Questo protocollo dimostra l'ablazione laser di singoli neuroni in larve di Drosophila intatte. Il metodo consente di studiare l'effetto della riduzione della competizione tra i neuroni nel sistema nervoso in via di sviluppo.
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Articolo metodologico
L'ablazione cellulare laser in larve di Drosophila intatte rivela la competizione sinaptica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il protocollo descrive l'ablazione di un singolo neurone con un sistema laser a 2 fotoni nel sistema nervoso centrale (SNC) di larve intatte di Drosophila melanogaster. Utilizzando questo metodo non invasivo, il sistema nervoso in via di sviluppo può essere manipolato in modo specifico per le cellule. L'interruzione dello sviluppo dei singoli neuroni in una rete può essere utilizzata per studiare come il sistema nervoso può compensare la perdita di input sinaptico. I singoli neuroni sono stati specificamente ablati nel sistema di fibre giganti di Drosophila, con particolare attenzione a due neuroni: la fibra gigante presinaptica (GF) e il motoneurone tergotrocanterale postsinaptico (TTMn). Il GF fa la sinapsi con il TTMn omolaterale, che è cruciale per la risposta di fuga. L'ablazione di uno dei GF nel cervello del terzo stadio, subito dopo che il GF inizia la crescita assonale, rimuove permanentemente la cellula durante lo sviluppo del SNC. Il GF rimanente reagisce al vicino assente e forma un terminale sinaptico ectopico al TTMn controlaterale. Questo terminale atipico, bilateralmente simmetrico, innerva entrambi i TTMn, come dimostrato dall'accoppiamento del colorante, e aziona entrambi i motoneuroni, come dimostrato da saggi elettrofisiologici. In sintesi, l'ablazione di un singolo interneurone dimostra la competizione sinaptica tra una coppia bilaterale di neuroni che può compensare la perdita di un neurone e ripristinare le normali risposte al circuito di fuga.
Introduzione
L'ablazione laser è uno strumento preferito per sezionare i circuiti neurali in un'ampia varietà di organismi. Sviluppato in sistemi genetici modello come vermi e mosche, è stato applicato in tutto il regno animale per studiare la struttura, la funzione e lo sviluppo del sistema nervoso 1,2,3. Qui, l'ablazione di un singolo neurone è stata impiegata per studiare come i neuroni interagiscono durante l'assemblaggio del circuito in Drosophila. Il sistema di fuga della mosca è un circuito preferito per l'analisi perché contiene i neuroni più grandi e le sinapsi più grandi nella mosca adulta, e il circuito è stato ben caratterizzato negli ultimi decenni4. Il ruolo che le interazioni neurone-neurone svolgono nell'assemblaggio del circuito della Giant Fiber è un punto focale di questa ricerca.
Un tipo di interazione che è stato un punto focale nelle neuroscienze sin dal lavoro di Hubel e Wiesel negli anni '60 è la "competizione sinaptica"5,6. In questo protocollo, l'ablazione laser è stata utilizzata per rivisitare il ruolo della competizione attraverso l'ablazione a singola cellula nel sistema di fibre giganti (GFS) di Drosophila, dove potrebbero essere scoperte le basi molecolari del fenomeno.
L'ablazione dei neuroni nel moscerino in via di sviluppo è stata difficile per una serie di motivi, tra cui la visualizzazione dei neuroni bersaglio, la precisione del metodo di ablazione e la sopravvivenza del campione. Per superare questi problemi nella GFS, il sistema UAS/Gal47 è stato utilizzato per marcare i neuroni di interesse, e un microscopio a due fotoni è stato utilizzato per rimuovere la fibra gigante presinaptica o il motoneurone a salto postsinaptico (TTMn).
In questo studio, per determinare il ruolo che i neuroni bilaterali vicini svolgono nella regolazione della connettività sinaptica e della forza sinaptica nella GFS, una delle coppie bilaterali di neuroni (GF presinaptico o motoneurone postsinaptico) è stata eliminata appena prima dello sviluppo della pupa. In questa fase di sviluppo, l'assonogenesi della GF non è stata completata8. Sono state quindi esaminate la struttura del GF e la funzione del circuito sinaptico nell'adulto, con particolare attenzione all'output del GF rimanente.
