Articolo metodologico

Studi sull'effetto antinfiammatorio delle pillole Xiaoyao nel trattamento dell'osteoporosi postmenopausale nei topi

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DOI:

10.3791/67051

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23 agosto 2024

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

In questo articolo

Sommario

L'osteoporosi postmenopausale è diventata un problema di salute pubblica globale. Lo scopo di questo studio è quello di esplorare gli effetti terapeutici e i meccanismi correlati della medicina tradizionale cinese Xiaoyao pillole su questa condizione.

Abstract

L'osteoporosi è una malattia metabolica comune delle donne anziane e in postmenopausa, senza sintomi evidenti durante le sue fasi iniziali. Nelle ultime fasi di questa condizione, i pazienti sono soggetti a fratture e questo può compromettere seriamente la loro salute e la qualità della vita. L'aumento dell'aspettativa di vita in tutto il mondo ha reso l'osteoporosi una preoccupazione globale. Le pillole Xiaoyao erano precedentemente
Utilizzato nel trattamento della depressione. Inoltre, il farmaco sembrava avere un'attività estrogeno-simile, che influenzava l'espressione di ALP, un marcatore specifico precoce per gli osteoblasti, e COL-1, un componente importante della matrice extracellulare ossea. Le pillole Xiaoyao sono state valutate per i loro effetti sull'osteoporosi postmenopausale (PMOM) nei topi. Le informazioni sul bersaglio di ciascun componente erboristico delle pillole Xiaoyao sono state accessibili attraverso il database Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP). Le informazioni provenienti da GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank e altri siti Web sono state utilizzate per costruire la rete regolatoria del complesso erboristico attraverso la rete Cytoscape e String per valutare le interazioni proteiche. I topi sono stati ovariectomizzati e trattati con dosi alte e basse di pillole Xiaoyao e queste sono state confrontate con i controlli. I loro sintomi sono stati valutati mediante immunocitochimica dei tessuti ossei. I risultati hanno suggerito che le pillole Xiaoyao avevano la capacità di alleviare i sintomi della PMOM nei topi ovariectomizzati attraverso la via di segnalazione IL-17. Questo farmaco ha il potenziale per diventare un nuovo agente terapeutico per il trattamento dell'osteoporosi.

Introduzione

L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) definisce l'osteoporosi (OP) come una malattia caratterizzata da una diminuzione della massa ossea e dal deterioramento della microarchitettura del tessuto osseo, che porta ad un aumento della fragilità ossea e, quindi, ad un aumento del rischio di frattura1. Il significato clinico dell'osteoporosi è che può portare a fratture, che sono associate a un'elevata mortalità, morbilità e costi economici2. L'osteoporosi postmenopausale (PMOP) è causata da una diminuzione dei livelli di estrogeni nelle donne dopo la menopausa, che porta ad un aumento dell'attività degli osteoclasti, con conseguente perdita ossea e distruzione della microstruttura ossea. Questo spesso causa l'osteoporosi con un grave impatto sulla salute3. Le attuali terapie per la PMOP includono la terapia sostitutiva con estrogeni, i bifosfonati e l'ormone paratiroideo, ma possono avere vari gradi di effetti avversi, una compliance insufficiente a lungo termine e costi elevati4. Pertanto, la fitoterapia a prezzi accessibili è una valida alternativa per gran parte della popolazione.

Le pillole di Xiaoyao sono incluse nella Farmacopeacinese 5 e contengono otto componenti erboristici, tra cui Chai Hu, Angelica sinensis, Paeonia lactiflora bianca, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, liquirizia e zenzero fresco. Tutte queste erbe sono note per essere efficaci nella disintossicazione del fegato e nel rafforzamento della milza, nel nutrimento del sangue e nella regolazione del ciclo mestruale, e la miscela è stata utilizzata anche per il trattamento della depressione6. Tuttavia, il ruolo delle pillole Xiaoyao nell'osteoporosi non è chiaro.

I primi studi hanno suggerito che l'infiammazione può portare alla perdita ossea7 e che il declino della densità ossea associato a questo processo può essere accelerato dalla menopausa. Inoltre, esiste una forte relazione tra lo sviluppo dell'osteoporosi e l'infiammazione. Il fattore infiammatorio, l'interleuchina-17 (IL-17), è un fattore pro-infiammatorio secreto dalle cellule Th17, un sottogruppo di linfociti T CD4+. Queste cellule sono associate a diverse condizioni infiammatorie croniche e svolgono un ruolo importante nello sviluppo della distruzione ossea nell'artrite reumatoide8. Inoltre, l'IL-17 stimola l'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κ B (RANKL), che regola l'osteoclastogenesi, portando a un maggiore riassorbimento osseo rispetto alla formazione ossea9. L'IL-17 stimola l'espressione di altre citochine osteoclastogeniche come TNFα, IL-1, IL-6 e IL-8. Ha la capacità di sinergizzare con altri fattori infiammatori, rendendolo un importante effettore infiammatorio10.

Gli studi hanno anche dimostrato un legame tra le pillole Xiaoyao e l'infiammazione. Shi et al.11 e Fang et al.12 hanno recentemente confermato che le pillole Xiaoyao possono ridurre i livelli di IL-6 e TNF-α, rispettivamente. In un altro studio sulla steatoepatite associata al metabolismo, è stato riportato che le pillole di Xiaoyao potrebbero sovraregolare l'espressione dell'acido propionico, che a sua volta inibisce l'espressione del TNF-α ed esercita un effetto antinfiammatorio13. Tuttavia, al momento, non è noto se le pillole Xiaoyao possano regolare lo sviluppo della PMOM mediando una risposta infiammatoria attraverso IL-17, che era lo scopo di questo studio.

Questo studio ha previsto l'intersezione dei bersagli delle pillole Xiaoyao e dei geni correlati all'osteoporosi attraverso la farmacologia di rete e l'analisi bioinformatica e ha analizzato i geni intersecanti per le interazioni proteiche, GO e KEGG. Sulla base dei risultati attesi, l'espressione di Act1 e IL-6, che sono proteine chiave nella via di segnalazione di IL-17, può essere osservata14,15, così come i marcatori di turnover osseo fosfatasi alcalina (ALP) e collagene di tipo I (COL-1), per osservare l'efficacia terapeutica delle pillole Xiaoyao nel modello murino PMOM.

Protocollo

Il Comitato Etico per gli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina di Youjiang per le Nazionalità ha approvato il protocollo di studio (numero di approvazione: 2022101502). I topi femmina C57BL/6, di età compresa tra 10 e 12 settimane, classe SPF e peso corporeo (22 ± 2) g, sono stati ospitati nel Centro di sperimentazione animale di classe SPF dell'Università medica di Youjiang per le nazionalità. Gli animali da esperimento sono stati mantenuti a una temperatura di 24-26 °C e un'umidità relativa compresa tra il 55% e il 60%.

1. Database di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese e piattaforma di analisi

NOTA: Il database e la piattaforma di analisi farmacologica dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) sono piattaforme di farmacologia della medicina cinese che contengono informazioni sugli ingredienti della MTC, sulle proprietà correlate all'ADME, sui bersagli e sulle malattie16,17.

  1. Accedi all'interfaccia web del TCMSP. Cerca il nome di Herb, inserisci il nome della medicina cinese e fai clic su Cerca. Fare clic su Nome latino nei risultati della ricerca. Eseguire lo screening sui risultati degli ingredienti con i parametri OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18.
  2. Copia tutti i risultati e salvali in formato TXT, chiamato Medicina Cinese Name_ingredients.txt.
  3. In Informazioni sulle destinazioni nella scheda Destinazioni correlate, filtrare per l'ID Mol (ad esempio, il risultato del passaggio 1.2).
  4. Copia i risultati filtrati e salvali in formato TXT denominato Chinese Medicine Name_targets.txt.
    NOTA: Attraverso i passaggi precedenti, sono stati ottenuti tutti i principi attivi idonei e le corrispondenti informazioni target della medicina tradizionale cinese (MTC).
  5. Posiziona tutti i file ingredients.txt di cui sopra e i file targets.txt nella stessa cartella e posiziona gli script Perl (Supplementary Coding File 1) in quella cartella.
  6. Apri CMD, digita il percorso della cartella cd, inseriscilo ed esegui lo script Perl. Ottenere un nuovo file di testo (allTargets.txt). Questo nuovo file di testo (allTargets.txt) contiene il nome dell'erbe, il nome dell'ingrediente, l'ID dell'ingrediente e il bersaglio.

