Articolo metodologico

Monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate

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DOI:

10.3791/67038

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16 agosto 2024

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1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales, 3Lucid Scientific, 4Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 5Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un nuovo dispositivo per misurare i tassi di consumo di ossigeno (OCR) nelle colture di epiteliale pigmentato retinico (RPE). Il dispositivo è in grado di misurare l'OCR per settimane su RPE coltivate su piastre di coltura cellulare standard con terreni standard mentre le piastre si trovano in un incubatore per colture cellulari standard.

Abstract

Il metabolismo mitocondriale è fondamentale per la normale funzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un monostrato di cellule della retina importante per la sopravvivenza dei fotorecettori. La disfunzione mitocondriale RPE è un segno distintivo della degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nei paesi sviluppati, e della vitreoretinopatia proliferativa (PVR), una complicanza accecante dei distacchi di retina. Le condizioni degenerative dell'RPE sono state ben modellate da sistemi di coltura dell'RPE che sono altamente differenziati e polarizzati per imitare l'RPE in vivo . Tuttavia, il monitoraggio dei tassi di consumo di ossigeno (OCR), un proxy per la funzione mitocondriale, è stato difficile in tali sistemi di coltura perché le condizioni che promuovono la polarizzazione e la differenziazione ideali dell'RPE non consentono facili misurazioni OCR.

Qui, introduciamo un nuovo sistema, Resipher, per monitorare l'OCR per settimane alla volta in colture di RPE ben differenziate, mantenendo l'RPE su substrati di crescita ottimali e terreni di coltura fisiologici in un incubatore di coltura cellulare standard. Questo sistema calcola l'OCR misurando il gradiente di concentrazione di ossigeno presente nel mezzo sopra le cellule. Discutiamo i vantaggi di questo sistema rispetto ad altri metodi per rilevare l'OCR e come impostare il sistema per misurare l'OCR nelle colture di RPE. Vengono illustrati i suggerimenti e i trucchi chiave per l'utilizzo del sistema, le avvertenze sull'interpretazione dei dati e le linee guida per la risoluzione dei problemi relativi ai risultati imprevisti.

Forniamo anche un calcolatore online per estrapolare il livello di ipossia, normossia o iperossia sperimentata nelle colture di RPE in base al gradiente di ossigeno nei terreni sopra le cellule rilevate dal sistema. Infine, esaminiamo due applicazioni del sistema, misurando lo stato metabolico delle cellule RPE in un modello PVR e comprendendo come l'RPE si adatta metabolicamente all'ipossia. Prevediamo che l'uso di questo sistema su colture di RPE altamente polarizzate e differenziate migliorerà la nostra comprensione del metabolismo mitocondriale dell'RPE sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule epiteliali funzionalmente postmitotiche e altamente polarizzate che formano una barriera tra i fotorecettori sensibili alla luce nella retina e la loro circolazione sanguigna, un letto capillare chiamato coriocapillare. Come il ruolo dei neuroni che supportano la glia, l'RPE svolge una miriade di funzioni per supportare i fotorecettori, tra cui la fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, il trasporto di nutrienti e il supporto metabolico per i fotorecettori e la secrezione di fattori di crescita essenziali, tutti fondamentali per il mantenimento della funzione visiva.

La degenerazione dell'EPR è alla base di diversi disturbi degenerativi comuni della vista. Nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), una delle cause più comuni di perdita incurabile della vista nel mondo, l'EPR muore e i fotorecettori sovrastanti subiscono quindi una degenerazione secondaria. Nella vitreoretinopatia proliferativa (PVR), l'EPR esce invece dal suo stato postmitotico normalmente quiescente, proliferando e dedifferenziandosi in uno stato mesenchimale (una cosiddetta transizione da epitelio a mesenchima [EMT]) con alterazioni del suo metabolismo. La dedifferenziazione dell'RPE provoca una perdita del supporto dell'RPE ai fotorecettori, innescando anche uno stato più fibrotico. Ciò provoca sia la degenerazione dei fotorecettori che le cicatrici indotte da RPE, che innescano entrambe la perdita della vista 1,2.

Una parte importante del supporto dell'RPE ai fotorecettori è metabolica e la disregolazione metabolica è un fattore critico in numerose malattie della retina, tra cui AMD e PVR. L'RPE funge da barriera regolatoria tra i fotorecettori e la loro fonte di ossigeno e nutrienti, la coriocapillare. Pertanto, ciò che l'RPE sceglie di metabolizzare rispetto a ciò che l'RPE sceglie di passare dalla coriocapillare ai fotorecettori governa fortemente il metabolismo e la sopravvivenza dei fotorecettori. Numerosi studi hanno dimostrato che l'EPR è fortemente dipendente dal metabolismo mitocondriale per la sua normale salute e che i fotorecettori dipendono invece fortemente dalla glicolisi3. Questo ha introdotto il concetto di stati metabolici complementari e intrecciati tra i fotorecettori e l'EPR. In particolare, l'RPE riduce il suo metabolismo dei substrati metabolici preferiti dai fotorecettori e utilizza invece i sottoprodotti del metabolismo dei fotorecettori combinati con i metaboliti che i fotorecettori non consumano. In malattie come la PVR e l'AMD, l'evidenza suggerisce fortemente che l'RPE diventa più glicolitico e meno dipendente dal metabolismo mitocondriale; questo passaggio alla glicolisi dell'RPE può affamare i fotorecettori dei metaboliti di cui ha bisogno, innescando la degenerazione 4,5,6. Data l'interdipendenza tra l'RPE e il metabolismo dei fotorecettori e l'alterazione del metabolismo alla base della malattia retinica, c'è un forte interesse nel modellare e manipolare il metabolismo dell'RPE per scopi terapeutici.

Mentre lo studio del metabolismo mitocondriale dell'RPE in vivo è l'ideale, molti aspetti del metabolismo mitocondriale dell'RPE possono essere sondati praticamente solo in un sistema di coltura in vitro. Negli ultimi decenni sono stati compiuti progressi significativi verso colture di RPE ad alta fedeltà, al punto che le colture di RPE più accuratamente curate vengono ora utilizzate per la terapia di sostituzione cellulare negli studi clinici sull'uomo7. Per mantenere tali colture ad alta fedeltà, l'RPE deve essere coltivato su particolari substrati in particolari terreni per mesi prima della sperimentazione. Con queste condizioni, le colture di RPE sono massimamente differenziate e polarizzate, approssimando l'RPE in vivo. Sfortunatamente, non sono attualmente disponibili apparecchiature in grado di misurare il metabolismo mitocondriale in modo specifico dall'RPE in vivo. Mentre il monitoraggio dell'ossigeno della rete capillare retinica è stato ottenuto in vivo utilizzando l'ossimetria a risonanza paramagnetica elettronica (EPR)8, ciò non è possibile per l'analisi dell'RPE. Le differenze tra il metabolismo dell'RPE in vivo e in vitro non sono ben descritte, ma è stato dimostrato che le colture di RPE hanno un'elevata attività mitocondriale, simile all'RPE in vivo 3,9, suggerendo che è possibile ottenere informazioni significative sul metabolismo mitocondriale dell'RPE utilizzando colture di RPE ad alta fedeltà.

Poiché tutto il metabolismo mitocondriale porta al consumo di ossigeno, la misurazione dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) di RPE è un proxy fedele per il metabolismo mitocondriale. La misurazione dell'OCR nelle colture di RPE è stata difficile, poiché le condizioni che promuovono la massima polarizzazione e differenziazione dell'RPE spesso precludono misurazioni OCR accurate a lungo termine con le tecniche attualmente disponibili, come l'analizzatore di cavallucci marini. In questo articolo sui metodi, viene introdotto un nuovo dispositivo, denominato Resipher (di seguito denominato "il sistema"), che consente la misurazione continua dell'OCR per settimane in RPE cresciuti in condizioni che promuovono al massimo la polarizzazione e la differenziazione. La facilità con cui l'OCR può essere misurato da questo sistema in condizioni di coltura RPE che promuovono al massimo la differenziazione e la polarizzazione dell'RPE è unica tra i dispositivi di misurazione OCR esistenti.

Questo documento fornisce suggerimenti e trucchi per l'utilizzo del sistema con colture RPE, seguito da una dimostrazione di due applicazioni particolari. In primo luogo, l'EMT RPE, che imita la PVR, è innescata dall'esposizione al fattore di crescita trasformante-beta (TGFβ)1,10,11,12. Il sistema viene utilizzato per monitorare l'evoluzione del metabolismo dell'RPE durante il processo EMT. In secondo luogo, il ruolo dell'ipossia nel metabolismo dell'RPE viene esplorato utilizzando questo sistema. L'ipossia è un importante contributo alla patogenesi dell'AMD, poiché la coriocapillare si assottiglia con l'età di13,14 anni. La combinazione di questo sistema con le camere di ipossia consente di modellare il metabolismo mitocondriale dell'RPE alterato con l'ipossia sottile che accompagna l'invecchiamento. Infine, viene introdotto un calcolatore online che utilizza i dati Resipher per consentire di determinare se le colture di RPE sono in condizioni ipossiche, normossiche o iperossiche. Tali informazioni sono fondamentali per trarre conclusioni sul metabolismo degli RPE da studi in vitro su colture di RPE.

Protocollo

Per i protocolli per stabilire colture primarie umane o iPSC-RPE, vedere i seguenti riferimenti 15,16,17,18. L'acquisizione e l'uso di tessuto umano per questi protocolli sono stati esaminati e autorizzati dall'Institutional Review Board (HUM00105486) dell'Università del Michigan.