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Protocollo
Tutti gli animali utilizzati per il protocollo erano della specie Drosophila melanogaster. Non ci sono problemi etici che circondano l'uso di questa specie. Per svolgere questo lavoro non è stato necessario un nulla osta etico. I dettagli delle specie di Drosophila , dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Allevamento di Drosophila e selezione dello stadio larvale corretto
- Scegliere una linea driver Gal4 che guidi l'espressione nelle cellule che devono essere ablate e ricombinarla o attraversarla con una linea reporter UAS-GFP. Allevare le mosche con cibo per mosche standard a 25 °C.
NOTA: Per l'ablazione della fibra gigante (GF), R91H05-Gal4 o A307-Gal4 è stato ricombinato con UAS-GFP. ShakB(lethal)-GAL4 ricombinato con UAS-GFP è stato utilizzato per le ablazioni TTMn (vedi Tabella dei materiali). - Seleziona le larve che hanno iniziato a emergere dal cibo e strisciano sul lato della fiala di cibo. Queste larve sono nella fase errante, che è la fase preferita per eseguire l'ablazione delle cellule GF.
NOTA: L'ablazione può essere eseguita in qualsiasi stadio larvale. L'ultimo stadio larvale è stato importante per la manipolazione dello sviluppo del GFS perché i corpi cellulari del GF possono essere facilmente identificati nel cervello, ma gli assoni del GF non hanno stabilito connessioni con i loro bersagli in questa fase.
2. Preparazione della larva del 3° stadio
NOTA: Le larve sono state anestetizzate utilizzando un metodo simile a Burra et al.9. Per ridurre i tempi della procedura, preparare solo una larva alla volta. Una breve esposizione all'anestetico migliorerà la sopravvivenza degli animali da esperimento10.
- Prepara un piatto di vetro con un coperchio ben aderente. Metti un batuffolo di cotone nel piatto e, sotto una cappa aspirante, aggiungi circa 3-5 ml di etere etilico (liquido pericoloso e infiammabile, camice da laboratorio, guanti, occhiali). Coprite il piatto con il coperchio.
- Raccogli le singole larve del 3° stadio dalle fiale di mosca. Al 3° stadio larvale, le larve lasciano il mezzo alimentare e strisciano lungo il lato della fiala di cibo11.
- Assicurati che le larve siano ancora in movimento e non abbiano iniziato la formazione del pupario. Le larve che sono stazionarie e mostrano un accorciamento del corpo iniziano la pupa e non sono adatte all'ablazione. Raccogli le larve con un piccolo pennello.
NOTA: Il 3° stadio larvale inizia dopo la seconda muta a 72 ore di sviluppo (dopo la deposizione delle uova) e dura fino alla formazione del pupario a 120 ore per le mosche allevate a 25 °C.
- Assicurati che le larve siano ancora in movimento e non abbiano iniziato la formazione del pupario. Le larve che sono stazionarie e mostrano un accorciamento del corpo iniziano la pupa e non sono adatte all'ablazione. Raccogli le larve con un piccolo pennello.
- Trasferisci una larva in un piccolo contenitore aperto. Mettere il contenitore nel piatto di vetro con etere etilico e chiudere bene il piatto. Quando si apre il piatto di vetro, posizionarlo sotto un boccaglio o in una cappa aspirante per evitare la fuoriuscita dei fumi.
- A intervalli di 30 s, rimuovere il coperchio con la larva dalla piastra e controllare la mobilità della larva al microscopio da dissezione. La larva viene generalmente immobilizzata entro 1 minuto. Una volta che i ganci della bocca smettono di contrarsi, la larva è pronta per il montaggio. Scartare le larve che non sono completamente immobilizzate dopo 3 minuti.
NOTA: La parte superiore di un coperchio capovolto di una provetta per microcentrifuga (coperchio rimosso dalla provetta) può essere utilizzata come contenitore.
