disegnare un quadrato.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare un quadrato di 30 x 30 pixel. Si può usare qualsiasi forma o dimensione, ma assicurarsi che la dimensione del ROI non cambi tra gli animali.
4. Per creare un grafico, fare clic su Immagine > Pile > Traccia profilo asse Z. Sul grafico appena creato, fai clic sul pulsante live. Torna alla pila di immagini della SD e sposta il ROI fino a quando il grafico non mostra la curva SD. Il grafico dovrebbe apparire come un'onda Sin con un aumento iniziale seguito da un calo al di sotto della linea di base e un lento ritorno alla linea di base entro pochi minuti><. NOTA: I grafici possono essere espressi come unità arbitrarie (UA) o come percentuale di base utilizzando le prime immagini come media di base.
5. Sul grafico generato, fare clic su Elenco per generare un elenco di valori che possono essere tracciati in altri software di generazione di grafici o Matlab.
6. Per la visualizzazione, trasformare l'immagine in scala di grigi in una tabella di ricerca in ImageJ tramite Image > Tabelle di ricerca > Fire.

4. Analisi elettrofisiologica

NOTA: Si raccomanda che l'esperienza del laboratorio di Buzsaki e il loro codice generato da MATLAB siano ampiamente utilizzati per visualizzare e analizzare i dati di elettrofisiologia. L'analisi richiederà il download di MATLAB con un codice di attivazione istituzionale e il file zip "Buzcode" del laboratorio di Buzsaki tramite GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).

1. Nel software di elettrofisiologia Intan, assicurarsi che i dati grezzi esportati vengano salvati in formato ".dat".
   NOTA: Matlab può essere installato dal sito Web di MathWorks. Per l'acquisto e l'utilizzo di Matlab è necessario un codice di attivazione istituzionale o individuale. Per eseguire questa analisi è necessaria una certa esperienza pregressa con l'esecuzione di codice in Matlab.
2. Utilizzare la funzione di bz_LoadBinary del codice Buzaki per caricare i dati in Matlab.
   NOTA: Esempio "'dati' = bz_LoadBinary ('percorso completo del file di dati','frequenza', frequenza di campionamento, nCanali, numero di canali);
3. Filtra il rumore CA utilizzando un filtro notch centrato a 60 Hz.
   NOTA: Esempio notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, dati);
4. Isolare l'attività ad alta frequenza utilizzando un filtro passa-banda con un intervallo di 0,5-100 Hz, in conformità con le raccomandazioni del gruppo COSBID per l'analisi e la visualizzazione delle depolarizzazioni di diffusione (SD).
5. Calcola lo spettrogramma di potenza utilizzando il comando pspectrum in MatLab.
6. Per visualizzare, tracciare lo spettrogramma ad alta frequenza e lo spettrogramma di potenza sulla stessa scala temporale e in una colonna.
   NOTA: Dai grafici, ci sarà un'estensione della depressione ad alta frequenza e della perdita di potenza.

Risultati

La Figura 1 illustra una rappresentazione grafica della configurazione sperimentale. Le viti del cranio di registrazione sono posizionate nella corteccia visiva primaria, con un elettrodo a vite del cranio posizionato nel verme cerebellare come elettrodo di terra. Le viti del cranio e i perni d'oro sono fissati al cranio utilizzando colla cianoacrilica e cemento dentale. È fondamentale limitare il cemento dentale alla parte caudale del cranio per lasciare spazio all'impatto e all'imaging. La posizione dell'impatto, centrata sulla linea mediana e circa 1 mm rostrale rispetto alla bregma, è indicata in Figura 1.

Le immagini dei segnali ottici intrinseci rappresentativi (iOS) sono mostrate in Figura 2A. Le immagini in scala di grigi vengono convertite utilizzando una tabella di ricerca antincendio per migliorare la visualizzazione delle depolarizzazioni a diffusione (SD). iOS comprende vari segnali, tra cui NAD(P)H, FADH e riflettanza tissutale, rendendo difficile l'interpretazione e il confronto di questi segnali. I recipienti di grandi dimensioni dovrebbero essere chiaramente visibili attraverso la finestra della super colla (indicata con frecce), mentre la linea tratteggiata in Figura 2A segna l'onda di propagazione della SD. Sebbene le SD siano difficili da osservare in tempo reale, diventano più evidenti quando le immagini vengono accelerate (vedere il video supplementare 1). Alcuni piccoli rami possono sembrare "scomparire" a causa della vasocostrizione (Figura 2A). Una piccola regione di interesse (ROI) estratta dalla pila di immagini dovrebbe produrre un grafico dell'asse Z simile a Figura 2B. Dalle registrazioni elettrofisiologiche, il segnale ad alta frequenza estratto dovrebbe assomigliare ai pannelli superiori di Figura 2C,D. Queste registrazioni sono state avviate immediatamente dopo la lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI), con gli animali che sono rimasti in anestesia con isoflurano durante i 4 minuti di imaging iOS. Dopo la rimozione dell'isoflurano, l'attività ad alta frequenza dovrebbe tornare rapidamente entro un minuto negli animali fittizi, come mostrato in Figura 2C (riquadro rosso). Al contrario, se si verificasse una SD, l'attività ad alta frequenza rimarrebbe depressa per diversi minuti prima del recupero (Figura 2D, riquadro rosso). I pannelli inferiori di Figura 2C,D mostrano la potenza calcolata (V²) per ogni grafico ad alta frequenza. Questi grafici di potenza aiutano a identificare la soppressione e il recupero dell'attività ad alta frequenza da parte del rapido aumento di potenza (indicato dal bordo destro delle caselle rosse).