2. Banca dati UniProt

NOTA: Il database UniProt (https://www.uniprot.org/) contiene sequenze proteiche umane annotate con informazioni funzionali e viene utilizzato per normalizzare i nomi dei bersagli con i loro nomi ufficiali18.

  1. Vai all'interfaccia web di UniProt. Fare clic sulla scheda Cerca , selezionare UniProtKB e fare clic su Cerca.
  2. Filtra nella barra laterale sinistra, seleziona Recensito (Swiss-Prot) per Stato e Umano per Organismi popolari. Fare clic su Download, selezionare Scarica tutto, selezionare TSV per Formato e fare clic su Download per scaricare il file di annotazione.
  3. Decomprimi il file scaricato nella cartella corrente, apri il file decompresso e copialo e incollalo in un file di testo denominato ann.txt.

3. Conversione dell'ID del bersaglio del farmaco

  1. Metti tutti i file di bersaglio del farmaco allTargets.txt ottenuti nella sezione 1 e il file di annotazione UniProt ann.txt ottenuto nella sezione 2 in una cartella e inserisci gli script Perl (Supplementary Coding File 2) al suo interno.
  2. Apri CMD, digita cd + spazio + percorso cartella, inseriscilo ed esegui lo script Perl per ottenere un nuovo file di testo (allTargets.symbol.txt). Questo nuovo file di testo (allTargets.symbol.txt) contiene il nome dell'erbe, l'ID dell'ingrediente, il nome dell'ingrediente e l'ID del gene.

4. Ricerca nel database

  1. GeneCards: database di geni umani (GeneCards)
    NOTA: Il database GeneCards (https://www.genecards.org/) fornisce informazioni di previsione e annotazione per i geni umani. Viene utilizzato per accedere ai bersagli della malattia19,20.
    1. Vai all'interfaccia web di GeneCard. Digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
    2. Fare clic su Esporta e selezionare Esporta in Excel.
    3. Apri il file scaricato, copia i geni con il punteggio di pertinenza ≥ 1, incollali e salvali in un file chiamato GeneCards.txt.
  2. Banca dati OMIM
    NOTA: Il database OMIM (https://omim.org) contiene geni, malattie genetiche e tratti umani21.
    1. Vai all'interfaccia web di OMIM. Fai clic su GENE Map, digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
    2. Fare clic su Scarica con nome e selezionare File Excel.
    3. Apri il file scaricato, copia il nome del gene nella colonna Simbolo approvato, incollalo e salvalo in un file chiamato OMIM.txt.
  3. Banca dati PharmGkb
    NOTA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), la base di conoscenze di farmacogenomica, contiene annotazioni sull'etichetta dei farmaci, percorsi incentrati sui farmaci, riassunti farmacogenetici e relazioni tra geni, farmaci e malattie22.
    1. Vai all'interfaccia del sito web di PharmGkb. Inserisci osteoporosi nella casella di ricerca, fai clic su Cerca e seleziona Gene nella barra laterale sinistra.
    2. Inserisci manualmente tutti i risultati e salvali in un file chiamato PharmGkb.txt.
  4. TTD: database dei bersagli terapeutici (TTD)
    NOTA: Il database TTD (https://idrblab.org/ttd/) fornisce informazioni sui bersagli di proteine e acidi nucleici, sulle malattie mirate, sulle informazioni sul percorso e sui farmaci corrispondenti per ciascun bersaglio23.
    1. Vai all'interfaccia web di TTD. Digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
    2. Fare clic su Informazioni di destinazione in ID di destinazione nel risultato, copiare il nome di destinazione, incollarlo e salvarlo in un file denominato TTD.txt. Sono stati ottenuti un totale di 33 risultati. Salva ogni risultato allo stesso modo.
  5. Banca dati DrugBank Online (DrugBank)
    NOTA: Il database DrugBank (https://go.drugbank.com) contiene informazioni sui farmaci e sui bersagli farmacologici, sulle interazioni farmacologiche, sui meccanismi farmacologici e sul metabolismo dei farmaci24.
    1. Vai all'interfaccia del sito web di DrugBank. Seleziona Indicazioni nella scheda di ricerca, digita osteoporosi nella casella di ricerca e fai clic su Cerca.
    2. Clicca sulla voce Osteoporosi nei risultati per maggiori informazioni, clicca sulla scheda FARMACI E BERSAGLI e clicca sul Link Appropriato nella colonna TARGET della tabella.
    3. Fare clic su Dettagli in Proteina, copiare il nome del gene, incollarlo e salvarlo in un file denominato DrugBank.txt. Salva ogni risultato allo stesso modo.

5. Diagramma di Venn

  1. Fusione genica associata alla malattia e mappatura di Venn
    1. Metti i file txt salvati e lo script nella stessa cartella.
    2. Apri il codice R (Merge Disease-Related Genes), copia e incolla il percorso in cui è memorizzato il file txt di cui sopra nella riga in cui si trova il setwd nel codice R.
    3. Apri il software R, esegui il codice R modificato e salva. Imposta il gene, assegna un nome al file Disease.txt.
    4. Apri il sito web di Draw Venn Diagram; nella sezione di input, copia e incolla il contenuto di testo salvato nelle sezioni da 4 a 8 uno per uno nell'elenco, denominandolo con il rispettivo database e facendo clic su Invia.
    5. Fai clic su Salva immagine come PNG sotto l'immagine e salva il risultato del testo nella stessa cartella.
  2. Intersezione di bersagli farmacologici e geni associati alla malattia
    1. Inserire il file allTargets.symbol.txt ottenuto nella sezione 3 e il file Disease.txt ottenuto nel passaggio 5.1.3 nella stessa cartella.
    2. Apri il codice R (l'intersezione tra il bersaglio del farmaco e il gene correlato alla malattia), copia e incolla il percorso in cui è memorizzato il file txt di cui sopra nella riga in cui si trova il setwd nel codice R.
    3. Apri il software R, esegui il codice R modificato e salva. Imposta il gene, assegna un nome al file Drug_Disease.txt.
    4. Apri il sito web Disegna diagramma di Venn. Nella sezione di input, copia e incolla allTargets.symbol.txt e Disease.txt nell'elenco e denominali con i nomi dei rispettivi file.
    5. Fai clic su Salva immagine come PNG sotto l'immagine e salva i risultati del testo nella stessa cartella.

6. Costruzione della rete regolatoria del TCM compounding

  1. Collocare il file allTargets.symbol.txt ottenuto nella sezione 3 nella stessa cartella del file Disease.txt e dello script Perl corrispondente (Supplementary Coding File 3).
  2. Apri CMD, digita il percorso del file cd, premi Invio ed esegui lo script Perl. Ottieni quattro nuovi file txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt e net.type.txt. Il file network.txt contiene l'ID dell'ingrediente TCM, il gene target, la relazione target e il nome dell'ingrediente. net.type.txt contiene il nome del nodo, gli attributi e l'affiliazione. net.geneLists.txt è l'elenco dei geni e net.molLists.txt è l'elenco degli ingredienti.
  3. Copia i file di testo appena ottenuti nella stessa nuova cartella.
  4. Apri il software Cytoscape 3.9.1, fai clic su File, fai clic su Importa e seleziona File modulo di rete. Selezionare net.network.txt, inserire la prima colonna di ID componente come nodo di origine, la seconda colonna di Geni come nodo di destinazione e la terza colonna di Relazione di targeting come tipo di interazione e fare clic su OK.
  5. Importare net.type.txt dalla finestra Tabella nodi. Fare clic sulla scheda Seleziona, selezionare Nodi, selezionare Da file elenco ID, selezionare net.geneLists.txt e fare clic su Apri.
  6. Fare clic sulla scheda Layout, selezionare Layout cerchio ordinato in gradi e selezionare Solo nodi selezionati. Regola sia l'altezza che la larghezza dei nodi su 70.
  7. Fare clic sulla seconda casella in Altezza, selezionare degree.layout in Colonna, selezionare Mappatura continua in Tipo di mappatura e fare doppio clic sulla finestra di regolazione dell'altezza sul lato destro della mappatura corrente per regolare i limiti superiore e inferiore dell'altezza in un intervallo appropriato.
  8. Ripetere l'operazione con l'opzione Larghezza.
  9. Fare nuovamente clic sulla scheda Layout , quindi su Strumenti di layout > Regola la scala in modo che i nodi non si sovrappongano.
  10. Fare clic sulla finestra in alto a destra del software per deselezionare la rete di nodi, fare clic sulla scheda Seleziona , selezionare Nodi, selezionare Da file elenco ID, selezionare net.molLists.txt e fare clic su Apri.
  11. Fare clic sulla scheda Layout, selezionare Layout attributi gruppo, selezionare Solo nodi selezionati e fare clic su Tipo.
  12. Fai clic su Dimensione carattere etichetta nella colonna di sinistra e imposta Valore predefinito su 12. Fare clic su Valore predefinito nell'immagine/grafico 1 nella colonna di sinistra.
  13. Seleziona Grafici nella finestra popup, fai clic su Grafico a torta e seleziona gli elementi nella colonna Colonne disponibili ad eccezione del grado. Layout nella colonna delle colonne selezionate e fare clic su Applica.
  14. Fare clic su Border Paint nella colonna di sinistra e impostare il valore predefinito su #003EF8. Fai clic sulla scheda Bordo nella parte inferiore della barra laterale sinistra e imposta Larghezza su 0,8.
  15. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, quindi seleziona Da rete a immagine.
  16. Nella finestra pop-up, selezionare Formato PNG per Formato, selezionare la directory di salvataggio e assegnare un nome alla rete di immagini, regolare lo zoom nella dimensione dell'immagine al massimo del 500%, selezionare Sfondo trasparente e fare clic su OK per completare il salvataggio dell'immagine.

