Articolo metodologico

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 novembre 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

In questo articolo

Sommario

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La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Abstract

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Le piastrine attivate promuovono la coagulazione principalmente esponendo il fosfolipide fosfatidilserina (PS) procoagulante sulla loro superficie esterna della membrana e rilasciando microvescicole che esprimono PS che mantengono l'architettura di membrana originale e i componenti citoplasmatici delle loro cellule originarie. L'accessibilità della fosfatidilserina facilita il legame dei principali fattori della coagulazione, amplificando significativamente l'efficienza catalitica degli enzimi della coagulazione, mentre il rilascio di microvescicole agisce come mediatore fondamentale della segnalazione intercellulare. Le piastrine procoagulanti svolgono un ruolo cruciale nella stabilizzazione del coagulo durante l'emostasi e la loro maggiore proporzione nel flusso sanguigno è correlata a un aumento del rischio di trombosi. È stato anche dimostrato che le microvescicole piastriniche sono ricche di fattori di crescita che favoriscono la guarigione delle ferite e la modulazione infiammatoria. L'analisi dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole mediante citometria a flusso pone sfide significative a causa delle loro dimensioni ridotte e del numero limitato di eventi positivi per i marcatori di interesse. Nonostante i notevoli progressi compiuti nell'ultimo decennio, i metodi per valutare l'esposizione alla fosfatidilserina e il rilascio di microvescicole rimangono in fase di sviluppo. Purtroppo, non esiste un unico protocollo universalmente applicabile e diversi fattori devono essere valutati per determinare la metodologia più appropriata per ogni specifica applicazione. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare le piastrine lavate dal sangue umano, seguito dall'attivazione del collagene e/o della trombina, per misurare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole che caratterizzano le piastrine procoagulanti. Questo protocollo è progettato per facilitare la preparazione iniziale del plasma ricco di piastrine e l'isolamento delle piastrine lavate. Infine, l'esposizione alla fosfatidilserina e il rilascio di microvescicole sono quantificati mediante citometria a flusso, consentendo l'identificazione delle piastrine procoagulanti.

Introduzione

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La formazione di procoagulanti piastrinici è fondamentale per mantenere l'emostasi 1,2,3. Questo processo coinvolge l'espressione indotta dall'agonista dei fosfolipidi sulla membrana piastrinica, che è essenziale per l'assemblaggio dei complessi tenasi e protrombinasi 1,3,4. Dopo l'attivazione piastrinica, anche le microvescicole piastriniche vengono rilasciate continuamente 5,6. Le microvescicole (da 50 nm a oltre 1 μm di diametro) incapsulano sia la struttura della membrana che i costituenti citoplasmatici delle cellule originarie 7,8. Le microvescicole sono importanti mediatori della segnalazione intercellulare 9,10 e anche depositari di fattori di crescita che promuovono la guarigione delle ferite e la modulazione infiammatoria11,12. È stato anche suggerito che le microvescicole siano da 50 a 100 volte più procoagulanti delle piastrine attivate13. In particolare, prove recenti suggeriscono che le piastrine immagazzinate si attivano, portando alla produzione di microvescicole: questo ha potenziali ramificazioni per la pratica della terapia trasfusionale piastrinica. La maggiore durata di conservazione delle microvescicole e l'elevata attività procoagulante le rendono un promettente sostituto delle piastrine nelle applicazioni trasfusionali14.

Sono state apportate innovazioni metodologiche per valutare, direttamente e indirettamente, la formazione di procoagulanti piastrinici sia in condizioni di salute che di malattia 4,14,15. Le valutazioni dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole utilizzando piastrine purificate hanno fornito nuovi dati su come le risposte procoagulanti piastriniche sono perturbate in diverse malattie umane 1,4. Questo campo di ricerca in crescita apre anche strade per interventi terapeutici 1,4. Tuttavia, l'isolamento e l'analisi delle piastrine purificate dal sangue richiedono molto tempo, richiedono attrezzature di laboratorio specializzate e, quindi, non sono attualmente adattabili per la diagnostica clinica di routine16,17. Anche l'analisi dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole è impegnativa a causa delle loro piccole dimensioni e del numero di eventi positivi per i marcatori di interesse18,19.

