Fotobiomodulazione sotto controllo elettroencefalografico del sonno per la stimolazione della rimozione linfatica delle tossine dal cervello di topo

Sommario

Questo studio presenta la tecnologia non invasiva e portatile della fotobiomodulazione transcranica sotto controllo elettroencefalografico per la stimolazione della rimozione linfatica delle tossine (ad es. beta amiloide solubile) dal cervello di topi maschi BALB/c invecchiati e non anestetizzati durante il sonno profondo naturale.

Abstract

I vasi linfatici meningei (MLV) svolgono un ruolo importante nella rimozione delle tossine dal cervello. Lo sviluppo di tecnologie innovative per la stimolazione delle funzioni della MLV è una direzione promettente nel progresso del trattamento di varie malattie cerebrali associate ad anomalie della MLV, tra cui il morbo di Alzheimer e il Parkinson, i tumori cerebrali, le lesioni cerebrali traumatiche e le emorragie intracraniche. Il sonno è uno stato naturale in cui i processi di drenaggio del cervello sono più attivi. Pertanto, la stimolazione del drenaggio cerebrale e dei MLV durante il sonno può avere gli effetti terapeutici più pronunciati. Tuttavia, tali tecnologie commerciali attualmente non esistono.

Questo studio presenta una nuova tecnologia portatile di fotobiomodulazione transcranica (tPBM) sotto controllo elettroencefalografico (EEG) del sonno progettata per fotostimolare la rimozione delle tossine (ad esempio, beta amiloide solubile (Aβ)) dal cervello di topi BALB/c invecchiati con la capacità di confrontare l'efficacia terapeutica di diverse risorse ottiche. La tecnologia può essere utilizzata nella condizione naturale di una gabbia domestica senza anestesia, mantenendo l'attività motoria dei topi. Questi dati aprono nuove prospettive per lo sviluppo di fototecnologie non invasive e clinicamente promettenti per la correzione dei cambiamenti legati all'età nelle funzioni MLV e nei processi di drenaggio del cervello e per la pulizia efficace dei tessuti cerebrali da metaboliti e tossine. Questa tecnologia è destinata sia a studi preclinici sulle funzioni del cervello addormentato sia allo sviluppo di trattamenti clinicamente rilevanti per le malattie cerebrali legate al sonno.

Introduzione

I vasi linfatici meningei (MLV) svolgono un ruolo importante nella rimozione delle tossine e dei metaboliti dai tessuti cerebrali ^1,2,3. Il danno delle MLV in varie malattie cerebrali, tra cui tumori, lesioni cerebrali traumatiche, emorragie e processi neurodegenerativi, è accompagnato da una diminuzione delle funzioni della MLV che porta alla progressione di queste patologie 1,2,3,4,5,6 . Pertanto, lo sviluppo di metodi per la stimolazione dei MLV apre nuovi orizzonti nell'emergere di tecnologie efficaci per il trattamento delle malattie cerebrali. Recentemente, è stata proposta una tecnologia non invasiva per un'efficace fotobiomodulazione transcranica (tPBM) per stimolare i MLV e rimuovere tossine come sangue e Aβ dal cervello 5,7,8,9,10,11,12. È interessante notare che il sonno profondo è un fattore naturale per l'attivazione dei processi di drenaggio linfatico nel cervello ^13,14. Sulla base di questo fatto, è logico supporre che il tPBM dei MLV durante il sonno possa avere effetti terapeutici più efficaci rispetto alla veglia 9,11,12,15. Tuttavia, attualmente non esistono tecnologie commerciali per la tPBM durante il sonno¹⁶. Inoltre, gli esperimenti sugli animali per studiare gli effetti terapeutici del tPBM vengono eseguiti in anestesia, necessaria per fornire con precisione la luce al cervello. Tuttavia, l'anestesia influisce in modo significativo sul drenaggio del cervello, il che riduce la qualità dei risultati della ricerca¹⁷.

Aβ è un prodotto metabolico della normale attività neurale¹⁸. Poiché è stato stabilito nei neuroni corticali di ratto in coltura, l'Aβ viene rilasciato da essi ad alti tassi nello spazio extracellulare (2-4 molecole/neurone/s per Aβ)¹⁹. Ci sono prove che la forma disciolta di Aβ, situata negli spazi extracellulari e perivascolari, è più tossica per i neuroni e le sinapsi²⁰. L'Aβ solubile viene rapidamente eliminato dal cervello umano durante 1-2,5 ore²¹. I MLV sono i tunnel per la rimozione dell'Aβ solubile dal cervello ^1,7 che diminuisce con l'età, portando all'accumulo di Aβ nel cervello invecchiato ^1,22. Ci sono prove che le anomalie extracellulari dei livelli di Aβ nel cervello sono correlate alle prestazioni cognitive nell'invecchiamento e sono associate allo sviluppo della malattia di Alzheimer (AD)^23,24. Pertanto, i roditori anziani e anziani sono considerati alternative ai modelli transgenici per lo studio dell'amiloidosi, incluso AD^25,26.

