Estrazione assistita da microonde di composti fenolici e antiossidanti per applicazioni cosmetiche utilizzando la tecnologia a base di polioli

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio l'utilizzo di un metodo di estrazione a microonde a base di polioli per l'estrazione di composti fenolici e antiossidanti naturali, che rappresenta un approccio pratico ed ecosostenibile allo sviluppo di estratti pronti all'uso.

Abstract

L'utilizzo di polioli come solventi verdi per l'estrazione di composti bioattivi da materiali vegetali ha attirato l'attenzione grazie alla loro sicurezza e al loro comportamento inerte con sostanze chimiche bioattive vegetali. Questo studio esplora l'estrazione sostenibile di composti fenolici e antiossidanti naturali dal silverskin del caffè utilizzando il metodo dell'estrazione assistita da microonde (MAE) con solventi a base di polioli: glicerina, glicole propilenico (PG), glicole butilenico (BG), metilpropandiolo (MPD), isopentildiolo (IPD), glicole pentilenico, 1,2-esandiolo e glicole esilenico (HG). È stata condotta un'analisi comparativa sulle estrazioni convenzionali e non convenzionali con solventi, concentrandosi sul loro impatto sui composti bioattivi del MAE, comprendendo parametri come il contenuto fenolico totale (TPC), il contenuto totale di flavonoidi (TFC) e le attività antiossidanti come il saggio di eliminazione dei radicali 1,1-difenil-2-pirilidrazil (DPPH), il saggio di eliminazione dei radicali 2,2'-azino-bis(-3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico) (ABTS) e il saggio del potere antiossidante riducente ferrico (FRAP). I valori più elevati sono stati osservati per TPC con estrazione acquosa-1,2-esandiolo (campione da 52,0 ± 3,0 mg GAE/g), TFC con estrazione acquosa-1,2-esandiolo (campione da 20,0 ± 1,7 mg QE/g), DPPH con estrazione acquosa da HG (campione da 13,6 ± 0,3 mg TE/g), ABTS con estrazione acquosa di glicole pentilenico (campione da 8,2 ± 0,1 mg TE/g) e FRAP con estrazione acquosa da HG (campione da 21,1 ± 1,3 mg Fe (II) E/g). Questa ricerca mira a far progredire la tecnologia di estrazione ecologica attraverso componenti vegetali naturali, promuovendo la sostenibilità riducendo al minimo l'uso di sostanze chimiche pericolose e riducendo il consumo di tempo ed energia, con potenziali applicazioni nei cosmetici.

Introduzione

Al giorno d'oggi, c'è una tendenza globale verso la consapevolezza ambientale nell'industria della bellezza, che porta i produttori a concentrarsi sulla tecnologia verde per l'estrazione di componenti vegetali utilizzando alternative sostenibili¹. In genere, i solventi tradizionali come l'etanolo, il metanolo e l'esano vengono utilizzati per estrarre componenti fenolici vegetali e antiossidanti naturali². Tuttavia, la presenza di residui di solventi all'interno degli estratti vegetali rappresenta un potenziale rischio per la salute umana, inducendo irritazione della pelle e degli occhi³, in particolare per quanto riguarda la loro applicazione prevista nei cosmetici. Di conseguenza, è difficile eliminare tali residui di solvente dagli estratti, un processo che richiede un notevole investimento in tempo, energia e risorse umane⁴. Recentemente, l'acqua surriscaldata, i liquidi ionici, i solventi eutettici profondi e i solventi bioderivati sono emersi come approcci promettenti per l'estrazione con solventi ecologici⁵. Tuttavia, il loro utilizzo è ancora limitato dalla separazione dei prodotti nei processi a base acquosa. Per affrontare queste sfide, lo sviluppo di estratti pronti all'uso emerge come una soluzione praticabile⁶.

I polioli sono spesso utilizzati nelle formulazioni cosmetiche come umettanti a causa della loro buona polarità e capacità di trattenere l'umidità dall'ambiente⁷. Inoltre, polioli come glicerina, glicole propilenico, glicole butilenico, metilpropandiolo, isopentildiolo, glicole pentilenico, 1,2-esandiolo e glicole esilenico possono essere utilizzati per le estrazioni vegetali. Sono considerati solventi non tossici, biodegradabili, ecologici, non reattivi e sicuri per l'uso nell'estrazione delle piante⁸. Inoltre, i polioli possono resistere al calore generato durante l'estrazione assistita da microonde (MAE) grazie ai loro punti di ebollizione elevati e alla polarità⁹. Questi polioli sono generalmente riconosciuti come sostanze chimiche sicure (GRAS) dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti. A differenza dei solventi convenzionali come l'etanolo o il metanolo, che possono richiedere una rimozione rigorosa dall'estratto a causa dei loro effetti potenzialmente dannosi, i polioli offrono il vantaggio di ridurre al minimo l'energia, il tempo e i costi associati ai processi di rimozione dei solventi¹⁰. Ciò non solo semplifica il processo di estrazione, ma migliora anche l'efficienza e la sostenibilità complessive del metodo di estrazione. Precedenti ricerche hanno impiegato polioli come il glicole propilenico e il glicole butilenico come solventi nell'estrazione di composti bioattivi dai fiori di Camellia sinensis ¹⁰ e dalla polpa di caffè¹¹, rivelando un potenziale significativo per il loro ruolo come solventi alternativi sostenibili nel processo di estrazione delle piante. Pertanto, il continuo sviluppo e l'ottimizzazione di un sistema solvente poliolo-acqua ha il potenziale per progressi significativi nella chimica verde e nelle pratiche industriali sostenibili.

