Questo protocollo dimostra la combinazione di imaging ed elettrofisiologia per rilevare in modo affidabile la diffusione delle depolarizzazioni nei topi adulti a seguito di una lieve lesione cerebrale traumatica.
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Articolo metodologico
Combinazione di imaging ed elettrofisiologia per visualizzare e registrare le depolarizzazioni di diffusione nei topi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diffusione Le depolarizzazioni (SD) sono eventi massicci nel cervello che spesso non vengono rilevati a causa della loro lenta propagazione attraverso la materia grigia. Poiché il rilevamento SD può essere sfuggente, viene confermato in modo ottimale utilizzando più metodi. Questo protocollo descrive i metodi per combinare l'imaging e l'elettrofisiologia per rilevare le SD in un modo che la maggior parte dei laboratori può adottare in modo affidabile e semplice. Le SD si verificano a seguito di lesioni cerebrali traumatiche, ictus, emorragie subaracnoidee, ischemia ed aura emicranica. Storicamente, le SD sono state registrate utilizzando amplificatori CC, che possono risolvere il lento spostamento extracellulare e la depressione nell'attività ad alta frequenza. Tuttavia, gli amplificatori CC sono quasi impossibili da utilizzare per registrazioni croniche in vivo. Questo protocollo utilizza un amplificatore CA comune per registrazioni elettrofisiologiche in vivo per confermare la depressione ad alta frequenza, insieme all'imaging non invasivo necessario per rilevare l'onda di propagazione della SD. Questi metodi possono essere adottati e/o modificati in modo affidabile per la maggior parte degli approcci sperimentali per confermare la presenza o l'assenza di SD a seguito di lesione cerebrale.
Introduzione
Le depolarizzazioni diffuse (SD) sono associate a varie condizioni neurologiche, tra cui lesioni cerebrali traumatiche (TBI), ictus, emorragie subaracnoidee, ischemia e aura emicranica1. Le SD sono state implicate nella progressione del danno tissutale negli ictus e nei TBI2. L'esatto meccanismo alla base della progressione della perdita di tessuto rimane poco chiaro3,4. Tuttavia, le SD si verificano quando le richieste metaboliche dei neuroni non sono soddisfatte con ossigeno e glucosio sufficienti, poiché la funzione della pompa sodio-potassio ATP-dipendente diventa inadeguata a mantenere i gradienti ionici. Per comprendere il ruolo delle SD nella perdita di tessuti, sono necessarie tecniche precise per misurarle e studiarle, il che è fondamentale per far progredire le conoscenze scientifiche. Le SD sono eventi neurologici significativi che spesso possono passare inosservati a causa di limitazioni del disegno sperimentale e/o della strumentazione.
Il ruolo della diffusione delle depolarizzazioni (SD) nella progressione delle lesioni è attualmente in fase di chiarimento, ma il loro ruolo nelle lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) rimane poco chiaro. Studi recenti che utilizzano le tecniche descritte in questo manoscritto hanno dimostrato che le SD vengono avviate in modelli murini mTBI a cranio chiuso, anche quando non vi è alcun danno tissutale o sanguinamento evidente5, 6. Questi studi suggeriscono che le SD possono contribuire a disturbi neurologici acuti e neuroinfiammazione. Inoltre, la presenza di SD indotte da mTBI è stata strettamente associata a deficit comportamentali acuti6,7. Pertanto, è probabile che le SD siano avviate in tutti i modelli di trauma cranico, ma il loro ruolo rimane difficile da accertare senza conferma. Confermare la presenza di SD è fondamentale per valutare accuratamente i risultati degli mTBI.
Le depolarizzazioni di diffusione (SD) sono identificate da un calo significativo del potenziale extracellulare, noto come "DC shift", e da una depressione dell'attività ad alta frequenza8. Lo "spostamento CC" richiede in genere pochi secondi per risolvere (~10 s)9. Per catturare lo "spostamento CC", sono necessari un amplificatore CC ed elettrodi a filo d'argento. Tuttavia, l'elettrofisiologia in vivo viene solitamente eseguita con amplificatori CA, progettati per filtrare gli eventi a bassa frequenza per ridurre gli artefatti di movimento. Sfortunatamente, questo filtraggio a bassa frequenza rimuove anche lo "spostamento CC". Inoltre, l'argento è tossico e inadatto per registrazioni croniche. Gli amplificatori CA comunemente usati possono rilevare la depressione dell'attività ad alta frequenza, ma senza il "DC shift" di accompagnamento, confermare la presenza di una SD è difficile.