7. Costrutti di reti di interazione proteina-proteina (PPI)

  1. Aprire il sito Web STRING (https://string-db.org/), fare clic su Proteine multiple, fare clic su Sfoglia in Carica un file, selezionare il file Drug_Disease.txt ottenuto nel passaggio 5.2.3 e selezionare Homo sapiens in Organismi. Fai clic su Cerca e fai clic su Continua.
  2. Fare clic su Impostazioni, impostare il punteggio minimo di interazione richiesto sull'attendibilità massima (0,900) e selezionare Nascondi nodi disconnessi nella rete nelle opzioni di visualizzazione della rete. Fare clic su Aggiorna.
  3. Apportare modifiche ai nodi nel diagramma di rete in modo che non vi siano sovrapposizioni o occlusioni.
  4. Fare clic su Esportazioni , quindi su Scarica come bitmap ad alta risoluzione per ottenere la mappa della rete di interworking delle proteine in formato PNG. Inoltre, scarica il file TSV come breve output di testo tabulare. Salva entrambi i file in una cartella unificata. Il file TSV contiene il nome del gene, l'ID interno STRING e i punteggi per diversi attributi.

8. Costruzione del nucleo di rete PPI

  1. Inserire il file TSV ottenuto nella sezione 7 e gli script Perl richiesti in una nuova cartella.
  2. Aprire il software Cytoscape 3.9.1, fare clic su File, selezionare Importa, fare clic su Rete da file, selezionare il file TSV sopra, inserire la prima colonna node1 come nodo di origine e la seconda colonna node2 come nodo di destinazione e fare clic su OK.
  3. Fai clic su Stile nella barra laterale sinistra, fai clic su Valore predefinito in Larghezza e impostalo su 60. Trascina e rilascia i nodi in modo che non ci siano sovrapposizioni e occlusioni nella rete.
  4. Fare clic su APP nella barra degli strumenti superiore, fare clic su CytoNCA e fare clic su Apri.
  5. Nella colonna di sinistra, selezionare Senza peso in Tramezzo, Vicinanza, Grado, Autovettore, Metodo basato sulla connettività media locale e Rete, quindi fare clic su Analizza.
  6. Al termine dell'analisi, fare clic su Tabella nodi nella finestra in basso a destra, fare clic su Esporta, salvarla nella cartella e denominarla con punteggio 1.
    NOTA: Il plugin CytoNCA deve essere installato nel software Cytoscape. A tale scopo, fare clic su App nella barra degli strumenti in alto, fare clic su APP Manager, immettere CytoNCA nella casella di ricerca, selezionare CytoNCA nella colonna centrale dei risultati restituiti e fare clic su Installa.
  7. Apri score1, regola la colonna del nome sulla prima colonna, copia le informazioni nella tabella, incollale in un nuovo file di testo, denominale score1.txt e salvale.
  8. Apri il codice R e copia e incolla il percorso in cui si trova il file score1.txt fino alla riga in cui si trova setwd nel codice R.
  9. Apri il software R ed esegui il codice modificato per ottenere due nuovi file, score2.txt e score2.gene.txt. Il file score2.txt contiene i geni per i quali tutti i punteggi dei programmi sono stati maggiori della mediana e i punteggi specifici per ciascun programma. score2.gene.txt contiene i geni che hanno ottenuto un punteggio maggiore della mediana per tutti gli elementi.
  10. Per continuare con Cytoscape, fare clic su AnalysisPanel 1 nella finestra in basso a destra, fare clic su Carica da file sul lato sinistro della finestra, selezionare la score2.gene.txt, fare clic su Apri e toccare OK nella finestra pop-up.
  11. Fare clic su Seleziona nodi in basso e fare clic su OK nella finestra pop-up.
  12. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, fai clic su Rete su immagine, regola lo zoom (%) in Dimensione immagine al massimo del 500%, seleziona Sfondo trasparente e salva il file nella stessa cartella, chiamalo rete1.
  13. Fai clic su Crea sottorete nella barra laterale destra della finestra inferiore per creare una sottorete, analizza la sottorete, fai clic su APP nella barra degli strumenti in alto, fai clic su CytoNCA e fai clic su Apri.
  14. Nella barra laterale sinistra, seleziona Senza peso in Tramezzo, Vicinanza, Grado, Autovettore, Metodo basato sulla connettività media locale e Rete, quindi fai clic su Analizza.
  15. Al termine dell'analisi, fare clic su Tabella nodi nella finestra in basso a destra, fare clic su Esporta e salvarla in una nuova cartella denominata score2.
  16. Apri score2, regola la colonna del nome sulla prima colonna, copia le informazioni nella tabella, incollale in un nuovo file di testo, denominale score2.txt e salvale.
  17. Apri il codice R e copia e incolla il percorso in cui si trova il file score2.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
  18. Apri il software R ed esegui il codice modificato per ottenere due nuovi file: score3.txt e score3.gene.txt. Il file score3.txt contiene i geni che hanno ottenuto un punteggio maggiore della mediana per tutti gli elementi e i punteggi specifici per ciascun elemento. score3.gene.txt contiene i geni che hanno ottenuto un punteggio maggiore della mediana per tutti gli elementi.
  19. Per continuare con Cytoscape, fare clic su AnalysisPanel 1 nella finestra in basso a destra, fare clic su Carica da file sul lato sinistro della finestra, selezionare il score3.gene.txt, fare clic su Apri e toccare OK nella finestra pop-up.
  20. Fare clic su Seleziona nodi in basso e fare clic su OK nella finestra pop-up.
  21. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, fai clic su Rete su immagine, regola Zoom (%) in Dimensione immagine su 500%, seleziona Sfondo trasparente e salva il file nella stessa cartella utilizzata in questo passaggio, denominandolo rete2.
  22. Fai clic su Crea sottorete nella barra laterale destra della finestra sottostante per creare una sottorete.
  23. Fai clic su File nella barra degli strumenti in alto, seleziona Esporta, fai clic su Da rete a immagine, regola lo zoom (%) in Dimensione immagine fino a un massimo del 500%, seleziona Sfondo trasparente e salva il file nella stessa cartella utilizzata in questo passaggio e chiamalo network3.

9. Conversione dell'ID genico

  1. Inserire il file Drug_Disease.txt nella stessa nuova cartella del file di codice richiesto.
  2. Apri il codice R (Supplementary Coding File 4) e copia e incolla il percorso in cui si trova il file Drug_Disease.txt alla riga in cui si trova setwd nel codice R.
  3. Apri il software R, esegui il codice modificato utilizzando l'org. Hs.eg.db pacchetto per convertire l'ID del gene ed eseguirlo dopo il completamento di un nuovo file id.txt. Il id.txt contiene il simbolo del gene e l'ID corrispondente.

10. Analisi dell'arricchimento GO

  1. Inserire il file id.txt del passaggio precedente nella stessa cartella del codice di analisi dell'arricchimento GO.
  2. Aprire il codice R (Supplementary Coding File 5) e impostare la directory di lavoro su id.txt e il percorso in cui è memorizzato il codice GO.
  3. Aprire il software R, eseguire il codice modificato e usare clusterProfiler, org. Hs.eg.db, arricchisci il grafico, il grafico ggplot2, gli istogrammi dell'analisi dell'arricchimento GO e i grafici a bolle. Al termine dell'esecuzione, ottenere tre nuovi file, GO.txt, barplot.pdf e bubble.pdf.
    NOTA: Il GO.txt è il file dei risultati dell'arricchimento contenente la classificazione dell'arricchimento (BP, CC, MF), GO ID, Go nome, proporzione del gene, proporzione di fondo, significato dell'arricchimento p-value, p-value corretto (p.adjust, valore), gene ID (nome) e numero di geni arricchiti su ciascun GO. barplot.pdf è l'istogramma, la bolla. Il PDF è un grafico a bolle.