Generalmente, i composti bioattivi presenti nelle piante sono sintetizzati come metaboliti secondari. Questi composti possono essere classificati in tre gruppi principali: terpeni e terpenoidi, alcaloidi e composti fenolici¹². Vari metodi di estrazione vengono utilizzati in diverse condizioni per isolare specifici composti bioattivi dalle piante. I composti bioattivi da materiali vegetali possono essere estratti utilizzando tecniche convenzionali o non convenzionali. I metodi tradizionali includono la macerazione, l'estrazione a riflusso e l'idrodistillazione, mentre i metodi non convenzionali consistono nell'estrazione assistita da ultrasuoni, nell'estrazione assistita da enzimi, nell'estrazione assistita da microonde (MAE), nell'estrazione pulsata assistita da campo elettrico, nell'estrazione di fluidi supercritici e nell'estrazione di liquidi pressurizzati¹³. Questi metodi non convenzionali sono progettati per migliorare la sicurezza utilizzando solventi e ausiliari più sicuri, migliorando l'efficienza energetica, prevenendo la degradazione dei componenti bioattivi e riducendo l'inquinamento ambientale¹⁴.

Inoltre, il MAE è tra le sofisticate tecnologie verdi per l'estrazione di composti bioattivi dalle piante. Le procedure di estrazione convenzionali richiedono una notevole quantità di tempo, energia e temperature elevate, che nel tempo potrebbero degradare i composti bioattivi sensibili al calore¹³. A differenza delle estrazioni termiche convenzionali, il MAE facilita l'estrazione di composti bioattivi generando un riscaldamento localizzato all'interno del campione, interrompendo le strutture cellulari e migliorando il trasferimento di massa, aumentando così l'efficienza dell'estrazione dei composti. Il calore viene trasferito dall'interno delle cellule vegetali tramite microonde, che operano sulle molecole d'acqua all'interno dei componenti della pianta¹³. Inoltre, MAE ha fatto progressi per migliorare l'estrazione e la separazione dei composti attivi, aumentando la resa del prodotto, migliorando l'efficienza dell'estrazione, richiedendo meno sostanze chimiche e risparmiando tempo ed energia prevenendo la distruzione dei composti bioattivi¹⁵.

Questa ricerca si concentra sull'estrazione di composti fenolici vegetali e antiossidanti naturali attraverso l'estrazione assistita da microonde (MAE) utilizzando diversi tipi di polioli come solventi. Vengono determinati il contenuto fenolico totale (TPC), il contenuto totale di flavonoidi (TFC) e le attività antiossidanti (DPPH, ABTS e FRAP) degli estratti di MAE a base di polioli. Inoltre, il MAE a base di polioli viene confrontato con il MAE utilizzando solventi convenzionali come acqua ed etanolo. Si prevede che questa ricerca contribuirà allo sviluppo di una tecnologia di estrazione sostenibile dal punto di vista ambientale per i componenti naturali, promuovendo la sostenibilità riducendo la dipendenza da sostanze chimiche pericolose, accorciando i tempi di lavorazione e riducendo al minimo il consumo di energia nella produzione di materie prime per potenziali applicazioni nell'industria cosmetica.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione sperimentale

1. Preparazione del campione di piante
   1. Raccogliere il caffè fresco silverskin (Coffea arabica) e asciugarlo a 60 °C in un essiccatoio a vaschette per 72 h¹¹.
   2. Macinare il caffè essiccato silverskin (CS) in una polvere fine utilizzando un macinino e conservarlo a temperatura ambiente per ulteriori analisi¹¹.
      NOTA: In questo studio, il CS fresco (C. arabica) è stato raccolto da Baan Doi Chang, distretto di Mae Suai, Chiang Rai, Thailandia. Il CS è un sottoprodotto ottenuto durante il processo di decorticazione che rimuove lo strato di pergamena dai chicchi di caffè essiccati dopo che le ciliegie sono state lavorate per rimuovere gli strati esterni di frutta¹⁶.
2. Prodotti chimici
   1. Utilizzare reagenti chimici di qualità analitica, ad eccezione dei solventi nell'esperimento.
      NOTA: Nell'esperimento sono stati utilizzati solventi di grado cosmetico.
   2. Utilizzare i solventi (acqua, etanolo, glicerina, glicole propilenico, glicole butilenico, glicole esilenico, isopentildiolo, 1-2 esandiolo, glicole pentilenico e metilpropandiolo) per l'estrazione di CS con MAE.