1. Applicazione generale del sistema alla coltura RPE

  1. Piastra di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) derivate da RPE o cellule RPE umane primarie in piastre a 96 pozzetti compatibili con il sistema.
    1. Supponendo colture mature già esistenti coltivate su piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti, lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) una volta e quindi aggiungere 500 μl di tripsina-EDTA allo 0,25% (Tabella dei materiali). Incubare per 10-40 minuti in un incubatore per colture cellulari, controllando ogni 5-10 minuti fino a quando le cellule sono arrotondate e quasi pronte a staccarsi.
    2. Pipettare delicatamente i terreni sulle cellule per staccarle dalla plastica di coltura cellulare, quindi trasferirli a un volume 3x di terreno di coltura cellulare (1.500 μl per 24 pozzetti), centrifugando in una centrifuga a 250 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: La ricetta per i terreni di coltura cellulare RPE è dettagliata nella Tabella 1 e disponibile nei riferimenti precedentemente pubblicati 9,15,16,17,18.
    3. Risospendere le cellule in terreni di coltura cellulare RPE con il 15% di siero fetale bovino (FBS) e contare le cellule con un emocitometro.
    4. Seminare 74.000 cellule per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti (generalmente 225-300 × 105 cellule/cm2), dopo il rivestimento con substrati di rivestimento a matrice extracellulare altamente specializzati (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Conservare le celle solo su una piastra compatibile con Resipher (Tabella dei materiali) e solo nei pozzetti corrispondenti all'array di sonde sul coperchio di rilevamento (colonne 3, 4, 9 e 10 per il coperchio a 32 canali; vedere Tabella dei materiali). Il coperchio di rilevamento del sistema è disponibile con sensori a 4, 32 o 96 canali (vedere le posizioni dei sensori nella Figura 1A-D) ed è compatibile una gamma di piastre per colture cellulari standard.
    5. Poiché i pozzetti sul bordo sono soggetti a evaporazione, il che influisce notevolmente sulla disponibilità di ossigeno, e quindi sulle letture OCR, evitare di seminare le cellule su tutti i pozzetti sul bordo (file A e H di una piastra a 96 pozzetti). Inoltre, aggiungere 200 μl di acqua sterile in ciascuno dei pozzetti vuoti della piastra a 96 pozzetti per ridurre gli effetti dell'evaporazione.
    6. Tenere la piastra su una superficie stabile del tavolo per 10 minuti per consentire alle celle di stabilizzarsi; Quindi rimettilo nell'incubatrice. Sostituire il terreno dopo 24-72 ore, sostituendolo con terreno di coltura RPE standard con il 5% di FBS. Coltura per almeno 4 settimane, cambiando i media 2 volte a settimana.
      NOTA: Le cellule sono pronte per la sperimentazione quando sono pigmentate, acciottolate e altamente compatte (Figura 1E).
  2. Impostazione e acquisizione dei dati con il sistema
    1. Posizionare il coperchio di rilevamento su una piastra ricevente vuota da 96 pozzetti e riposizionarla nell'incubatore per colture cellulari. Allineare e montare il dispositivo sul coperchio di rilevamento e collegarlo all'hub tramite il cavo USB in dotazione. Questo crea un "sandwich" Resipher (Figura 2A).
    2. Vai all'applicazione del sito Web del laboratorio Lucid (https://lab.lucidsci.com/) e fai clic sul pulsante Nuovo esperimento nell'angolo in alto a destra per creare un nuovo esperimento.
    3. Nomina il titolo dell'esperimento e inserisci tutte le note sperimentali rilevanti per lo studio specifico (ad esempio, il numero di passaggio dell'iPSC-RPE che stai utilizzando).
    4. Creare condizioni di bene e gruppi di trattamento. Ad esempio, se si testano gli effetti di diverse concentrazioni sieriche nel terreno con OCR, selezionare Siero nel nome del gruppo, quindi immettere le concentrazioni sieriche del terreno da utilizzare, aggiungendo altri valori percentuali di siero facendo clic sul pulsante + . Assegna quali pozzetti riceveranno una particolare percentuale di siero e seleziona un modello di colore per quei pozzetti. Aggiungi altri gruppi (ad esempio, una variabile sperimentale diversa da testare) secondo necessità facendo clic sul pulsante Aggiungi gruppo .
    5. Definire la configurazione della piastra e selezionare il dispositivo e lo stile della piastra corrispondenti. Fare clic sul pulsante Aggiungi piastra e scegliere Dispositivo; Selezionare il tipo di targa. Seleziona il trattamento e fai clic sul pozzetto corrispondente.
    6. Fai clic sul pulsante Inizia ora per avviare l'esperimento. Verificare che l'indicatore sul sito Web e il LED sull'hub siano di colore verde fisso.
    7. Lasciare in funzione il sistema per 15-60 minuti per garantire che ogni sensore sia calibrato correttamente e rilevi accuratamente l'ossigeno atmosferico, che dovrebbe essere a una concentrazione di ~200 μM in un incubatore per colture cellulari completamente umidificato con il 5% di CO2 (Figura 2Bi).
      NOTA: Se uno dei sensori si trova in uno dei sensori in una configurazione standard di incubatore per colture cellulari, è consigliabile escluderlo nell'analisi dei dati, poiché il sensore è difettoso (Figura 2Bii).
      NOTA: Se tutti i sensori sono sfasati di oltre il 20% rispetto alla media degli altri sensori e rispetto all'O2 atmosferico previsto riportato come 200 μM in una configurazione standard di incubatore per colture cellulari, il coperchio di rilevamento è stato utilizzato troppe volte; sostituirlo con un nuovo coperchio di rilevamento (Figura 2Biii).
      NOTA: Ottenere le letture di O2 nell'aria prima di iniziare un esperimento migliora significativamente la risoluzione dei problemi in seguito. Se un particolare pozzetto appare come un valore anomalo dopo che un esperimento è stato fatto e quel pozzetto aveva un sensore che non era calibrato, il problema potrebbe essere con il sensore, non con la replica biologica.
    8. Rimuovere il dispositivo dal coperchio di rilevamento (ma non staccare il cavo USB dal dispositivo). Posizionare il dispositivo capovolto nell'incubatrice per consentire il ripristino del motore del dispositivo. Non riutilizzare il dispositivo fino a quando tutti i suoni del motore non si sono fermati (circa 20-30 s).
      NOTA: È importante mantenere il dispositivo sempre collegato all'hub tramite il cavo USB durante un esperimento, anche quando il dispositivo è fuori dal coperchio di rilevamento. Ciò consente al dispositivo di monitorare e segnalare continuamente l'ambiente dell'incubatore per colture cellulari.
    9. Riposizionare la piastra con il coperchio di rilevamento nella cappa di coltura cellulare, insieme a una piastra da 96 pozzetti contenente le colture di RPE. Sostituire il terreno nella piastra con colture RPE con lo stesso terreno e lo stesso volume per tutti i pozzetti per ottenere i valori OCR di base per ciascun pozzetto. Assicurati di riempire tutti i pozzetti senza RPE con acqua sterile per prevenire l'evaporazione.
      NOTA: In generale, si raccomandano 60-100 μL di terreno di coltura RPE per 96 pozzetti, sulla base di dati che dimostrano che volumi di terreno più bassi portano a una rapida deplezione dei nutrienti, ma volumi più elevati portano a ipossia involontaria9.
    10. Trasferire il coperchio di rilevamento sulla piastra contenente le colture cellulari e il coperchio standard (non Resipher) sulla piastra contenente le colture cellulari sulla piastra ricevente vuota a 96 pozzetti per mantenere la sterilità del coperchio standard, che sarà necessaria in vari punti durante la sperimentazione.
    11. Riposizionare la piastra con le colture cellulari e il coperchio di rilevamento nell'incubatore per colture cellulari. Ancora una volta, allineare e montare il dispositivo sul coperchio di rilevamento e collegarlo all'Hub tramite il cavo USB in dotazione (assemblando il "sandwich"). Verificare che gli indicatori sull'interfaccia del sito Web e sull'hub siano tutti verdi fissi.
      NOTA: I dati sulla concentrazione di O2 verranno visualizzati immediatamente, mentre i dati OCR verranno visualizzati solo dopo che sono stati raccolti dati sufficienti su O2 , circa 1 ora.
    12. Lasciare che il dispositivo misuri l'OCR su ciascun pozzetto per almeno 12-24 ore per acquisire un OCR di base.
      NOTA: L'OCR di base differirà a seconda di molti fattori, incluso il tipo di terreno applicato alle cellule. Nella Figura 2C, i terreni di coltura RPE standard con diverse quantità di FBS (0%, 5%, 15%) hanno valori OCR leggermente diversi. Inoltre, le colture con più FBS possono sostenere l'attività mitocondriale più a lungo dopo l'applicazione del terreno alle cellule prima che l'OCR diminuisca a causa della deplezione dei metaboliti mitocondriali (lato destro della curva).
    13. Una volta ottenuto un OCR di base, ripetere i passaggi 1.2.8-1.2.12, ma cambiare il terreno sulla piastra con le colture di RPE in base alle proprie condizioni sperimentali (in genere, ± un farmaco o un confronto di diverse condizioni del terreno).
      NOTA: Anche le modifiche di routine dei supporti possono essere gestite allo stesso modo. Ogni volta che l'incubatore per colture cellulari viene aperto, aspettatevi un'interruzione significativa delle letture OCR, poiché dipendono da temperatura, umidità, concentrazioni di CO2 e altri fattori che vengono temporaneamente interrotti con l'apertura della porta dell'incubatore. Durante la rimozione del dispositivo dal coperchio di rilevamento, non è necessario mettere in pausa l'esperimento online. Dopo l'apertura dello sportello dell'incubatore per colture cellulari o la sostituzione del terreno sulla piastra da sondare, in genere sono necessarie 2-4 ore per ristabilire il gradiente di ossigeno e iniziare a misurare un OCR accurato.
    14. Dopo aver ottenuto i dati, sottrarre l'OCR basale per ciascun pozzetto dall'OCR dopo l'applicazione della condizione sperimentale, per determinare l'OCR Delta attivato dal trattamento.
    15. Al termine dell'esperimento, sterilizzare e riutilizzare il coperchio di rilevamento (che può essere riutilizzato 3-5 volte, anche se le prestazioni diminuiscono con l'uso ripetuto). Per sterilizzare il coperchio di rilevamento, immergere l'intero coperchio in etanolo al 70% per 10 minuti in una cappa di coltura cellulare, quindi rimuoverlo dall'immersione e farlo riposare nella sonda dell'armadio con il lato rivolto verso l'alto (evitare di toccare le delicate punte della sonda) e lasciare evaporare completamente l'etanolo e l'acqua prima di mettere il coperchio di rilevamento su una nuova piastra ricevente a 96 pozzetti.
  3. Scatta immagini in campo chiaro per normalizzare i valori OCR al numero di cella.
    NOTA: L'accumulo di melanina nell'RPE facilita la normalizzazione dell'OCR basata su un semplice conteggio del numero di cellule in colture viventi utilizzando un microscopio a campo chiaro.
    1. Rimuovere il dispositivo e posizionarlo capovolto, come al punto 1.2.8. Nella cappa per colture cellulari, sostituire il coperchio di rilevamento sulla piastra di coltura RPE con un coperchio standard a 96 pozzetti.
    2. Utilizzando un microscopio invertito standard, scattare immagini in campo chiaro di ciascun pozzetto.
      NOTA: Mantenere le immagini dell'area uno coerenti tra i pozzetti (posizione relativa nel pozzetto e ingrandimento dell'obiettivo).
    3. Nella cappa per colture cellulari, sostituire il coperchio standard a 96 pozzetti della piastra di coltura RPE con il coperchio di rilevamento e riporlo nell'incubatore per un ulteriore monitoraggio.
    4. Conta il numero di celle in ogni pozzetto con ImageJ o un altro software.
    5. Normalizzare l'OCR al numero di cellule nei diversi gruppi sperimentali. Il sistema riporta l'OCR in unità di fmol∙(mm2)-1∙s-1-il consumo per area dell'unità trasversale. Pertanto, per normalizzare l'OCR per cella, dividere l'OCR per il numero di cellule per mm2 (anziché per il numero di cellule per pozzetto). Equivalentemente, moltiplicare l'OCR riportato dal sistema per l'area della sezione trasversale del pozzetto (circa 31 mm2 per una piastra standard a 96 pozzetti) per ottenere l'OCR in unità di fmol∙s-1∙well-1.
  4. Controlli per la determinazione dei parametri bioenergetici dell'RPE.
    NOTA: Per garantire che il sistema e le colture di RPE rispondano alle manipolazioni mitocondriali in modi prevedibili, è possibile testare alcune piccole molecole ben consolidate per mirare a particolari passaggi della fosforilazione ossidativa mitocondriale. Questi test sono analoghi alle fasi eseguite in un test da sforzo mitocondriale utilizzando il Seahorse Analyzer10 e forniscono un profilo bioenergetico per le colture di RPE.
    1. Coltivare le cellule RPE in 65 μL di terreno di coltura RPE standard con il 5% di FBS e misurare l'OCR per 24 ore per stabilire un valore di riferimento.
    2. Aspirare i terreni di coltura e aggiungere 65 μL di terreno di coltura RPE standard con FBS al 5% e con disaccoppiatori mitocondriali (3 μM di cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone [FCCP] o 500 nM Bam15, Tabella dei materiali). Incubare per una notte.
      NOTA: I disaccoppiatori mitocondriali dovrebbero aumentare significativamente l'OCR. Assicurarsi che l'aumento dell'OCR non sia pari o vicino all'OCR teorico massimo limitato alla diffusione di circa 275 fmol∙(mm2)-1∙s-1 per 65 μL di terreno in condizioni di coltura standard. L'OCR massimo per i diversi volumi multimediali di uso comune è disponibile nella sezione Discussione.
    3. Dopo l'incubazione notturna, aspirare il terreno con disaccoppiatori mitocondriali e sostituirlo con 65 μL di terreno di coltura RPE standard con FBS al 5%. Osservare la piastra per altre 24 ore per determinare il recupero dell'OCR dell'RPE dopo la rimozione dei farmaci.
    4. Calcolare gli effetti dei disaccoppiatori sull'OCR sottraendo l'OCR ottenuto dopo il trattamento dall'OCR ottenuto prima del trattamento (Figura 3).
      NOTA: L'aumento dell'OCR con l'aggiunta di disaccoppiatori mitocondriali indica la capacità respiratoria mitocondriale di riserva della cellula19.
    5. Per misurare altri parametri mitocondriali tipicamente acquisiti durante il test da sforzo mitocondriale con un analizzatore di cavallucci marini, eseguire gli stessi passaggi precedenti con i seguenti composti (Figura 4).
      1. Utilizzare l'oligomicina a 1 μM per valutare la respirazione legata all'ATP.
      2. Utilizzare l'antimicina A e il rotenone a 1 μM per valutare la presenza di qualsiasi respirazione non mitocondriale.
        NOTA: FCCP, oligomicina, antimicina A e rotenone possono essere tossici per l'RPE. Se inducono una morte cellulare significativa, le misurazioni OCR non saranno accurate. Pertanto, le misurazioni OCR dovrebbero essere ottenute solo in un momento in cui non vi è una morte cellulare evidente, generalmente entro le prime ore dopo l'aggiunta dei farmaci (Figura 4).