La citometria a flusso, che sfrutta il legame fluorescente dell'annessina-V, è stata una pietra miliare nella valutazione dell'espressione di PS su piastrine e microvescicole sin dal suo inizio due decenni fa20. Ha ottenuto un'ampia accettazione nell'esame delle piastrine e delle microvescicole procoagulanti21,22. Pertanto, viene presentato qui un protocollo ottimizzato che può essere utilizzato per l'isolamento di piastrine purificate da campioni di sangue utilizzando la tecnica sviluppata dal gruppo23 di Cazenave, e la successiva caratterizzazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole mediante citometria a flusso dopo l'attivazione piastrinica24. Questo protocollo faciliterà ulteriori studi e una caratterizzazione approfondita delle piastrine procoagulanti nelle popolazioni cliniche di interesse.

Protocollo

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Il protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Ospedale Universitario di Bordeaux. I campioni di sangue sono stati ottenuti da volontari sani che hanno fornito il consenso informato e questi campioni sono stati elaborati secondo i protocolli istituzionali. I donatori che avevano assunto sostanze che potevano influire sulla funzione piastrinica erano esclusi se tali sostanze erano state assunte nei 10 giorni precedenti gli esperimenti. Il consenso informato è stato ottenuto da volontari sani per raccogliere il loro sangue e pubblicare i loro dati. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta del sangue e preparazione delle piastrine lavate

  1. Raccogliere il sangue venoso periferico in provette di raccolta contenenti l'anticoagulante attivo citrato trisodico con acido citrico e destrosio (ACD) dopo aver eliminato i primi 3 ml.
  2. Dopo la raccolta, capovolgere delicatamente la provetta per mescolare il sangue con l'ACD e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti prima della centrifugazione.
  3. Contare le piastrine utilizzando un contatore di cellule automatizzato prima della centrifugazione per determinare la velocità corretta per la centrifugazione (Tabella 1). Preparare il plasma ricco di piastrine (PRP) mediante centrifugazione a 250 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) senza applicare il freno per ottimizzare il recupero piastrinico.
    NOTA: Questa fase produrrà tre strati nel campione: lo strato superiore contenente plasma, piastrine e una piccola frazione di globuli bianchi; uno strato intermedio arricchito con globuli bianchi; e uno strato inferiore costituito da globuli rossi. Trasferire con cura il PRP dallo strato superiore in una nuova provetta conica da 50 mL per evitare la contaminazione con globuli rossi e bianchi.
  4. Al PRP, aggiungere 1 mL di ACD-A (vedere Tabella 2) e 6,25 μL di apirasi per 9 mL.
    NOTA: L'apirasi, ad una concentrazione di 0,02 U/mL, degrada le tracce di ATP o ADP secrete dalle piastrine, prevenendo così la desensibilizzazione dei recettori ADP piastrinici e mantenendo la forma piastrinica25. Un inibitore della prostaciclina PGI2 (0,5 μM) può anche essere incluso con l'apirasi per prevenire l'attivazione piastrinica.
  5. Preparare il pellet piastrinico mediante centrifugazione a RT a 1100 x g per 10 min. Aspirare il surnatante contenente plasma povero di piastrine (PPP) utilizzando un metodo delicato, come una pipetta Pasteur, e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lavaggio (vedere Tabella 3 e Tabella 4). Omogeneizzare delicatamente con una pipetta, quindi aggiungere altri 3-4 ml di tampone di lavaggio.
    NOTA: Il livello di calcio viene ridotto per prevenire la coagulazione con i fattori della coagulazione presenti nel plasma. In questa fase, il plasma povero di piastrine è stato completamente rimosso, impedendo la formazione di coaguli e l'attivazione piastrinica da parte della produzione di trombina.
  6. Centrifugare nuovamente a RT a 1100 x g per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lavaggio. Trasferire 150 μl della sospensione piastrinica in una provetta da 1,5 mL per il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Quindi, risospendere il pellet con 3-4 mL di tampone di lavaggio.
  7. Eseguire una centrifugazione finale a 1100 x g per 10 minuti (a RT). Aspirare il surnatante e risospendere il pellet piastrinico in un volume di tampone di reazione (vedere Tabella 5 e Tabella 6) per ottenere una concentrazione finale di 5 x 1011 piastrine/L.
  8. Lasciare riposare le piastrine lavate per almeno 30 minuti prima degli esperimenti per consentire agli inibitori residui di svanire e alle piastrine di acclimatarsi al tampone.