11. Analisi dell'arricchimento KEGG

  1. Inserire il file id.txt nella stessa cartella del codice di analisi dell'arricchimento KEGG.
  2. Aprire il codice R (Supplementary Coding File 6) e impostare la directory di lavoro sul percorso in cui sono memorizzati id.txt e il codice KEGG.
  3. Aprire il software R, eseguire il codice modificato e usare clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, pacchetto ggplot2 per tracciare istogrammi di analisi dell'arricchimento GO, grafici a bolle e grafici di percorso. La corsa si completa con la produzione di tre nuovi file, KEGG.txt, barplot.pdf e bubble.pdf.
    NOTA: Il file KEGG.txt è un file dei risultati dell'arricchimento contenente l'ID del percorso, la descrizione del percorso, la proporzione genica, la proporzione di fondo, il valore p del significato dell'arricchimento, il valore p corretto (p.adjust, qvalue), l'ID del gene (nome) e il numero di geni arricchiti in ciascun percorso. barplot.pdf è un grafico a barre e bubble.pdf è un grafico a bolle.
  4. Cerca IL-17 nel file KEGG.txt; Il risultato mostra che esiste un solo percorso; copiare l'ID del percorso.
  5. Aprire il codice R, incollare l'ID del percorso IL-17 in KEGGID e usare il pacchetto pathview per etichettare la mappa del percorso. Eseguire il codice R modificato e ottenere due nuovi file, hsa04657.pathview.png e hsa04657.png.
    NOTA: Il file hsa04657.png è la mappa del percorso, hsa04657.pathview.png è la mappa del percorso etichettato e quelli etichettati in rosso sono i geni presenti nella rete di interazioni.

12. Preparazione delle pillole Xiaoyao

NOTA: Per il metodo di preparazione utilizzato, fare riferimento alla Farmacopea cinese5.

  1. Assumere 100 g di Chai Hu, 100 g di Angelica sinensis, 100 g di Paeonia lactiflora bianca, 100 g di Atractylodes macrocephala saltata in padella, 100 g di Poria cocos, 80 g di preparato Radix glycyrrhizae e 20 g di erba Menthae.
  2. Usando un mulino a pietra o una macchina per spolverare, schiacciare le erbe fino a ridurle in polvere fine; Diverse erbe vengono combinate nelle proporzioni di cui sopra e polverizzate in una polvere fine per mescolarsi naturalmente. Utilizzare un setaccio per farmaci da 80 maglie con un diametro interno di 180 μm ± 7,6 μm e setacciare la polvere polverizzata. Mescolare accuratamente.
  3. Prendete 100 g di zenzero, aggiungete l'acqua e fatelo bollire 2 volte per 20 minuti ogni volta. Filtrate e mettete da parte.
  4. Prendi una placca medicinale, immergi una piccola scopa nell'acqua di zenzero, spennellala sulla placca, prendi la polvere di cui sopra, cospargila sull'acqua di zenzero e gira la placca in modo che tutta la polvere sia bagnata e possa essere modellata a forma di palla.
    NOTA: La formazione della placca medicinale è un passaggio essenziale durante la preparazione delle pillole MTC. La maggior parte del bambù moso verrà diviso in strisce e intrecciato in uno scheletro. La pelle di bambù, o tengpi, viene intrecciata sulla superficie e diventa arrotondata. La superficie della placca deve essere ricoperta sottilmente con olio di tung e poi spazzolata con uno strato di vernice. Questo viene essiccato per diventare a tenuta stagna. Le pillole fatte in questo modo saranno rotonde e lisce.
  5. Spennellare nuovamente l'acqua di zenzero, cospargere la polvere e ruotare la placca in modo che il farmaco sia gradualmente arrotondato e ingrandito. Riporre in un luogo fresco per l'asciugatura.

13. Istituzione del modello animale

  1. Dopo 7 giorni di acclimatazione, dividere casualmente i topi sperimentali in 4 gruppi, vale a dire, il gruppo di operazione fittizia (Sham, in cui è stato rimosso solo il grasso intorno alle ovaie) e tre gruppi di topi ovariectomizzati costituiti da un gruppo modello (OVX) e gruppi di somministrazione di pillole Xiaoyao a bassa e alta concentrazione.
  2. Anestetizzare i topi con pentobarbital di sodio al 3% (40 mg/kg) iniettato per via intraperitoneale. Verificare che i topi entrino nello stato di anestesia osservando il rilassamento muscolare generalizzato, la respirazione profonda e lenta e il movimento rallentato. Applicare un unguento per gli occhi sugli occhi dei topi prima dell'intervento chirurgico.
  3. Posizionare gli animali in posizione prona e radere la regione renale della schiena con un rasoio per animali. Eseguire la disinfezione locale con etanolo al 75%.
  4. Praticare un'incisione longitudinale di circa 1 cm bilateralmente, vicino alla regione dorsale del rene, e incidere la fascia per separare i muscoli e il peritoneo.
  5. Individuare la parte superiore del corno uterino e le tube di Falloppio per la legatura. Inserire una pinza nell'incisione per l'esplorazione e individuare l'ovaio, racchiuso dal tessuto adiposo in un motivo a cavolfiore rosso vivo, con le tube di Falloppio disposte a spirale sotto l'ovaio, che collegano l'ovaio al corno uterino25. Rimuovere le ovaie con forbici chirurgiche e sutura.
  6. Rimuovere una piccola quantità di tessuto adiposo vicino all'ovaio come controllo nel gruppo operatorio fittizio. Osserva gli animali fino a quando non riprendono conoscenza. Mettere gli animali postoperatori in gabbie separate fino al completo recupero.
  7. Per prevenire l'infezione, fornire ai topi gentamicina per 3 giorni dopo l'intervento. Dopo l'operazione, garantire una dieta normale e un buon ambiente di crescita in base alle condizioni effettive dei topi. In caso di anomalie, come infezione della ferita o perdita di appetito, consultare immediatamente l'istruttore del Laboratory Animal Center.

14. Somministrazione di farmaci

NOTA: Secondo la Metodologia Sperimentale di Farmacologia26, la conversione dei dosaggi umani e animali utilizzati è stata di 9 g di pillole Xiaoyao per un adulto di 70 kg, equivalente a una dose (dosaggio per una singola somministrazione).

  1. Per i gruppi a basso e alto dosaggio, utilizzare rispettivamente 0,683 g/kg e 2,73 g/kg per un gruppo di 8 animali. Usa la mano sinistra per immobilizzare il mouse in modo che la bocca del topo sia in linea retta con l'esofago. Tenendo l'ago della sonda nella mano destra, inserirlo delicatamente nell'esofago lungo la parete posteriore della faringe dall'angolo della bocca del topo.
  2. A questo punto, la direzione dell'ago del gavage può essere leggermente modificata per stimolare un'azione di deglutizione indotta. Iniettare il farmaco. Esegui questa operazione una volta al giorno per 12 settimane.
  3. Per i gruppi operati con finta e modello, somministrare soluzione salina una volta al giorno per 12 settimane in una quantità determinata dal peso dell'animale.
  4. Sopprimere i topi mediante lussazione cervicale e tagliare gli arti posteriori. Scuoiare gli arti per separare il muscolo dal femore. Trattare i femori dei topi con una soluzione decalcificante EDTA per 1 mese e sostituirli con una soluzione fresca ogni giorno.

15. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)

  1. Decerare i tessuti femorali per 8 minuti e poi immergerli in etanolo a gradiente per 3 minuti; Sciacquare con acqua corrente per 1 min.
  2. Aggiungere la soluzione colorante di ematossilina goccia a goccia sulle sezioni per coprire completamente il tessuto, colorare per 5 minuti e lavare con acqua di rubinetto
  3. Aggiungere la soluzione di differenziazione dell'acido cloridrico al tessuto sul vetrino, assicurandosi che copra completamente il tessuto. Fermarsi quando si osserva uno scolorimento del tessuto. Risciacquare con acqua di rubinetto.
  4. Aggiungere la soluzione di colorante Eosin goccia a goccia e lasciare coprire completamente il tessuto, agendo da 30 s a 2 min. Sciacquare il colorante in eccesso con acqua corrente.
  5. Eseguire la disidratazione con etanolo a gradiente con etanolo anidro al 75% per 5 minuti, seguita da etanolo anidro per 5 minuti e depistare con la soluzione decerante per 3 minuti.
  6. Far cadere una quantità adeguata di gomma neutra sul vetrino in base alle dimensioni del tessuto e abbassare con cautela il vetrino, evitando bolle d'aria.