2. Misurazione delle variazioni del metabolismo mitocondriale nell'RPE sottoposta a EMT

  1. Seguire lo stesso protocollo descritto nella sezione 1.2.
  2. Per indurre l'EMT dopo aver ottenuto le misurazioni OCR al basale, aggiungere TGF-β2 (10 ng/mL) alle colture di RPE e monitorare l'OCR per 3 settimane. Aggiornare i terreni con TGFβ2 fresco ogni 2-3 giorni (Figura 5).
  3. Almeno 2 volte alla settimana, ottenere immagini in campo chiaro come nella sezione 1.3 per assicurarsi che la conta delle cellule non cambi. Se il conteggio cambia, normalizzare i valori OCR in base al numero di cella in ciascun pozzetto.
    NOTA: Lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri induttori di EMT per monitorare i cambiamenti dell'OCR a lungo termine durante il periodo di coltura mentre le cellule sono nell'incubatore.

3. Misurazione delle variazioni del metabolismo mitocondriale nell'RPE ipossica

NOTA: L'applicazione del sistema in condizioni di ipossia, normossia o iperossia è la stessa della sezione 1.2, ad eccezione del mantenimento del "sandwich" in una camera di ipossia (Tabella dei materiali) collocata in un incubatore per colture cellulari standard.

  1. Praticare un foro sul coperchio della camera di ipossia per montare il cavo USB di tipo c e sigillarlo con silicone o stucco (Figura 6A).
  2. Montare il coperchio di rilevamento con la piastra di coltura cellulare nella cappa e trasferirli nella camera di ipossia.
  3. Installare il "sandwich" (piastra, coperchio di rilevamento, dispositivo) nella camera di ipossia. Metti anche nella camera dell'ipossia una capsula di Petri con acqua sterile per aiutare a mantenere l'umidità. Infine, posizionare un sensore portatile di O2 nella camera di ipossia (Tabella dei materiali). L'impostazione è visualizzata nella Figura 6A.
  4. Sigillare la camera e collegarla a una bombola di gas con una concentrazione ipossica di O2 e una concentrazione standard di CO2 in coltura cellulare (ad esempio, 1% O2 e 5% CO2).
  5. Scambiare lentamente l'aria nella camera di ipossia con l'aria all'1% di O2/5% di CO2 nel cilindro fino a quando il sensore di ossigeno mostra la concentrazione di O2 desiderata, di solito tra l'1% e il 10%.
    NOTA: Il sensore portatile di O2 richiede tempo per equilibrarsi, quindi il gas dalla bombola deve essere aggiunto lentamente nella camera di ipossia.
  6. Chiudere le valvole di ingresso e uscita della camera di ipossia e trasferire l'intera camera nell'incubatrice.
  7. Impostare e avviare l'esperimento come nella sezione 1.2.
    NOTA: Il pre-equilibramento dei terreni nella camera di ipossia prima dell'aggiunta alle cellule può ridurre il tempo necessario al monostrato cellulare per sperimentare l'ipossia vera (Figura 6B).

4. Calcolo della concentrazione di O2 nel monostrato di RPE per determinare se le cellule sono in condizioni ipossiche, normossiche o iperossiche

NOTA: Per impostazione predefinita, il sistema misura la concentrazione di O2 tra circa 1 e 1,5 mm sopra il fondo del pozzetto, supponendo che venga utilizzata una piastra standard con il corrispondente coperchio di rilevamento consigliato per la coltura monostrato (fare riferimento a https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Sebbene la concentrazione di O2 nel monostrato cellulare non sia misurata direttamente, i dati del sistema possono essere utilizzati per stimare la concentrazione di O2 a livello dell'RPE. In particolare, sapendo che esiste un gradiente di ossigeno tra la parte superiore della colonna del terreno, dove è disponibile l'O2 , e la parte inferiore della colonna del terreno, dove l'O2 viene consumato, le leggi di diffusione di Fick possono essere combinate con il tasso di OCR misurato per estrapolare i livelli di O2 nel monostrato cellulare. Un calcolatore per questa stima è fornito online: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (e sotto forma di un taccuino interattivo open source su https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, il codice sorgente di questo calcolatore potrebbe essere trovato su https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Una volta effettuato l'accesso alla calcolatrice, inserire il volume del terreno in microlitri (ad esempio, 100 μL).
  2. Inserire la concentrazione di ossigeno saturo all'interfaccia aria-liquido (la parte superiore della colonna del fluido sopra le celle). Questo valore è ~185 μM a pressione atmosferica standard con 5% O2 e 95% di umidità.
    NOTA: Questo può essere determinato anche dalle misurazioni di O2 mediante sonde di sistema in pozzetti di solo terreno (senza celle sul fondo del pozzetto).
  3. Nell'input Flusso, immettere il flusso/OCR riportato dal sistema.
  4. Sulla base di questi valori, la concentrazione di ossigeno allo stato stazionario a ciascuna altezza nella colonna del terreno viene calcolata e mostrata nel grafico (Figura 7). L'asse x del grafico è l'altezza in mm sopra il fondo del pozzo. L'asse y è la concentrazione di O2 calcolata a quell'altezza (in μM).
  5. La concentrazione di O2 sul fondo del pozzetto (dove si trovano le cellule) è riportata nella riga sotto il grafico.
    NOTA: In generale, si stima che l'RPE in vivo veda una concentrazione di O2 del 4-9%. Ogni 10 μM di O2 in condizioni atmosferiche standard corrisponde a circa l'1% di O2. Pertanto, la normossia a livello delle cellule è di circa 40-90 μM di O2. Più alta è la colonna del supporto, più basso sarà l'O2 a livello del monostrato RPE9. Pertanto, se le cellule sembrano essere in condizioni di ipossia, il volume del terreno può essere ridotto. Se le cellule sembrano essere in condizioni iperossiche, il volume del terreno può essere aumentato.