- A intervalli di 30 s, rimuovere il coperchio con la larva dalla piastra e controllare la mobilità della larva al microscopio da dissezione. La larva viene generalmente immobilizzata entro 1 minuto. Una volta che i ganci della bocca smettono di contrarsi, la larva è pronta per il montaggio. Scartare le larve che non sono completamente immobilizzate dopo 3 minuti.
3. Montaggio delle larve su vetrini per l'ablazione
- Posizionare la larva anestetizzata su un vetrino da microscopio. Immergere la larva in una goccia di soluzione salina per insetti; Questo laverà via alcuni dei residui di cibo che potrebbero attaccarsi alla larva.
- Sotto il microscopio di dissezione, rimuovere la maggior parte della soluzione salina con un fazzoletto di carta. Posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto per l'ablazione GF o con il lato ventrale rivolto verso l'alto per l'ablazione TTMn. Abbassa lentamente un vetrino coprioggetti sulla larva. Aggiungere soluzione fisiologica sul lato del vetrino coprioggetti per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino.
- Per l'ablazione GF, controllare il posizionamento del cervello ad alto ingrandimento sul microscopio di dissezione. Assicurati che il cervello sia sdraiato in piano e sia visibile attraverso la cuticola. Spesso, il cervello sarà coperto da tessuto adiposo, rendendo impossibile la visualizzazione e l'ablazione cellulare.
- Per spostare il tessuto adiposo che copre il cervello, applicare una leggera pressione sul vetrino coprioggetti con una pinza e spostare il vetrino coprioggetti da un lato all'altro. Se il tessuto adiposo non può essere allontanato dal cervello in questo modo, usa invece una larva diversa.
4. Individuazione delle celle target
NOTA: Il sistema multi-fotone utilizzato per questo studio è stato montato su un microscopio verticale. È stato utilizzato un software specifico del sistema per controllare le impostazioni di acquisizione e stimolazione laser. Il sistema è stato dotato di una sorgente luminosa a epifluorescenza per localizzare i campioni. L'obiettivo era una lente ad immersione in acqua con ingrandimento 25x, una lunga distanza di lavoro di 2 mm e un NA di 1,10.
- Posizionare il campione sul tavolino del microscopio multifotone e utilizzare il filtro GFP per localizzare il campione in modalità epifluorescenza. Per l'ablazione GF, i corpi cellulari possono essere identificati nel cervello, come si vede nella Figura 1A, C, D. Per l'ablazione TTMn, un gruppo di quattro cellule può essere identificato dal lato ventrale nel cordone nervoso ventrale (VNC), come mostrato nella Figura 1A, B. Al termine della messa a fuoco, centrare le celle nel campo visivo e passare alla modalità a 2 fotoni.
5. Impostazione dei parametri di ablazione
- Regola le impostazioni del laser e il guadagno del rivelatore per visualizzare le cellule che esprimono GFP con lo scanner Galvano. Una lunghezza d'onda di 870 nm funziona meglio per visualizzare il segnale GFP. Centrare la cella nel campo visivo.
- Utilizzare una regione circolare di interesse (ROI) per definire l'area per l'ablazione. Assicurarsi che il ROI copra la maggior parte della superficie della cella (Figura 1E, G).
- Impostare il protocollo di ablazione nel software. Impostare un frame di acquisizione, quindi la stimolazione, seguita da un altro frame di acquisizione.
- Avviare l'impostazione della potenza del laser di stimolazione su un valore inferiore (10%-20%) ed eseguire il protocollo di stimolazione. Un'ablazione riuscita può essere riconosciuta da un cerchio chiaro al centro del soma cellulare nella posizione della ROI e da un aumento della fluorescenza che circonda la ROI (Figura 1F).
- Se l'ablazione non ha avuto successo e ha semplicemente sbiancato la cellula (Figura 1H), aumentare la potenza del laser con incrementi del 5% o del numero di loop uno alla volta ed eseguire nuovamente il protocollo. La potenza laser applicata era compresa tra il 10% e il 40% per il sistema utilizzato nel protocollo.
NOTA: Le impostazioni di potenza del laser per l'ablazione dipendono in gran parte dalla profondità in cui si trovano le cellule nel tessuto e da altri fattori come il ripiegamento delle cuticole. Se le celle sono luminose e chiaramente visibili, la potenza del laser sarà all'estremità inferiore dell'intervallo. La potenza del laser sarà diversa per ogni sistema a seconda del modello di laser e dell'età del laser.