2. Preparazione del saggio

  1. Preparare tutti gli agonisti e i fluorocromi nel tampone di reazione. Aggiungere 5 μL di trombina a 45 μL di tampone (diluizione 1:10) e 5 μL di ionoforo a 495 μL di tampone (diluizione 1:500).
    1. Per i test interni, confrontare le piastrine non attivate con quelle trattate con agonisti singoli e doppi. Aggiungere, in aliquote diverse, 100 μl di piastrine lavate a 50 x 109 piastrine/L a: (i) 10 μl di tampone di reazione, (ii) 3 μl di collagene non diluito (concentrazione finale di 30 μg/mL), (iii) 10 μl di trombina prediluita (0,5 UI/mL), (iv) 3 μl di collagene non diluito + 10 μl di trombina prediluita e (v) 10 μl di ionoforo prediluito (concentrazione finale di 2 μM), che è noto per aumentare direttamente i livelli intracellulari di calcio come notato in precedenza26.
      NOTA: Il trattamento con uno ionoforo di calcio, come A23187 o ionomicina, è fondamentale in quanto induce un esteso scrambling della membrana fosfolipidica e una maggiore esternalizzazione del PS.
    2. Agitare delicatamente ogni aliquota a mano e incubare a 37 °C per 5 minuti.
      NOTA: Un'incubazione più lunga dell'agonista (30 minuti) può consentire una migliore differenziazione tra le popolazioni piastriniche durante il processo di analisi della citometria a flusso.
  2. Aggiungere 5 μl di Annexin-V FITC non diluita a ciascuna microprovetta e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio.
    NOTA: Un anticorpo monoclonale contro uno dei recettori piastrinici specifici, GPIX (CD42b) o integrina αIIb (CD41, GPIIb), potrebbe anche essere incluso per identificare meglio le cellule piastriniche.
  3. Aggiungere 500 μL di tampone di reazione per arrestare il processo e procedere con l'analisi del campione utilizzando un citometro a flusso.

3. Caratterizzazione di piastrine e microvescicole procoagulanti mediante Citometria a Flusso (FC)

NOTA: Per un'analisi affidabile della funzione piastrinica, utilizzare uno strumento di citometria a flusso (FC) configurato secondo gli standard stabiliti27. Lo strumento deve essere in grado di rilevare la diffusione diretta (FSC) e almeno un segnale di fluorescenza. Impostare i rilevatori di dispersione della luce e di fluorescenza su guadagno logaritmico. Diluire i campioni in modo adeguato per FC per garantire che vengano contate solo le singole piastrine a una velocità di acquisizione dati ridotta.