2. Processo di estrazione

1. Preparazione del campione e del solvente
   1. Preparare il campione e i solventi per la procedura MAE secondo un protocollo⁹ precedentemente riportato con alcune modifiche.
   2. Preparare ciascun solvente al 60% di concentrazione diluendo 60 ml di ciascun solvente con acqua distillata e regolando il volume a 100 ml per estrazioni in triplice copia.
      NOTA: Utilizzare acqua distillata al 100% per l'estrazione dell'acqua.
   3. Pesare 0,67 g di CS e miscelare con 20 mL di ciascun solvente di estrazione in un rapporto 1:30 in un contenitore di reazione (Figura 1A) per MAE.
      NOTA: La quantità massima solido-liquido per ciascun recipiente è di 2 g di campione e 20 ml di solvente.
   4. Aggiungere una barra di agitazione magnetica a ciascun recipiente per garantire una distribuzione uniforme del calore e del solvente all'interno del campione, migliorando l'efficienza del processo di estrazione e promuovendo una migliore resa di estrazione.
      NOTA: Se al processo di estrazione vengono applicati solventi non polari, è possibile utilizzare barre di agitazione in teflon al posto delle barre di agitazione magnetiche per fornire un riscaldamento efficace attraverso il sistema a microonde.
   5. Chiudere saldamente ogni recipiente con un attrezzo speciale (Figura 2) e posizionare tutti i recipienti nella camera MAE (Figura 1B).
2. Impostazione dello strumento e della procedura di estrazione assistita da microonde
   1. Eseguire la procedura di estrazione secondo il protocollo di riferimento con alcune modifiche⁹.
   2. Aprire lo schermo del monitor per impostare il metodo facendo clic sull'icona della cassetta degli attrezzi nella barra in alto e selezionando il rotore SK eT nella sezione accessori (Figura 3A, B).
   3. Selezionare la velocità di agitazione delle barre di agitazione facendo clic sulla sezione dell'agitatore e digitando 20% (Figura 4A).
      NOTA: La velocità di agitazione può essere selezionata da 0% a 100%.
   4. Fare clic sul settore della serratura della porta e impostarlo in modo che si attivi a temperature superiori a 80 °C (Figura 4B).
      NOTA: Questa impostazione garantisce la chiusura automatica della porta della camera quando la temperatura interna supera gli 80 °C.
   5. Fare clic sull'icona della tabella nella barra superiore (Figura 5A) e impostare il gradiente di temperatura (T1) su una durata di estrazione di 10 minuti, la potenza delle microonde su 1800 W e la temperatura su 120 °C.
   6. Attivare l'agitatore facendo clic sul pulsante dell'agitatore fino a quando non appare la luce verde.
   7. Impostare la velocità della ventola del ventilatore al livello 3 (massimo) (Figura 5B).
   8. Per mantenere il tempo di estrazione, selezionare la temperatura di estrazione desiderata (T2) impostando la durata di estrazione su 15 min, la potenza del microonde su 1800 W e la temperatura su 120 °C.
   9. Impostare la velocità dell'agitatore e della ventola come indicato nelle sezioni 2.2.6 e 2.2.7 (Figura 5A, B).
      NOTA: La temperatura massima e la potenza del microonde sono 260 °C e 1800 W.
   10. Impostare il tempo di raffreddamento facendo clic sul pulsante di raffreddamento nell'angolo in basso a sinistra dello schermo e selezionando la durata di 10 minuti (Figura 6).
   11. Salva il metodo facendo clic sull'icona di salvataggio nell'angolo in alto a destra dello schermo (Figura 7A).
   12. Assicurarsi che dopo aver salvato le condizioni del metodo, il grafico delle condizioni di estrazione venga visualizzato sullo schermo con il pulsante di riproduzione nell'angolo in basso a destra (Figura 7B).
   13. Avviare il processo di estrazione scegliendo il numero di recipienti utilizzati (Figura 7C).
       NOTA: È possibile utilizzare fino a 15 recipienti in un'estrazione e, se viene utilizzato il numero desiderato di recipienti, assicurarsi che i recipienti siano posizionati in modo equilibrato nella camera.
   14. Dopo l'estrazione, centrifugare gli estratti a 4 °C, 9072 x g, per 15 minuti, utilizzando una centrifuga refrigerata.
   15. Raccogliere il surnatante con una pipetta di vetro da 10 ml (Figura 8) e conservarlo a -20 °C nel congelatore per ulteriori studi.
       NOTA: A seconda della dimensione delle particelle e della densità del residuo vegetale, gli estratti richiederanno tempi di centrifugazione più lunghi (20-30 min).

3. Determinazione dei composti fenolici

1. Determinazione del contenuto fenolico totale
   1. Determinare il contenuto fenolico totale degli estratti di CS facendo riferimento al protocollo con alcune modifiche¹⁷.
   2. Preparare una diluizione di 10 volte dei campioni diluendo con acqua distillata.
   3. Miscelare 10 μl del campione diluito con 20 μl di reagente di Folin-Ciocalteu non diluito e lasciarli reagire per 3 minuti.
   4. Quindi, aggiungere 100 μl di soluzione di Na₂CO₃ al 7,5% alla miscela in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
   5. Preparare concentrazioni diverse per l'intervallo di concentrazione standard dell'acido gallico (vedere la Tabella 1 e la Tabella 2) diluendo con acqua distillata.
   6. Mescolarli con 20 μl di reagente di Folin-Ciocalteu e lasciarli reagire per 3 minuti.
   7. Quindi, aggiungere 100 μl di soluzione di Na₂CO₃ al 7,5% alla miscela in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
   8. Incubare la reazione per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
   9. Misurare l'assorbanza della soluzione di reazione a 765 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Figura 9A).
   10. Tracciare la curva di calibrazione standard utilizzando le concentrazioni dello standard e l'assorbanza a 765 nm (Figura 10A).
   11. Esprimere i risultati in mg di acido gallico equivalente (GAE) per g di campione e calcolare utilizzando la seguente equazione¹⁸:
       NOTA: mg di acido gallico equivalente (GAE) per g di campione = [((A₇₆₅ - c) / m)) in μg di acido gallico equivalente × Volume totale nel pozzetto di reazione (mL) x Diluizione × peso del campione secco (1 g) x Volume risultante dell'estratto (mL)] / [(Volume del campione aggiunto in ciascun pozzetto (mL) x Peso effettivo del campione secco (g) × fattore di conversione da μg a mg (1000)]
       dove, c = intercetta y, m = pendenza
2. Determinazione del contenuto totale di flavonoidi
   1. Determinare il contenuto totale di flavonoidi dell'estratto di CS secondo il protocollo con alcune modifiche¹⁷.
   2. Preparare una diluizione di 5 volte dei campioni diluendo con acqua distillata.
   3. Aggiungere 50 μl del campione diluito a 15 μl di NaNO₂ al 5% e incubare al buio per 5 minuti.
   4. Miscelare 15 μL di soluzione di AlCl₃ al 10% con la reazione e mantenerla a temperatura ambiente per 6 minuti.
   5. Quindi, aggiungere 100 μl di soluzione di NaOH 1 M alla reazione e incubare per altri 10 minuti.
   6. Misurare l'assorbanza della miscela a 510 nm (Figura 9B).
   7. Preparare diverse concentrazioni di quercetina nell'intervallo standard (vedere la Tabella 3 e 4) aggiungendole a 15 μL di NaNO₂ al 5% e incubando al buio per 5 minuti.
   8. Mescolare 15 μL di soluzione di AlCl₃ al 10% con la reazione e mantenere a temperatura ambiente per 6 minuti.
   9. Aggiungere 100 μl di soluzione di NaOH 1 M alla reazione e incubare ulteriormente per 10 minuti.
   10. Determinare l'assorbanza dello standard a 510 nm (Figura 9B).
   11. Tracciare la curva di calibrazione standard utilizzando le concentrazioni dello standard e l'assorbanza a 510 nm (Figura 10B).
   12. Esprimere i risultati in mg di quercetina equivalente (QE) per g del campione, calcolati con l'equazione¹⁹ come segue:
       NOTA: mg di quercetina equivalente (QE) per g di campione = [((A₅₁₀ - c) / m)) in μg di quercetina equivalente × Volume totale nel pozzetto di reazione (mL) x Diluizione × peso del campione secco (1 g) x Volume risultante dell'estratto (mL)] / [(Volume del campione aggiunto in ciascun pozzetto (mL) x Peso effettivo del campione secco (g) × fattore di conversione da μg a mg (1000)]
       dove, c = intercetta y, m = pendenza