- Se l'ablazione non ha avuto successo e ha semplicemente sbiancato la cellula (Figura 1H), aumentare la potenza del laser con incrementi del 5% o del numero di loop uno alla volta ed eseguire nuovamente il protocollo. La potenza laser applicata era compresa tra il 10% e il 40% per il sistema utilizzato nel protocollo.
Figura 1: Identificazione di neuroni per l'ablazione laser in larve intatte di Drosophila L3. (A) Schema della posizione del soma a fibra gigante (GF) nel cervello e del gruppo di motoneuroni contenenti il motoneurone tergotrocanterale (TTMn) nel midollo nervoso ventrale (VNC). (B) Proiezione di massima intensità dell'espressione di guida shakB(lethal)-Gal4 di GFP nel VNC larvale. La linea mediana è indicata dalla linea tratteggiata. Il cerchio indica il gruppo di neuroni contenenti il TTMn che sono bersaglio per l'ablazione laser. Barra della scala: 50 μm. (C) Vista a proiezione parziale del cervello larvale che esprime GFP sotto il controllo di A307-Gal4. Il cerchio indica il soma GF mirato per l'ablazione laser. Barra della scala: 50 μm. (D) Proiezione della massima intensità del cervello con R91H05-Gal4 che guida UAS-GFP. Entrambi i GF (cerchi) sono identificabili per posizione, forma e dimensione. Barra della scala: 50 μm. (E) GF soma vista ingrandita prima dell'ablazione laser. Il cerchio magenta indica la regione target per l'ablazione laser. Barra della scala: 10 μm. (F) GF soma vista ingrandita dopo l'erogazione della potenza laser localizzata e l'ablazione riuscita. Barra della scala: 10 μm. (G) GF soma vista ingrandita prima dell'ablazione laser. Il cerchio magenta indica la regione target per l'ablazione laser. Barra graduata: 10 μm. (H) GF soma vista ingrandita dopo l'erogazione della potenza laser localizzata e l'ablazione non riuscita (sbiancamento). Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Recupero delle larve
- Dopo aver ablato con successo la cella, rimuovere il vetrino coprioggetti e raccogliere delicatamente le larve dal vetrino con un pennello. Metti le larve in una fiala di cibo. Le larve ricominceranno a strisciare entro 30 minuti.
NOTA: Mantenere il tempo della procedura breve migliora i tassi di sopravvivenza degli animali. Con l'esperienza, l'esperimento può essere eseguito in poco meno di 10 minuti. - Continuare ad allevare le larve in condizioni standard fino a quando non si chiudono dall'involucro pupale.
7. Testare la funzionalità del GFS nei moscerini adulti
NOTA: I seguenti passaggi sono spiegati in dettaglio in Allan e Godenschwege12 e Augustin et al.13.
- Testare le mosche adulte all'età di 2-5 giorni dopo l'eclosione. Anestetizzare le mosche con CO2 e montarle sulla cera dentale spingendo le gambe nella cera. Allargare le ali con un angolo di 90° e fissarle in posizione con la cera. Fissare la testa spingendo la proboscide nella cera.
- Posizionare i fili di stimolazione in entrambi gli occhi, un filo di terra nell'addome e gli elettrodi di registrazione in vetro nei muscoli di salto (TTM) su ciascun lato.
- Stimolare il circuito GF con singoli stimoli per misurare la latenza di risposta per entrambi i muscoli. Stimola il circuito con treni di stimoli a 100 Hz e 200 Hz, rispettivamente, per misurare la frequenza successiva per entrambi i muscoli.
8. Dissezione e marcatura del sistema a fibre giganti per l'imaging confocale
NOTA: La dissezione del SNC e l'iniezione di colorante sono descritte in Boerner e Godenschwege14.
- Rimuovere delicatamente la mosca dalla cera dentale con una pinza e trasferirla in una piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico sotto un cannocchiale da dissezione.