  1. Impostare il citometro a flusso su una velocità di flusso "lenta" con una soglia di almeno 10.000 eventi piastrinici. Monitorare l'emissione di fluorescenza utilizzando un filtro passante per FITC.
  2. Gate della popolazione piastrinica utilizzando la diffusione diretta (FSC). Esaminare le piastrine e le microvescicole rilasciate in base alle loro dimensioni. Utilizzare i grafici di densità per identificare le piastrine e le microvescicole rilasciate sia per le piastrine a riposo che per quelle stimolate; Analizza ogni popolazione recintata in modo indipendente.
  3. Distinguere le piastrine procoagulanti in base all'asse FL1. Posizionare il cut-off negativo all'estrema destra della popolazione piastrinica nello stato di riposo (cioè in presenza di tampone di reazione). Dopo l'attivazione piastrinica, classificare tutti gli eventi localizzati a destra di questo cut-off come piastrine che espongono fosfatidilserina.
  4. Differenzia le microvescicole, essendo più piccole delle piastrine, in base alle loro caratteristiche uniche di diffusione della luce. Impostare il cut-off al valore FSC più basso osservato nella popolazione piastrinica a riposo. Dopo l'attivazione, classificare come microvescicole tutti gli eventi positivi alla fosfatidilserina che scendono al di sotto di questa soglia.
    NOTA: Tenere conto della variazione individuale delle dimensioni delle piastrine regolando il cut-off se necessario. Assicurarsi che meno dell'1% delle microvescicole sia presente nello stato di riposo.

Risultati

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La quantificazione delle piastrine e delle microvescicole procoagulanti si ottiene utilizzando la colorazione con annessina-V, con almeno 50.000 eventi registrati per campione. Come indicato nella fase 2.2, le misurazioni piastriniche al basale sono state effettuate da campioni incubati con tampone di reazione, come illustrato nella Figura 1A. Le dimensioni delle piastrine sono state misurate utilizzando il valore mediano di diffusione diretta (FSC). Sebbene l'FSC sia influenzato da vari fattori, rimane un proxy comune per la stima delle dimensioni delle cellule, inclusa quella delle piastrine. I grafici di densità dell'area (Figura 1A) sono stati utilizzati per identificare e bloccare le piastrine a riposo e le microvescicole rilasciate.

Nel caso delle piastrine non attivate, meno del 2,9% presentava fosfatidilserina (PS) come determinato dalla colorazione con Annexina-V. Dopo l'attivazione delle piastrine lavate con collagene da solo o in combinazione con trombina o ionoforo di calcio, c'è stato un aumento osservabile dell'esposizione al PS. Il collagene da solo ha provocato un aumento del 26,7% delle piastrine PS-positive. La trombina ha avuto effetti minimi sull'esposizione al PS (9,1%), ma quando associata al collagene, ha aumentato la percentuale di piastrine che espongono il PS al 36,2%. A titolo di riferimento, il trattamento con ionoforo da 2 μM ha portato il 49,6% delle piastrine a diventare procoagulanti.

La Figura 1 illustra che la proporzione basale di microvescicole da piastrine lavate in un individuo sano era minima (0,3%). Mentre la trombina e il collagene hanno aumentato minimamente la formazione di microvescicole, è stato solo con la combinazione di collagene e trombina che la formazione di microvescicole è aumentata significativamente (Figura 1D; 11,4%). L'aggiunta di 2 μM di ionoforo ha portato al 44,0% delle microvescicole formate dalle piastrine di controllo esposte al PS.

La Figura 2 fornisce informazioni relative alla variazione, alla ripetibilità e alla riproducibilità che ci si può aspettare da questo processo.

figure-results-1
Figura 1: Esposizione al PS e formazione di microvescicole nelle piastrine di controllo a riposo e attivate. Le piastrine erano attivate o inattivate (a riposo) (A), con 30 μg/mL di collagene (B), con 0,5 U/mL di trombina (C), con combinazioni di collagene e trombina (D) con ionoforo da 2 μM. I dot plot rappresentativi mostrano la dimensione delle piastrine (diffusione diretta (log FSC)) rispetto al legame dell'annessina-V. Le linee orizzontali e verticali (E) delineano la popolazione piastrinica-negativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Ripetibilità e riproducibilità dell'esposizione al PS e della formazione di microvescicole dopo l'incubazione con ionoforo. Analisi dell'esposizione al PS e della formazione di microvescicole dopo incubazione con ionoforo da 2 μM o 5 μM in piastrine lavate, trattate o non trattate con citrato (un chelante del calcio): (A) da 4 diversi controlli sani; (B) da un controllo sano ripetuto 5 volte; e (C) da due controlli sani preparati da due tecnici diversi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Conta piastrinica nel sangue intero (10,9 per ml)Forze centrifughe relative (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tabella 1: Forze centrifughe relative per la preparazione di plasma ricco di piastrine in relazione alla conta piastrinica nel sangue intero.