4. Determinazione delle attività antiossidanti

1. Saggio di scavenging dei radicali 1,1-difenil-2-picryl-idrazil (DPPH)
   1. Determinare l'attività di eliminazione dei radicali DPPH dell'estratto di CS secondo il protocollo con alcune modifiche¹⁷.
   2. Preparare una diluizione di 10 volte dei campioni diluendoli con acqua distillata.
   3. Miscelare 20 μl dei campioni diluiti con 135 μl di soluzione DPPH 0,1 mM.
   4. Preparare diverse concentrazioni dell'intervallo di concentrazione standard di Trolox (vedere le Tabelle 5 e 6) mescolando con 135 μL di soluzione 0,1 mM di DPPH.
   5. Incubare la miscela al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
   6. Misurare l'assorbanza della risultante a 517 nm (Figura 9C).
   7. Tracciare la curva di calibrazione standard utilizzando le concentrazioni dello standard e la % di inibizione (Figura 10C).
   8. Calcolare la % di inibizione del test DPPH come segue:
      % Inibizione = [(assorbanza del controllo − assorbanza del campione)/ assorbanza del controllo] × 100
   9. Esprimere i risultati in mg della capacità antiossidante equivalente di Trolox per g di campione, calcolata con la seguente equazione²⁰:
      NOTA: mg di Trolox equivalente (TE) per g di campione = [((% inibizione-c) / m) in μg Trolox equivalente × Volume totale nel pozzetto di reazione (mL) x Diluizione × peso del campione secco (1 g) x Volume risultante dell'estratto (mL)] / [(Volume del campione aggiunto in ciascun pozzetto (mL) x Peso effettivo del campione secco (g) × fattore di conversione da μg a mg (1000)]
      dove, c = intercetta y, m = pendenza
2. Saggio di eliminazione dei radicali dell'acido 2,2′-Azino-Bis-3-Etilbenztiazolina-6-Solfonico (ABTS)
   1. Determinare l'attività di scavenging dei radicali ABTS dell'estratto di CS utilizzando il protocollo dal riferimento con alcune modifiche¹⁷.
   2. Preparare la soluzione madre ABTS·+ mescolando 7 mM di ABTS e 2,45 mM di persolfato di potassio (1:2) e incubare al buio a temperatura ambiente per 16 ore.
   3. Preparare la soluzione di lavoro mescolando 5 mL di soluzione madre ABTS·+ con 100 mL di acqua deionizzata.
   4. Miscelare 160 μl di soluzione di lavoro ABTS·+ con 10 μl del campione diluito 10 volte o dello standard Trolox a diverse concentrazioni (vedere Tabella 7 e Tabella 8).
   5. Incubare la reazione al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
   6. Determinare l'assorbanza della miscela a 734 nm (Figura 9D).
   7. Tracciare la curva di calibrazione standard utilizzando le concentrazioni dello standard e la % di inibizione (Figura 10D).
   8. Calcolare la % di inibizione del test ABTS utilizzando la seguente formula:
      % Inibizione = [(assorbanza del controllo - assorbanza del campione) / assorbanza del controllo] × 100.
      1. Esprimere i risultati in mg della capacità antiossidante equivalente di Trolox per g di campione, calcolata utilizzando la seguente equazione²¹:
         NOTA: mg di equivalente trolox (TE) per g di campione = [((% inibizione - c) / m)) in μg Trolox equivalente × Volume totale nel pozzetto di reazione (mL) x Diluizione × peso del campione secco (1 g) x Volume risultante dell'estratto (mL)] / [(Volume del campione aggiunto in ciascun pozzetto (mL) x Peso effettivo del campione secco (g) × fattore di conversione da μg a mg (1000)]
         dove, c = intercetta y, m = pendenza
3. Dosaggio del potere antiossidante riducente ferrico (FRAP)
   1. Determinare l'attività antiossidante ferrico-riducente dell'estratto di CS secondo il protocollo con alcune modifiche¹⁷.
   2. Preparare il reagente FRAP utilizzando un tampone acetato 30 mM a pH 3,6, che è una miscela di 10 mM di soluzione TPTZ in 40 mM di HCl e 20 mM di FeCl_{3,6H 2}O in un rapporto di 10:1:1.
   3. Mettere il reagente FRAP in un flacone ambrato fino al momento del bisogno.
      NOTA: Assicurarsi che il reagente FRAP sia marrone. Se contaminato da ioni metallici o altri composti reattivi, il reagente diventerà viola e dovrà essere scartato. Utilizzare solo reagenti preparati al momento.
   4. Preparare una diluizione di 5 volte dei campioni diluendoli con acqua distillata.
   5. Aggiungere 10 μl del campione diluito o 20 μl di FeSO_{4.7H 2}O a diverse concentrazioni standard (Tabella 9 e Tabella 10) a 180 μl della soluzione FRAP.
   6. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 4 min.
   7. Valutare l'assorbanza della miscela a 593 nm (Figura 9E).
   8. Tracciare la curva di calibrazione standard utilizzando le concentrazioni dello standard e l'assorbanza a 593 nm (Figura 10E).
   9. Esprimere i risultati in mg di FeSO₄ per g di campione, calcolati utilizzando la seguente equazione²¹:
      NOTA: mg di FeSO₄ equivalente [Fe (II) E) per g di campione = [((A₅₉₃ - c) / m)) in μg FeSO₄ equivalente × Volume totale nel pozzetto di reazione (mL) x Diluizione × peso del campione secco (1 g) x Volume risultante dell'estratto (mL)] / [(Volume del campione aggiunto in ciascun pozzetto (mL) x Peso effettivo del campione secco (g) × fattore di conversione da μg a mg (1000)]
      dove, c = intercetta y, m = pendenza
4. Eseguire tutti i saggi (TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP) di ciascun campione in triplice copia. In questo studio, l'acqua è stata utilizzata come bianco per la maggior parte dei saggi, ad eccezione del DPPH, dove l'etanolo è servito come bianco per affrontare l'assorbanza di fondo.