Risultati

La configurazione "a sandwich" per l'esperimento Resipher è dimostrata nella Figura 2A. I coperchi di rilevamento con 32 sonde corrispondenti alle colonne 3, 4, 9 e 10 sulla piastra a 96 pozzetti si trovano tra la piastra della cella e il dispositivo. Dopo il collegamento all'hub, il dispositivo attiva i motori per spostare il coperchio di rilevamento su e giù, misurando la concentrazione di O2 nella colonna del fluido a un intervallo di altezze sopra il monostrato della cella (tipicamente 1-1,5 mm). Il gradiente di O2 viene quindi misurato in modo continuo registrando le concentrazioni di O2 a queste varie altezze al di sopra del monostrato. Dalle misurazioni del gradiente e dall'applicazione delle leggi di diffusione di Fick, il dispositivo calcola automaticamente il flusso di ossigeno da sopra l'intervallo di altezza della sonda a sotto di esso, che è il tasso di consumo di ossigeno (OCR) del monostrato di celle. Il coperchio di rilevamento rileva l'O2 indipendentemente dal fatto che un pozzetto sia vuoto (solo aria), riempito con terreno ma senza celle (solo terreno) o con terreno sovrastato a un monostrato di celle (terreno + celle). Come controllo di qualità del funzionamento dei sensori nel coperchio di rilevamento, il coperchio può essere posizionato su una piastra vuota (solo aria) a 96 pozzetti. Se ogni sensore per ogni pozzetto è in funzione, l'O2 riportato deve essere coerente tra loro e vicino a 200 μM, che è vicino all'O2 previsto nell'atmosfera in condizioni standard di incubatore per colture cellulari. La Figura 2Bi mostra le letture di O2 da otto sonde nell'aria atmosferica (riportate come concentrazione in μM poiché la conversione dell'unità predefinita presuppone che le sonde siano in un liquido a 37 °C). Queste letture sono strette (±5%) e vicine a 200 μM, il che implica che tutti e otto i sensori funzionano bene. Nella Figura 2Bii, viene utilizzato lo stesso coperchio di rilevamento della Figura 2Bi , ma viene distribuito un dispositivo diverso. In questo caso, due sensori del dispositivo difettosi vengono rilevati in base alle curve anomale (in rosso). Ciò suggerisce che il dispositivo è problematico e deve essere sostituito (o che i pozzetti corrispondenti ai sensori difettosi dovrebbero essere esclusi dall'esperimento). Nella Figura 2Biii, viene utilizzato lo stesso dispositivo della Figura 2Bi , ma vengono impiegati due diversi coperchi di rilevamento. Il coperchio1 (lato sinistro) ha un'elevata variabilità tra le sonde, suggerendo che il materiale di rilevamento del coperchio è degradato, di solito perché il coperchio è stato utilizzato troppe volte. Il coperchio2 (lato destro) è nuovo, e dimostra letture strette e raggruppate intorno ai 200 μM. Utilizzando il sistema, è possibile analizzare l'effetto dell'integrazione sierica nei terreni sul metabolismo mitocondriale dell'RPE. Come si vede nella Figura 2C, l'aumento dei livelli di integrazione sierica ha innescato livelli di OCR RPE leggermente più elevati. È importante sottolineare che una maggiore integrazione sierica ha anche permesso di sostenere il metabolismo mitocondriale per un periodo più lungo. Anche senza alcuna integrazione sierica, l'OCR viene mantenuto per circa 90 ore prima che l'esaurimento dei substrati metabolici mitocondriali inneschi un calo dell'OCR. Pertanto, i cambi di terreno con 100 μl per 96 pozzetti ogni 3,5 giorni (due volte a settimana) sono sufficienti, anche con terreni privi di siero, per evitare l'esaurimento dei nutrienti in colture di RPE mature, altamente differenziate e polarizzate.

I tassi di OCR possono variare in modo significativo da pozzetto a pozzetto, anche nelle colture in cui tutti i pozzetti sembrano avere lo stesso numero di cellule e la stessa morfologia. Pertanto, per isolare se gli aumenti dell'OCR sono attribuibili a una condizione sperimentale o semplicemente alle differenze di base nell'OCR tra i pozzetti, è necessaria la normalizzazione. Il primo passo verso la normalizzazione consiste nel garantire che la conta delle cellule tra i pozzetti sia coerente, come indicato nella sezione 1.3 del protocollo. Se il numero di cellule varia tra i pozzetti, l'OCR per il pozzetto deve essere normalizzato al numero di cellule. In generale, per le colture di RPE altamente mature e polarizzate, la conta cellulare tra i pozzetti è notevolmente costante9. Anche in tali scenari, l'OCR di base tra i pozzi può variare, come dimostrato nella Figura 3A. In questo caso, l'OCR basale, prima di qualsiasi trattamento, varia fino a 100 fmol/mm2/sec tra i pozzetti. Misurando l'OCR prima del trattamento, è possibile determinare l'OCR Delta innescato dal trattamento sperimentale e isolarlo da eventuali differenze nell'OCR basale tra i pozzetti. In questo caso, i trattamenti stanno confrontando due disaccoppiatori mitocondriali (FCCP vs. BAM15) con il controllo del veicolo. Una volta che l'OCR al basale viene utilizzato per la normalizzazione, gli effetti del trattamento specifici per i disaccoppiatori rispetto al controllo diventano evidenti (confrontare la Figura 3B con la Figura 3C). In generale, gli esperimenti che possono modificare l'OCR devono essere suddivisi in almeno due fasi: l'OCR iniziale per stabilire un OCR di base e una fase di trattamento per determinare l'OCR Delta.

Per confermare che le colture di RPE rispondono nei modi attesi alla manipolazione mitocondriale e stabilire un profilo bioenergetico per l'RPE, è possibile utilizzare con il sistema i classici strumenti a piccole molecole utilizzati nel test da sforzo mitocondriale sull'analizzatore di cavallucci marini di Agilent. In primo luogo, la capacità mitocondriale di riserva può essere misurata utilizzando un disaccoppiatore mitocondriale19. Nelle colture di RPE, il disaccoppiatore mitocondriale BAM15 mostra un aumento molto più robusto e sostenuto dell'OCR rispetto all'FCCP (Figura 3C, D), senza indurre tossicità. Altri parametri disponibili nel Seahorse Analyzer Mitochondrial Stress Test, tra cui la respirazione basale, la respirazione legata all'ATP, la perdita di protoni e la capacità respiratoria non mitocondriale, possono essere calcolati utilizzando il sistema. Mentre l'analizzatore Seahorse si basa su porte di iniezione per erogare in sequenza tossine che inibiscono specifici complessi di fosforilazione ossidativa per dedurre i parametri di cui sopra, Resipher non ha questa capacità. Tuttavia, ogni tossina mitocondriale può essere aggiunta a pozzetti separati e diversi parametri respiratori possono essere calcolati in base al cambio di piega sui pozzetti trattati con veicolo. Nella Figura 4A, vengono confrontate le differenze nell'OCR tra i pozzetti trattati con il disaccoppiatore mitocondriale BAM15, l'inibitore dell'ATP sintasi oligomicina, gli inibitori del complesso I e III antimicina/rotenone e il controllo del veicolo (DMSO). Poiché queste tossine possono indurre la morte cellulare per periodi di tempo più lunghi e la morte cellulare influenzerà l'OCR, le letture OCR sono state effettuate dopo solo poche ore di trattamento. La Figura 4B mostra le differenze di OCR tra veicolo e pozzetti trattati con ciascuna piccola molecola mitocondrialmente attiva sotto forma di grafico a barre, estrapolata dagli ultimi punti temporali nella Figura 4A. I valori OCR nella Figura 4B possono quindi essere utilizzati per calcolare i parametri bioenergetici per la coltura di RPE, come mostrato nella Figura 4C. Ogni valore codificato a colori nel profilo bioenergetico nella Figura 4C deriva dallo stesso valore codificato a colori nella Figura 4B. Pertanto, parametri come la respirazione legata all'ATP, la perdita di protoni, la capacità respiratoria mitocondriale massima e la capacità respiratoria non mitocondriale possono essere stimati utilizzando il sistema OCR. Un riassunto della modalità d'azione di ciascuna piccola molecola mitocondrialmente attiva è mostrato nella Figura 4D.