Le depolarizzazioni a diffusione (SD) possono anche essere rilevate utilizzando varie tecniche di imaging. Più comunemente, le SD vengono visualizzate con l'imaging a contrasto laser speckle, che misura il flusso sanguigno cerebrale attraverso il cranio intatto10. Le SD influenzano significativamente la vascolarizzazione cerebrale e il flusso sanguigno. Nella maggior parte delle specie diverse dai topi, le SD inducono un'onda di iperperfusione che si propaga con il bordo anteriore della SD11. Le SD possono anche essere visualizzate utilizzando indicatori fluorescenti di calcio o glutammato12, anche se ciò richiede il caricamento di tessuti con coloranti o indicatori fluorescenti geneticamente codificati12,13. È interessante notare che le SD possono essere osservate ad occhio nudo grazie ai segnali ottici intrinseci (iOS) associati a SD14. iOS sono segnali complessi composti da molecole autofluorescenti come NAD(P)H e FADH15,16, gonfiore dei tessuti17 e potenziali cambiamenti nel flusso sanguigno cerebrale. Nonostante la loro complessità, i segnali iOS sono affidabili e possono essere catturati in mice18. Questo protocollo descrive il metodo per l'imaging di iOS perché questa tecnica può essere implementata in qualsiasi laboratorio senza la necessità di virus specializzati o animali transgenici.
L'obiettivo generale di questo metodo è confermare sperimentalmente la presenza o l'assenza di una depolarizzazione diffusa (SD) a seguito di una lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) utilizzando l'imaging simultaneo e l'elettrofisiologia. L'elettrofisiologia in vivo, facilitata da amplificatori avanzati, è una tecnica comunemente usata. Tuttavia, questi amplificatori non sono in grado di rilevare il caratteristico "DC shift". Pertanto, le tecniche di imaging, come descritto in questo protocollo, vengono impiegate per confermare con sicurezza la presenza o l'assenza di SD. Il vantaggio di combinare l'imaging e l'elettrofisiologia è che l'imaging può rilevare la propagazione della SD, mentre l'elettrofisiologia può identificare la depressione ad alta frequenza associata.
Nel complesso, questo metodo è adatto per studiare la presenza di depolarizzazioni diffuse (SD) a seguito di una lesione cerebrale traumatica (TBI). La sua applicazione potrebbe migliorare la comprensione della funzione della rete corticale dopo trauma cranico e SD. Questo protocollo può essere adattato da un modello di impatto cranico chiuso ad altri modelli, come l'impatto corticale controllato, la percussione di fluidi o la caduta di peso. L'implementazione di questo protocollo in più laboratori potrebbe chiarire il ruolo delle SD in diverse gravità del trauma cranico. È possibile utilizzare qualsiasi modello di trauma cranico stabilito, seguito dalle procedure di imaging ed elettrofisiologia iOS descritte in questo protocollo.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto (IACUC) presso l'Università del New Mexico. I topi C57BL/6J sono stati ottenuti da una fonte commerciale. Un numero uguale di topi maschi e femmine è stato utilizzato nella fascia di età di 8-14 settimane. Tutti i topi pesavano circa 20 g. I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. Il file supplementare 1 contiene l'elenco delle abbreviazioni.
1. Preparazione del cranio per l'imaging e l'elettrofisiologia
- Anestetizzare l'animale in una scatola di induzione dell'isoflurano con isoflurano al 2%-3% in ossigeno al 100%, garantendo una corretta profondità di anestesia senza sussulti dovuti al pizzico della zampa.
- Somministrare analgesici preoperatori (buprenorfina a lento rilascio, 3,25 mg/kg, SQ) prima di inserire l'animale in un telaio stereotassico e mantenere l'anestesia (isoflurano al 2%).
- Aggiungi un unguento oftalmico e mantieni la temperatura corporea dell'animale con un termoforo che ha un feedback sulla temperatura corporea.
- Radere i peli sopra il cranio dove si troverà l'incisione, lungo la linea mediana dalla fessura oculare alla lambda.
- Rimuovere i peli tagliati prima di sterilizzare la pelle con uno scrub e una soluzione antisettica e disinfettante. Terminare con etanolo al 70% e ripetere tre volte per garantire un sito chirurgico sterile.
- Utilizzando una lama di bisturi #10, praticare un'incisione lungo la linea mediana da rostrale a caudale, immediatamente seguita dall'applicazione di colla cianoacrilica di grado medico sull'incisione. Allargare la pelle lateralmente per esporre il cranio.
- Aggiungi un'altra goccia o due di colla cianoacrilica sul cranio per aggiungere ulteriore protezione al cranio.