5. Analisi statistica

1. Utilizzare il software SPSS per effettuare un'analisi statistica dei dati sperimentali.
2. Condurre il test di normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
3. Confronta le sostanze bioattive e le attività antiossidanti dell'estratto di MAE CS a base di polioli e degli estratti di MAE CS a base di solventi convenzionali utilizzando l'ANOVA unidirezionale con i test a gamma multipla di Duncan.
4. Esprimi tutti i dati come media ± SD (n = 3) e definisci il livello di significatività a p < 0,05.

Risultati

Effetto dei solventi polioli e dei solventi convenzionali sul contenuto fenolico totale, sul contenuto totale di flavonoidi, sui dosaggi antiossidanti DPPH, FRAP e ABTS
La polarità del solvente deve essere compatibile con quella delle molecole attive mirate per migliorare l'efficienza di estrazione delle sostanze bioattive dalle piante²². Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando vari solventi (acqua, etanolo, glicerina, glicole propilenico, glicole butilenico, metilpropandiolo, isopentildiolo, glicole pentilenico, 1,2-esandiolo e glicole esilenico) per valutare il loro impatto sui composti bioattivi e sulle attività antiossidanti dell'estratto di caffè MAE silverskin.

Effetto dei solventi polioli e dei solventi convenzionali sul contenuto fenolico totale
È stato analizzato il contenuto fenolico totale di ciascuna estrazione con solventi diversi. Il contenuto fenolico più alto è stato prodotto nei campioni con 1,2-esandiolo acquoso (campione di 52,0 ± 3,0 mg di GAE/g), mentre il TPC più basso è stato rivelato nei campioni con estrazione con acqua (campione di 31,4 ± 4,3 mg di GAE/g), e questi valori erano significativamente diversi da quelli di tutte le altre condizioni. I campioni con glicole acquoso pentilenico hanno prodotto il secondo valore TPC più alto, seguiti da campioni con glicole acquoso butilenico, metilpropandiolo e altri sistemi solventi (Figura 11A). Confrontando campioni con solventi convenzionali (acqua e sistema acquoso-etanolo) e campioni con solventi a base di polioli, si possono osservare differenze significative nei valori di TPC (p < 0,05).

Effetto dei polioli, dei solventi e dei solventi convenzionali sul contenuto totale di flavonoidi
È stato analizzato il contenuto totale di flavonoidi di ciascuna estrazione con solventi diversi. Il contenuto di flavonoidi più elevato è stato ottenuto in campioni con 1,2-esandiolo acquoso (20,0 ± 1,7 mg di campione QE/g), dimostrando una differenza significativa rispetto a quello di tutti gli altri estratti. I campioni con isopentidiolo acquoso hanno rivelato il valore TFC più basso (8,8 ± 0,7 mg QE/g campione), che non era significativamente diverso dal propandiolo metilico acquoso e dagli estratti acquosi di etanolo. Inoltre, il secondo valore di TFC più alto è stato riscontrato nel campione con glicole acquoso-pentilenico, seguito da glicole acquoso-esilenico, glicole acquoso-propilenico, glicole acquoso-butilenico e acquosa glicerina (Figura 11B).

Effetto dei solventi polioli e dei solventi convenzionali sui saggi antiossidanti
Le attività antiossidanti degli estratti con polioli e solventi convenzionali sono state valutate utilizzando saggi DPPH, ABTS e FRAP. Il valore più alto per il test DPPH è stato misurato nei campioni con glicole acquoso esilenico (campione da 13,6 ± 0,3 mg TE/g) e il più basso nei campioni con etanolo acquoso (campione da 4,5 ± 0,2 mg GAE/g), e questi valori erano significativamente diversi da altri estratti (p < 0,05). I secondi valori DPPH più alti sono stati osservati nei campioni con 1,2-esandiolo acquoso, seguiti da glicole pentilenico acquoso, propandiolo metilico acquoso e altri sistemi solventi (Figura 11C).

Il valore ABTS più alto è stato misurato nei campioni con glicole pentilenico acquoso (8,2 ± 0,1 mg TE/g campione) e il più basso nei campioni con acqua (5,6 ± 0,04 mg GAE/g campione), e questi valori erano significativamente diversi da altri estratti (p < 0,05). I secondi valori più alti di ABTS sono stati rilevati nel glicole acquoso butilenico e nell'acquoso-1,2-esandiolo, seguiti da campioni con glicerina acquosa, metil propandiolo acquoso e altri sistemi solventi (Figura 11D).

I valori FRAP più elevati sono stati osservati nei campioni con glicole acquoso esilenico (21,1 ± 1,3 mg Fe (II) E/g campione e i più bassi nell'estrazione in acqua (11,5 ± 0,2 Fe (II) E/g campione), con questi valori significativamente diversi (p < 0,05) per i solventi rimanenti. Inoltre, i secondi valori FRAP più alti sono stati riscontrati nei campioni con glicole acquoso-pentilenico, seguiti da glicole acquoso-butilenico, glicerina acquosa e altri sistemi solventi (Figura 11E).