Questo studio presenta una tecnologia tPBM originale e portatile sotto controllo elettroencefalografico (EEG) del sonno con movimenti oculari profondi o non rapidi (NREM) in topi maschi BALB/c non anestetizzati di età diverse per stimolare la clearance linfatica di Aβ dal cervello al sistema linfatico periferico (i linfonodi cervicali profondi, dcLN).

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio", la Direttiva 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e le linee guida del Ministero della Scienza e dell'Alta Istruzione della Federazione Russa (Nº 742 del 13.11.1984), che sono state approvate dalla Commissione di Bioetica dell'Università Statale di Saratov (Protocollo n. 7, 22.09.2022).

1. Assemblaggio hardware

1. Tagliare un pezzo di foglio di textolite di 1,5 mm di spessore alle dimensioni di 1,5 mm x 2 mm. Questa parte sarà indicata come circuito stampato (PCB) a diodi a emissione di luce (LED) (Figura 1C).
2. Saldare un LED a un circuito stampato, come mostrato nella Figura 1.
3. Saldare due fili di rame intrecciati ai pin di un LED e poi coprirli con un manicotto.
4. Stampare il modello 3D del telaio (Figura 1A); posizionare un LED (Figura 1B) e dei magneti (Figura 1D) sul telaio; posizionare una rondella (Figura 1E) sulla testa del mouse.
5. Per assemblare il circuito (Figura 2), attenersi alla seguente procedura.
   1. Innanzitutto, collegare il resistore (Figura 2; R1) tra un anodo LED e la porta 5 V su Arduino.
   2. Quindi, collegare un catodo LED al transistor a effetto di campo (MOSFET) a semiconduttore di ossido di metallo (Figura 2; Q1) drenare. Quindi, collegare la sorgente MOSFET a terra.
   3. Collegare la resistenza di pull-down (Figura 2; R2) tra il gate MOSFET e la massa. Infine, collega il gate MOSFET al pin 3 su Arduino.
6. Collega una protezione della tastiera con display a cristalli liquidi (LCD) ad Arduino.
7. Stampa i modelli 3D della custodia, la piastra di copertura e i pulsanti. Inserire la scheda Arduino con la schermatura della tastiera LCD, il MOSFET e il connettore LED nella custodia, come mostrato nella Figura 3.

2. Guida al software (Figura 4)

1. Scarica lo sketch di Arduino (file .ino) e aprilo tramite l'ambiente di sviluppo integrato (IDE) di Arduino (file di codifica supplementare 1).
2. Selezionare la porta di comunicazione (COM) corretta e aggiornare il firmware.
3. L'interfaccia include due colonne. Utilizzare i pulsanti Sinistra e Destra per spostarsi tra queste colonne. L'indicatore di selezione si trova a sinistra della colonna.
4. La colonna di sinistra sullo schermo è il campo di selezione del ciclo di lavoro PWM (Pulse Width Modulation). Utilizzare i pulsanti Su e Giù per regolare il ciclo di lavoro. Raggiungi la dose di 10/20/30 Dj/cm² di PBM con un corrispondente ciclo di lavoro PWM del 2%/4%/6% in una sessione di 17 minuti.
5. La colonna di destra sullo schermo è il campo RUN/Off. Per selezionare questa colonna, premere il tasto destro sulla tastiera, quindi premere Seleziona. Quando il processo è in esecuzione, l'indicatore di attività lampeggerà e il testo sul pulsante RUN cambierà in OFF.
   NOTA. I topi vengono preparati per gli esperimenti per un periodo di 10 giorni, compreso l'impianto di elettrodi EEG, l'impianto di un catetere cronico nel ventricolo laterale destro per l'iniezione di Aβ fluorescente e il posizionamento di una piastra per PBM.