16. Micro-CT e analisi immunoistochimiche

  1. Rimuovere i muscoli e i legamenti in eccesso attorno ai campioni di femore da diversi gruppi di topi e fissare i tessuti del campione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
  2. Asciugare i tessuti ossei all'aria ed eseguire la micro-CT mediante scansione del tessuto osseo al fine di ottenere dati micro-CT tridimensionali.
  3. Dai blocchi di cera di topo conservati, tagliarli in sezioni continue di 6 μm di spessore e cuocere le fette a 70 °C -72 °C per 30-60 min.
  4. Decerare per 8 minuti, seguito da un trattamento con etanolo anidro al 75% per 5 minuti, etanolo anidro per 5 minuti e risciacquo PBS per 5 minuti per 3 volte.
  5. Eseguire la riparazione ad alta pressione EDTA per 15 minuti, seguita dal lavaggio PBS per 5 minuti per 3x.
  6. Aggiungere il 3% di perossido di idrogeno goccia a goccia nel fazzoletto, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e lavare con PBS per 5 minuti per 3 volte.
  7. Usa una penna immunoistochimica per disegnare un cerchio. Lavare con PBS lavare per 3 minuti per 3x.
  8. Colorazione dell'anticorpo primario (anticorpi anticorpi anti-ALP di coniglio (1:200), anticorpi anti-COL-1 di coniglio (1:200), anticorpi anti-IL-17 di coniglio (1:275), anti-Act1 (1:500), anticorpi anti-IL-6 di coniglio (1:500)) durante la notte, seguiti da risciacquo con tampone PBS per 5 minuti per 3x.
  9. Aggiungere goccia a goccia l'anticorpo secondario [Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000) coniugato con HRP) e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti. Lavare con tampone PBS per 3 minuti per 3x.
  10. Incubare in DAB pronto all'uso per 3-5 minuti, quindi risciacquare con PBS.
  11. Eseguire la ricolorazione con ematossilina per 3 minuti, seguita dal risciacquo PBS.
  12. Utilizzare la soluzione differenziante per circa 10 s, seguita dal risciacquo PBS.
  13. Aggiungere la soluzione blu di ritorno per 10 s, seguita dal risciacquo PBS.
  14. Eseguire il trattamento con etanolo anidro al 75% per 5 minuti, etanolo anidro per 5 minuti e chiarificare per 3 minuti. Utilizzare resina neutra per sigillare le diapositive.

Risultati

Principi attivi e obiettivi d'azione delle pillole Xiaoyao
Effettuando una ricerca nel database TCMSP e lo screening secondo i criteri di biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e proprietà farmaco-simili (DL) ≥ 0,18, è stata riscontrata l'esistenza di 125 principi attivi nelle pillole Xiaoyao. Tra questi, gli ingredienti 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 e 2 provenivano rispettivamente da Paeonia lactiflora bianca, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, liquirizia e zenzero. Alcuni dei principi attivi sono riportati nella Tabella 1. Inoltre, dal database TCMSP sono stati ottenuti un totale di 879 target di principi attivi efficaci e 232 target sono rimasti dopo la conversione dell'ID e l'eliminazione dei valori duplicati.

Analisi di rete della MTC - Principio attivo - Bersaglio intersecante - Malattia
Diversi database sono stati cercati utilizzando la parola chiave osteoporosi per i geni associati alla malattia. Nel database GeneCards, 1692 geni sono stati ottenuti dopo il filtraggio secondo il punteggio di rilevanza ≥1. Un totale di 35 geni sono stati ottenuti nel database OMIM. C'erano 3, 33 e 386 geni nei database PharmGkb, TTD e DrugBank, rispettivamente. Successivamente, l'intersezione dei risultati di queste cinque banche dati è stata utilizzata per ulteriori analisi (Figura 1A). Uno dei geni che è stato rappresentato in quattro database era CALCR. Un totale di 102 geni intersecanti sono stati ottenuti dopo aver combinato i geni correlati alla malattia e aver preso l'intersezione con il bersaglio del farmaco (Figura 1B). Sulla base delle interazioni tra i bersagli della malattia e i principi attivi del farmaco, è stata costruita una rete di farmaci che intersecano il bersaglio della malattia con il software Cytoscape. Di conseguenza, sono state ottenute relazioni tra i componenti del farmaco e la regolazione polimorfica delle scansioni geniche correlate alla malattia (Figura 2A).

Nel database String, le interazioni proteiche sono state analizzate all'intersezione dei geni malattia e dei bersagli farmacologici per ottenere i loro diagrammi di rete di interazione (Figura 2B), e questi sono stati poi sottoposti a screening per le proteine più centrali (Figura 2C-D). I risultati hanno mostrato le interazioni più forti tra FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 e STAT3 tra i geni della malattia e i bersagli farmacologici (Figura 2E).

Analisi della funzione GO e dell'arricchimento della via KEGG
L'analisi dell'arricchimento OB ha mostrato un totale di 2177 voci, tra cui 1990 voci di processo biologico (BP), 58 voci di componenti cellulari (CC) e 129 voci di funzioni molecolari (MF). Nella BP, i geni si concentravano principalmente sulla risposta ai livelli di nutrienti, sulla risposta allo stress ossidativo e sulla risposta cellulare allo stress ossidativo. La MF si è concentrata sul legame del fattore di trascrizione legante il DNA, sul legame del fattore di trascrizione legante il DNA specifico per l'RNA polimerasi II, sull'attività del recettore nucleare, sull'attività del fattore di trascrizione attivato dal ligando e sull'attività delle citochine (Figura 3A-B).

Nell'analisi dell'arricchimento della via KEGG, sono state ottenute un totale di 168 vie di segnalazione correlate, e le più significative sono state la via di segnalazione AGE-RAGE, la via di segnalazione IL-17, la via di segnalazione TNF, la via di segnalazione HIF-1 e la differenziazione cellulare Th17 (Figura 3C-D). Si suggerisce che le pillole Xiaoyao possano esercitare effetti terapeutici sulla PMOM in diversi modi. L'infiammazione è fortemente associata all'osteoporosi e può essere accelerata dalla menopausa e l'IL-17 è un importante fattore infiammatorio7. Pertanto, il prossimo piano è quello di esplorare se le pillole Xiaoyao potrebbero trattare l'osteoporosi da una prospettiva infiammatoria rispetto all'IL-17.

Cambiamenti strutturali nel tessuto osseo prima e dopo la rimozione del tessuto ovarico
La colorazione HE ha mostrato che nei femori dei topi Sham, le trabecole erano disposte strettamente, con buona continuità, piccoli spazi tra le trabecole, fratture rare e dimensioni normali della cavità del midollo osseo. Rispetto al gruppo Sham, i femori del gruppo OVX erano scarsamente disposti, con gravi fratture delle trabecole, continuità interrotta e una cavità midollare marcatamente allargata, che mostrava alterazioni tipiche dell'osteoporosia (Figura 4A).

Confronto micro-CT tra i gruppi
I femori dei topi del gruppo OVX mostravano un reticolo trabecolare incompleto, una cavità midollare parzialmente vuota e un assottigliamento della corteccia ossea rispetto a quelli dei topi del gruppo Sham. Il gruppo di topi Sham ha mostrato un'abbondanza di trabecole, una buona continuità e un restringimento della cavità midollare nei loro femori (Figura 4B).

Effetti comportamentali delle pillole Xiaoyao sui topi
Durante il periodo di studio, ad eccezione del gruppo OVX, tutti i topi degli altri gruppi avevano migliori abitudini di vita, colore normale dei capelli, elevata mobilità e buona salute. L'urina e le feci di ciascun topo sono tornate alla normalità entro 1 settimana dopo il trattamento con le pillole Xiaoyao. Non ci sono stati morsi, infezioni della ferita, ostruzione gastrointestinale, distacco della sutura, necrosi cutanea dell'incisione o morte di nessuno dei topi. I topi del gruppo OVX erano inclini alla caduta dei capelli, all'oscuramento del colore dei capelli, alla mobilità ridotta, ai riflessi più lunghi, all'aumento dell'escrezione e alla diminuzione del mangiare e del bere.