Confrontando le attività antiossidanti dei campioni con solventi convenzionali (acqua ed etanolo acquoso), quelli contenenti polioli hanno mostrato attività antiossidanti significativamente più elevate in tutti i saggi antiossidanti (DPPH, ABTS e FRAP) (p < 0,05).

Figura 1: Reazione in contenitori sperimentali e nella camera MAE. (A) Il campione e il solvente vengono aggiunti al recipiente bianco intercalare di un contenitore di teflon prima dell'estrazione. (B) Ogni contenitore viene posizionato all'interno della camera a microonde prima di iniziare l'estrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Utensili speciali per la chiusura dei recipienti di reazione. Dopo aver aggiunto il campione e il solvente al contenitore in teflon, i coperchi vengono applicati sulla parte superiore del contenitore, posizionati nel supporto del recipiente e fissati saldamente con gli strumenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Metodo di estrazione. (A) Metodo di estrazione, creato entrando nella sezione del metodo. (B) L'accessorio SK eT viene applicato per il processo MAE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Impostazione della velocità di agitazione e della funzione di blocco della porta. (A) Le barre di agitazione magnetiche all'interno di ciascun recipiente possono essere attivate scegliendo la velocità di agitazione. (B) La funzione di blocco della porta limita la temperatura, consentendo l'apertura della camera dopo l'estrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Impostazione delle condizioni di estrazione. (A) Accesso all'icona della tabella e impostazione delle condizioni di estrazione come tempo, temperatura e potenza del microonde. (B) Apertura del pulsante dell'agitatore e scelta della velocità del ventilatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Impostazione del tempo di raffreddamento. Applicazione del tempo di raffreddamento per ridurre la temperatura interna nella camera MAE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Avvio del processo di estrazione. (A) Salvataggio del metodo creato per l'estrazione. (B) Fare clic sull'icona di riproduzione per avviare il processo di estrazione. (C) Scelta del numero di recipienti per iniziare l'estrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagine dell'estratto finale dopo l'estrazione con MAE. Ottenimento del surnatante dopo la centrifugazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Le 96 piastre a pozzetti per determinare l'attività di scavenging TPC, TFC, DPPH, l'attività di scavenging ABTS e il saggio FRAP degli estratti. (A) Determinazione del TPC per la piastra standard dell'acido gallico a partire da una concentrazione di 2,5-75 μg/mL e estratti di campioni. (B) Determinazione del TFC per la piastra standard di quercetina a partire da concentrazioni di 2,5-50 μg/mL e test TFC per misurare gli estratti dei campioni. (C) Determinazione dell'attività di scavenging DPPH per la piastra standard Trolox a partire da concentrazioni di 0,25-12,5 μg/mL e la piastra di rilevamento dell'attività di scavenging DPPH degli estratti del campione. (D) Determinazione dell'attività di scavenging dell'ABTS per la piastra standard Trolox a partire da concentrazioni di 0,25-5 μg/mL e della piastra di rilevamento dell'attività di scavenging dell'ABTS degli estratti del campione. (E) Determinazione del test FRAP per la piastra standard FeSO₄ a partire da concentrazioni di 0,25-10 μg/mL e la piastra di rilevamento del test FRAP degli estratti del campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Le curve di calibrazione standard per l'attività di scavenging TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP. (A) La curva standard per la determinazione della TPC, tracciata dalle concentrazioni dello standard dell'acido gallico e dall'assorbanza ad A₇₆₅. (B) La curva standard per la determinazione del TFC, tracciata dalle concentrazioni dello standard di quercetina e dall'assorbanza ad A₅₁₀. (C) La curva standard per determinare l'attività di scavenging del DPPH, tracciata dalle concentrazioni dello standard Trolox e dalla % di inibizione. (D) La curva standard per determinare l'attività di scavenging dell'ABTS, tracciata dalle concentrazioni dello standard Trolox e dalla % di inibizione. (E) La curva standard per la misurazione del saggio FRAP, tracciata dalle concentrazioni dello standard del solfato ferroso e dall'assorbanza ad A₅₉₃. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: L'effetto dei tipi di solvente sul TPC, TFC, DPPH scvenging, l'attività di scavenging ABTS e il saggio FRAP nel MAE del caffè silverskin. (A) L'effetto dei tipi di solvente sul contenuto fenolico totale. (B) L'effetto dei tipi di solvente sul contenuto totale di flavonoidi. (C) L'effetto dei tipi di solvente sull'attività di scavenging del DPPH. (D) L'effetto dei tipi di solvente sull'attività di scavenging dell'ABTS. (E) L'effetto dei tipi di solvente sul saggio FRAP. I valori sono indicati come Media ± SD (n = 3). I valori con lettere in apice diverse esprimono una differenza statisticamente significativa (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione della curva standard dell'acido gallico. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 2,5-75 μg/mL nella piastra a 96 pozzetti. B = bianco, 1-7 = numero di pozzetti sulla piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Calcolo finale della concentrazione degli standard dell'acido gallico. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 2,5-75 μg/mL. Le concentrazioni finali (μg/mL) di acido gallico sono calcolate di conseguenza. Concentrazione finale (μg/mL) = (Concentrazione iniziale (mg/mL) × Volume iniziale (μL) / Volume finale (μL)) × (1000 μg/1 mg). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Preparazione della curva standard della quercetina. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 2,5-50 μg/mL nella piastra a 96 pozzetti. B = bianco, 1-7 = numero di pozzetti sulla piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Tabella di calcolo della concentrazione finale per gli standard di quercetina. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 2,5-50 μg/mL. Le concentrazioni finali (μg/mL) di quercetina sono calcolate di conseguenza. Concentrazione finale (μg/mL) = (Concentrazione iniziale (mg/mL) × Volume iniziale (μL) / Volume finale (μL)) × (1000 μg/1 mg). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Preparazione della curva standard Trolox nell'intervallo di concentrazione di 0,25-12,5 μg/mL. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 0,25-12,5 μg/mL nella piastra a 96 pozzetti. B = bianco, C = controllo, 1-7 = numero di pozzetti sulla piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 6: Calcolo della concentrazione finale degli standard Trolox per il saggio DPPH. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 0,25-12,5 μg/mL, comprese le concentrazioni finali (μg/mL) di Trolox. Concentrazione finale (μg/mL) = (Concentrazione iniziale (mg/mL) × Volume iniziale (μL) / Volume finale (μL)) × (1000 μg/1 mg). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 7: Preparazione della curva standard Trolox nell'intervallo di concentrazione di 0,25-5 μg/mL. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard stock di 0,25-5 μg/mL nella piastra a 96 pozzetti. B = bianco, C = controllo, 1-7 = numero di pozzetti sulla piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 8: Calcolo della concentrazione finale degli standard Trolox per il saggio ABTS. Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 0,25-5 μg/mL, comprese le concentrazioni finali (μg/mL) di Trolox. Concentrazione finale (μg/mL) = (Concentrazione iniziale (mg/mL) × Volume iniziale (μL) / Volume finale (μL)) × (1000 μg/1 mg). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 9: Tabella di calcolo della concentrazione finale per gli standard FeSO₄ . Preparazione della preparazione di un intervallo di concentrazione standard di 2,5-100 μg/mL, comprese le concentrazioni finali (μg/mL) di FeSO₄. Concentrazione finale (μg/mL) = (Concentrazione iniziale (mg/mL) × Volume iniziale (μL) / Volume finale (μL)) × (1000 μg/1 mg). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 10: Preparazione della curva standard FeSO₄ . Preparazione dell'intervallo di concentrazione standard di 0,25-10 μg/mL nella piastra a 96 pozzetti. B = vuoto. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Vari fattori giocano un ruolo cruciale nell'implementazione di successo del MAE, come il contenuto fitochimico dei componenti della pianta, la durata dell'estrazione, la temperatura, la potenza delle microonde, il rapporto solido-liquido e la concentrazione del solvente¹³. Le piante mostrano tipicamente profili variabili di sostanze fitochimiche; Pertanto, la selezione di piante naturali ricche di antiossidanti e composti fenolici è essenziale²³. Inoltre, i diversi costituenti bioattivi mostrano una varietà di polarità a seconda del solvente utilizzato. Allo stesso modo, i solventi mostrano polarità diverse. Dato che la polarità dei solventi gioca un ruolo cruciale nel determinare l'efficacia dell'estrazione di composti bioattivi dalle materie prime, è imperativo che la polarità del solvente si allinei con quella delle molecole bioattive bersaglio²⁴.

