Metodologia per lo studio delle interazioni dei recettori di membrana della vitamina A e della proteina opsina con i loro ligandi nella generazione della proteina retinilidene

Sommario

Qui, descriviamo due metodi quantitativi per studiare le interazioni proteina-ligando dei recettori di membrana della vitamina A e dell'opsina del fotorecettore con i rispettivi ligandi fisiologici.

Abstract

La distribuzione alimentare della vitamina A/all-trans retinolo (ROL) in tutto il corpo è fondamentale per mantenere la funzione retinoide nei tessuti periferici e generare la proteina retinilidene per la funzione visiva. RBP4-ROL è il complesso di ROL con la proteina legante il retinolo 4 (RBP4), presente nel sangue. Due recettori di membrana, il recettore 2 della proteina legante il retinolo 4 (RBPR2) nel fegato e STimulato dall'acido retinoico 6 retinolo (STRA6) nell'occhio, legano RBP4 circolatorio e questo meccanismo è fondamentale per internalizzare il ROL nelle cellule. Stabilire metodi per studiare la cinetica recettore-ligando è essenziale per comprendere la funzione fisiologica dei recettori della vitamina A per l'omeostasi dei retinoidi. Utilizzando saggi di risonanza plasmonica di superficie (SPR), possiamo analizzare le affinità di legame e i parametri cinetici dei recettori di membrana della vitamina A con il suo ligando fisiologico RBP4.

Queste metodologie possono rivelare nuove informazioni strutturali e biochimiche dei motivi di legame di RBP4 in RBPR2 e STRA6, che sono fondamentali per comprendere gli stati patologici di carenza di vitamina A. Nell'occhio, il ROL internalizzato viene metabolizzato in 11-cis retinale, il cromoforo visivo che si lega all'opsina nei fotorecettori per formare la proteina retinilidenica, la rodopsina. L'assorbanza della luce provoca l'isomerizzazione cis-trans della retina 11-cis, inducendo cambiamenti conformazionali nella rodopsina e la successiva attivazione della cascata di fototrasduzione. La diminuzione delle concentrazioni di ROL sierica e oculare può influire sulla formazione della proteina retinilidene, che a sua volta può causare un'errata localizzazione della rodopsina, l'accumulo di opsina apoproteica, cecità notturna e degenerazione del segmento esterno dei fotorecettori, portando a retinite pigmentosa o amaurosi congenita di Leber.

Pertanto, le metodologie spettrofotometriche per quantificare il complesso retinico opsina-11-cis accoppiato al recettore della proteina G nella retina sono fondamentali per comprendere i meccanismi di degenerazione delle cellule retiniche negli stati patologici sopra menzionati. Con queste metodologie complete, i ricercatori saranno in grado di valutare meglio l'apporto alimentare di vitamina A nel mantenimento dell'omeostasi sistemica e oculare dei retinoidi, che è fondamentale per la generazione e il mantenimento delle concentrazioni di proteina retinilidene nei fotorecettori, che è fondamentale per sostenere la funzione visiva negli esseri umani.

Introduzione

La vitamina A/retinolo/ROL ottenuti con la dieta è un componente importante che svolge un ruolo nella funzione visiva ^1,2. Il cromoforo 11-cis retinal, un metabolita della vitamina A alimentare, si lega all'opsina del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) per generare la proteina retinilidenica, la rodopsina, nei fotorecettori. Quando la luce cade sull'occhio, la configurazione della rodopsina subisce un cambiamento fondamentale attraverso la conversione della sua componente 11-cis-retinica in all-trans-retinal. Questo cambiamento di configurazione innesca una cascata di fototrasduzione all'interno dei fotorecettori dei bastoncelli, convertendo la luce in un segnale elettrico, che viene trasmesso alla corteccia visiva nel cervello attraverso il nervo ottico 3,4,5,6,7,8,9,10 . La diminuzione delle concentrazioni di ROL sierica e oculare può influire sulla formazione della proteina retinilidene, che a sua volta causa l'errata localizzazione dell'opsina, l'accumulo di opsina apoproteica, la cecità notturna e la degenerazione dell'OS dei fotorecettori, portando alla retinite pigmentosa o all'amaurosi congenita di Leber, che può causare cecità ^3,10.

Il retinolo all-trans è la forma di trasporto fondamentale della vitamina A nella dieta ed è la fonte da cui derivano tutti i retinoidi funzionali e i metaboliti della vitamina A nella dieta. Il fegato funge da organo principale per l'immagazzinamento della vitamina A nella dieta. Il retinolo epatico viene trasportato attraverso il siero come complesso con la proteina legante il retinolo 4 (RBP4). RBP4, espresso principalmente nel fegato, forma un olocomplesso con il substrato del retinolo e la transtiretina (TTR), che entra in circolo 11,12,13,14,15,16,17. Il rapporto di un recettore di superficie cellulare per RBP4 negli anni '70 ha portato all'ipotesi di proteine di trasporto di membrana che aiutano il trasporto dei retinoidi dentro e fuori le cellule. Il recettore della superficie cellulare per il retinolo legato a RBP4 (RBP4-ROL) è stato identificato come STimulato dall'acido retinoico 6 retinolo (STRA6) nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dell'occhio. STRA6 si lega al complesso olo-RBP4 circolatorio e trasporta il retinolo legato a RBP4 attraverso l'RPE per essere utilizzato dai fotorecettori^18,19. Le mutazioni in STRA6 possono portare a una miriade di malattie e fenotipi associati a ridotte concentrazioni di ROL oculari. Le mutazioni di STRA6 durante lo sviluppo possono portare ad anoftalmia, microftalmia e altri sintomi non oculari che si sovrappongono ai fenotipi associati alla sindrome di Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 è espresso in diversi organi e tessuti, come l'RPE nell'occhio, ma non in tutti i tessuti^26,27. Sebbene il sito principale di stoccaggio dei retinoidi sia il fegato, STRA6 non è espresso nel fegato.