Dopo aver dimostrato il protocollo di questo sistema su colture di RPE ed esperimenti di controllo per il dosaggio dei profili bioenergetici dei RPE, è possibile esplorare le applicazioni sperimentali del sistema alla biologia e alla patologia dei RPE. Nella vitreoretinopatia proliferativa (PVR), una condizione che si verifica dopo il distacco della retina o un trauma oculare, l'RPE subisce una drammatica trasformazione nota come transizione da epitelio a mesenchima (EMT) per cui l'RPE altamente regolare e simile a un ciottolo perde le sue aderenze cellula-cellula e si transdifferenzia in cellule mesenchimali a forma di fuso che sono contrattili e mobili 1,2. Questo innesca forze contrattili tangenziali sulla retina che possono indurre il distacco della retina. Gli induttori classici dell'EMT nell'EPR includono il fattore di crescita trasformante-beta (TGFβ) e il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα)10,11,12. Delle tre isoforme di TGFβ nei mammiferi, il TGFβ2 è il più importante e potente induttore di EMT nella retina1, causando un distinto allungamento cellulare delle cellule RPE tipicamente esagonali e un aumento dell'espressione di marcatori mesenchimali. La risposta EMT indotta dal TGFβ2 nell'RPE è accompagnata da una soppressione della respirazione mitocondriale e da un conseguente aumento della capacità glicolitica, come precedentemente dimostrato utilizzando un cavalluccio marino XFe9610. Sebbene il cavalluccio marino fornisca profili bioenergetici in tempo reale, non consente il monitoraggio OCR a lungo termine. Pertanto, nella prima applicazione del sistema OCR in questo studio (Figura 5), la respirazione mitocondriale è stata monitorata per tre settimane poiché l'EMT è stata indotta con TGFβ2 nell'RPE, consentendo la modellazione in vitro della riprogrammazione metabolica che si verifica durante la PVR. A differenza dell'analisi a singolo punto temporale dell'EMT RPE utilizzando un analizzatore di cavallucci marini, lo stato metabolico dell'RPE sottoposto a EMT può essere monitorato per diverse settimane. È evidente che l'esposizione ripetuta di RPE al TGFβ2 provoca un continuo declino progressivo del metabolismo mitocondriale. I dati precedenti che utilizzavano l'analizzatore Seahorse XF indicavano che il TGFβ2 riduceva significativamente la capacità respiratoria massima a 24 e 72 ore, ma non influenzava i livelli basali di OCR10. L'OCR basale invariato con TGFβ2 fino a 72 h è corroborato dal sistema OCR utilizzato in questo studio (Figura 5). Tuttavia, i dati a lungo termine del sistema OCR in questo studio rivelano che dopo 5 giorni di esposizione al TGFβ2, i livelli basali di OCR iniziano a diminuire, con un calo dell'OCR basale che diventa più evidente a 20 giorni. Questi risultati evidenziano cambiamenti a lungo termine nell'OCR basale che non sono stati catturati con i precedenti punti temporali del cavalluccio marino.

In una seconda applicazione, il sistema può essere utilizzato per monitorare il metabolismo mitocondriale dell'RPE in condizioni di ipossia. Poiché l'AMD è collegata all'assottigliamento dei coriocapillari e all'ipossia13,20, la comprensione degli aggiustamenti dell'RPE all'ipossia subtossica dovrebbe fornire informazioni sulla patogenesi dell'AMD. Per sottoporre le colture di RPE a ipossia controllata durante il monitoraggio del metabolismo mitocondriale, il sistema può essere collocato in una camera di ipossia che, a sua volta, viene collocata in un incubatore per colture cellulari. Per facilitare questa configurazione, viene praticato un piccolo foro nel coperchio di una camera di ipossia, consentendo al cavo USB del sistema di raggiungere l'interno della camera di ipossia. Il foro è sigillato con stucco o silicone (Figura 6A). Un sensore portatile di O2 può essere posizionato nella camera di ipossia per monitorare i livelli di O2 atmosferico e garantire che la guarnizione della camera di ipossia rimanga intatta. Utilizzando questa configurazione, è possibile determinare il tasso di equilibrio tra la concentrazione atmosferica di O2 e la concentrazione di O2 del mezzo. Nella Figura 6B, il terreno bilanciato con l'O2 atmosferico viene posto in pozzetti individuali su una piastra a 96 pozzetti, senza cellule, e introdotto in una camera di ipossia contenente solo il 5% di O2 (~50 μM O2). Nel tempo, il mezzo in ogni pozzo si equilibra con la nuova concentrazione atmosferica. Maggiore è l'altezza della colonna multimediale (maggiore è il volume), maggiore è il tempo necessario per l'equilibrio. Con 65 μL di terreno in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, l'equilibrio con l'O2 atmosferico richiede circa 5 ore. Tuttavia, il tempo di equilibrio richiede più di 10 ore quando il volume del terreno è di 100-200 μL. Questi risultati sottolineano l'importanza di pre-equilibrare i terreni con la concentrazione atmosferica di O2 desiderata prima di applicare i mezzi alle cellule durante un esperimento di ipossia.

Per gli esperimenti sull'ipossia, è importante assicurarsi che i livelli di O2 nella camera dell'ipossia rimangano stabili. Mantenendo uno dei pozzetti sul bordo della piastra a 96 pozzetti libero da celle o terreni consentirà a uno dei sensori del coperchio di rilevamento di monitorare continuamente l'O2 atmosferico. Nella Figura 6C, tale monitoraggio con un singolo pozzo esposto all'aria dimostra che la camera di ipossia ha una perdita lenta, tale che entro 30 ore le celle sono vicine alle concentrazioni atmosferiche di O2 . Come controllo finale per gli esperimenti di ipossia, è importante determinare se la solubilità dell'O2 differisce tra terreni "freschi" e "condizionati". Se la solubilità differisce tra i terreni inizialmente posizionati sulle cellule e i terreni che sono stati sulle cellule per un periodo di tempo significativo, allora il gradiente di O2 nella colonna dei terreni sopra le celle differirà come "condizioni" dei mezzi con il tempo sulle cellule. Questo, a sua volta, influisce sul calcolo dell'OCR. Nella Figura 6D, una piastra da 96 pozzetti con pozzetti vuoti ("aria"), pozzetti senza cellule ma con terreni freschi ("nuovi terreni") e pozzetti senza cellule ma con terreni precedentemente incubati su colture RPE per 48 ore ("terreni condizionati") è stata prima collocata nell'atmosfera O2 per consentire il pieno equilibrio. La piastra è stata quindi posta in una camera di ipossia a circa il 3-4% di O2 (30-40 μM) e lasciata equilibrare. Infine, la placca è stata nuovamente riportata alle concentrazioni atmosferiche di O2 . Le curve di concentrazione di O2 per i nuovi mezzi e i mezzi condizionati sono identiche, dimostrando che la solubilità dell'O2 tra i mezzi nuovi e quelli condizionati è identica, confermando che i cambiamenti nella composizione dei terreni nel tempo, man mano che i nutrienti vengono consumati e i sottoprodotti vengono secreti nei mezzi, non alterano in modo significativo la solubilità dell'O2 e quindi non influenzano inavvertitamente l'OCR.

Poiché l'altezza della colonna del terreno sopra le cellule influisce notevolmente sulla disponibilità di O2 nel monostrato9 dell'RPE, è importante determinare se un particolare volume del terreno induce ipossia, normossia o iperossia nel monostrato dell'RPE. Utilizzando le misurazioni del sistema, combinate con un calcolatore online (https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (e sotto forma di quaderno interattivo open source presso https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture) - codice sorgente di questo calcolatore presso https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator), è possibile stimare la concentrazione di ossigeno nel monostrato RPE. Nella Figura 7 viene illustrata una schermata della calcolatrice interattiva. L'RPE in vivo vede tipicamente una concentrazione di O2 del 4-9%, che si traduce in una concentrazione molare di O2 di ~40-90 μM.