3. Impianto di un sistema di registrazione EEG (Figura 5)

1. Pesare il topo e anestetizzarlo con una miscela di Zoletil 100 e Xylanite (100 mg/kg; 10 mg/kg, rispettivamente) mediante iniezione intramuscolare nella coscia.
2. Quando i riflessi di ritiro del piede posteriore e la risposta al pizzico della coda cessano, posizionare il mouse in un telaio stereotassico sopra un termoforo (Figura 5A).
3. Applicare un unguento oftalmico sulle palpebre per prevenire la secchezza dei bulbi oculari durante l'intervento chirurgico. Ripetere questa procedura ogni volta che è necessario.
4. Radere la testa nell'area dalle ossa nasali alle ossa occipitali utilizzando una macchina da barba e sterilizzare prima la pelle esposta con alcol.
5. Usando le forbici da dissezione diritte, taglia il cuoio capelluto, tienilo con una micro pinza, pulisci il cranio dalla fascia e asciugalo con tamponi di cotone. Se necessario, utilizzare gli agenti emostatici.
6. Utilizzando un trapano con un diametro di 1,3 mm, praticare 2 fori nelle ossa temporali su ciascun lato lungo le coordinate: AP = -1 mm per il primo paio di viti e AP = -3 mm per il secondo paio di viti.
7. Immergere le viti EEG con i cavi nell'alcool per 5 minuti. Successivamente, posizionare le viti EEG nella soluzione salina.
8. Posizionare quattro viti argentate con elettrodi nei fori a una profondità di 1 mm (Figura 5B).
9. Fissare le viti sulla superficie del cranio utilizzando acrilico dentale in modo che gli elettrodi che si estendono da esse si trovino verso il naso dell'animale (Figura 5C). Lasciare indurire l'acrilico dentale per 15 minuti.
10. Collegare un sensore di registrazione EEG al naso dell'animale utilizzando l'acrilico dentale. Lasciare indurire l'acrilico dentale per 30 minuti (Figura 5D).
11. Posizionare gli elettrodi EMG sul retro del muscolo orbicolare dell'occhio utilizzando una pinzetta curva e fissarli con l'acrilico dentale. Lasciare indurire l'acrilico dentale per 15 minuti (Figura 5E).
12. Collegare gli elettrodi EEG all'incavo argentato del sensore e saldarli utilizzando una stazione di saldatura. Successivamente, fissare gli elettrodi EEG utilizzando l'acrilico dentale (Figura 5F).
13. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea fino a quando l'animale non si riprende completamente dall'anestesia.
14. Successivamente, mettere il topo in una gabbia domestica individuale con libero accesso a cibo e acqua con ibuprogene (40 mg/kg in 200 ml di acqua) per l'analgesia dopo l'intervento chirurgico per 10 giorni.

4. Impianto di una placca per PBM

1. Pesare il topo e anestetizzarlo con una miscela di Zoletil 100 e xilanite (100 mg/kg; 10 mg/kg, rispettivamente) mediante iniezione intramuscolare nella coscia 7 giorni dopo l'impianto del sistema di registrazione EEG.
2. Quando i riflessi di ritiro del piede posteriore e la risposta al pizzico della coda cessano, fissare il mouse in un sistema stereotassico.
3. Applicare un unguento oftalmico sulle palpebre per prevenire la secchezza dei bulbi oculari durante l'intervento chirurgico. Ripetere questa procedura ogni volta che è necessario.
4. Fissare una placca metallica con un diametro di 5 mm sull'osso occipitale del cranio utilizzando acrilico dentale e pinza Dumont. Lasciare indurire l'acrilico dentale per 15 minuti (Figura 6).

5. Preparazione di un catetere cronico

1. Segnare sull'ago da insulina un segmento a 2 cm dal lato dell'estremità smussata.
2. Fissare l'ago per insulina nel portaago dal lato della punta smussata al segmento contrassegnato.
3. Posizionare un catetere in polietilene PE-10 da 2 cm su tutta la lunghezza rimanente dell'ago.
4. Riempire il catetere con una soluzione salina e coprirlo con un tappo di plastica per sigillarlo.

6. Impianto di un catetere cronico nel ventricolo laterale destro

1. Dopo l'impianto della placca per PBM, praticare un foro di trapanazione alle coordinate AP = -0,5 mm e ML = 1,2 mm, con un diametro di 1,5 mm, utilizzando un trapano.
2. Posizionare il catetere in polietilene PE-10 in un supporto stereotassico e inserirlo nel cranio del topo (DV = 2 mm). Successivamente, fissalo usando l'acrilico dentale. Lasciare indurire l'acrilico dentale per 15 minuti (Figura 7).
3. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea fino a quando l'animale non si riprende completamente dall'anestesia.
4. Successivamente, mettere il topo in una gabbia domestica individuale con libero accesso a cibo e acqua con ibuprogene (40 mg/kg in 200 ml di acqua) per l'analgesia dopo l'intervento chirurgico per 10 giorni.

7. tPBM sotto controllo EEG del sonno NREM

1. Collegare qualsiasi sistema di registrazione EEG commerciale al connettore sulla testa del mouse e impostare il valore richiesto del ciclo di lavoro PWM.
2. Monitorare il segnale EEG e attendere l'attività del ritmo delta. Se viene rilevato il sonno NREM, avviare il processo PBM e interrompere il processo se il sonno NREM passa al sonno REM (Rapid Eye Movement) o alla veglia. La dose aumenta ad ogni interazione fino a raggiungere il valore richiesto.
3. Quando si ottiene la dose di PBM richiesta, la sessione è terminata.