Alapatt e colleghi hanno scoperto che il recettore 2 della proteina legante il retinolo 4 (RBPR2) legava RBP4 con elevata affinità ed era responsabile dell'assorbimento del retinolo legato a RBP4 nel fegato, simile a STRA6 nell'RPE²⁸. È stato riportato che RBPR2 condivide l'omologia strutturale con STRA6 29,30,31. Si propone che RBP4 si leghi ai residui S294, Y295 e L296 su RBPR2, un dominio di legame agli amminoacidi parzialmente conservato tra RBPR2 e STRA6 29,30,31. Da questi studi, si propone che i recettori di membrana della vitamina A come STRA6 e RBPR2, che contengono uno o più residui/domini di legame extracellulare, interagiscano con RBP4-ROL circolatorio. I recettori di membrana, quindi, svolgono un ruolo importante nel legame del recettore alla RBP4 circolatoria per l'internalizzazione di ROL nei tessuti bersaglio, come il fegato e l'occhio.

Nella prima parte di questo studio, abbiamo utilizzato la risonanza plasmonica di superficie (SPR) per studiare l'interazione di due recettori di membrana della vitamina A (RBPR2 e STRA6) con il loro ligando fisiologico RBP4³¹. Le affinità di legame e la cinetica di associazione/dissociazione dei complessi proteina-ligando possono essere misurate in tempo reale utilizzando SPR. Questa metodologia mirava a fornire informazioni cinetiche, strutturali e biochimiche critiche sui motivi di legame di RBP4 in RBPR2 e STRA6, che sono fondamentali per comprendere gli stati patologici di carenza di vitamina A^31,32. Come accennato in precedenza, il ROL circolatorio viene internalizzato nell'RPE tramite STRA6 per generare il cromoforo 11-cis retinico, che si lega all'opsina per generare la proteina retinilidene, la rodopsina, nei fotorecettori³³. Abbiamo utilizzato metodologie di spettrofotometria per quantificare la GPCR-opsina e il suo ligando 11-cis complesso retinico nei lisati retinici murini, che è fondamentale per comprendere i meccanismi della proteina retinilidene, la rodopsina, negli stati patologici oculari della Retinite Pigmentosa o dell'Amaurosi Congenita di Leber³⁴. In generale, questi protocolli possono essere applicati per studiare in vitro le conseguenze fisiologiche di RBP4, STRA6 o RBPR2 mutanti nell'influenzare l'omeostasi sistemica e oculare della vitamina A o l'impatto delle rodopsine mutanti o delle proteine del ciclo retinoide sulla funzione visiva^35,36.