In questo studio, sono stati utilizzati vari polioli per estrarre polifenoli e antiossidanti dal silverskin del caffè utilizzando il MAE. I polifenoli sono prevalentemente polari e i solventi con alta polarità in genere aumentano la resa dei composti fenolici²⁵. Rispetto ai campioni con acqua ed etanolo, quelli che impiegano polioli diversi hanno dimostrato una maggiore efficienza in tutte le risposte misurate, inclusi TPC, TFC e saggi antiossidanti come DPPH, ABTS e FRAP. Studi precedenti supportano i risultati secondo cui le miscele acquose-polioli possono migliorare la resa di estrazione dei composti bioattivi rispetto alle miscele acquose-etanolo ^9,10,11. Quando si confrontano diversi polioli, i campioni con uno specifico sistema acquoso-poliolo non sono riusciti a produrre il valore più alto. Tuttavia, è interessante notare che i campioni con 1,2-esandiolo acquoso hanno prodotto i valori più alti nei saggi TPC e TFC. Nel frattempo, quelli con glicole acquoso esilenico hanno prodotto i valori più alti nei test DPPH e FRAP e l'estratto acquoso di glicole pentilenico ha mostrato i valori più alti nel test ABTS. La variazione dei valori ottenuti da diversi saggi come TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP all'interno di sistemi acquosi-polioli può essere attribuita a diversi fattori, tra cui le caratteristiche distintive dei polioli impiegati. I polioli mostrano differenze di viscosità, polarità e punti di ebollizione, influenzando direttamente la loro efficacia nell'estrazione di composti bioattivi da materiali vegetali²⁶. Una possibile spiegazione può essere attribuita al principio del "simile dissolve il simile", in cui il particolare sistema solvente è il più appropriato per facilitare il trasferimento di massa di particolari composti bioattivi²⁷. Ciò sottolinea l'importanza di selezionare un solvente con una polarità che corrisponda a quella del composto bioattivo mirato.

Un'altra possibile ragione potrebbe essere il fatto che la differenza nel numero di gruppi ossidrilici (-OH) presenti nel solvente influisce in modo significativo sulla resa dei composti fenolici²⁸. Tra questi polioli, solo la glicerina contiene tre gruppi -OH, mentre i restanti polioli in questo studio contengono due gruppi -OH. I solventi con un numero maggiore di gruppi -OH tendono a mostrare una viscosità più elevata rispetto a quelli con meno²⁹. Un'elevata viscosità può ostacolare il trasferimento efficiente dei composti attivi durante il processo di estrazione, riducendo così la resa complessiva. Inoltre, la costante dielettrica di un solvente, strettamente legata alla sua polarità, gioca un ruolo cruciale nel determinare la sua capacità di sciogliere soluti polari o non polari. I solventi con costanti dielettriche più elevate sono più abili a sciogliere i soluti polari, e quelli con costanti inferiori sono più adatti ai soluti non polari³⁰. Tra i polioli, la glicerina mostra una costante dielettrica relativamente alta di 41,14, mentre il glicole esilenico, il glicole pentilenico e l'1,2-esandiolo dimostrano costanti dielettriche inferiori di 25,86, 17,31 e 15,45, rispettivamente^31,32. I risultati di questo studio suggeriscono che i composti bioattivi all'interno del campione possono comprendere costituenti a basso polarismo.