Colorazione HE di sezioni patologiche di topi dopo intervento farmacologico
Nel gruppo Sham, il tessuto femorale era denso, reticolare e sistemato regolarmente. Le dimensioni e la continuità della cavità midollare erano normali e la spaziatura tra le trabecole ossee adiacenti era relativamente piccola. Rispetto al gruppo Sham, la corteccia femorale e l'osso spongioso nel gruppo OVX mostravano difetti evidenti, diminuzione delle trabecole, aumento delle lacune, continuità interrotta, assottigliamento della struttura, allargamento della cavità midollare e assottigliamento della corteccia ossea. Rispetto al gruppo OVX, le trabecole femorali dei topi nei gruppi trattati con farmaci (basse e alte dosi) apparivano strutturalmente intatte, con spaziatura ridotta, maggiore connettività, cavità del midollo osseo ristrette e strutture più dense (Figura 5A).

Rilevamento di indici di imaging nei topi dopo un intervento farmacologico
Rispetto al gruppo Sham, i femori dei topi del gruppo OVX avevano trabecole ossee rade e rotte e corteccia ossea assottigliata. Rispetto al gruppo OVX, i topi nel gruppo delle pillole Xiaoyao ad alto dosaggio avevano meno trabecole ossee fratturate, reticolazione ripristinata e un grado significativo di riduzione parziale della cavità del midollo osseo. Tuttavia, i topi trattati con pillole Xiaoyao a basso dosaggio avevano ancora trabecole ossee fratturate, sebbene ci fosse un aumento delle trabecole ossee e una riduzione della cavità del midollo osseo. La struttura trabecolare delle trabecole ossee del gruppo operato con sham ha mostrato maggiore continuità e completezza (Figura 5B).

Risultati immunoistochimici dei tessuti nei gruppi dopo l'intervento farmacologico
Act1 e IL-6 sono proteine chiave nella via di segnalazione di IL-17 e ALP e COL-1 sono geni osteogenici. L'espressione delle proteine ALP, COL-1, IL-6, IL-17 e Act1 porta alla formazione di granuli marrone chiaro o gialli sul tessuto osseo. I risultati dell'immunoistochimica hanno mostrato che i valori medi di densità ottica di ALP e COL-1 nel gruppo farmaco erano superiori a quelli del gruppo OVX dopo il trattamento con pillole di Xiaoyao e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,05). I valori medi di densità ottica di IL-17, Act1 e IL-6 nel gruppo farmaco erano inferiori a quelli del gruppo OVX e la differenza era statisticamente significativa (p < 0,05; Figura 6). Le pillole di Xiaoyao hanno invertito il declino di ALP e COL-1 causato dall'ovariectomia, diminuendo l'espressione di diverse proteine chiave IL-17, IL-6 e Act1 nella via di segnalazione IL-17, il che suggerisce che il farmaco può esercitare i suoi effetti terapeutici attraverso questa via.

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Figura 1: Analisi della rete dell'intersezione tra i principi attivi della fitoterapia cinese e i geni correlati alla malattia. (A) L'intersezione di geni correlati alla malattia, ottenuti dai database GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD e DrugBank. Questi sono rappresentati dai colori blu, rosso, verde, giallo e marrone con 1692, 35, 3, 33 e 386 geni, rispettivamente. L'intersezione è costituita dai geni associati alla malattia nei cinque database e la parte sovrapposta indica il numero di geni intersecanti in ciascun database. (B) Vengono mostrati i bersagli farmacologici (con il colore blu che indica questo set di dati, ovvero l'insieme di geni bersaglio ad azione farmacologica raccolti nel database TCMSP dopo la trasformazione dell'ID e la rimozione dei duplicati) e i geni correlati alla malattia (con il colore rosso che indica questo set di dati, che contiene tutti i geni dei cinque database sopra menzionati). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Interazione dei principi attivi della MTC con le reti di regolazione genica correlate alla malattia e le proteine core. (A) La rete di regolazione dei principi attivi e dei geni correlati alla malattia nella MTC mostra le relazioni di regolazione genica corrispondenti a ciascun ingrediente attivo nelle pillole Xiaoyao, con ogni ingrediente collegato al gene che regola. (B) I risultati dell'analisi dell'interazione proteina-proteina di geni intersecanti in STRING (i nodi della rete rappresentano proteine, gli Edge rappresentano associazioni proteina-proteina e collegamenti multipli indicano interazioni multiple tra due proteine). (C-E) Le interazioni proteiche ottenute da String sono state sottoposte a screening più volte. (C) La rete di interazione proteica è stata ottenuta dopo il primo screening e la parte evidenziata è la sua porzione centrale. (D) Il risultato del secondo screening e la parte evidenziata è la parte centrale. (E) La rete di interazione proteica più centrale nella rete di interazione proteica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi dell'arricchimento GO e KEGG. (A-B) I risultati dell'analisi dell'arricchimento OB dei geni intersecanti sono divisi in 3 voci, Processo biologico (BP), Componente cellulare (CC) e Funzione molecolare (MF), e ogni voce mostra solo i primi 10 geni arricchiti in modo più significativo. (C-D) I risultati dell'analisi dell'arricchimento KEGG dei geni intersecanti (che mostrano i primi 30 più significativamente arricchiti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Definizione e valutazione del modello di topi ovariectomizzati. (A) Confronto della morfologia ossea metafisaria tra i gruppi operati con sham e quelli ovariectomizzati (10x). Nel gruppo OVX, le fratture trabecolari erano gravi, la continuità era interrotta e la cavità del midollo osseo era significativamente ingrandita, mentre nel gruppo sham, le fratture trabecolari erano rare e la cavità del midollo osseo era di dimensioni normali. (B) Scansioni micro-TC del femore nei gruppi operati con sham e ovariectomizzati. Nel gruppo OVX, la rete trabecolare era incompleta e la cavità del midollo osseo era parzialmente vuota. Nel gruppo Sham, le trabecole erano abbondanti e continue e la cavità del midollo osseo era stretta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Dosaggio HE e micro-CT dopo il trattamento con le pillole Xiaoyao. (A) Colorazione HE (10x) delle sezioni del femore dei topi in ciascun gruppo dopo il trattamento con le pillole Xiaoyao. Nel gruppo OVX, le trabecole ossee erano ridotte, la continuità era interrotta, la struttura era rada e la cavità midollare era allargata. Nel gruppo Sham, le trabecole ossee avevano una buona continuità, il tessuto femorale era strutturalmente denso e la cavità midollare era normale. Rispetto al gruppo OVX, le trabecole ossee nel gruppo farmacologico apparivano strutturalmente intatte, con una maggiore connettività, una ridotta cavità midollare e una struttura più densa rispetto al gruppo modello. (B) Confronto della micro-CT dei femori dei topi in ciascun gruppo dopo il trattamento con pillole Xiaoyao. Le trabecole ossee nei femori dei topi del gruppo ovariectomizzato erano rade e rotte, mentre il gruppo Sham aveva trabecole più continue e intatte. Rispetto al gruppo ovariectomizzato, i topi nel gruppo trattato con farmaci ad alte dosi avevano meno trabecole ossee rotte, struttura reticolare ripristinata e cavità del midollo osseo parzialmente ridotta, mentre gli animali nel gruppo con farmaci a basso dosaggio avevano più trabecole ossee e ridotta cavità del midollo osseo, ma le trabecole ossee rotte sono rimaste. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Immunoistochimica per rilevare l'effetto delle pillole Xiaoyao sulla via di segnalazione IL-17 e sull'espressione della proteina genica marcatore osteogenico nei topi osteoporotici (40x). Le reazioni positive per la presenza di proteine ALP, COL-1, IL-6 e IL-17 e Act1 si sono manifestate con la comparsa di granuli marrone chiaro o gialli sul tessuto osseo. L'espressione di ALP e COL-1 nel gruppo farmaco era superiore a quella del gruppo OVX (p < 0,05). L'espressione di IL-17, Act1 e IL-6 nel gruppo farmaco era inferiore a quella nel gruppo OVX (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della medicina tradizionale cineseID molecolareNome della molecola
Paeonia lactiflora biancaMOL001918paeoniflorgenone
Paeonia lactiflora biancaMOL000211Mairin
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-acetil-12-senenecioil-2E,8Z,10E-atractylentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-acetossiacitractilone
Menthae HerbaMOL000471aloe-emodina
Menthae HerbaMOL005190eriodictyol
Chai HuMOL000354di isoramnetina
Chai HuMOL013187Cubebin
Angelica sinensisMOL000449Stigmasterolo
Angelica sinensisMOL000358beta-sitosterolo
Poria cocosMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-olo
Poria cocosMOL000283Perossido di ergosterolo
LiquiriziaMOL002311Glicirolo
LiquiriziaMOL0049907,2',4'-triidrossi - 5-metossi-3 - arilcumarina
Zenzero frescoMOL0061296-metilgingdiacetato2
Zenzero frescoMOL001771Poriferast-5-en-3beta-olo

Tabella 1: Principi attivi in medicinali cinesi selezionati. La prima colonna elenca i nomi delle medicine tradizionali cinesi, la seconda colonna è l'ID del principio attivo della medicina cinese e la terza colonna è il nome del principio attivo nella medicina cinese.