Protocollo

1. Metodologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR)

1. Preparazione e purificazione della proteina RBP4 di topo
   1. Primer di progettazione per generare cDNA di topo RBP4 (msRBP4) a lunghezza intera (sequenza di riferimento NCBI: NM_001159487.1). Clonare il cDNA msRBP4 in un vettore di espressione pET28a His-tag Kanamicina resistente ed esprimerlo in cellule BL-21 DE3 (Tabella dei materiali).
   2. Trasformare le cellule competenti BL-21 DE3 (secondo il protocollo del produttore) con il vettore msRBP4-pET28a ligato e quindi impiattare su piastre di brodo Agar Luria-Bertani (LB) contenenti Kanamicina 50 μg/mL^30,37. Incubare le piastre per una notte a 37 °C in un'incubatrice e vagliare le colonie positive il giorno successivo.
   3. Prelevare una singola colonia e incubare per una notte a 37 °C in 5 ml di brodo LB contenente Kanamicina 50 μg/mL.
   4. Per la coltura secondaria in 500 mL di brodo LB contenente Kanamicina 50 μg/mL, utilizzare l'1% del volume della coltura primaria (dal passaggio 1.1.3.) e incubare a 37 °C per 3-4 ore; Controllare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro. Idealmente, procedere se il valore OD è compreso tra 0,6 e 1 per indurre l'espressione proteica con 0,5 mM IPTG a 24 °C durante la notte.
   5. Utilizzare più concentrazioni di IPTG di 0,1-1 mM e un intervallo di temperatura di 16-30 °C per ottimizzare l'espressione e la stabilità di msRBP4.
   6. Centrifugare la coltura (dal punto 1.1.5) a 16.000 × g per 10 minuti, scartare il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio.
   7. Omogeneizzare il pellet con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% glicerolo, 0,5 mM PMSF e inibitori della proteasi [pH 8,0]). Sonicare il lisato per cicli di 15 s ON e 30 s OFF utilizzando un omogeneizzatore con una potenza di 250 Watt e una frequenza di uscita del 40-50% a 20 kHz. Ripeti 5 volte.
   8. Rimuovere i detriti cellulari e le cellule non lisate mediante centrifugazione a 16.000 × g per 20 minuti. Far passare il surnatante del lisato attraverso una colonna NTA di nichel bilanciata con tampone.
   9. Lavare la colonna con tampone di lisi (dal passaggio 1.1.8) contenente 30 mM di imidazolo.
   10. In frazioni, eluire la proteina msRBP4 legata utilizzando un tampone contenente 250 mM di imidazolo. Eseguire le frazioni eluite e monitorare visivamente la quantità di proteine con un gel di poliacrilammide SDS al 12%, colorato con Coomassie Brilliant Blue R-250 in soluzione di metanolo:acqua:acido acetico (45:45:10) e decolorare con soluzione senza colorazione Coomassie metanolo:acqua:acido acetico (45:45:10).
   11. Raggruppare le frazioni inutilizzate e dializzare le frazioni raggruppate con una cassetta per dialisi da 10K da 10 kDa MWCO.
   12. Valutare la qualità della frazione dializzata su un gel SDS-PAGE al 12% e quantificare la concentrazione proteica.
       NOTA: La proteina Apo-RBP4 è stata utilizzata nell'analisi SPR. Per la generazione di olo-RBP4 (RBP4-retinolo), fare riferimento ai protocolli dettagliati pubblicati altrove ^36,37.
2. Validazione iniziale dei peptidi RBPR2 e STRA6 con RBP4 per la struttura e l'interazione mediante saggio di fluorescenza del triptofano e spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
   1. Saggio di fluorescenza del triptofano
      1. Utilizza lo strumento di analisi della composizione proteica online (https://web.expasy.org/protparam/) e incolla la sequenza di aminoacidi in un codice di una lettera per valutare la composizione strutturale della proteina ricombinante RBP4 e dei singoli peptidi di RBPR2 e STRA6 per determinare i residui di triptofano amminoacido nei singoli peptidi e proteine (Tabella dei materiali).
      2. Fare clic sul pulsante Calcola parametri e valutare la composizione degli amminoacidi per i residui di triptofano (Trp).
         NOTA: I residui di triptofano devono essere presenti nei singoli peptidi o proteine analizzati.
      3. Diluire i singoli peptidi RBPR2 e STRA6 in varie concentrazioni micromolari e incubare singolarmente con 3 μg msdi RBP4 in una piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente per 5 minuti. Eccita la miscela a 290 nm e scansiona l'emissione da 300 nm a 400 nm di lunghezza d'onda.
      4. Normalizza i dati con la condizione di controllo del vuoto (solo tampone, nessun peptide e nessuna proteina) e del peptide (nessuna proteina) e traccia.
         NOTA: L'incremento della fluorescenza del triptofano in seguito all'esposizione a una concentrazione peptidica da bassa ad alta suggerisce un'interazione positiva tra i due singoli peptidi e la proteina RBP4.
   2. Spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
      1. Diluire i singoli peptidi e la proteina ricombinante RBP4 in 1x tampone PBS, pH 7,0. Utilizzare varie concentrazioni di peptidi RBPR2 e STRA6 e proteina RBP4 da 0,1 a 10 μg/mL per un controllo di qualità, come descritto di seguito.
      2. Aggiungere singoli peptidi e proteine diluiti in una cuvetta lunga un percorso di 0,1 cm e misurare l'assorbanza/ellitticità del CD utilizzando uno spettrofotometro CD (195-250 nm). Utilizzare la formula seguente per calcolare l'ellitticità media dei residui (θ).
         [v] = (S × mRw)/(10cl)
         S rappresenta il segnale CD in mθ; mRw rappresenta la massa media dei residui; c rappresenta la concentrazione della proteina in mg/mL; e l rappresenta la lunghezza del percorso in cm.
      3. Calcola la variazione percentuale della struttura molecolare utilizzando l'analisi della struttura secondaria BeStSel per la previsione del ripiegamento delle proteine mediante spettroscopia CD (https://bestsel.elte.hu).
         NOTA: La struttura secondaria indica il corretto ripiegamento e le conferme conservate cruciali per lo studio dell'interazione e l'esito delle interazioni. Ispezionare la struttura prevista del dominio e procedere ulteriormente con lo studio dell'interazione.

2. Analisi SPR per determinare le affinità di legame e i parametri cinetici dei recettori di membrana della vitamina A (RBPR2 e STRA6) con il loro ligando fisiologico RBP4