L'efficienza dell'estrazione può essere migliorata ottimizzando la selezione e la composizione dei solventi e potrebbero essere necessarie ulteriori sperimentazioni per identificare il sistema di solventi più adatto. Sebbene l'indagine mostri un potenziale, è limitata dal suo esclusivo focus sull'estrazione assistita da microonde con polioli e dalla sua valutazione limitata di altre variabili, tra cui la durata dell'estrazione, la temperatura, la concentrazione del solvente, il rapporto solido-liquido e la potenza di estrazione. Inoltre, è necessario uno studio meccanicistico per capire come funzionano i polioli a causa delle loro varie costanti dielettriche, che influenzano direttamente la loro solubilità di soluti polari o non polari. Le differenze nelle costanti dielettriche tra i polioli evidenziano l'importanza di studiare i loro meccanismi specifici nell'estrazione di composti bioattivi. Tale ricerca offrirebbe preziose informazioni sulle interazioni solvente-soluto, aiutando l'ottimizzazione e la selezione di sistemi di solventi per processi di estrazione efficienti.

Per quanto riguarda il processo MAE, ci sono alcune limitazioni. Sebbene il MAE possa fornire un riscaldamento rapido, un controllo preciso della temperatura può essere difficile, portando potenzialmente al surriscaldamento e alla degradazione dei composti termicamente sensibili³³. Tuttavia, l'impostazione della potenza delle microonde per il gradiente e la temperatura di estrazione può essere impostata sulla stessa potenza delle microonde per evitare la frustrazione della temperatura durante l'estrazione. Inoltre, il MAE presenta limitazioni sui componenti dell'impianto sensibili al calore. Tuttavia, l'avanzata tecnologia Ethos X MAE può ridurre al minimo il rischio di deterioramento supportando un riscaldamento efficace a una durata più breve utilizzando il riscaldamento dielettrico³⁴. Ogni recipiente della camera MAE ha una propria capacità massima limitata di solidi e liquidi. Il rapporto solido-liquido oltre questa limitazione può anche influenzare notevolmente la concentrazione degli estratti¹¹. La dissoluzione tra solvente e soluto può essere promossa utilizzando le barre di agitazione, portando potenzialmente a un'estrazione efficace e a una resa più elevata³⁵. Inoltre, i composti fenolici e flavonoidi estratti all'interno degli estratti possono essere verificati attraverso ulteriori analisi, come la cromatografia liquida con spettrometria di massa a triplo quadrupolo (LC-QQQ) e la cromatografia liquida con quadrupolo a tempo di volo (LC-QTOF), per stabilire la presenza di specifici composti bioattivi e le rispettive quantità³⁶.

L'estrazione di polifenoli e antiossidanti dal silverskin del caffè utilizzando polioli acquosi attraverso il MAE ha dimostrato una maggiore efficienza rispetto all'acqua e agli estratti acquosi di etanolo. Sulla base dei risultati derivati dal MAE a base di polioli degli estratti di CS, è stato osservato che l'impiego dei sistemi acquoso di glicole esilenico, acquoso 1,2-esandiolo e glicole acquoso pentilenico ha portato a rese di estrazione significativamente più elevate di composti bioattivi e capacità antiossidanti. Inoltre, questi risultati sottolineano il potenziale dell'utilizzo di tali composti estratti per successive analisi investigative. L'utilizzo dei polioli come solventi verdi per l'estrazione di composti bioattivi da materiali vegetali attraverso il MAE promette benefici ambientali e una maggiore resa dei composti bioattivi, offrendo un approccio sostenibile con il potenziale per l'uso in applicazioni cosmetiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,2-esandiolo	Chanjao Longevity Co., Ltd.
2,2 -Azino-bis 3 etilbenzotiazolina-6-solfonico acido sale diammonico (ABTS)	Sigma	A1888
2,2-Difenil-1-pirilidrazil (DPPH)	Sigma	D9132
2,4,6-Tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)	Sigma	93285
2-Bilancia digitale	Ohaus		Pioneer
4-Bilancia digitale	Denver	SI-234
Acido 6-idrossi-2,5,7,8 tetrametilcromano -2-carbossilico (Trolox)	Sigma	238813
piastra a 96 pozzetti	SPL Life Science
Etanolo assoluto	RCI Labscan	64175
Acido acetico	RCI Labscan	64197
Cloruro di alluminio	Loba Chemie	898
Automatico pipetta	Labnet		Biopett
Glicole butilenico	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Ethos X estrazione avanzata a microonde	Milestone Srl, Sorisole, Italia
Solfato ferroso	Ajex Finechem	3850
Reagente di Folin-Ciocalteu	Loba Chemie	3870
Congelatore SF	Sanyo	C697(GYN)
Acido gallico	Sigma	398225
Grinder	Ou Hardware Products Co., Ltd
Glicole esilenico	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Acido cloridrico (37%)	RCI Labscan	AR1107
Cloruro di ferro (III)	Loba Chemie	3820
Isopentyldiol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Metanolo	RCI Labscan	67561
Metilpropandiolo	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Pentylene	glycol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Potassio persolfato	Loba Chemie	5420
Glicole propilenico	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Quercetina	Sigma	Q4951
Centrifuga refrigerata	Hettich
Acetato di sodio	Loba Chemie	5758
Carbonato di sodio	Loba Chemie	5810
Idrossido di sodio	RCI Labscan	AR1325
Nitrito di sodio	Loba Chemie	5954
Lettore di micropiastre SPECTROstar Nano	BMG- LABTECH
SPSS software	IBM SPSS Statistics 20
Essiccatore a vaschette	Francia Etuves	XUE343