8. Imaging confocale della rimozione linfatica di Aβ dal cervello di topo

1. Collegare un catetere da 10 cm a un ago per insulina.
2. Utilizzando una siringa Hamilton con un ago da 29 G, preparare un'infusione di beta-amiloide fluorescente (FAβ) in un volume di 5 μl nel catetere. Lasciare che il catetere rimanga su una siringa di Hamilton.
3. Fissare la mano del topo e collegare il catetere attraverso un ago al catetere cronico impiantato.
4. Collegare il catetere a un microiniettore. Successivamente, posiziona il mouse in una casella individuale;
5. Selezionare la velocità di iniezione 0,1 μL/min nel menu del microiniettore e premere il pulsante Start.
6. Iniettare FAβ nel ventricolo laterale destro.
7. Dopo la somministrazione di FAβ, eseguire PBM utilizzando un LED per 61 minuti seguendo l'algoritmo: 17 minuti - luce e 5 minuti - pausa su 61 minuti.
8. Dopo PBM, iniettare per via endovenosa qualsiasi tracciante per marcare i vasi cerebrali attraverso la coda.
9. Dopo l'iniezione, sopprimere i topi utilizzando la camera di eutanasia CO₂ .
10. Usando forbici affilate e dritte, praticare una piccola incisione trasversale nella pelle lungo la trachea, tenendo la pelle con una pinzetta dritta non affilata.
11. Praticare un'incisione longitudinale lungo l'intera lunghezza del collo utilizzando le forbici dritte.
12. Usando una pinzetta curva, prelevare le ghiandole salivari e separarle accuratamente dal tessuto connettivo. Posizionare un divaricatore della ferita sulla sezione aperta dell'incisione e fissarlo in modo tale da spingere indietro i tessuti circostanti.
13. Esamina l'area tra la trachea e il muscolo cleidomastoideo usando due pinzette curve da entrambi i lati del collo.
14. Quando il linfonodo cervicale profondo (dcLN) viene rilevato su ciascun lato, rimuovere i dcLN usando una pinzetta dritta con estremità smussate e tagliarli dal tessuto connettivo.
15. Porre i dcLN in una capsula di Petri con una soluzione salina e coprirli con un vetro di copertura orientato orizzontalmente (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
16. Utilizzare qualsiasi microscopio confocale commerciale per ottenere immagini di interi dcLN.