1. Per l'immobilizzazione di RBP4 sulla configurazione della superficie del chip CM5, utilizziamo il chip del sensore SPR, che trasporta un linker carbossimetildestrano esteso a una dimensione di ~100 nm attaccato in modo covalente su una superficie d'oro. In presenza di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC), la N-idrossisuccinimide (NHS) converte i gruppi carbossilici sulla superficie del chip in esteri N-idrossisuccinimide, che reagiscono spontaneamente con i gruppi amminici di amminoacidi e proteine, costringendo il ligando a legarsi covalentemente sulla superficie del chip (Tabella dei materiali).
   1. Immobilizzare la proteina msRBP4 purificata sul chip del sensore (Figura 1 e Figura 2). Nel menu Esegui del software, scegliere la procedura guidata e procedere con l'opzione di immobilizzazione . Diluire il ligando (proteina msRBP4 ottenuta dalla fase 1.1) nel tampone di immobilizzazione (10 mM di tampone acetato di sodio, pH 5,0) a 10 μg/mL (4 μL di ligando + 396 μL di tampone) e aliquotare i reagenti di accoppiamento in fiale. Aprire la finestra della procedura guidata di configurazione dell'immobilizzazione dal controllo software, selezionare Chip CM5 e l'opzione Immobilizzare la cella di flusso 2 e il livello target di 1.200 unità di risposta (RU) per ottenere un Rmax di 30 RU nello studio cinetico e nella soluzione di lavaggio: etanolammina. Immettere il nome RBP4 e fare clic su Avanti.
      NOTA: Facoltativo: la finestra di dialogo Preparazioni di sistema per l'opzione Prime prima dell'esecuzione non è necessaria se in precedenza è stato eseguito l'adescamento con tampone di corsa PBST (soluzione salina tamponata con fosfato con una soluzione detergente Tween 20 allo 0,05%).
   2. Nella finestra di dialogo Posizione rack fare clic su Espelli rack. Prendere il rack e posizionare le fiale con i volumi assegnati per ciascun reagente: 156 μL di msRBP4, 177 μL di etanolammina, 89 μL di EDC, 89 μL di NHS e una fiala vuota. Inserire il rack con le fiale di campionamento e fare clic su OK e Avanti.
   3. Nella finestra di dialogo Prepara protocollo di esecuzione fare clic su Avvia e salva.
2. Configurazione del saggio cinetico dei peptidi RBPR2 e STRA6
   1. Diluire in serie i peptidi RBPR2 di topo, RBPR2 mutante e STRA6 (sintetizzati chimicamente in precedenza³¹ ed elencati nella Tabella dei materiali) in un tampone di corsa in un intervallo di 0,8-26,6 μM.
   2. Aprire il software di controllo e selezionare la procedura guidata Cinetica/Affinità. Fare clic su File | Aprire il modello e selezionare Cinetica/Affinità. Immettere il percorso del flusso 2-1 della finestra di dialogo della sequenza di iniezione (cella di flusso 2 attiva e cella di flusso 1 come riferimento), controllare il tipo di chip CM5 e fare clic su Avanti. Nella finestra di dialogo di configurazione, selezionare Esegui cicli di avvio, immettere Soluzione: buffer e cicli: e fare clic su Avanti.
   3. Nella finestra di dialogo dei parametri di iniezione , inserire i valori per i parametri del campione : tempo di contatto: 120 s, portata 30 μL/min, tempo di dissociazione 300 s; per i parametri di rigenerazione : inserire il nome della soluzione di rigenerazione: Glicina-HCl (pH 2,5), tempo di contatto: 30 s, portata: 30 μL/min e fare clic su Avanti.
   4. Nella finestra di dialogo dei campioni , inserisci il nome dei peptidi, il peso molecolare e le concentrazioni e fai clic su Avanti. Nella finestra di dialogo Posizione rack , assegnare i peptidi diluiti come singoli campioni da ~120 μL di varie concentrazioni da 1 a 100 μM e ~230 μL di tampone, ~120 μL di tampone e ~1.000 μL di glicina, pH 2,5, alle posizioni sul rack. Fare clic su Eject Rack (Espellere rack ) e inserire tutte le fiale. Fare clic su Avanti e nella finestra di dialogo Prepara protocollo di esecuzione fare clic su Avvia, immettere un nome file e salvare (Figura 2).
   5. Nel software, fare clic sul menu Start e selezionare Valutazione. Scegli apri il file nel software e, dal menu di selezione a discesa, scegli Fc2-1 per analizzare il sensore attivo sottratto in bianco della cella di riferimento per le fasi di associazione e dissociazione dei peptidi msRBP4 e mutanti msRBPR2 e msSTRA6.
   6. Fare clic sul pulsante a discesa Cinetica/Affinità e scegliere Superficie limitata; per aprire la finestra di dialogo Seleziona curve , selezionare Includi colonna nella tabella e fare clic su Avanti. Seleziona la finestra di dialogo Dati per mostrare i sensorgram sottratti in bianco; fare clic su Cinetica e affinità, mantenere i parametri predefiniti e fare clic sull'opzione Adatta per l'adattamento della curva. Ispezionare la scheda Rapporto per verificare la presenza di costante di dissociazione di equilibrio K_d e K_a o K_sul tasso di associazione e K_d o K_{fuori dal} tasso di dissociazione. Salvare il sensorgram dei dati Kinetics in .txt formato delimitato da schede e utilizzare i valori per tracciare i grafici (Figura 3).
   7. Per determinare la costante cinetica di affinità K_d (concentrazione del ligando che si lega a metà dei recettori all'equilibrio), copiare e incollare le colonne di dati nel file in formato .txt generato dal grafico Evaluation to XY utilizzato nel software. Fare clic su Analizza e Regressione non lineare (adattamento della curva), controllare la colonna dei dati e fare clic su OK. Nella finestra di dialogo dei parametri , fare clic su Saturazione rilegatura e su Modello di raccordo rilegatura specifico per un sito con la formula seguente:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Dove Bmax è il numero massimo di siti di legame (unità di risposta), X è la concentrazione dei peptidi e Y è il legame (unità di risposta) (Figura 3).

3. Metodologia spettrofotometrica per quantificare il complesso proteico retinico GPCR-11-cis (proteina retinilidene rodopsina) nei lisati retinici