File di codifica supplementare 1: nome dell'erba, ingrediente e codice di unione dell'ID di destinazione. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 2: Conversione dell'ID bersaglio del farmaco. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 3: File per l'analisi della rete. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 4: Conversione da simbolo a ID genico. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 5: Analisi dell'arricchimento GO. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 6: Analisi dell'arricchimento KEGG. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Secondo le statistiche, l'osteoporosi causa 1,5 milioni di fratture ogni anno negli Stati Uniti e la stragrande maggioranza di queste si verifica nelle donne in postmenopausa27. Con l'aumento dell'invecchiamento della popolazione, si prevede che la maggior parte delle future fratture dell'anca nel mondo si verificherà in Asia e che entro il 2050 il numero totale di queste in tutto il mondo raggiungerà gli 8,2 milioni28. Il costo della prevenzione delle fratture è quasi uguale a quello del loro trattamento e l'uso di farmaci avrà inevitabilmente alcuni effetti collaterali29. Pertanto, vi è un urgente bisogno di un modo più efficace in termini di costi per affrontare questo problema in una società responsabile.

Le pillole Xiaoyao sono composte da otto ingredienti. Sono in corso studi sugli effetti dei suoi ingredienti sull'osteoporosi. Poria cocos inibisce l'osteoclastogenesi e l'attività osteolitica in un modello murino indotto da osteoporosi ovariectomizzata30. La combinazione di due componenti, liquirizia e Shu-di-huang, può esercitare un effetto antiossidante inibendo la via di segnalazione NF-κB31. Il tonico tradizionale cinese a base di erbe, Danggui buxue tang, può essere utile nel trattamento dell'osteoporosi grazie alla sua capacità di inibire il turnover osseo e modulare la regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG) e quindi prevenire la perdita ossea nei ratti ovariectomizzati32. Tutti questi risultati suggeriscono che le pillole Xiaoyao possono avere un effetto terapeutico sull'osteoporosi. I risultati di questo studio suggeriscono anche che le pillole Xiaoyao possono esercitare un effetto anti-osteoporosi modulando l'attività della via di segnalazione IL-17 in modo antinfiammatorio.

Un totale di 168 vie di segnalazione rilevanti sono state ottenute dalla rete regolatoria di bersagli farmacologici e geni correlati all'osteoporosi costruiti in questo studio, e questo studio ha esplorato ulteriormente la via di segnalazione IL-17. La famiglia IL-17 è composta da sei membri, tra cui IL-17A-F, di cui IL-17A è stato il primo e il più importante ad essere scoperto33. Nei primi studi, si pensava che l'IL-17 fosse associata a malattie infiammatorie e autoimmuni nell'uomo. Successivamente, gli studi hanno suggerito che aveva un ruolo nel mantenere l'integrità della barriera ed è stato anche scoperto che era associato al cancro15. Tuttavia, sebbene non svolga un ruolo fisiologico nel rimodellamento osseo, si comporta in modo diverso durante condizioni ossee anomale. Inoltre, l'IL-17 può agire come un debole attivatore e sinergizza con altre citochine per aumentare la produzione di energia. Ciò è dimostrato dalla sua co-attivazione con il TNFα 15,34.

Esperimentiin vitro hanno dimostrato che IL-17 può indurre la proliferazione e la differenziazione delle MSCosteoblastiche 35 e può anche inibire la differenziazione indotta da BMP-2 degli osteoblasti primari di ratto36. L'IL-17 può stimolare gli osteoblasti ad esprimere RANKL, che, a sua volta, promuove l'osteoclastogenesi, ma questo effetto sembra dipendere dalla presenza di osteoblasti37,38. In questo studio, le diverse concentrazioni delle pillole Xiaoyao hanno prodotto effetti terapeutici sui topi modello PMOM, soprattutto se utilizzate a concentrazioni più elevate. IL-17, Act1 e IL-6, che sono correlati con la via di segnalazione IL-17, erano significativamente diminuiti in questi topi rispetto ai controlli. Quando sono stati valutati i risultati dell'analisi dell'arricchimento, questi hanno suggerito il coinvolgimento della via IL-17 quando gli animali sono stati trattati con pillole di Xiaoyao.

Questo studio ha anche testato alcuni dei marcatori di conversione ossea. L'ALP è un enzima tetramerica legato alla membrana che può essere secreto dagli osteoblasti e svolge un ruolo importante nella formazione e nella mineralizzazione ossea degradando l'inibitore della mineralizzazione, il pirofosfato39. Circa il 90% della frazione organica nella matrice extracellulare dei tessuti ossei è composta da COL-1 e, durante la mineralizzazione ossea, il collagene svolge un ruolo chiave in questo processo40. Nel risultato di questo studio, i livelli di espressione delle proteine ALP e COL-1, come osservato dall'immunoistochimica dei topi nel gruppo farmacologico, erano superiori a quelli del gruppo modello, suggerendo che l'effetto delle pillole Xiaoyao nel migliorare l'osteoporosi potrebbe essere ottenuto aumentando gli indicatori dei geni osteogenici. Alcuni studiosi hanno dimostrato che l'espressione e l'attività trascrizionale del recettore degli estrogeni degli epatociti (ERα) possono essere sovraregolate da Xiaoyao san41. È stato dimostrato che gli estratti di Angelica sinensis, Paeonia lactiflora bianca e liquirizia nello Xiaoyao san hanno un'attività simile agli estrogeni. Gli stessi ingredienti sono presenti anche nelle pillole Xiaoyao utilizzate in questo studio, che sono realizzate su prescrizione di Xiaoyao san con moderni metodi di preparazione. Pertanto, si può ipotizzare che le pillole di Xiaoyao possano anche aumentare l'espressione di geni osteogenici come ALP e COL-1 esercitando effetti simili agli estrogeni sugli osteoblasti per aumentare la loro attività e migliorare la qualità delle ossa.

Questo studio ha stabilito con successo un modello di PMOM nei topi rimuovendo entrambe le ovaie mediante ovariectomia dorsale. Il modello animale è la base per tutti gli esperimenti successivi in questo studio. Durante la rimozione chirurgica delle ovaie dei topi, era importante assicurarsi che le ovaie dei topi nei gruppi OVX e farmaci fossero completamente rimosse, mentre nel gruppo fittizio veniva rimosso solo il grasso vicino alle ovaie ed era anche importante evitare infezioni della ferita.

Il numero di trabecole ossee e la densità di connessione dei topi sono migliorati dopo il trattamento di ovariectomizzati con pillole di Xiaoyao, il che ha suggerito che questo farmaco ha un effetto terapeutico sull'osteoporosi. L'immunoistochimica e l'immunocitochimica sono state utilizzate per valutare l'efficacia del trattamento in questo studio; Il tempo di azione dei vari reagenti non è assoluto, soprattutto nel processo di sviluppo del colore, che richiede un'osservazione in tempo reale e una reazione tempestiva per garantire i migliori risultati. Durante l'incubazione degli anticorpi, viene prima impostato il gradiente di concentrazione degli anticorpi e, dopo l'osservazione e il confronto, si sceglie la concentrazione più adatta per gli esperimenti successivi.

Tuttavia, c'erano alcune limitazioni in questo studio. I dati di farmacologia web avevano un'unica fonte di dati e l'analisi rispetto alla composizione del farmaco proveniva da un solo database. Inoltre, l'efficacia delle pillole Xiaoyao non è stata confrontata con i farmaci positivi in questo studio e non è stato possibile valutare le differenze specifiche tra le pillole Xiaoyao e le attuali modalità di trattamento.