9. Analisi dell'Aβ nei lisati dei tessuti cerebrali

1. Preparare i campioni per il test.
   1. Eutanasia dei topi utilizzando la camera di eutanasia CO₂ .
   2. Decapita il topo, rimuovi la pelle dalla sua testa e rimuovi i muscoli dal cranio.
   3. Praticare due incisioni con forbici affilate e diritte dal grande forame occipitale al canale uditivo.
   4. Usando una pinzetta dritta, separa la parte ventrale del cranio, l'osso occipitale e le ossa che formano le cavità dell'orecchio medio.
   5. Usando una pinzetta, separa il cervello dalle ossa parietali e frontali.
   6. Usando le forbici dritte, rimuovere la mascella superiore e tagliare i bulbi olfattivi.
   7. Metti il cervello nella soluzione fisiologica.
   8. Sciacquare il cervello con soluzione salina fredda tamponata con fosfato per rimuovere accuratamente il sangue in eccesso e pesare prima dell'omogeneizzazione.
   9. Preparare un tampone di lisi pH 7,2 contenente 1,5 mm di KH₂PO₄, 8 mm di Na₂HPO₄, 3 mm di KCl, 137 mm di NaCl e 0,1% di Tween20, 10 mM EDTA con una miscela inibitoria della proteasi appena preparata.
   10. Omogeneizzare il cervello in un tampone di lisi fresco (1 mL di tampone di lisi per 200-500 mg di campione di tessuto) con un omogeneizzatore di vetro su ghiaccio.
   11. Sonicare una sospensione risultante con un disgregatore di celle a ultrasuoni fino a quando la soluzione non è chiarificata.
   12. Centrifugare gli omogeneizzati a 10.000 × g per 5 minuti.
   13. Raccogliere il surnatante utilizzando una pipetta meccanica a canale singolo (100-1000 μL) e dosare immediatamente o aliquotare e conservare a ≤-20 °C.
2. Preparare i seguenti materiali: lettore di micropiastre con filtro da 450 nm ± 10 nm; provette per microcentrifuga; pipette monocanale o multicanale con puntali ad alta precisione e monouso; carta assorbente per tamponare la micropiastra; contenitore per soluzione di lavaggio; 0,01 mol/L (o 1x) soluzione salina tamponata con fosfato (PBS); e acqua deionizzata o distillata.
3. Preparare i reagenti.
   1. Portare i componenti del kit e i campioni a temperatura ambiente (RT; 18-25 °C) prima dell'uso.
   2. Ricostituire lo standard con 1,0 ml di diluente standard, conservare per 10 minuti a RT e agitare delicatamente (per non formare schiuma). La soluzione madre standard è di 300 pg/mL. Preparare 5 provette contenenti un volume di 0,6 mL di diluente standard e fare una serie di diluizioni triple.
   3. Impostare 5 punti (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33,33 pg/mL, 11,11 pg/mL e 3,70 pg/mL) dello standard diluito e le ultime provette con un bianco contenente solo il diluente standard (0 pg/mL).
   4. Centrifugare rapidamente le soluzioni stock del reagente di rilevamento A e del reagente di rilevamento B prima dell'uso. Diluirli 100 volte con i diluenti A e B per preparare la concentrazione di lavoro.
   5. Diluire 20 mL della soluzione di lavaggio concentrata (30x) con 580 mL di acqua deionizzata o distillata per ottenere 600 mL di soluzione di lavaggio (1x).
   6. Aspirare il dosaggio necessario della soluzione con i puntali sterilizzati e non versare nuovamente la soluzione residua nel flaconcino.
4. Eseguire il test.
   1. Determinare i pozzetti per uno standard diluito, un bianco e un campione.
   2. Preparare 5 pozzetti per i punti standard e un pozzetto per il bianco.
      1. Aggiungere rispettivamente 50 μl di diluizioni standard, bianco e campione nei pozzetti corrispondenti. Quindi, aggiungere immediatamente 50 μl di reagente di rilevamento A a ciascun pozzetto.
      2. Agitare delicatamente la piastra (si consiglia uno shaker per micropiastre) e coprirla con un sigillante per piastre. Incubare la piastra a 37 °C per 1 ora. Il reagente di rilevamento A può apparire torbido. Scaldare la soluzione a RT e mescolare delicatamente fino a quando non appare uniforme.
   3. Aspirare la soluzione e lavare ogni pozzetto con 350 μl di soluzione di lavaggio 1x con l'aiuto di un flacone a spruzzo, una pipetta multicanale, un erogatore di collettori o un lavatore automatico. Lasciare la piastra indisturbata per 1-2 minuti. Agganciare la piastra su carta assorbente per rimuovere completamente il liquido rimanente da tutti i pozzetti. Ripetere questa procedura 3 volte.
   4. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare o decantare il tampone di lavaggio rimanente. Garantire la completa rimozione della soluzione di lavaggio capovolgendo la lastra e tamponandola contro la carta assorbente.
   5. Aggiungere 100 μl di soluzione di lavoro del reagente di rilevamento B a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C dopo averla coperta con il sigillante per piastre.
   6. Ripetere le fasi di aspirazione/lavaggio per un totale di 5 minuti.
   7. Aggiungere 90 μl di soluzione di substrato a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un nuovo sigillante per piastre. Incubare per 10-20 minuti a 37 °C (non superare i 30 minuti) al riparo dalla luce. Dopo aver aggiunto la soluzione di substrato, il liquido diventerà blu.
   8. Aggiungere 50 μl di una soluzione di arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione. L'aggiunta della soluzione di arresto farà ingiallire il liquido. Picchiettare il piatto su un lato per mescolare il liquido. Se il cambiamento di colore è incoerente, picchiettare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione accurata.
   9. Garantire la completa rimozione dell'acqua e delle impronte digitali sul fondo della piastra e l'assenza di formazione di bolle sulla superficie del liquido. Quindi, leggere immediatamente la piastra in un lettore di micropiastre a 450 nm.
5. Calcola i risultati.
   1. Determinare la media delle letture duplicate per ogni standard, controllo e campione. Tracciare una curva standard con il log della concentrazione di Aβ 1-42 sull'asse y e dell'assorbanza sull'asse x.
   2. Disegna una curva di adattamento attraverso i punti, che può essere determinata dall'analisi di regressione.
   3. Se sono stati utilizzati campioni diluiti, moltiplicare la concentrazione ottenuta dalla curva standard per il fattore di diluizione.
      NOTA: Per l'ELISA, in questo studio è stato utilizzato un kit per la determinazione di Aβ 1-42.

Risultati

Nella prima fase, lo studio si è concentrato sulla determinazione della dose di luce efficace (un LED da 1050 nm) per la stimolazione della rimozione linfatica di Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN in topi BALB/c maschi adulti svegli (2-3 mesi, 26-29 g). Le dosi di luce sono state selezionate in modo casuale come 10 J/cm², 20 J/cm^{2 e} 30 J/cm² sulla base dei nostri precedenti studi sugli effetti del tPBM sulla rimozione di diversi coloranti e dei globuli rossi dal cervello ^{7,8,9,10,11,12}. I risultati dell'imaging confocale presentati nella Figura 8A-E dimostrano chiaramente gli effetti dose-correlati di tPBM sulla rimozione linfatica di Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN. La dose di luce di 30 J/cm² è risultata la più efficace rispetto alle dosi di luce di 10 J/cm² e 20 J/cm² a causa di una maggiore intensità di un segnale fluorescente da Aβ nei dcLN.

Nella seconda fase, la ricerca è stata finalizzata a trovare le lunghezze d'onda più efficaci per l'eliminazione linfatica dell'Aβ fluorescente dal cervello di topi maschi BALB/c adulti (2-3 mesi, 26-29 g) svegli utilizzando le piattaforme fotografiche portatili con diverse lunghezze d'onda della luce (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) e modalità (1050 nm in regime continuo e a impulsi) con la stessa dose (30 J/cm²). La Figura 9A-E mostra i risultati dell'imaging confocale delle dcLN nei gruppi testati. I risultati hanno rivelato che la lunghezza d'onda della luce di 1050 nm in modalità a impulsi rispetto ad altre lunghezze d'onda testate (880 nm e 1300 nm) e la lunghezza d'onda di 1050 nm in regime continuo hanno causato una rimozione significativamente più elevata di Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN.