NOTA: L'applicazione della colla è sensibile al tempo poiché il cranio inizierà a opacizzarsi se esposto all'aria per più di 10 s. Ciò oscurerà la visualizzazione della SD attraverso i metodi di imaging. - Mentre la colla si asciuga, utilizzare forbici chirurgiche sterili per aumentare le dimensioni dell'incisione sul cervelletto. Una volta che la colla è solidificata, iniziare l'impianto degli elettrodi a vite del cranio.
- Sterilizzare le viti del cranio con uno sterilizzatore a perline per 20-30 s prima dell'impianto.
- Posizionare le viti del cranio in una regione distante dal sito di iniziazione SD per mantenere una finestra visiva aperta.
NOTA: Per le registrazioni croniche nella corteccia visiva primaria, vengono utilizzate tre viti del cranio. La prima vite è posta approssimativamente a y = -6,00 mm dal bregma, nel cervelletto, fungendo da elettrodo di riferimento. Gli elettrodi di registrazione sono posizionati a y = -2,79 mm da bregma e x = ±2,5 mm dalla linea mediana, all'interno degli emisferi sinistro e destro. - Con una punta da trapano da 0,8 mm, praticare dei fori pilota attraverso il cranio. Per garantire l'assenza di danni al tessuto sottostante, l'ideale è -0,5 mm in z. Utilizzare viti #00-90 presaldate a perni d'oro con filo di acciaio inossidabile.
- Girare le viti verso il basso nel cranio.1,5-2 giri completi faranno passare la vite attraverso il cranio e a contatto con la superficie corticale.
- Avvolgere il filo in eccesso attorno alla vite, lasciando un po' di gioco nel filo per il successivo posizionamento dell'headstage.
- Utilizzando le stesse procedure, posizionare le altre viti del cranio.
- Una volta che tutte le viti del teschio sono in posizione, collegare tutti i pin dorati al connettore dell'headstage desiderato. Tenere il connettore in posizione utilizzando il braccio stereotassico e tenere i pin del connettore vicini sopra le teste delle viti assicurandosi che i fili non si tocchino.
- Sigillare l'intera area con colla cianoacrilica, facendo attenzione a non interrompere l'area di imaging davanti alle viti del cranio.
- Accumulare del cemento dentale attorno alla base dei perni d'oro, assicurandosi che i perni d'oro delle viti del cranio non siano collegati ai perni d'oro nello stadio della testa.
- Lasciare indurire il cemento dentale prima di rimuovere il connettore dell'headstage.
- Rimuovi l'animale dal telaio stereotassico e rimettilo nella gabbia di casa per riprenderlo. Segui le cure postoperatorie standard e tieni gli animali su un termoforo mentre ti riprendi dall'anestesia.
NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, gli animali sono stati alloggiati da soli e monitorati quotidianamente per il dolore. Segui le linee guida istituzionali locali per l'analgesia. Se si utilizza una buprenorfina a lento rilascio, monitorare il dolore e potenzialmente somministrare una dose aggiuntiva a 72 ore.
- Rimuovere tutti gli oggetti che potrebbero impigliarsi negli elettrodi, compresi l'alloggiamento e l'arricchimento. Utilizzare biancheria da letto standard con accesso ad libium a cibo e acqua.
NOTA: Consentire un periodo di recupero di due giorni tra l'intervento chirurgico e la registrazione.
2. Rilevamento delle depolarizzazioni di diffusione con l'imaging del segnale ottico intrinseco (iOS) e l'elettrofisiologia AC
- Anestetizzare gli animali con isoflurano al 2% in ossigeno al 100%.
NOTA: La parte di imaging di questa procedura dovrebbe richiedere ~5 minuti e la quantità di esposizione all'isoflurano dovrebbe essere costante. - Posiziona l'animale in una cornice stereotassica. Attraverso il cono del naso, mantenere l'1%-2% di isoflurano in ossigeno.
NOTA: È fondamentale mantenere una corretta profondità dell'anestesia, poiché è noto che l'isoflurano riduce le SD. Si raccomanda di mantenere 60-70 respiri/min durante l'esperimento. - Posiziona l'animale sotto la fotocamera e assicurati che la fotocamera sia messa a fuoco sulla superficie corticale regolando l'anello di messa a fuoco.
- Applicare olio minerale sull'area di imaging per aumentare la trasparenza.
- Accendi i computer, la scheda del pannello LED e le apparecchiature di elettrofisiologia.