Figura 1: Configurazione sperimentale e posizione dell'impatto e delle viti del cranio. La superficie dorsale del cranio è esposta attraverso un'incisione cutanea. Il cranio e la pelle sono sigillati con colla cianoacrilica per migliorare la trasparenza. Viene praticato un foro di bava per il terreno a y = -6,00 e x = 0 da bregma. I fori di bava per gli elettrodi di registrazione sono posizionati a y = -2,79 e x = ±2,5 da bregma. Le viti in acciaio inossidabile sono infilate attraverso il teschio e saldate a perni d'oro con filo di acciaio inossidabile non rivestito. Si presta attenzione ad evitare un'eccessiva copertura della superficie del cranio con cemento dentale per garantire uno spazio adeguato per l'impatto e l'imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative di iOS e registrazioni AC. (A) Immagini rappresentative di iOS con frecce che indicano i vasi sanguigni. Le immagini in scala di grigi vengono convertite nella tabella di ricerca Fire in ImageJ per una migliore visualizzazione. La linea nera tratteggiata denota la SD che si propaga, visualizzata come un'onda di intensità aumentata in iOS. La SD è chiaramente visibile quando si scorre rapidamente l'intera pila di immagini. Il segnale iOS riflette vari cambiamenti fisiologici e metabolici associati alla SD, tra cui la produzione mitocondriale di NAD(P)H e FADH e l'edema neuronale. La casella nera evidenzia la regione di interesse (ROI) utilizzata per generare la traccia in (B). Barra della scala: 1 mm. (B) Traccia rappresentativa della SD iOS espressa come percentuale della linea di base. Il segnale iOS aumenta e ritorna vicino alla linea di base entro circa 60 s. Sebbene le modifiche ai segnali iOS siano piccole (circa il 10%), sono sufficienti per identificare la SD. Nelle registrazioni AC sia per gli animali fittizi (C) che SD (D), le tracce superiori mostrano un'attività ad alta frequenza e le tracce inferiori rappresentano la potenza (V²). Le caselle blu indicano i periodi di anestesia con isoflurano, mentre la casella rossa indica il periodo di recupero dell'attività ad alta frequenza da isoflurano e SD. La depressione prolungata indotta dalla SD è in contrasto con il rapido recupero dell'attività dopo il solo isoflurano (sham). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Visualizzazione delle onde di propagazione. Il file video viene accelerato fino a una velocità di circa 8 volte per facilitare l'identificazione visiva dell'onda che si propaga. L'immagine in scala di grigi è stata convertita nella tabella di ricerca Fire e salvata come file .AVI in ImageJ. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 1: Elenco delle abbreviazioni. Per favore clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

La diffusione delle depolarizzazioni è fondamentale in vari modelli di malattia, tra cui le lesioni cerebrali traumatiche (TBI), l'ictus e l'emicrania¹. L'individuazione accurata delle SD è essenziale per comprendere il loro ruolo nei deficit comportamentali acuti e/o nell'attivazione del sistema neuroimmune a seguito di lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI)^23,24. Per mitigare il rischio di perdere SD quando si utilizza un unico metodo, è necessario un approccio multi-metodo per una visualizzazione e una registrazione efficaci delle SD.

Sebbene la combinazione delle tecniche consenta di confermare la diffusione delle depolarizzazioni (SD), ciascuna tecnica può presentare potenziali insidie. Le tecniche di imaging descritte in questo protocollo sono accessibili alla maggior parte dei laboratori e sono dettagliate da Zepeda e colleghi²⁵. La preparazione della finestra cranica è fondamentale, poiché le finestre opache possono portare a immagini inconcludenti²⁶. Questo problema può essere mitigato riducendo al minimo l'esposizione del cranio all'aria prima di applicare la colla cianoacrilica. Inoltre, la trasparenza della finestra può essere migliorata con una goccia di olio minerale prima dell'imaging. Gli artefatti di movimento possono anche complicare la conferma SD, quindi ridurre al minimo questi artefatti è essenziale per ottenere video nitidi. Per risolvere questo problema, è importante mantenere l'animale sotto isoflurano durante tutto il processo di imaging²⁷. L'uso di un cono nasale facilita il trasferimento efficiente dell'animale tra l'impattatore e la configurazione di registrazione. È fondamentale riposizionare rapidamente l'animale sotto il cono del muso dopo l'impatto per catturare la maggior parte possibile della propagazione SD. In questo modello di lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI), la registrazione per circa 4 minuti è solitamente sufficiente per acquisire l'intera SD. Tuttavia, nei TBI più gravi, le SD spontanee possono essere generate da un danno tissutale²⁸. L'imaging continuo può rilevare queste SD spontanee, ma l'anestesia prolungata con isoflurano può rendere difficile l'osservazione della depressione ad alta frequenza. Le SD spontanee possono essere rilevate con l'elettrofisiologia da ulteriori depressioni nell'attività ad alta frequenza, ma confermare la relazione tra depressione e SD è difficile senza l'imaging.