Nella fase finale, sono stati studiati gli effetti di un LED a 1050 nm in modalità a impulsi sul livello di Aβ solubile nel cervello di topi anziani prima e dopo il ciclo di 10 giorni di tPBM sotto un controllo EEG di NREM e veglia. L'analisi immunologica ha rivelato che il contenuto di Aβ solubile nel cervello era significativamente più alto nei topi maschi BALB/c di età (16-18 mesi, 30-33 g) rispetto ai topi maschi adulti BALB/c (2-3 mesi, 26-29 g). Il ciclo di 10 giorni di tPBM durante il sonno profondo, ma non durante la veglia, ha ridotto efficacemente il livello di Aβ solubile nel cervello di topi anziani al livello di Aβ solubile nel cervello di topi adulti (Figura 10).

Figura 1: Processo di assemblaggio dell'hardware. (A) Telaio stampato in 3D, (B) LED, (C) Circuito stampato a LED, (D) magneti, (E) rondella metallica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Circuito di controllo LED. R1 - resistenza di regolazione della corrente, R2 - resistenza di pull-down per il gate MOSFET, Q1 - MOSFET a canale n. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vista 3D del case. (A) Piastra di copertura stampata in 3D, (B) Pulsanti stampati in 3D, (C) Schermo della tastiera LCD per Arduino, (D) Arduino, (E) Case stampato in 3D, (F) Connettore LED, (G) MOSFET di canale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Software. (A) Pulsante di selezione, (B) Pulsante sinistro, (C) Pulsante Su/Giù, (D) Pulsante destro, (E) Indicatore di selezione, (F) Campo di selezione del ciclo di lavoro PWM, (G) Campo RUN/OFF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Impianto di un sistema di registrazione EEG. (A) Preparazione del cranio; (B) Impianto di viti; (C) Fissaggio di viti con l'acrilico dentale; (D) Fissazione del sensore di registrazione EEG; (E) Impianto e fissazione degli elettrodi EMG sul retro del muscolo orbicolare dell'occhio; (F) Gli elettrodi saldati all'incavo argentato del sensore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Fissazione di una placca per PBM sull'osso occipitale del cranio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Impianto di un catetere cronico nel ventricolo laterale destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Gli effetti di diverse dosi di LED 1050 nm sulla rimozione linfatica di Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN. (A-D) Immagini rappresentative di dcLN dal gruppo di controllo (A) e dal gruppo PBM con (B) 10 J/cm², (C) 20 J/cm² e (D) 30 J/cm²; (E) Analisi quantitativa dell'accumulo di Aβ fluorescente nei dcLN dei gruppi testati (n = 8, ANOVA unidirezionale con test post hoc di Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Gli effetti di diverse lunghezze d'onda dei LED sulla rimozione linfatica di Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN. (A-D) Immagini rappresentative di dcLN del gruppo PBM con modalità di impulso 1050 nm (ImpMode_1050, A), 880 nm (ImpMode_880, B), 1300 nm (ImpMode_1300, C) e modalità continua 1050 nm (ContMode_1050 nm, D); (E) Analisi quantitativa dell'accumulo di Aβ fluorescente nei dcLN dei gruppi testati (n = 8, ANOVA unidirezionale con test post hoc di Duncan, **p < 0,01). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Gli effetti PBM (LED 1050 nm in modalità impulso, 30 J/cm²) durante NREM e lo stato di veglia sul livello di Aβ solubile (pg/mL) nel cervello di topi adulti e anziani. Un'ANOVA unidirezionale con test post hoc di Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File di codifica supplementare 1: lcd1key.ino Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

I MLV sono un obiettivo importante per lo sviluppo di tecnologie innovative per la modulazione del drenaggio cerebrale e la rimozione di detriti e rifiuti cellulari dal cervello, specialmente in soggetti anziani la cui funzione MLV diminuisce ^1,22. In uno stato omeostatico, il sonno profondo è associato all'attivazione naturale della pulizia del tessuto cerebrale^13,14. Pertanto, è ovvio aspettarsi che la stimolazione dei MLV durante il sonno profondo sarà più efficace che durante la veglia^15,16. La nuova tecnologia non invasiva e portatile di tPBM sotto controllo EEG del sonno per la stimolazione della rimozione linfatica di Aβ solubile dal cervello di topi maschi anziani è presentata qui.

Le dimensioni ridotte della piattaforma fotografica (7 mm x 11 mm) e il suo peso ridotto (1 g) ne consentono il montaggio saldo e sicuro sulla testa dei topi, mantenendo la loro naturale attività motoria. Ciò elimina anche la necessità di utilizzare l'anestesia durante la tPBM. Il tPBM durante il sonno profondo può essere eseguito utilizzando qualsiasi dispositivo commerciale per un controllo EEG delle fasi del sonno. Pertanto, la nostra tecnologia consente di eseguire lo studio in una gabbia domestica, preservando le condizioni più naturali per gli animali.