ReagenteImporto
Acido citrico monoidrato (C6H8O7. H2Ø, 38 mM)8 g
Citrato trisodico diidrato (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)180 g
Glucosio (C6H12O6, 136 mM)24,6 g
Il pH della soluzione non deve essere regolato. Mantenere la soluzione a 4 °C.

Tabella 2: Preparazione di una soluzione acquosa da 1 L di acido-citrato-destrosio (ACD).

ReagenteImporto
Acido citrico monoidrato (C6H8O7. H2O, 36 mM)7,56 g
NaCl (103 mM)6 g
NaOH4 g
MgCl2,6 H2O (1 mM)0,203 g
Regolare il pH a 6,5. Mantenere la soluzione a 4 °C.

Tabella 3: Preparazione della soluzione madre del tampone di lavaggio.

ReagenteImporto
30% di albumina sierica bovina (BSA)583 μl
CaCl2, 0,25 m400 μl
Glucosio40 mg
Apirasi31,5 μl

Tabella 4: Preparazione di una soluzione estemporanea da 50 mL di tampone di lavaggio dalla soluzione madre.

ReagenteImporto
NaCl (137 mM)8 g
KCl (2,7 mM)0,2 g
MgCl2,6 H2O (1 mM)0,203 g
HEPES (5 mM)1,19 g
NaHCO3 (12 mM)1 g
NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM0,05 g
Regolare il pH a 7,4. Mantenere la soluzione a 4 °C.

Tabella 5: Preparazione di una soluzione madre di tampone di reazione.

ReagenteImporto
30% di albumina sierica bovina (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μl
Glucosio50 mg

Tabella 6: Preparazione di una soluzione estemporanea da 50 mL di tampone di reazione dalla soluzione madre.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recenti studi sulle piastrine procoagulanti hanno evidenziato i loro cambiamenti durante diverse malattie 1,28,29, sottolineando l'importanza della loro analisi e caratterizzazione dettagliata 30,31,32. Sebbene gli attuali test clinici per valutare la formazione di procoagulanti piastrinici siano limitati, negli ultimi due decenni c'è stato un aumento significativo dell'interesse clinico. Ad esempio, la scramblase calcio-dipendente TMEM16F (ANO6) è coinvolta nell'esposizione alla fosfatidilserina (PS)procoagulante 33. Varianti di TMEM16F sono associate alla sindrome di Scott 33,34,35, una rara malattia emorragica caratterizzata da alterato scrambling dei fosfolipidi e ridotta generazione di trombina nelle piastrine attivate36. Inoltre, livelli elevati di piastrine procoagulanti sono collegati a ictus trombotici e malattia coronarica, suscitando interesse per le terapie per frenare l'attività procoagulante piastrinica37. Tra i metodi attualmente disponibili per valutare la formazione di piastrine procoagulanti, la valutazione dell'esposizione al PS mediante il legame dell'annessina-V e il rilascio di microvescicole è uno dei più comunemente utilizzati38,39.