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Figura 1: Posizione dei sensori su diversi coperchi di rilevamento, disposizione delle piastre per il coperchio di rilevamento a 32 canali e morfologia dell'RPE. Pozzetti che corrispondono alla posizione dei sensori nei diversi coperchi di rilevamento per le opzioni di coperchio (A) a 4 canali, (B) a 32 canali e (C) a 96 canali. (D) Layout della piastra consigliato per il coperchio del sensore a 32 canali. A causa degli effetti del bordo, le cellule non devono essere seminate nei pozzetti del bordo e devono invece essere posizionate in questi quattro pozzetti (viola). Le cellule vengono seminate in pozzetti arancioni. I pozzetti rimanenti devono essere riempiti con acqua sterile (blu) per evitare effetti di evaporazione. (E) Coltura di RPE matura con cellule esagonali, strettamente impacchettate e pigmentate. Barra di scala = 20 μm. Abbreviazioni: RPE = epitelio pigmentato retinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Configurazione del sistema Resipher "sandwich" e controllo qualità. (A) Il coperchio di rilevamento sostituisce un coperchio standard per piastre da 96 pozzetti e le sue sonde vengono inserite nei pozzetti corrispondenti. Il dispositivo in nero si posiziona saldamente sul coperchio di rilevamento tramite magneti. Le immagini sul lato sinistro della figura mostrano il dispositivo e il coperchio di rilevamento nel loro orientamento corretto. Tuttavia, per le fotografie sul lato destro, il dispositivo e il coperchio di rilevamento sono stati ruotati ai lati per visualizzare meglio il profilo inferiore. (B) Controllo di qualità per i coperchi di rilevamento e il Dispositivo. (i,ii) Lo stesso coperchio di rilevamento è posizionato in una piastra ricevente vuota a 96 pozzetti (solo aria) e due diversi dispositivi sono posizionati in sequenza sopra il coperchio di rilevamento. (i) Il primo dispositivo mostra i dati di otto sonde con bassa variabilità e letture di O2 ~200 μM, previste per l'O2 atmosferico. (ii) Il secondo dispositivo mostra i dati di otto sonde in cui due sonde leggono in modo anomalo (punti rossi). (iii) Un dispositivo è stato utilizzato con una piastra vuota da 96 pozzetti (solo aria) ma con due diversi coperchi di rilevamento testati in sequenza. Sono stati tracciati i dati di 16 sonde, dimostrando un'ampia variabilità per Lid1 (lato sinistro) e una bassa variabilità per Lid2 (lato destro). (C) I grafici OCR di colture di RPE in terreni da 100 μL con diverse quantità di siero sono stati monitorati per 120 ore. Le cellule RPE in terreni sierici liberi (magenta) hanno un OCR inferiore, con un calo anticipato rispetto ai terreni con quantità più elevate di siero. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; RPE = epitelio pigmentato retinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Effetti a lungo termine dei disaccoppiatori mitocondriali dimostrati in modo univoco con il sistema OCR. (A) Dati OCR grezzi nel tempo (ore) che evidenziano l'OCR iniziale (stabilito in 50 ore), la fase di trattamento (~20 ore dopo l'aggiunta di farmaci) e la fase di recupero (~20 ore dopo il washout del farmaco). L'RPE è stato trattato con due diversi disaccoppiatori mitocondriali, FCCP (3 μM, N = 4) o BAM15 (500 nM, N = 4) e confrontato con il controllo del veicolo DMSO (0,6%, N = 7). Ogni traccia rappresenta un singolo pozzo. (B) OCR medio di tutti i pozzetti per ciascuna condizione di cui al punto (A) tracciato per le fasi di trattamento e recupero. Senza normalizzazione (l'asse Y è l'OCR assoluto), è difficile vedere l'entità dell'effetto del trattamento con FCCP. (C) Quando ogni traccia OCR viene sottratta dal suo OCR prima del trattamento, è possibile calcolare un Delta OCR (tracciato sull'asse Y). Ciò consente di isolare gli effetti del trattamento sull'OCR, nonostante la variabilità dell'OCR basale tra i pozzetti. Utilizzando Delta OCR, l'effetto dell'FCCP diventa evidente. Diventa anche evidente quanto sia di breve durata l'effetto della FCCP sul disaccoppiamento mitocondriale, rispetto al BAM15. Infine, diventa evidente che, rispetto alla FCCP, l'esposizione a BAM15, anche dopo che il farmaco è stato lavato via, crea un nuovo stato "adattato" di OCR più elevato e sostenuto. (D) I grafici in (B) e (C) vengono visualizzati sotto forma di grafico a barre, consentendo il confronto diretto tra dati non normalizzati (grafico a sinistra, da (B)) e normalizzati (Delta OCR, grafico a destra, da (C)). Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; RPE = epitelio pigmentato retinico; FCCP = cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone; DMSO = dimetilsolfossido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Utilizzo del sistema OCR per calcolare i parametri della bioenergetica mitocondriale. (A) Utilizzando le stesse piccole molecole che fanno parte del Seahorse Analyzer Mitochondrial Stress Test, viene illustrato l'OCR nelle prime 2,5 ore della fase di trattamento per le colture di RPE. (Grafico a sinistra) L'inibitore dell'ATP-sintasi oligomicina (N = 3), gli inibitori del complesso I e III antimicina A/rotenone (N = 7) o veicolo, DMSO 0,4% (N = 4). (Grafico a destra) Il disaccoppiatore mitocondriale BAM15 (N = 4) o il veicolo DMSO 0,6% (N = 4). (B) Media degli ultimi tre punti temporali per ciascun gruppo di trattamento (caselle rosse in (A)). (C) Rappresentazione di un profilo bioenergetico simulato di un Seahorse Analyzer Mitochondrial Stress Test basato sui dati Resipher. I punti dati codificati a colori sul grafico simulato corrispondono ai grafici a barre codificati a colori in (B). Tutti i parametri respiratori possono essere calcolati utilizzando i dati Resipher e selezionando piccole molecole. (D) Diagramma del meccanismo d'azione dei reagenti utilizzati nelle figure 3 e 4. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; RPE = epitelio pigmentato retinico; DMSO = dimetilsolfossido; AA = Antimicina A; Marciume = Rotenone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Monitoraggio OCR a lungo termine dell'RPE in fase di transizione epiteliale-mesenchimale stimolata dal TGFβ2. Le colture primarie di RPE umane mature sono state trattate con 10 ng/mL di TGFβ2 o con il controllo del veicolo ogni 2-3 giorni. (A) Le misurazioni OCR in tempo reale sono state monitorate per 3 settimane con (B) Quantificazione dell'OCR Delta nel tempo (Giorno 19-Giorno 6). N = 6-7 pozzetti per condizione, t-test non appaiato, * P < 0,05. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; RPE = epitelio pigmentato retinico; TGFβ2 = fattore di crescita trasformante beta-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Monitoraggio della risposta mitocondriale dell'RPE all'ipossia. (A) Il "sandwich" del sistema OCR è stato assemblato in una camera di ipossia e il cavo USB è stato collegato all'hub tramite un foro praticato nel coperchio e sigillato con grasso o mastice siliconico. Nella camera di ipossia c'è anche una capsula di Petri di acqua sterile per mantenere l'umidità e un sensore portatile di O2 . L'intero sistema è stato lasciato in un incubatore per colture cellulari dopo che l'atmosfera della camera di ipossia è stata sostituita con una concentrazione di O2 inferiore. (B) Il fluido impiega tempo per equilibrarsi a concentrazioni di O2 al di sopra dell'interfaccia aria-liquido. Diversi volumi di mezzi RPE bilanciati all'O2 atmosferico sono stati aggiunti in pozzetti vuoti (senza celle) di una piastra a 96 pozzetti. La camera di ipossia è stata quindi regolata al 5% (50 μM) O2. La concentrazione di O2 nel mezzo di ciascun pozzo è stata monitorata per 20 ore. I pozzetti con volumi di media più elevati si equilibravano al 5% di O2 più lentamente rispetto ai volumi di media più bassi. N = 8. (C) Il sistema può essere utilizzato per rilevare perdite d'aria nella camera di ipossia. La camera di ipossia è stata allestita con l'1% di O2 e il coperchio di rilevamento è stato posizionato su pozzetti vuoti (solo aria). Le porte di ingresso e di uscita della camera di ipossia sono state lasciate aperte e l'atmosfera della camera di ipossia è stata riequilibrata ai livelli di O2 atmosferico in ~90 ore. (D) I nuovi mezzi e i surnatanti ("mezzi condizionati") hanno una solubilità simile all'O2 . Ciò elimina la preoccupazione della solubilità differenziale dell'O2 nei terreni poiché la sua composizione cambia durante la coltura, il che influirebbe sulla coerenza delle letture OCR nel tempo. Lo stesso volume (100 μL) di terreno fresco ("nuovo terreno") o di terreno incubato per 48 ore su cellule ("terreno condizionato") è stato aggiunto ai pozzetti di una piastra senza cellule. Il sistema OCR "sandwich" è stato inizialmente sottoposto a livelli di O2 atmosferico, quindi trasferito nella camera di ipossia (3-5% O2 o 30-50 μM), quindi trasferito nuovamente a livelli di O2 atmosferico. I livelli di O2 nell'aria sono stati monitorati da sonde in pozzi vuoti (solo aria). La variazione della concentrazione di O2 durante ogni transizione tra i due tipi di terreno è identica, dimostrando che la solubilità dell'O2 tra i due tipi di terreno è identica. N = 6. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; RPE = epitelio pigmentato retinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Concentrazioni di O2 al monostrato di RPE determinate con un calcolatore online. Screenshot del calcolatore online (https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture). Vedere il testo per i dettagli su come il calcolatore può essere utilizzato per determinare la quantità di ossigeno disponibile nel monostrato RPE. Abbreviazioni: RPE = epitelio pigmentato retinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Risoluzione dei problemi degli esperimenti: evaporazione, cellule malsane ed eccessive fluttuazioni OCR. (A) Evaporazione eccessiva. Quando si verifica un'irregolarità nella traccia OCR di un pozzo, iniziare facendo clic sulla scheda Ambiente nell'interfaccia online del sistema (a sinistra). Qui è possibile monitorare l'umidità, la temperatura e la pressione atmosferica. L'apertura dell'incubatore per colture cellulari interromperà temporaneamente l'umidità (vedere 2 h e 28 h sulla traccia). Tuttavia, a partire da 30 h, la traccia di umidità diminuisce costantemente nel tempo, anche senza aprire la porta. Ciò suggerisce che la vaschetta dell'acqua dell'incubatore per colture cellulari è asciutta. Qualsiasi interruzione dell'umidità o della temperatura altererà le letture OCR. (A destra) La bassa umidità aggrava l'evaporazione. Nella traccia a destra, un pozzo sottoposto a rapida evaporazione mostra differenze progressivamente più piccole nella concentrazione di O2 tra la parte superiore e inferiore dell'escursione della sonda del sensore (da 1 mm a 1,5 mm sopra il monostrato di RPE). Ciò suggerisce che la punta della sonda è vicina all'interfaccia air-media. Quando la lettura della concentrazione di O2 è "piatta" a un valore vicino alle concentrazioni atmosferiche note di O2 (~200 μM), ciò suggerisce che la punta della sonda è completamente fuori dalla colonna del terreno e sta campionando solo aria. Le letture OCR non sono più valide e tali pozzetti necessitano di un cambio immediato del fluido. (B) Cellule malsane. Il tracciamento dell'O2 e della traccia OCR di ogni singolo pozzetto consente l'identificazione di un pozzetto anomalo, solitamente causato da cellule non sane. Qui, il pozzo designato dalla traccia blu non è salutare. N = 6 pozzi. (C) Aperture della porta dell'incubatore e cambio dei fluidi. I cambiamenti di umidità atmosferica, temperatura, pressione e CO2 durante l'apertura della porta dell'incubatore, insieme a qualsiasi cambiamento del fluido, interrompono temporaneamente il gradiente di equilibrio O2 stabilito nel pozzo, causando picchi aberranti di O2 e OCR all'inizio e alla fine di questi grafici. N = 6 pozzi. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Risoluzione dei problemi relativi agli esperimenti: volume multimediale e normalizzazione. (A) Il volume dei supporti limita l'OCR massimo possibile. Poiché volumi di terreno più elevati portano a una minore disponibilità di O2 nel monostrato RPE, ogni volume di terreno in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ha un OCR massimo. Al di sopra di questo OCR, l'O2 a livello delle cellule è essenzialmente dello 0% (anossico). Pertanto, se si è vicini al massimo OCR teorico per un dato volume multimediale, è utile abbassare il volume multimediale, in modo che non si veda alcun "effetto soffitto" OCR nel corso dell'esperimento. Viene mostrato l'OCR teorico massimo ottenibile per ciascun volume del terreno (in una piastra standard a 96 pozzetti). Tutti i valori sono stati calcolati utilizzando il calcolatore online discusso nella sezione 4 del protocollo e visualizzati nella Figura 7. (B) Normalizzazione appropriata. Per gli esperimenti in cui si è interessati all'effetto di una variabile sulla capacità di un'altra variabile di indurre il metabolismo mitocondriale, una configurazione sperimentale OCR Delta-Delta è l'ideale. Nella configurazione in (B), viene testata la capacità di due diversi mezzi di promuovere la β-ossidazione del palmitato. Se si verifica una β-ossidazione dell'acido grasso, dovrebbe esserci un aumento significativo dell'OCR mitocondriale. Alcuni terreni possono promuovere la β-ossidazione del palmitato meglio di altri mezzi. Sul lato sinistro del grafico OCR, due diversi terreni (Media 1 e Media 2) vengono introdotti in pozzetti paralleli di colture RPE. Si ottiene l'OCR di base. Successivamente, il palmitato viene aggiunto a metà dei pozzetti contenenti ciascun tipo di terreno. Questo crea quattro condizioni: Media 1 - palmitato, Media 1 + palmitato, Media 2 - palmitato, Media 2 + palmitato. Viene registrata la risposta OCR a ciascuna di queste nuove condizioni dei media. Successivamente, i valori OCR dopo i trattamenti sperimentali (media del riquadro tratteggiato rosso in fase di trattamento) vengono sottratti dai valori OCR di base prima del trattamento (media del riquadro tratteggiato rosso in fase basale), creando grafici a barre Delta OCR (in basso a sinistra). Infine, la capacità del Media 1 rispetto al Media 2 di promuovere l'ossidazione β è determinata in un grafico a barre OCR Delta-Delta (in basso a destra). In questo caso, viene calcolata la differenza tra "Delta OCR del terreno 1 + palmitato" e "Delta OCR del terreno 1 - palmitato" e confrontata con la differenza tra "Delta OCR del terreno 2 + palmitato" e "Delta OCR del terreno 2 - palmitato". Questo tipo di set-up sperimentale e normalizzazione isola gli effetti del Media 1 rispetto al Media 2 sulla promozione della β-ossidazione; la struttura generale di questa normalizzazione è applicabile a qualsiasi esperimento in cui si misura l'effetto di una variabile sulla capacità di un'altra variabile di alterare l'OCR. Abbreviazioni: OCR = tasso di consumo di ossigeno; RPE = epitelio pigmentato retinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: La ricetta per i terreni di coltura cellulare RPE. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il metabolismo mitocondriale dell'RPE svolge un ruolo critico nella patogenesi delle comuni malattie retiniche cieche, tra cui AMD e PVR. La modellazione del metabolismo mitocondriale dell'RPE in vitro consente di isolare il suo stato metabolico da quelli dei tessuti circostanti, oltre a sottoporre il tessuto a diversi insulti che simulano la malattia in modo controllato. Tale modellazione in vitro del metabolismo mitocondriale dell'RPE è stata facilitata dall'avvento di colture primarie umane ad alta fedeltà e iPSC-RPE che raggiungono lo stato di differenziazione e la polarità appropriati necessari per avvicinarsi strettamente all'RPE in vivo. Sebbene il monitoraggio del tasso di consumo di ossigeno (OCR) in tali colture sia un metodo ideale per monitorare il metabolismo mitocondriale, la configurazione per il monitoraggio OCR spesso preclude la coltivazione di colture nelle condizioni necessarie per un'RPE altamente polarizzata e completamente differenziata. Qui, descriviamo Resipher come un nuovo sistema per il monitoraggio del metabolismo mitocondriale dell'RPE attraverso la valutazione in tempo reale e a lungo termine dell'OCR in colture di RPE altamente differenziate e polarizzate.