Nella prima fase, una lunghezza d'onda del LED di 1050 nm è stata selezionata in modo casuale per lo studio della dose efficace di foto-effetti sulla rimozione linfatica di Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN in topi adulti svegli (2-3 mesi). La scelta di questa lunghezza d'onda è correlata ai dati precedenti sulla stimolazione efficace dei MLV con un laser a 1267 nm 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34. Questa lunghezza d'onda promuove la generazione diretta di ossigeno singoletto in piccole quantità nel tessuto cerebrale e nelle sue meningi, che è uno dei meccanismi alla base del PBM dei MLV ^8,28,34. Tuttavia, gli effetti biologici sia di un laser a 1267 nm che di un LED a 1050 nm sono correlati alla generazione dell'eccitazione dell'ossigeno singoletto³⁵. Infatti, le bande di un laser a 1267 nm ± 20 nm e di un LED a 1065 nm ± 15 nm sono correlate alla formazione dell'ossigeno singoletto dallo stato fondamentale di una molecola di ossigeno. Una banda di un laser a 1267 nm pompa una molecola di ossigeno direttamente nel primo stato di singoletto eccitato, mentre una banda di LED a 1065 nm corrisponde a un'energia vibrazionale aggiuntiva, che decade molto velocemente, rilasciando calore nell'ambiente. Inoltre, l'assorbimento d'acqua nella lunghezza d'onda di 1065 nm è dieci volte inferiore rispetto alla lunghezza d'onda di 1267 nm, il che lo rende più favorevole per la ricerca biologica³⁵. Inoltre, un LED da 1050 nm è disponibile in commercio sul mercato ed è molto più economico rispetto al raro e costoso laser da 1267 nm. Si noti che la banda di emissione di un LED da 1050 nm utilizzato in questo studio era larga 40 nm e si sovrappone solo parzialmente a una banda di ossigeno singoletto. Tuttavia, abbiamo dimostrato l'effetto significativo del tPBM sulla rimozione linfatica dell'Aβ fluorescente dal cervello ai dcLN utilizzando un LED a 1050 nm (30 J/cm²). La dose di luce di 30 J/cm² è risultata la più efficace rispetto alle dosi di luce di 10 J/cm² e 20 J/cm² in base alla maggiore intensità di un segnale fluorescente da Aβ nelle dcLN. Pertanto, un LED da 1050 nm può essere molto utile per l'applicazione della tecnica tPBM all'uomo, il che è coerente con la tendenza comune di utilizzare i LED invece dei laser per PBM^36,37.

Nella seconda fase, la ricerca mirava a rispondere alla domanda su quali lunghezze d'onda della luce siano più efficaci per l'eliminazione linfatica dell'Aβ fluorescente dal cervello di topi adulti svegli. Questa fase dello studio è stata eseguita utilizzando una piattaforma fotografica portatile con diverse lunghezze d'onda della luce (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) e modalità (1050 nm in regime continuo e a impulsi) con la stessa dose (30 J/cm²). Queste lunghezze d'onda sono state scelte a causa dell'uso diffuso nella pratica clinica di tPBM (880 nm) e di nuovi LED costosi (1300 nm), che potrebbero essere potenzialmente clinicamente significativi. Inoltre, sono state confrontate le modalità pulsata e continua solo per il LED da 1050 nm come risorsa luminosa. Questi dati dimostrano chiaramente che solo un LED a 1050 nm in modalità a impulsi rispetto ad altre lunghezze d'onda e i 1050 nm in modalità continua causano una significativa rimozione linfatica di Aβ dal cervello ai dcLN. Questi risultati sono coerenti con i risultati di altri ricercatori, che indicano anche il vantaggio dell'utilizzo di un PBM pulsato per ottenere efficacemente effetti biologici 38,39,40.

Nella fase finale, quando sono state selezionate la lunghezza d'onda, la dose e la modalità efficaci, è stato effettuato lo studio degli effetti di un LED da 1050 nm in modalità a impulsi sul livello di Aβ solubile nel cervello di topi anziani prima e dopo il corso di 10 giorni di tPBM sotto un controllo EEG di NREM e veglia. L'analisi immunologica ha rivelato che il contenuto di Aβ solubile nel cervello era significativamente più alto nei topi anziani (16-18 mesi) rispetto ai topi adulti (2-3 mesi). È interessante notare che il ciclo di 10 giorni di tPBM durante il sonno profondo, ma non durante la veglia, ha ridotto efficacemente il livello di Aβ solubile nel cervello di topi anziani al livello di Aβ solubile nel cervello di topi adulti. In altri studi è stato notato anche un aumento del contenuto di Aβ nel tessuto cerebrale di topi e ratti sani con l'età^25,26, che può essere associato a una diminuzione correlata all'età delle funzioni MLV che porta a una pulizia inefficace del tessuto cerebrale da questa proteina tossica ^1,22. Il tPBM più efficace nella rimozione dell'Aβ solubile dal tessuto cerebrale nei topi addormentati rispetto a quelli svegli può essere spiegato dall'attivazione naturale del drenaggio del tessuto cerebrale durante il sonno. La morfologia della MLV cambia significativamente con l'età, portando a una ridotta rimozione linfatica dei metaboliti dal cervello invecchiato²². Tuttavia, il tPBM durante il sonno aiuta a ripristinare la rimozione linfatica dell'Aβ solubile dal tessuto cerebrale dei topi anziani al livello degli animali adulti.