Per la PMOM, l'opzione di trattamento di prima linea disponibile sono i bifosfonati. Tuttavia, l'uso di questi farmaci può portare a controindicazioni gastrointestinali e fratture atipiche del femore e osteonecrosi dei mascellari42,43. Le opzioni di trattamento di seconda linea includono l'uso di denosumab e la terapia ormonale. È stato dimostrato che Denosumab riduce le fratture dell'anca, vertebrali e non vertebrali. Tuttavia, il rimbalzo può verificarsi una volta che il farmaco viene interrotto e maggiore è la durata dell'interruzione, maggiore è la perdita di densità ossea 42,44,45. La terapia ormonale della menopausa riduce il rischio di fratture osteoporotiche della colonna vertebrale, ma i suoi effetti sono limitati all'età e i suoi rischi a lungo termine sembrano superare i benefici46. La terapia sequenziale è un'opzione di trattamento a lungo termine per la PMOM, in cui l'uso di farmaci che formano l'osso seguiti da farmaci anti-riassorbimento può ottenere il massimo aumento della massa ossea. I farmaci specifici sono solitamente determinati paziente per paziente42.

A questo proposito, si può presumere che le erbe tradizionali cinesi possano avere un potenziale vantaggioso nel trattamento dell'osteoporosi. La modalità d'azione dell'erboristeria è multi-percorso e multi-target piuttosto che agire attraverso un unico meccanismo47. Alcuni studiosi hanno valutato l'efficacia e la sicurezza di alcune medicine erboristiche cinesi e hanno dimostrato che il numero di fratture quando si utilizza una combinazione di medicine cinesi e occidentali rispetto alla sola somministrazione di medicina cinese era inferiore a quello del gruppo48 della sola medicina occidentale. Rispetto ai farmaci chimici, i rimedi erboristici cinesi hanno meno effetti collaterali, sono relativamente economici e sono adatti per un uso a lungo termine. I rimedi erboristici cinesi non solo possono riparare la microstruttura ossea e aumentare il volume osseo, ma possono anche ridurre o eliminare i sintomi della debolezza della colonna lombare e del mal di schiena49. L'attuale studio può aiutare a fornire un possibile approccio alla scoperta di nuovi farmaci e trattamenti.

L'applicazione delle pillole Xiaoyao per il trattamento del PMOM sembra essere promettente. Nel presente studio, le pillole possono migliorare la massa ossea e la qualità ossea in un modello murino di PMOM sopprimendo l'infiammazione. Alcuni studiosi hanno persino suggerito che una combinazione di medicina cinese e agopuntura può essere efficace nel trattamento del PMOM50. Allo stesso tempo, una combinazione di medicina cinese e occidentale si è dimostrata efficace51. Entrambi questi possibili rimedi sono validi, anche se qualsiasi trattamento raccomandato che utilizza le pillole Xiaoyao in combinazione con l'agopuntura e la medicina occidentale dovrebbe essere convalidato da studi clinici. L'importanza clinica dell'osteoporosi risiede nelle fratture ossee e la ricerca futura dovrebbe concentrarsi anche sulla prevenzione di queste.

In sintesi, questo studio ha dimostrato attraverso la farmacologia di rete e gli esperimenti sugli animali che i topi PMOM hanno mostrato un miglioramento significativo del metabolismo osseo e un aumento della massa ossea dopo il trattamento con pillole Xiaoyao. Il meccanismo d'azione di questo fenomeno può essere correlato all'inibizione della via di segnalazione IL-17 e all'aumento dell'attività dei fattori osteogenici, ALP e COL-1. Questo studio getta le basi teoriche e sperimentali per l'applicazione clinica delle pillole Xiaoyao nel trattamento delle malattie associate all'osteoporosi.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Il Programma di ricerca scientifica e sviluppo tecnologico (20224128) di Baise City ha sostenuto questo lavoro. Gli autori ringraziano il Dr. Dev Sooranna dell'Imperial College di Londra e YMUN per l'editing del manoscritto. YYX e ZYW hanno contribuito in egual misura a questo studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Campionatore da 1 mlGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Per l'anestesia nei topi
4% poliformaldeidePechino Solarbio Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.P1110Per la fissazione dei tessuti
6-0 sutura assorbibile (ago angolato)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Per la sutura postoperatoria
Batuffolo di cotone assorbenteVincitoreMIANQIU-500gPer sterilizzazione ed emostasi
Vetrini adesiviJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Per il sezionamento dei tessuti
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLPer l'anestesia nei topi Soluzione
BluingPechino Solarbio Scienza & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.G1866Colorazione blu dei nuclei delle cellule dopo l'azione della soluzione di differenziazione dell'ematossilina
C57BL/6 topiBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Per l'uso in esperimenti sugli animali
Lame chirurgiche in acciaio al carbonioPremier Medical Equipment Co.SP239Per la chirurgia del topo
CIKS/TRAF3IP2 Coniglio pAbBIOSS ANTICORPIbs-6202RSi lega ad Act1 nei tessuti
Soluzione di ematossilina di Cole (per colorazione convenzionale)Beijing Solarbio Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.G1140Per la colorazione di sezioni di paraffina
Anticorpo policlonale di collagene di tipo Iproteintech14695-1-APSi lega a COL-1 nei tessuti
Kit substrato DAB, 20xBeijing Solarbio Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.DA1010Per lo sviluppo del colore dei tessuti
Foglio chirurgico monouso 50 * 60 cmNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Per la chirurgia del topo
Soluzione di decalcificazione EDTA (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.E1171-500mlPer la decalcificazione dei tessuti
Tampone di blocco perossidasi endogena potenziatoBeyotime BiotechnologyP0100BSequestro di perossidasi endogene tissutali o cellulari
Liquido trasparente decerante ecologicoServicebioG1128-1LPer la deceratura di sezioni di paraffina
Alcool etilicoCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Per la disidratazione di sezioni di paraffina
Diluente anticorpale per uso generaleEpizyme BiotechPS119LPer la diluizione degli anticorpi
Soluzione di differenziazione dell'ematossilinaServicebioG1039-500MLPer la differenziazione dopo la colorazione con ematossilina e la rimozione di coloranti eccessivamente legati e non specificamente adsorbiti dai tessuti Kit
di colorazione dell'ematossilina eosina (HE)Pechino Solarbio Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.G1120-3 * 100mlper la colorazione dei tessuti
Manico del coltello chirurgico in acciaio inossidabile di alta qualitàPremier Medical Equipment Co.SP0088Per la chirurgia del topo
Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2Si lega all'anticorpo primario e amplifica il segnale
IL-17A Anticorpo policlonaleproteintech13082-1-APSi lega a IL-17 nei tessuti
IL-6 Anticorpo policlonaleproteintech21865-1-APSi lega a IL-6 nei tessuti
Penna per immunoistochimicaPechino Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)Per disegnare cerchi in immunoistochimica
Sutura chirurgica medica Non assorbente (palla) 5-0 3,5 mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2Per la sutura postoperatoria
Aghi di sutura medica Aghi angolari 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Per la sutura postoperatoria
Balsamo neutroPechino Solarbio Science & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.G8590Come sigillante per fette
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Tampone per il lavaggio dei vetrini e la diluizione parziale della soluzione
Tampone a blocco rapido senza proteine (1X)Epizyme BiotechPS108PEvitare il legame non specifico delle proteine
Anticorpo anti-osso della fosfatasi alcalina di coniglioBIOSS ANTIBODIESbs-6292RSi lega alla fosfatasi alcalina nei tessuti
salinaOspedale Affiliato Youjiang Medical University Per NazionalitàLHN500Per gli animali da gavage
Rasatura / Tosatrici elettricheHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Per la rasatura di topi
in acciaio inox Medico Ago Titolare 14cm Coarse NeedlePremier Medical Equipment Co.SP784Per la chirurgia del topo
Pinze oftalmiche in acciaio inossidabile 10,5 cm curve (senza gancio)ZhuoyouyueYKNWW-10.5Per la chirurgia del topo
Forbici oftalmiche in acciaio inossidabile / forbici chirurgiche 10CM Punta drittaPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJPer la chirurgia del topo
Punta in acciaio inossidabile Ago gastrico 12 Gauge 55mm GomitoGWJ-12-55WPer l'uso nei topi con sonda gastrica
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002Per la riparazione dell'antigene delle sezioni di paraffina
Tavola da dissezione in legno 25 * 16 cmJP16 * 24Per la chirurgia del topo
Pillole XiaoyaoJiuzhitang Co., Ltd.YPG-041Per la somministrazione di farmaci per animali
Others
R 4.3.1Elaborazione dati
Cytoscape3.9.1National Resource for Network BiologyBuilding a regulatory network network networking
ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthImage processing for risultati dell'immunoistochimica
Adobe Photoshop 24.0.0AdobePer la combinazione di immagini
GraphpadPrism 9.5SoftwareAnalisi statistica delle celle di dati
DimensionOLYMPUSPer affettare e fotografare
OLYMPUS BX53OLYMPUSPer la colorazione HE e la fotografia di sezioni immunoistochimiche
Soluzione GraphPad

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