Altri metodi sono stati utilizzati per monitorare l'OCR nell'RPE. L'analizzatore Seahorse XF è progettato per monitorare l'OCR in brevi periodi di tempo con manipolazioni acute della funzione mitocondriale. Tuttavia, i saggi di cavalluccio marino richiedono che le cellule vengano coltivate su piastre personalizzate, che non sono in grado di supportare un'elevata polarità e differenziazione dell'RPE21. Calton, Vollrath e colleghi hanno adattato il cavalluccio marino per la valutazione di colture di RPE altamente differenziate coltivate su supporti microporosi tagliando la membrana microporosa in pezzi e inserendoli nella piastra del cavalluccio marino, ma questo metodo funziona ancora solo per il monitoraggio a breve termine delle colture poiché le cellule non hanno accesso alla CO2 Durante il test, il test può essere eseguito solo in condizioni non sterili e il taglio del supporto microporoso indurrà la morte e la disfunzione della porzione del bordo del supporto microporoso nel tempo22. Il Barofuse è un sistema di perfusione senza pompa in cui strisce di RPE coltivate su supporti microporosi possono essere caricate nel sistema di perfusione, consentendo il monitoraggio dell'OCR in tempo reale23. Analogamente alla configurazione modificata per il cavalluccio marino da Calton, Vollrath e colleghi, i principali limiti della valutazione dell'RPE con Barofuse sono la necessità di tagliare i supporti microporosi e la natura a breve termine del punto finale del saggio. L'ossigrafo è progettato anche per rapidi cambiamenti cinetici nell'OCR in risposta a manipolazioni metaboliche24. Non è stato utilizzato per le colture RPE e soffrirebbe delle stesse limitazioni per la valutazione delle colture RPE altamente polarizzate e differenziate del cavalluccio marino e del barofuse.

A differenza di questi altri metodi, il sistema OCR qui descritto consente il monitoraggio dell'OCR mentre l'RPE viene coltivato in piastre/substrati di coltura cellulare standard in condizioni standard con terreni RPE standard in un incubatore di CO2 per colture cellulari standard, fornendo un sondaggio facile e conveniente di colture di RPE altamente differenziate e polarizzate. Oltre a generare dati sulle modifiche OCR in tempo reale da parte del sistema, quelle stesse cellule possono essere utilizzate per ulteriori saggi alla fine del periodo di monitoraggio OCR. Ciò consente di realizzare esperimenti altamente flessibili in cui l'effetto di un intervento sull'OCR viene ripetutamente testato per un periodo di settimane (ad es. - induzione dell'RPE EMT nella Figura 5) o in cui è possibile testare il recupero a lungo termine di un intervento (ad es. - recupero dal disaccoppiamento mitocondriale nella Figura 3) o in cui è possibile monitorare i cambiamenti metabolici a cascata in risposta a un intervento iniziale (ad es. - effetti del siero sull'OCR una volta esauriti i nutrienti dei terreni nella Figura 2). Il sistema OCR in questo documento è particolarmente utile per misurare l'OCR in colture di RPE altamente polarizzate e differenziate. Tali colture sono funzionalmente postmitotiche, con impacchettamento stretto e pigmentazione pesante. Ciò significa che ogni pozzetto contiene numeri di cella quasi identici9, ovviando così alla necessità di normalizzare l'OCR al numero di cellule per la maggior parte degli esperimenti. Anche quando è richiesta la normalizzazione del numero di cellule, la forte pigmentazione dell'RPE e i bordi cellulari ben delimitati consentono la normalizzazione con una conta cellulare semplice non invasiva basata sull'imaging in campo chiaro. Per gli esperimenti che coinvolgono RPE indifferenziato e proliferazione di RPE, come gli esperimenti EMT nella Figura 5, la normalizzazione dell'OCR per pozzetto al numero di cellule diventa necessaria per sapere cos'è l'OCR "per cellula".

Al di fuori del campo retinico, il sistema è stato impiegato per studiare la respirazione cellulare e l'attività metabolica in vari tipi di cellule, tra cui le cellule delle isole pancreatiche25, il muscolo scheletrico26, il cancro ovarico27, i cardiomiociti28 e persino interi organismi, come C. elegans29. Il monitoraggio in tempo reale e a lungo termine dell'OCR utilizzando il sistema OCR qui descritto ha rivelato informazioni chiave sui cambiamenti bioenergetici e sulla disfunzione mitocondriale in questi diversi modelli di malattia.

Il sistema Resipher comporta delle limitazioni. Il metodo per determinare l'OCR è fondamentalmente diverso da quello dell'analizzatore di cavallucci marini, del barofuse o dell'ossigrafo. Richiede la definizione di un gradiente O2 per calcolare l'OCR e il gradiente può richiedere ore per essere stabilito. Pertanto, esperimenti cinetici veloci, possibili negli altri sistemi, non sono possibili con questo sistema. Inoltre, a differenza degli altri sistemi, Resipher non dispone di porte di iniezione per la somministrazione rapida di piccole molecole o la raccolta di metaboliti. Invece, il coperchio di rilevamento deve essere rimosso in una cappa di coltura cellulare, con l'aggiunta di farmaci o la sostituzione dei terreni, insieme alla raccolta manuale dei metaboliti da analizzare.