Considerando la dispersione dell'energia luminosa quando passa attraverso il cranio, il tPBM limita i suoi effetti solo sui MLV senza penetrare in profondità nei tessuti cerebrali. Tuttavia, nonostante il fatto che i vasi linfatici non siano ancora stati trovati direttamente nei tessuti cerebrali dell'uomo e degli animali, stanno emergendo prove crescenti che indicano la presenza del sistema linfatico cerebrale 41,42,43,44. Questo spiega i risultati che mostrano la rimozione delle tossine (sangue e Aβ) dalle strutture profonde del cervello (il sistema ventricolare, l'ippocampo) ai MLV e più avanti verso la periferia (dcLNs^)5,7. Nel corso di un secolo, le conoscenze si sono accumulate, indicando una stretta connessione tra il drenaggio del cervello e il sistema linfatico periferico⁴⁵. Anche in assenza di una rete linfatica generalmente riconosciuta nel sistema nervoso centrale, ci sono fatti che indicano la rimozione linfatica di macromolecole dalle parti profonde del cervello alla periferia 1,2,3,4,5,6,7 Questo spiega anche perché il tPBM, agendo solo sui MLV, stimola la clearance del sangue e dell'Aβ dal cervello 5^{, 7}.

In sintesi, questo studio presenta una tecnologia portatile di tPBM sotto controllo EEG del sonno progettata per foto-stimolare la rimozione delle tossine utilizzando l'esempio di Aβ solubile dal cervello di topi anziani con la capacità di confrontare l'efficacia terapeutica di diverse risorse ottiche. La tecnologia può essere utilizzata nella condizione naturale di una gabbia domestica senza anestesia, mantenendo la naturale attività motoria dei topi. Questi dati aprono nuove prospettive per lo sviluppo di fototecnologie non invasive e clinicamente promettenti per correggere i cambiamenti legati all'età nelle funzioni MLV e nei processi di drenaggio del cervello e per l'efficace pulizia dei tessuti cerebrali da metaboliti e tossine. La tecnologia proposta per la fotostimolazione del drenaggio cerebrale e la rimozione linfatica delle tossine dal cervello ha effetti limitati sui MLV a causa della dispersione di energia luminosa quando passa attraverso il cranio. Pertanto, la tecnologia può essere utilizzata per sviluppare nuovi metodi per il trattamento delle malattie cerebrali associate alla disfunzione MLV. I foto-effetti stimolanti più pronunciati sui MLV si osservano nel sonno profondo (NREM), che richiede l'uso di PBM sotto controllo EEG. Ciò crea alcune difficoltà (tecniche, di programmazione) per il controllo simultaneo dell'inizio del sonno profondo e dell'apporto di esposizione alla luce.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catetere	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0,28 mm ID & 0,61 mm OD
CO2 camera	Legante, Germania	CB-S 170
Microscop confocale	Nikon, Giappone	A1R MP
Acrilico dentale	Zermack, Polonia-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forcipe	Stoelting, USA	52100-07
Evans Colorante blu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Svizzera	29 G ago
Ibuprofene	Sintez OJSC, Russia	N/A	Ago
insulina	INSUPEN, Italia	31 G, 0,25 mm x 6 mm
Levomekol unguento antibatterico	Nizhpharm	D06C	Per uso esterno alla dose di 40 mg/g, 1 volta al giorno
Micro pinza	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuga	Gyrozen, Corea del Sud	GZ-1312
Microiniettore	Stoelting, USA	53311
Pinzetta non affilata	Stoelting, USA	52108-83P
Sistema PINNACLE	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	Sistema per la registrazione EEG (2 canali) ed EMG (1 canale) dei topi
Rasatrice	Braun	Serie 3310s
Pipette monocanale e multicanale	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Cloruro di sodio	Kraspharma, Russia	N/A
Stazione di saldatura	AOYUE, Cina	N/A
Telaio stereotassico	Stoelting, USA	51500
Forbici da dissezione diritte	Stoelting, USA	52132-10P
Tetraciclina	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Pinzetta per unguento per gli occhi
	Stoelting, USA	52100-03
Disgregatore cellulare ad ultrasuoni	Biobase, Cina	USD-500
Divaricatore per ferite	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Miorilassante
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, Francia	N/A	Anestesia generale