Il protocollo qui descritto consente l'isolamento di piastrine purificate dall'uomo e la caratterizzazione di piastrine procoagulanti misurando l'esposizione al PS e il rilascio di microvescicole mediante citometria a flusso. È fondamentale consigliare ai volontari sani di astenersi da farmaci che possono influire sulla funzione piastrinica per almeno 10 giorni prima del prelievo di sangue. La raccolta del sangue richiede attenzione per evitare traumi venosi o un flusso eccessivamente lento, poiché questi possono indurre la generazione di trombina e l'attivazione piastrinica. Il sangue anticoagulato con citrato di sodio non è raccomandato per la preparazione di piastrine lavate, poiché il calcio residuo può consentire la generazione di trombina e l'attivazione piastrinica durante la centrifugazione17. Il sangue anticoagulato con ACD ha un pH di 6,5 e una concentrazione di citrato più elevata di 22 mmol/L rispetto al pH del sangue anticoagulato con citrato di 7,5 e una concentrazione di citrato di 13 mmol/L17. Il pH acido e la ridotta concentrazione di calcio extracellulare nel sangue anticoagulato con ACD prevengono l'aggregazione piastrinica24. Ridurre al minimo la generazione di trombina durante il processo di raccolta è essenziale. Si consiglia una venipuntura non traumatica con un ago da almeno 21 G per prevenire la stasi venosa o una pressione eccessiva. Inoltre, i primi millilitri di sangue devono essere scartati per evitare la contaminazione con fattori tissutali e tracce di trombina17. È inoltre essenziale ridurre al minimo il tempo tra la venipuntura e l'elaborazione del campione, poiché la conservazione prolungata del sangue può portare all'attivazione piastrinica, aumentando così l'esposizione al PS e il rilascio di microvescicole40. Durante l'intera procedura di preparazione delle piastrine è necessario prestare particolare attenzione per prevenire la preattivazione spontanea delle piastrine, che può verificarsi durante il processo di preparazione stesso41,17. Inoltre, l'isolamento delle piastrine purificate richiede un'attenta prevenzione della contaminazione da parte di altre cellule del sangue17. Ciò comporta l'aspirazione accurata del surnatante dopo la centrifugazione delle piastrine per garantire una preparazione pulita. Poiché il pellet è tipicamente visibile e aderisce saldamente alla parete del tubo, il surnatante può essere facilmente aspirato utilizzando un puntale per pipette.

Durante le fasi di lavaggio della centrifugazione, le piastrine vengono risospese in un tampone che simula le condizioni fisiologiche. L'uso di piastrine lavate in un tampone fisiologico le isola dagli anticoagulanti e dal plasma, prevenendo così gli artefatti mediati dalla trombina. Sebbene il plasma ricco di piastrine (PRP) sia un metodo rapido per ottenere alte concentrazioni piastriniche, il suo uso per gli studi funzionali è limitato dalle variazioni di pH indotte dagli anticoagulanti e dal contenuto extracellulare di calcio e proteine del plasma, che possono influenzare l'attivazione piastrinica17. Inoltre, alti livelli di PS generati durante l'attivazione piastrinica sarebbero sufficienti a promuovere l'assemblaggio dei complessi di coagulazione plasmatica, il successivo scoppio della trombina e la formazione di coaguli nel PRP, rendendo i risultati sperimentali non interpretabili. Al contrario, la risospensione in un tampone contenente apirasi è raccomandata per mantenere la funzionalità piastrinica prevenendo la desensibilizzazione dei recettori purinergici attraverso la degradazione di ATP e ADP42,43. Sebbene le fasi ripetute di centrifugazione e lavaggio richiedano più tempo, le sospensioni di piastrine lavate preparate con questo metodo offrono il vantaggio di una maggiore stabilità (5-8 ore) rispetto alle preparazioni di PRP citato, che sono stabili per non più di 1-3 ore23.

Questo studio dimostra la fattibilità e la semplicità della quantificazione delle microvescicole mediante citometria a flusso. Tuttavia, la produzione di microvescicole può perdersi nei detriti e nel rumore della macchina. Pertanto, è fondamentale assicurarsi che il citometro a flusso sia stato sottoposto a una pulizia approfondita e che i tamponi utilizzati non contengano particelle contaminanti che potrebbero portare a un elevato fondo durante l'analisi della citometria a flusso. In alternativa, è possibile utilizzare citometri a flusso specializzati con capacità di rilevamento di piccole particelle per identificare la formazione di microvescicole. È stato studiato anche il legame dell'annessina-V marcata con fluoresceina in funzione del contenuto di PS di membrana, evidenziando il ruolo critico di sufficienti concentrazioni di calcio nel tampone per il legame dell'annessina-V e la risposta piastrinica procoagulante44.