Per stabilire e risolvere i problemi di un esperimento utilizzando il sistema OCR descritto in questo documento, si consiglia quanto segue. Innanzitutto, riduci al minimo l'evaporazione. Tenere presente che il gradiente O2 nella colonna multimediale sopra il monostrato RPE dipende fortemente dall'altezza della colonna9 e il sistema calcola l'OCR in base al gradiente O2 . Pertanto, se durante l'esperimento si verifica un marcato abbassamento della colonna del terreno a causa dell'evaporazione, il gradiente di O2 cambierà, influenzando le letture OCR. Mantenere piena la vaschetta dell'acqua per l'incubatrice è fondamentale, ma si suggerisce anche di mettere l'acqua in tutti i pozzetti inutilizzati della piastra a 96 pozzetti. Inoltre, i pozzetti sul bordo della piastra hanno tassi di evaporazione più elevati, quindi questi pozzetti vengono lasciati vuoti di celle negli esperimenti tipici presentati sopra. Il sensore di umidità sul sistema OCR può aiutare a monitorare l'umidità dell'incubatrice. Nella Figura 8A, il calo di umidità durante l'esperimento suggerisce che la vaschetta dell'acqua dell'incubatrice è vuota. Man mano che l'evaporazione accelera nel pozzo, le letture della concentrazione di O2 per il pozzo saliranno più in alto e alla fine si "appiattiranno" alla concentrazione atmosferica di O2 (~200 μM) (Figura 8A).

In secondo luogo, verificare che il "sandwich" del sistema OCR sia assemblato in modo appropriato. I punti di contatto metallici sulla parte inferiore del dispositivo e sulla parte superiore del coperchio di rilevamento devono essere puliti, senza detriti che impediscano il pieno contatto. Il dispositivo e il coperchio di rilevamento devono essere fissati completamente a filo e allineati uniformemente sulla piastra a 96 pozzetti senza alcuna inclinazione. Il cavo USB che collega il dispositivo all'hub non deve essere in tensione, il che può causare una torsione del "sandwich" e la limitazione del corretto movimento del dispositivo.

In terzo luogo, assicurarsi che il dispositivo e i sensori del coperchio di rilevamento siano calibrati. La Figura 2B descrive in dettaglio come verificare rapidamente il corretto funzionamento del sensore all'inizio di ogni esperimento. In quarto luogo, assicurarsi che un particolare pozzetto non dimostri un OCR anomalo prima della manipolazione sperimentale. Dopo aver verificato il funzionamento dei sensori, la determinazione dei valori OCR di base per tutti i pozzetti con celle può aiutare a determinare se alcuni pozzetti contengono cellule malsane. La Figura 8B mostra diversi pozzetti sottoposti a valutazione OCR di base, in cui il pozzetto di colore blu dimostra chiaramente un OCR inferiore (e quindi un'alta concentrazione di O2 ). Questo pozzo è un valore anomalo e dovrebbe essere escluso dalla manipolazione sperimentale.

In quinto luogo, ridurre al minimo le manipolazioni ambientali durante le letture OCR attive. Il gradiente di O2 è altamente sensibile alle variazioni di temperatura, umidità, livelli di CO2 dell'incubatrice e pressione atmosferica. L'apertura della porta dell'incubatore influisce in modo significativo su questi fattori, causando interruzioni temporanee nelle letture OCR fino a quando il gradiente di O2 della colonna del supporto non torna all'equilibrio (Figura 8C). I parametri che influenzano l'OCR possono essere monitorati nell'interfaccia online del sistema nella scheda "Ambiente" (Figura 8A).

Sesto, determinare il volume ottimale dei supporti per l'esperimento. Mentre un volume insufficiente del terreno può creare artefatti da un'eccessiva evaporazione (vedere la prima misura di risoluzione dei problemi sopra) o dall'esaurimento prematuro dei nutrienti nel terreno, un volume eccessivo del terreno limita la disponibilità di O2 al monostrato RPE, innescando l'ipossia9. La Figura 7 è uno screenshot del calcolatore online disponibile per determinare l'effetto del volume del mezzo sulla concentrazione di O2 al monostrato RPE. L'OCR massimo possibile per un determinato volume multimediale è visualizzato nella Figura 9A. Se la velocità di OCR per un dato esperimento che utilizza un dato volume si avvicina alla velocità mostrata nella Figura 9A, allora la concentrazione di O2 nel monostrato di RPE si avvicina all'anossia (0%) ed è necessario un volume del terreno inferiore. In generale, gli esperimenti che coinvolgono processi ad alta intensità mitocondriale in coltura di RPE dovrebbero avere volumi di terreno non superiori a 75 μL per 96 pozzetti.

Settimo, eseguire un'appropriata normalizzazione per isolare gli effetti di un intervento sperimentale sull'OCR. Poiché pozzi diversi possono avere un OCR di base diverso, è fondamentale ottenere le letture OCR di base per ciascun pozzetto prima di un intervento sperimentale. Sottrarre l'OCR basale dall'OCR dopo l'intervento sperimentale per ottenere il "Delta OCR", che dimostra l'effetto dell'intervento sperimentale sull'OCR. Il metodo per ottenere il "Delta OCR" è illustrato nella Figura 3 e nella Figura 9B. Se si è interessati agli effetti di un intervento sperimentale sulla capacità di un altro intervento sperimentale di indurre l'OCR, è necessaria un'ulteriore fase di normalizzazione, la "Delta-Delta OCR". Tale esempio è illustrato nella Figura 9B, dove la capacità del palmitato (un intervento sperimentale) di indurre un aumento dell'OCR (attraverso l'induzione della β-ossidazione) dipende dal tipo di terreno per la coltura di RPE (un secondo intervento sperimentale).

Infine, ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Il sistema monitora l'OCR introducendo un sensore di ossigeno nel mezzo sopra le celle. Ciò aumenta il rischio di infezione. Cali imprevisti dell'OCR durante l'esperimento o un OCR inaspettatamente basso all'inizio dell'esperimento potrebbero essere segni di un'infezione. Le piastre devono essere monitorate attivamente per l'infezione al microscopio per colture cellulari. La contaminazione incrociata tra piastre da 96 pozzetti potrebbe verificarsi se viene riutilizzato un coperchio di rilevamento. Per ridurre al minimo tale contaminazione incrociata, si dovrebbe immergere l'intero coperchio in etanolo al 70% per 20 minuti per la decontaminazione dopo l'esecuzione di un esperimento, prima di riutilizzare il coperchio di rilevamento in un nuovo esperimento (vedere la sezione 1.2.15 del protocollo).

In conclusione, viene presentato un protocollo per il monitoraggio in tempo reale e a lungo termine del metabolismo mitocondriale in colture di RPE ad alta fedeltà tramite la valutazione dell'OCR utilizzando un nuovo sistema chiamato Resipher. Può essere utilizzato per numerose applicazioni su colture di RPE altamente polarizzate e differenziate, in particolare, per sondare le proprietà metaboliche fisiologiche dell'RPE isolata e il metabolismo alterato dell'RPE in modelli in vitro di malattia retinica, tra cui AMD e PVR.

Dichiarazioni

Richard A. Bryan e Kin Lo sono dipendenti della Lucid Scientific, che produce il sistema Resipher.

Ringraziamenti

Ringraziamo i dottori Daniel Hass e Jim Hurley per l'idea di testare la solubilità dell'O2 in mezzi nuovi rispetto a quelli condizionati come controllo. Ringraziamo la Dott.ssa Magali Saint-Geniez per il contributo editoriale al manoscritto. Ringraziamo Scott Szalay dell'Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, per aver adattato la camera di ipossia con il cavo USB Resipher. Nessun fondo federale è stato utilizzato per la ricerca sull'HFT. L'Electronic Services Core è supportato da P30 EY007003 del National Eye Institute. Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione dipartimentale illimitata di Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. è sostenuto dalla James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, dalla E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, da una sovvenzione Eversight eye-bank, da una sovvenzione K08EY033420 dal National Eye Institute e dal sostegno di Dee e Dickson Brown, nonché della David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. è supportato dal Programma Scientia dell'UNSW. L.A.K. è sostenuto dall'Iraty Award, da Monte J. Wallace, da Michel Plantevin, da una sovvenzione R01EY027739 del National Eye Institute e dal Department of Defense Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-tironina sale sodicoSigmaT5516
32 canali Resipher lidLucid ScientificNS32-101A per Falco
Antimicina A da streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInibitore del complesso III della catena di trasporto degli elettroni
BAM15SigmaSML1760-5MGAgente di disaccoppiamento per aumentare la respirazione mitocondriale
DMSO, grado di coltura cellulareSigma-aldrichD4540-100MLVeicolo per la ricostituzione di farmaci mitocondriali
Substrati di rivestimento della matrice extracellulare:
Synthemax II-SC		Corning#3535Matrice extracellulare per hfRPE
Substrati di rivestimento della matrice extracellulare: VitronectinaGibcoA14700Matrice extracellulare per iPSC-RPE
FCCP SigmaC2920-10MGAgente disaccoppiante per aumentare la respirazione mitocondriale
Siero fetale bovino (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Idrocortisone-CiclodestrinaSigmaH0396
Camera per ipossiaEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
aminoacidi non essenzialiGibco11140050
Sensore O2Tecnologia Sensit o rilevatori forensiP100 o FD-90A-O2
Penicillina-StreptomicinaGibco15140-122
TGF umano ricombinanteβ 2Peprotech100-35BFattore di crescita trasformante beta-2 per indurre la transizione epitelio-mesenchimale
RotenoneSigmaR8875-1GInibitore del complesso I della catena di trasporto degli elettroni
Piastra compatibileCorning#353072
TaurineSigmaT8691
α MEM (modifica alfa dei supporti di Eagle)Corning15-012-CV
Soluzione di con il sistema

Riferimenti

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