1. Trasporta il gruppo predeterminato di topi composto da topi adulti WT-C57BL/6J nella camera oscura.
2. L'oscurità adatta i topi durante la notte per 12-16 ore e, sotto la luce rossa, posiziona il topo in una camera di eutanasia e apri la valvola del gas CO₂ sul regolatore a 5 L/min per ~ 5 minuti. Garantire la morte esercitando una pressione sul collo e sulla coda tirata all'indietro (lussazione cervicale).
3. Enucleare i globi oculari e omogeneizzare gli occhi in un tampone ghiacciato contenente 20 mM bis-tris propano (1,3-bis (tris(idrossimetil)metilammino)propano; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e con inibitore della proteasi (Tabella dei materiali).
4. Centrifugare l'omogenato per 15 minuti a 16000 x g a 4 °C, scartare il surnatante contenente proteine citosoliche solubili in acqua. Risospendere e solubilizzare la membrana pellettata e le proteine di membrana in tampone contenente 20 mM di n-dodecil-β-d-maltoside (DDM), 20 mM di bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM di NaCl, 1 mM di EDTA e con inibitore della proteasi per 1 ora a 4 °C su una piattaforma rotante.
5. Centrifugare la frazione di membrana risolubilizzata per 1 ora a 16000 x g, 4 °C. Miscelare il surnatante con 30 μl di perle di anticorpi Rho 1D4 e incubare per 1 ora a 4 °C su una piattaforma rotante.
6. Utilizzando un supporto magnetico, separare il pulldown utilizzando le perline, scartare il surnatante e lavare le perle con tampone 20 mM bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 500 mM NaCl e 2 mM DDM.
7. Eluire la proteina rodopsina incubando per 5-10 minuti a temperatura ambiente con tampone 20 mM di bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM di NaCl, 2 mM DDM contenenti 0,2 mg/mL di peptide 1D4 (-TETSQVAPA) (Figura 4 e Figura 5).
8. Analizza l'eluizione per l'assorbanza da 200 nm a 800 nm utilizzando una cuvetta rettangolare, sub-micro, al quarzo, apertura di 2 mm, lunghezza del percorso di 10 mm, 50 μl in un'impostazione di scansione rapida con aspectrofotometro.
   NOTA: Utilizzare solo cuvette al quarzo di alta qualità (Figura 4).
9. Per convalidare e determinare la qualità, controllare ed esporre l'eluizione a una luce intensa per 1 minuto, quindi ripetere il passaggio 3.8.
10. Sottrarre l'assorbanza del bianco e calcolare il rapporto tra gli spettri di assorbanza analizzati con l'assorbanza a 500 nm per l'opsina legata alla retina 11-cis , 380 nm per l'opsina legata alla retina all-trans esposta alla luce e 280 nm per la proteina Apo-Opsina priva di ligando (Figura 6). L'opsina libera senza ligando retinico fornisce un'assorbanza basale a 500 nm.
11. Per quantificare la concentrazione di rodopsina, utilizzare la legge di Beer-Lambert:
    A=ε· C·l o C=A/ε·l
    Dove A è l'assorbanza, ε il coefficiente di estinzione molare (rodopsina ε500 = 40.600 M⁻¹ cm⁻¹ per l'Apo Opsina libera ε280 = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹), C è la concentrazione e l la lunghezza del cammino.
12. Per quantificare l'Opsina ligata in percentuale, utilizzare un rapporto di A280/A500.
13. Tracciare gli spettri di assorbanza sottratti in bianco e calcolare il valore dell'opsina libera³².
14. Calcola la concentrazione di rodopsina utilizzando il coefficiente di estinzione ε₅₀₀ = 40600 M⁻¹ cm⁻¹. La concentrazione di opsina libera da leganti è calcolata con la legge di Beer-Lambert utilizzando il coefficiente di estinzione ε₂₈₀ = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹.

Risultati

Vengono descritti metodi quantitativi per studiare le interazioni proteina-ligando dei recettori di membrana della vitamina A e dell'opsina fotorecettrice con i rispettivi ligandi fisiologici. La RBP4 ricombinante di topo deve essere espressa in E. coli e la proteina purificata deve essere utilizzata come ligando coniugato su un chip SPR. RBPR2, STRA6 e il mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" di un peptide di amminoacidi ~40 sintetizzati chimicamente vengono utilizzati come analita a varie concentrazioni per misurare la cinetica di legame e la saturazione di equilibrio K_d di interazione (Figura 1 e Figura 2).

La proteina ricombinante RBP4, come ligando per RBPR2 e STRA6, ha mostrato un'affinità di legame verso i siti interagenti in questi peptidi, misurata rispettivamente a K_d ~ 22,38 μM e ~ 26,73 μM. Il motivo amminoacidico "SYL" svolge un ruolo essenziale nella stabilizzazione di queste interazioni sia in RBPR2 che in STRA6 e, come previsto, il peptide mutante S294A ha aumentato K_d di ~114,9 μM, suggerendo un aumento del numero di copie del peptide mutante RBPR2 necessario per raggiungere la saturazione del legame (Figura 3). L'assorbimento del retinolo nell'occhio tramite STRA6 e la conversione in vari retinoidi fino alla conversione finale della retina 11-cis come cromoforo con legame al residuo di lisina 296 della rodopsina crea un recettore funzionale per il rilevamento e la visione dei fotoni. Il legame covalente retinico 11-cis alla proteina Opsina per formare la rodopsina mostra alcune caratteristiche di assorbanza. L'assorbanza delle proteine avviene a 280 nm e l'assorbanza del retinolo libero è a ~325 nm. Tuttavia, l'olo-opsina con assorbanza retinica o rodopsina 11-cis si verifica a una lunghezza d'onda di 500 nm.

Qualsiasi difetto in questa formazione complessa a causa del basso retinolo sistemico o difetto nell'assorbimento del retinolo da parte di una mutazione in RBPR2 o STRA6 porta all'accumulo di opsina libera o apoproteina opsina priva del cromoforo 11-cis retinico, modificando i caratteristici spostamenti di assorbanza a bassa assorbanza a 500 nm. Quantificando l'assorbanza e utilizzando il rapporto tra l'assorbanza di 280 nm e la lunghezza d'onda di 500 nm, è possibile stimare le Opsine o Rodopsine legate. Attraverso una breve esposizione alla luce, è possibile effettuare un controllo incrociato della foto-isomerizzazione dell'assorbanza dell'Opsina legata alla retina 11-cis a 500 nm con l'assorbanza dell'Opsina all-trans-retinal-bound (rodopsina Meta II) a 380 nm (Figura 4, Figura 5 e Figura 6). In una configurazione sperimentale, la possibilità di artefatti e contaminanti è alta; le due principali fonti di artefatti riscontrati sono l'esposizione involontaria alla luce degli strumenti e il lavaggio salino a bassa concentrazione con mancata rimozione delle molecole contaminanti dall'RPE o dalla lente (Figura 7).