NOTA: Il pannello LED funziona meglio se posizionato di fronte all'animale per illuminare la finestra di imaging mentre le luci dall'alto sono spente. La luce è stata impostata su ~2.400 lux (95% di potenza) con un'impostazione della temperatura fredda di 4000K. - Impostazione del carico per iOS utilizzando Micro-Manager19,20,21,22.
- Premere Live per visualizzare il mouse sotto la telecamera e centrare il cranio dell'animale sotto la telecamera. Chiudere la finestra "Live".
- Premere Multi-D Acq.
- Nella finestra Acquisizione multidimensionale, selezionare i punti temporali desiderati.
NOTA: Si consiglia di contare 750 immagini a un intervallo di 250 ms. - Salva le immagini nel percorso del file desiderato e nel prefisso del nome.
- Collegare i pin d'oro dall'animale al connettore dell'headstage e poi all'headstage.
- Impostazione del carico per il software Intan.
- Fare clic sull'icona Scegli formato file e, nella finestra pop-up, selezionare un file per tipo di segnale Formato. In questo modo il file verrà salvato come ".dat" per un ulteriore utilizzo in MATLAB.
- Nella scheda BW in Larghezza di banda hardware, selezionare la larghezza di banda dell'amplificatore di 0,13-500 Hz.
- In Selettore di visualizzazione filtro, selezionare WIDE per coprire la gamma più ampia di segnali.
- Per selezionare il percorso del file desiderato da salvare, fare clic sull'icona Seleziona nome file.
- Eseguire l'impatto utilizzando un impattatore elettromagnetico.
NOTA: Le impostazioni dell'impattatore sono una velocità di impatto di 4 m/s e una deflessione di 5 mm.- Accendere l'impattatore e assicurarsi che la punta si ritragga e si estenda in modo appropriato premendo l'interruttore a 3 vie per ritrarre la punta ed estendere la punta. La punta deve essere estesa prima di posizionare l'animale sotto la punta.
- Muovendosi rapidamente, posizionare l'animale su un letto di schiuma e far scorrere il letto sotto la punta.
- Allineare la punta dell'impattatore sulla linea mediana e 1 mm di rostrale di bregma.
- Abbassare la punta dell'impattatore fino a toccare saldamente la parte superiore della testa dell'animale.
NOTA: Non spingere la punta verso il basso nella testa. - Spingere la leva per ritrarre la punta dell'impattatore e quindi abbassarla manualmente di 5 mm prima di attivare la leva di impatto.
- Rimuovere immediatamente l'animale dal letto di schiuma e posizionarlo sotto la telecamera per l'imaging entro 5 s, poiché la SD viene avviata dall'impatto.
- Avviare l'imaging iOS facendo clic su Acquisisci! nella finestra Acquisizione multidimensionale. Immagine per 4 minuti per catturare l'intera SD.
- Avviare la registrazione elettrofisiologica facendo clic sull'icona Registra sul software Intan.
- Rimuovi l'animale dal cuscinetto di schiuma e consentigli di riprendersi in un'arena aperta o in una gabbia domestica.
NOTA: Si raccomanda di registrare l'elettrofisiologia per almeno 1 ora per consentire il recupero della funzione della rete corticale. - Al termine della registrazione, scollegare l'animale dal tavolino e dal connettore e riposizionare l'animale nella sua gabbia.
NOTA: Si consiglia di attendere 24 ore tra ogni impatto e sessione di registrazione. L'animale può rimanere nella sua gabbia di casa per tutto il tempo al di fuori delle sessioni di registrazione.
3. Visualizzazione e quantificazione delle immagini iOS
- In ImageJ19,20,21,22, apri la pila di immagini facendo clic sulla sequenza File > Importa > immagini.
- Scorri manualmente le immagini per assicurarti che non ci siano movimenti o altri artefatti.
- Per generare il grafico della SD, creare una ROI utilizzando il cursore per disegnare un quadrato.
NOTA: Si consiglia di utilizzare un quadrato di 30 x 30 pixel. Si può usare qualsiasi forma o dimensione, ma assicurarsi che la dimensione del ROI non cambi tra gli animali. - Per creare un grafico, fare clic su Immagine > Pile > Traccia profilo asse Z. Sul grafico appena creato, fai clic sul pulsante live. Torna alla pila di immagini della SD e sposta il ROI fino a quando il grafico non mostra la curva SD. Il grafico dovrebbe apparire come un'onda Sin con un aumento iniziale seguito da un calo al di sotto della linea di base e un lento ritorno alla linea di base entro pochi minuti><. NOTA: I grafici possono essere espressi come unità arbitrarie (UA) o come percentuale di base utilizzando le prime immagini come media di base.