I dati a sostegno della stabilità dei campioni piastrinici nel tempo sono attualmente scarsi. Diversi laboratori hanno affrontato questo problema stabilizzando i campioni attraverso l'aggiunta di una soluzione fissativa, come un tampone contenente formaldeide. L'aggiunta di un fissativo ai campioni di piastrine appena raccolti ha il vantaggio di conservare i campioni per analisi successive. Tuttavia, la fissazione della formaldeide può causare un aumento artificiale del legame con l'annessina-V. Rochat et al. hanno dimostrato che la fissazione piastrinica con una soluzione di formaldeide priva di calcio a bassa concentrazione non altera la proporzione di piastrine positive all'annessina-V45. Tuttavia, i ricercatori che richiedono la fissazione dovrebbero ottimizzare il loro protocollo specifico per garantire che non causi risultati alterati artificialmente. In caso contrario, i campioni devono essere elaborati immediatamente.

Un'altra via che può anche portare all'esposizione al PS coinvolge l'apoptosi intrinseca, un processo noto per regolare la durata della vita piastrinica in circolazione46. L'attivazione delle proteine pro-apoptotiche BAK e BAX provoca l'attivazione della caspasi, che promuove l'esternalizzazione del PS, portando alla clearance in vivo delle piastrine. Recentemente, è stato suggerito di utilizzare un altro marcatore di superficie piastrinica, P-selectina/CD62P, oltre all'annessina-V, per distinguere i procoagulanti dalle piastrine apoptotiche47. Ci si aspetta che le piastrine procoagulanti siano positive sia per i marcatori PS che per P-selectina, mentre le piastrine apoptotiche sono positive per l'annessina-V ma negative per la P-selectina. Tuttavia, il tempo è anche un fattore di differenziazione tra piastrine procoagulanti e apoptotiche47. La generazione di piastrine procoagulanti in vitro è un processo rapido, mentre l'apoptosi intrinseca è un processo più lento, che richiedeore 48. In questo contesto, l'uso di marcatori aggiuntivi per valutare le piastrine procoagulanti non è necessario, semplificando il metodo. Aumenti sostenuti della formazione intracellulare di Ca2+ e di piastrine procoagulanti si verificano entro pochi minuti con agonisti molto forti, come lo ionoforo o l'attivazione combinata con collagene e trombina, mentre un inibitore di BCL-XL (o BH3 mimetico) innesca la formazione di piastrine apoptotiche attivando BAK e BAX pro-apoptotici, causando permeabililizzazione della membrana esterna mitocondriale, rilascio di citocromo C, e attivazione della caspasi49.

In conclusione, il protocollo qui descritto facilita l'isolamento delle piastrine purificate e la loro successiva caratterizzazione per l'attività procoagulante utilizzando apparecchiature di laboratorio standard e citometria a flusso. Questa procedura apre la strada a future ricerche sulle piastrine procoagulanti nei campioni di sangue dei pazienti, con potenziali applicazioni nella pratica clinica, come la diagnosi della rara sindrome di Scott50.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A Provette per prelievo di sangueBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apirasi di grado VIISigma-AldrichA6410
Albumina sierica bovina 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Acido citrico monoidratoMerck5949-29-1
Collagene Stago86924
GlucosioSigma-AldrichG8270
Hepes Ionoforo Sigma-AldrichH3375
nbsp;Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Carbonato acido di sodioMerck6329NaHCO3
Trombina Trattino BiomedEZ 006 A
Citrato trisodico diidrato Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α Integrina IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115
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