Con lo sviluppo degli amplificatori Open-Ephys e Intan, l'elettrofisiologia in vivo è ora accessibile a molti laboratori. Tutte le registrazioni elettrofisiologiche richiedono l'impianto di viti e/o elettrodi del cranio. In questo protocollo, c'è un periodo di latenza di due giorni tra l'impianto delle viti del cranio e la registrazione per supportare il recupero. Anche se questo periodo potrebbe non essere sufficiente per il cervello per riprendersi completamente dall'impianto, il danno dovrebbe essere minimo poiché le viti del cranio non penetrano nel tessuto cerebrale. Inoltre, la trasparenza del cranio sigillato con cianoacrilato diminuisce nel tempo, quindi l'imaging deve essere eseguito il prima possibile per ottenere una trasparenza ottimale. Per l'elettrofisiologia, è fondamentale ridurre al minimo il rumore a 60 Hz. Assicurarsi che l'area sperimentale sia isolata dall'alimentazione CA e adeguatamente collegata a terra all'amplificatore Intan. Sebbene gli artefatti di movimento non possano essere completamente eliminati, gli accelerometri sullo stadio principale possono aiutare a identificare e rimuovere i periodi di movimento durante la post-elaborazione. Nel complesso, queste tecniche possono fornire preziose informazioni sul recupero della SD e sulla funzione della rete corticale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI).

Una limitazione di queste tecniche è che gli animali sono sotto anestesia durante l'imaging. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di trauma cranico richiede l'anestesia ed è improbabile che l'anestesia prolungata abbia un impatto significativo sul disegno sperimentale. L'isoflurano riduce significativamente l'attività ad alta frequenza²⁷. Se l'esposizione all'isoflurano si estende oltre il periodo di imaging, può complicare il rilevamento del recupero dell'attività ad alta frequenza dopo la SD. Pertanto, è fondamentale includere un gruppo sham o isoflurano-solo nel disegno sperimentale per confrontare il recupero dell'attività ad alta frequenza, come mostrato nella Figura 2. Un'altra limitazione è che le registrazioni elettrofisiologiche non rilevano lo spostamento CC. L'ampiezza e la durata dello spostamento DC sono indicatori della salute dei tessuti e del recupero dalla SD²⁸. Tuttavia, la conferma delle SD con queste tecniche fornirà comunque preziose informazioni sulla ricerca sul trauma cranico.

Tutti i ricercatori di TBI trarrebbero vantaggio dalle tecniche qui descritte, poiché è molto probabile che tutti i modelli di TBI producano depolarizzazioni a diffusione (SD). Il campo del trauma cranico trarrebbe vantaggio significativo dalla comprensione del ruolo delle SD nelle lesioni, nella progressione delle lesioni, nell'attivazione neuroimmune e nel recupero. Ricerche recenti suggeriscono che le SD contribuiscono ai deficit comportamentali e possono essere un meccanismo alla base della compromissione neurologica ^5,7. Le tecniche descritte in questo protocollo aiuteranno a chiarire la connessione tra trauma cranico e SD. Le future applicazioni di queste tecniche potrebbero estendersi ad altri campi di ricerca, tra cui ictus, epilessia ed emicrania.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#00-90 x .118 Vite a macchina	Micro vite USA	00.90-118-M-SS-P, Amazon
0.8 mm diametro punta	da trapano PCB	WYTP21, Amazon
16-A Headstage	Intan	C3335
2.1 mm Sbavature micro punta da trapano	Fine Science Tools	19007-21
Amplificatore CA	Intan	RHD sistema
C57BL / 6J mouse	Laboratorio Jackson	Jax#000664
Telecamera CCD	Mightex	TCE-1304-U
Obiettivo di prolunga	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (buprenorfina a rilascio lento)	Midwest Veterinary Supply	Codice prodotto: 267.10000.3
Perno connettore dorato (femmina)	A-M Systems	520100
Perno connettore dorato (maschio)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
Scheda LED	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	Codice di attivazione istituzionale o individuale Colla
cianoacrilica per uso medico	MasterBond	MB287
Micro-Manager Software per fotocamera	Immagine J	NA
Perforatrice/lucidatrice per unghie	Makartt Fresa per unghie Lima elettrica	JD700
Connettori Omnetic	Omnetics	A79014-001
RHX Software di acquisizione dati	Intan	NA
Filo non rivestito in acciaio inossidabile (0,005")	A-M Systems	792800
Telaio stereotassico	Kopf Intruments	1923-B
Teets 'cold cure' cemento dentale	A-M systems	525000, 526000
Obiettivo per fotocamera XLR	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16