- Sul grafico generato, fare clic su Elenco per generare un elenco di valori che possono essere tracciati in altri software di generazione di grafici o Matlab.
- Per la visualizzazione, trasformare l'immagine in scala di grigi in una tabella di ricerca in ImageJ tramite Image > Tabelle di ricerca > Fire.
4. Analisi elettrofisiologica
NOTA: Si raccomanda che l'esperienza del laboratorio di Buzsaki e il loro codice generato da MATLAB siano ampiamente utilizzati per visualizzare e analizzare i dati di elettrofisiologia. L'analisi richiederà il download di MATLAB con un codice di attivazione istituzionale e il file zip "Buzcode" del laboratorio di Buzsaki tramite GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).
- Nel software di elettrofisiologia Intan, assicurarsi che i dati grezzi esportati vengano salvati in formato ".dat".
NOTA: Matlab può essere installato dal sito Web di MathWorks. Per l'acquisto e l'utilizzo di Matlab è necessario un codice di attivazione istituzionale o individuale. Per eseguire questa analisi è necessaria una certa esperienza pregressa con l'esecuzione di codice in Matlab. - Utilizzare la funzione di bz_LoadBinary del codice Buzaki per caricare i dati in Matlab.
NOTA: Esempio "'dati' = bz_LoadBinary ('percorso completo del file di dati','frequenza', frequenza di campionamento, nCanali, numero di canali); - Filtra il rumore CA utilizzando un filtro notch centrato a 60 Hz.
NOTA: Esempio notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, dati); - Isolare l'attività ad alta frequenza utilizzando un filtro passa-banda con un intervallo di 0,5-100 Hz, in conformità con le raccomandazioni del gruppo COSBID per l'analisi e la visualizzazione delle depolarizzazioni di diffusione (SD).
- Calcola lo spettrogramma di potenza utilizzando il comando pspectrum in MatLab.
- Per visualizzare, tracciare lo spettrogramma ad alta frequenza e lo spettrogramma di potenza sulla stessa scala temporale e in una colonna.
NOTA: Dai grafici, ci sarà un'estensione della depressione ad alta frequenza e della perdita di potenza.
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Risultati
Figura 1 illustra una rappresentazione grafica del setup sperimentale. Le viti di registrazione sono posizionate nella corteccia visiva primaria, con un’elettrodo a vite posizionato nel verme cerebellare come elettrodo di riferimento. Le viti craniche e i perni in oro sono fissati al cranio utilizzando colla cianoacrilica e cemento dentale. È fondamentale limitare il cemento dentale alla parte caudale del cranio per lasciare spazio all’impatto e all’imaging. La posizione dell’impatto, centra...
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Discussione
La diffusione delle depolarizzazioni è fondamentale in vari modelli di malattia, tra cui le lesioni cerebrali traumatiche (TBI), l'ictus e l'emicrania1. L'individuazione accurata delle SD è essenziale per comprendere il loro ruolo nei deficit comportamentali acuti e/o nell'attivazione del sistema neuroimmune a seguito di lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI)23,24. Per mitigare il rischio di perdere SD quando si utilizza un unico metod...
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIGMS P20GM109089 e Department of Defense PR200891.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 Vite a macchina | Micro vite USA | 00.90-118-M-SS-P, Amazon | |
| 0.8 mm diametro punta | da trapano PCB | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2.1 mm Sbavature micro punta da trapano | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| Amplificatore CA | Intan | RHD sistema | |
| C57BL / 6J mouse | Laboratorio Jackson | Jax#000664 | |
| Telecamera CCD | Mightex | TCE-1304-U | |
| Obiettivo di prolunga | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (buprenorfina a rilascio lento) | Midwest Veterinary Supply | Codice prodotto: 267.10000.3 | |
| Perno connettore dorato (femmina) | A-M Systems | 520100 | |
| Perno connettore dorato (maschio) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| Scheda LED | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Codice di attivazione istituzionale o individuale Colla | |
| cianoacrilica per uso medico | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Software per fotocamera | Immagine J | NA | |
| Perforatrice/lucidatrice per unghie | Makartt Fresa per unghie Lima elettrica | JD700 | |
| Connettori Omnetic | Omnetics | A79014-001 | |
| RHX Software di acquisizione dati | Intan | NA | |
| Filo non rivestito in acciaio inossidabile (0,005") | A-M Systems | 792800 | |
| Telaio stereotassico | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Teets 'cold cure' cemento dentale | A-M systems | 525000, 526000 | |
| Obiettivo per fotocamera XLR | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Riferimenti
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