Figura 1: Area di lavoro Risonanza plasmonica di superficie. Materiali necessari e panoramica della strumentazione SPR. (A) SPR Banchina di carico trucioli. (A') Chip CM5 con destrano carbossimetilato con superficie d'oro attaccata in modo covalente per l'immobilizzazione tramite gruppi -NH2, -SH, -CHO, -OH o -COOH. (B) Rack per iniettori robotizzati per il caricamento dei campioni. (B') tappi in gomma tipo 3. (B'') Flaconcini di plastica da 7 mm per aliquote di campioni. (C, D) Serbatoio tampone di equilibraggio/funzionamento e vasca di raccolta rifiuti. (E) Pannello di controllo del software Biacore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica schematica della risonanza plasmonica di superficie e delle fasi di acquisizione dei sensorgram. Fase 1: La superficie del chip CM5 immobilizzata con la proteina RBP4 con un bersaglio di 1.200 unità di risposta. Passo 2: Varie concentrazioni di peptidi RBPR2 vengono analizzate come analiti e questa interazione biomolecolare modifica la densità di carica elettronica sulla superficie del chip d'oro, portando al cambiamento/riduzione della riflessione della luce a un angolo specifico o a un angolo di risonanza. Fase 3: Il lavaggio inverte il fenomeno del plasmone di superficie, portando all'inversione dell'intensità di riflessione e alla caduta del sensorgram rispetto alla linea di base. La cinetica di queste interazioni è stata ulteriormente utilizzata per determinare le costanti di dissociazione dell'associazione e la forza delle interazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Studi di legame con la risonanza plasmonica di superficie di singoli peptidi del dominio di legame del recettore della vitamina A con il suo ligando fisiologico RBP4. (A) Il prompt del software che mostra l'immobilizzazione ottenuta di RBP4 sulla superficie del chip CM5. (B, C, D) Sensogrammi delle interazioni peptide-ligando RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 e S294A mutante RBPR2-RBP4 a varie concentrazioni. (B',C',D') Cinetica di legame e determinazione dell'equilibrio K_d che mostra la differenza e la vicinanza del pattern di legame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Area di lavoro dell'assorbanza retinica Opsin-11-cis e panoramica della strumentazione. (A) Centrifuga da banco refrigerata, tutti gli indicatori LED coperti da nastro rosso; (B) spettrofotometro UV-visibile, un indicatore LED coperto da nastro rosso; (B') Cella ultra-micro rettangolare, cuvetta al quarzo e supporto magnetico. (C) Scansione del software applicativo; (D) Coperchio dello scomparto dello spettrofotometro aperto, supporto per cuvette per l'analisi e coperchio dello scomparto chiuso. (E) Configurazione Light OFF con monitor OFF per la preparazione del campione con un'unica sorgente di luce rossa. (F) Rotatore refrigerato per la preparazione e la solubilizzazione del campione. (G) Configurazione Light OFF con monitor ON per la misurazione dell'assorbanza del campione. (H) Analisi dell'assorbanza in XY-Plot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Panoramica del flusso di lavoro della metodologia di assorbanza retinica Opsin-11-cis. Fase 1: Le retine di topi adattati al buio sotto una singola fonte di luce rossa vengono isolate, omogeneizzate e solubilizzate per ottenere frazioni di membrana retinica. Passaggi 2-4: In una sequenza di centrifugazioni, il pellet viene solubilizzato in assenza di detergente e in presenza di tampone detergente DDM. Passaggi 5-6: Il pellet solubilizzato contenente fotorecettori retinici e altre proteine di membrana pronto per il pulldown e la purificazione degli anticorpi. Passo 7: L'Opsina eluita utilizzando il peptide VAPA 1D4 è pronta per l'analisi dell'assorbanza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Spettri di assorbanza della rodopsina. (A) Estratto di retina di topi scuri adattati utilizzando rodopsina purificata 1D4 che mostra l'assorbanza di picco di 500 nm e (B) estratto di retina esposta alla luce utilizzando rodopsina purificata 1D4 che mostra l'assorbanza di picco di 380 nm. (C) Western blot con anticorpo 1D4 rodopsina che mostra la qualità della purificazione della rodopsina e la distribuzione dimensionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Artefatto degli spettri di assorbanza della rodopsina. (A) L'artefatto negli spettri di assorbanza dell'estratto di occhio adattato al buio è mostrato con il picco di assorbanza a 380 nm; L'esposizione involontaria alla luce degli indicatori LED degli strumenti o il guasto del blocco della luce della porta della camera oscura provoca lo sbiancamento della proteina rodopsina. (B) Lavaggi insufficienti con un alto tampone salino causano l'accumulo di contaminanti da RPE, cristallino o altre fonti dall'estratto dell'occhio, portando a un'elevata diffusione dello spettro di assorbanza e artefatti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Rappresentazione schematica delle interazioni tra i recettori di membrana della vitamina A (RBPR2 e STRA6) e la proteina Opsina con i rispettivi ligandi (RBP4 e 11-cis retinale) critici per la generazione della proteina retinilidene nei fotorecettori per la funzione visiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Intensità intrinseche di fluorescenza del triptofano. Evidenze preliminari di interazione e cambiamento negli orientamenti dei residui intrinseci di triptofano di RBP4 dopo l'interazione con varie concentrazioni di peptidi RBPR2 e STRA6. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S2 supplementare: Docking e interazione proteina-proteina RBPR2 e RBP4. I residui di interfaccia vengono visualizzati in PyMOL e l'orientamento di RBPR2 nella membrana viene visualizzato utilizzando lo strumento server https://opm.phar.umich.edu/. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S3 supplementare: Pipeline per l'analisi in silico dell'interazione di docking proteina-proteina e dei possibili siti di contatto. La pipeline di analisi dimostra la sequenza di esecuzione dello script Python e l'utilizzo della riga di comando PyMOL dai passaggi 1 a 6, garantendo l'affidabilità dell'acquisizione dei siti di interazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S4 supplementare: Analisi della struttura secondaria della spettroscopia CD che mostra la composizione dei peptidi RBP4, RBPR2 e STRA6. Il grafico a torta mostra le quote di strutture secondarie presenti nella molecola. Utilizzando lo strumento BeStSel Secondary Structure, è stata analizzata la previsione del ripiegamento delle proteine mediante spettroscopia di dicroismo circolare (https://bestsel.elte.hu). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Metodologia SPR
Modellazione in silico e analisi di docking: la struttura prevista di RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) e STRA6 e la struttura nota per il database PDB msRBP4 (RSCB PDB ID: 2wqa), dovrebbero essere utilizzate per lo studio di docking^29,31. Inoltre, dovrebbero essere utilizzati metodi in vitro (coltura cellulare) per confermare l'interazione dei siti di legame putativi sui recettori della vitamina A (RBPR2 e STRA6) con il suo ligando (RBP4)^29,31 (Figura supplementare S1, Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3). Determinare la qualità dei peptidi utilizzando la spettroscopia CD. In precedenza, per lo spettro CD dell'UV lontano, venivano utilizzate celle rettangolari da 1 mm 0,1 μg/μL ~200 μL (3-4 μg di proteina RBP4, 32 μM RBPR2 e 32 μM di peptidi STRA6)³¹ (Figura S4 supplementare). Il flusso di azoto gassoso dovrebbe essere utilizzato per prevenire la formazione di ozono dannoso sotto le lampade allo xeno a emissione e ridurre l'assorbanza di fondo a 200-300 nm. Utilizzando il parametro predefinito, lo spettro è stato misurato da 185 nm a 300 nm. La linea di base deve essere corretta sottraendo con il Blank. Il contenuto dell'alfa elica e del foglio beta viene calcolato in base alle proprietà dell'assorbanza, come i picchi negativi dell'alfa elica a 222 nm.

Analizzare le proteine RBPR2 e STRA6 e i dati dei domini topologici nel database (https://www.uniprot.org), confermare i possibili siti di interazione precedentemente noti dalle regioni extracellulari e utilizzare la sequenza ~40-50 amminoacidi per sintetizzare chimicamente i peptidi. Lo studio richiede la proteina RBP4 ricombinante purificata di topo (msRBP4) e peptidi RBPR2 e STRA6 sintetizzati chimicamente che comprendono i residui di legame RBP4 proposti per lo studio delle interazioni recettore-ligando 18,19,29,31. Prima di selezionare i peptidi, la sequenza peptidica extracellulare delle proteine del recettore della vitamina A interagenti deve essere determinata utilizzando l'analisi in silico (docking protein-ligando basato su computer)³¹. Il saggio SPR viene eseguito per comprendere la cinetica delle interazioni recettore-ligando. È fondamentale conoscere i siti di interazione previsti mediante saggi informatici in silico o analisi in vitro. In questo studio, il peptide progettato fa riferimento alla regione extracellulare delle proteine di membrana RBPR2 e STRA6, che sono note per interagire con RBP4. Per garantire risultati accurati e prevenire potenziali artefatti e sensorigrammi SPR negativi, è fondamentale standardizzare i tamponi, le concentrazioni di peptidi e la solubilità. Per gli studi sull'assorbanza della rodopsina, l'isolamento del lisato retinico richiede rigorose condizioni di buio e fasi di lavaggio per evitare artefatti e picchi di assorbanza indesiderati (Figura 7).

Per comprendere l'importanza del motivo SYL sui trasportatori della vitamina A nel legare RBP4, RBPR2, STRA6 e un mutante S294A-RBPR2, i peptidi³¹ sono stati sintetizzati chimicamente utilizzando una reazione di condensazione dei gruppi carbossilici e amminici tra due amminoacidi. Il protocollo ha seguito l'aggiunta graduale precisa di amminoacidi sequenziali alla resina di ancoraggio. Il processo di sintesi degli amminoacidi subisce modifiche chimiche di protezione e deprotezione dell'unità amminoacidica N-terminale, consentendo la sintesi e la formazione di polimeri peptidici. Una volta completato, il peptide viene recuperato dalla resina e purificato. La validazione iniziale delle interazioni tra la proteina RBP4 e i peptidi del recettore della vitamina A deve essere confermata utilizzando un saggio interno di fluorescenza del triptofano e verificata utilizzando uno spettrometro CD (Figura S1 supplementare). La qualità iniziale dell'interazione della proteina ricombinante RBP4 con STRA6 di topo (msSTRA6), RBPR2 di topo (msRBPR2) e peptidi di controllo deve essere confermata utilizzando il saggio di fluorescenza intrinseca del triptofano (Figura S1 supplementare). Il saggio di fluorescenza intrinseca del triptofano è una procedura sperimentale fondamentale per valutare l'estinzione o l'aumento dei residui di amminoacidi triptofano nelle proteine per la fluorescenza dopo il legame del recettore e del ligando. La fluorescenza misurata è un'indicazione diretta del cambiamento nell'ambiente locale a seguito dell'interazione.

Modifiche e risoluzione dei problemi dei metodi
Ottimizza l'SPR con tamponi in esecuzione: 1x soluzione salina tamponata con fosfato (Tween 20) o 1x HEPES (P20). Per evitare precipitati, i peptidi diluiti devono essere centrifugati e filtrati prima dell'uso. Standardizzare l'assorbanza della rodopsina con vari tamponi ad alto contenuto di sale (300-500 mM di NaCl). Per confermare i picchi di assorbanza della rodopsina al buio a 500 nm, esporre i campioni alla luce per 30 s e ripetere la misurazione per garantire la qualità attraverso lo spostamento del picco di assorbanza a 380 nm e l'efficacia del pulldown.

Limitazioni dei metodi
SPR può fornire informazioni specifiche sull'interazione di due proteine; Tuttavia, se l'interazione richiede un terzo componente sconosciuto, i dati possono diventare complessi da comprendere. Il cambiamento nella conformazione della molecola rimarrà non identificato nell'interazione. Poiché la proteina RBP4 viene preparata in assenza di retinolo (apo-RBP4), ciò che viene misurato è il legame dell'apo-RBP4 ai suoi recettori. Pertanto, l'RBP4 caricato con retinolo (olo-RBP4) può avere un'affinità alterata per i recettori RBPR2 e STRA6 rispetto all'apo-RBP4^35,36. È interessante notare che le affinità per apo- e olo-RBP4 per STRA6 sono state precedentemente mostrate in entrambi i range micromolari, e non è stata osservata alcuna differenza statistica tra i legami di apo- e olo-RBP4 al recettore STRA6³⁵. La metodologia di assorbanza della rodopsina è in grado di identificare la presenza di opsina non ligata (apoproteina opsina) nell'occhio, ma non è in grado di identificare i meccanismi causali.

Spettri di assorbanza della rodopsina
CHECKPOINT CRITICO: La foto-isomerizzazione della retina 11-cis in retinica all-trans è altamente sensibile e istantanea³². La quantificazione della rodopsina (olo-opsina) deve essere condotta in condizioni di buio rigoroso per misurare il corretto contenuto di opsina e 11-cis retinico al buio (500 nm) o in condizioni adattate alla luce come la rodopsina Meta II (380 nm)³². I topi dovrebbero quindi essere adattati al buio in una stanza buia per 12-16 ore per misurare la rodopsina³² non sbiancata. A tale scopo, la camera oscura dovrebbe essere completamente buia, con la porta d'ingresso coperta da un telo oscurante e sorgenti luminose a LED esterne su tutte le apparecchiature coperte da nastro rosso. Copri lo schermo del laptop con un foglio di plastica rosso e tienilo chiuso fino al momento del bisogno. È inoltre necessaria una fonte di luce rossa dall'alto.

PASSAGGIO CRITICO: Standardizzare le fasi di lavaggio a varie concentrazioni elevate di sali per rimuovere le proteine del cristallino o dell'RPE o i contaminanti molecolari che hanno un'assorbanza di lunghezza d'onda di 300-500 nm e potrebbero potenzialmente interferire con la misurazione dell'assorbanza dell'opsina.

Importanza dei metodi rispetto ai metodi esistenti/alternativi
Non esiste un approccio fattibile per studiare l'utilizzo sistemico dei retinoidi, i contributi multi-tessuto e l'impatto delle mutazioni nei recettori delle proteine leganti il retinolo per i meccanismi di distribuzione del retinolo. Questo protocollo utilizza due tecniche essenziali per comprendere e colmare le connessioni mancanti nella deplezione del retinolo nei fotorecettori con l'Apo-Opsina e l'utilizzo della riserva di retinoidi epatici tramite interazioni recettore-ligando RBPR2-RBP4 (Figura 3, Figura 6 e Figura 8).

Importanza e potenziali applicazioni del metodo in specifiche aree di ricerca
I saggi di spettroscopia di rodopsina basati sull'assorbanza e SPR forniscono una strategia significativa per studiare i meccanismi di omeostasi sistemica e oculare della vitamina A per la generazione della proteina retinilidene (rodopsina). In sintesi, queste tecniche e approcci sperimentali possono chiarire la cinetica del trasporto dipendente dal recettore di membrana dei retinoidi alimentari attraverso il fegato e nell'occhio, facilitando la generazione di rodopsina (Figura 8). Aiutano anche a comprendere i meccanismi e le conseguenze oculari delle mutazioni nei recettori della vitamina A e nelle proteine opsina, in particolare nel legame con i rispettivi ligandi. Queste interazioni possono influenzare la generazione della proteina retinilidene, che è fondamentale per la funzione visiva.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Quant 2-D	Cytiva	80648356
Kit di accoppiamento amminico	Cytiva	BR100050
Software di valutazione Biacore	Biacore S200	Versione 1.1
Biacore Chip sensore CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propano	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 celle competenti	Thermo Scientific	EC0114
Spettrofotometro CD	Jasco	J-815 Spettropolarimetro
Glicina HCL	Fisher Bioreagenti	BP381-1
GraphPad Prism			Adattamento del modello, analisi dei dati
LB	broth Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecil-beta;-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamicina-resistant vettore di espressione resistente	Addgene	69864-3
Kit di purificazione plasmidico	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer Cassetta per dialisi 10K	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0,05%
UV vis Spettrofotometro	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Nome del peptide	Sequenza peptidica<	strong>HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforme
a Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90,84%	Conforme al mutante
Rbpr2 del mouse S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0,92%	Conforme