- Rimuovi le zampe, le ali e la proboscide con le forbici e usa gli spilli per insetti per fissare la mosca con il lato dorsale rivolto verso l'alto nel rivestimento in elastomero.
- Praticare un'incisione laterale lungo la linea mediana dal medio addome, attraverso l'intero torace e su per il collo, collegando il torace alla testa. Apri la mosca con spilli per insetti. Rimuovere organi e ghiandole dalla mosca senza danneggiare il sistema nervoso.
NOTA: A questo punto, gli assoni GF possono essere iniettati con coloranti per marcare i GF e i neuroni accoppiati elettricamente13. - Rimuovere la capsula cranica dalla testa per esporre il cervello.
9. Immunoistochimica del sistema nervoso
- Dopo la dissezione del SNC, fissare la mosca in PFA al 4% in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare per 20 minuti in PBS a RT (3 volte).
- Bloccare il campione per 1 ora a RT in BSA al 3% in PBS con soluzione detergente allo 0,5%.
- Incubare per 2-3 notti a 4 °C in BSA al 3% in PBS con soluzione detergente allo 0,3% e anti-GFP di coniglio (1:500). Lavare per 20 minuti in PBS a RT (6 volte).
- Incubare per una notte a 4 °C in PBS con Alexa 488 anti-coniglio. Lavare per 20 minuti in PBS a RT (6 volte).
- Disidratare i campioni con una serie di etanolo ascendente (50%, 70%, 90%, 100% etanolo) per 10 minuti ad ogni passaggio. Rimuovi i perni e taglia l'addome e i muscoli del volo. Trasferire il resto del torace contenente il sistema nervoso su un vetrino e coprirlo con un mezzo di montaggio come il salicilato di metile. Posizionare un vetrino coprioggetti sul campione e sigillarlo con smalto per unghie.
- Visualizzare il sistema nervoso su un microscopio confocale per analizzare l'anatomia del terminale GF.
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Risultati
Questo metodo può essere utilizzato per manipolare lo sviluppo di specifiche reti neuronali nel sistema nervoso di Drosophila. La domanda principale di ricerca qui era la formazione di connessioni sinaptiche. La rimozione del GF presinaptico o del TTMn postsinaptico ha permesso di studiare la sinaptogenesi reattiva in questa sinapsi centrale e i meccanismi molecolari cruciali per la funzione e lo sviluppo sinaptico. Come descritto nel protocollo, è stata eseguita l'ablazione cellulare laser di uno dei GF o di un...
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Discussione
L'ablazione cellulare con un microscopio a 2 fotoni si è dimostrata un metodo di grande successo per manipolare lo sviluppo del circuito neuronale in Drosophila. Poiché questo metodo non è invasivo, provoca danni minimi all'animale. I dati supportano l'utilità di questa manipolazione cellulo-specifica di circuiti noti.
Fondamentale per il successo dell'ablazione è stata la selezione del driver Gal4 più appropriato. Poiché il GFS è ben studiato, sono state descritte molte linee di driv...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli esperimenti sul microscopio a 2 fotoni sono stati eseguiti presso l'Advanced Cell Imaging Core del FAU Stiles-Nicholson Brain Institute. Ringraziamo la Jupiter Life Science Initiative per il sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Proteina fluorescente anti-verde, coniglio | Fisher Scientific | A11122 | Concentrazione 1:500 |
| Apo LWD 25x/1.10W Obiettivo | Nikon | MRD77220 | immersione in acqua lunga distanza di lavoro |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Batuff | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetrametilrodamina, 10.000 MW, Lisina Fissabile (fluoro-Rubino) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Ricetta salina | di Drosophila da Gu e O'Dowd, 2006 | ||
| Etere etilico | Fisher Scientific | E134-1 | Pericolo, Liquido infiammabile |
| Cibo per mosche B (ricetta Bloomington) | LabExpress | 7001-NV | |
| Salicilato di metile | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Provetta per microcentrifuga 1,5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Vetrino coprioggetto per microscopio 18x18 #1,5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Vettore tracciante di neurobiotina | Laboratori | SP-1120 | |
| Microscopio multi-fotone Nikon A1R | Nikon | su un supporto verticale per microsope FN1 | |
| Elementi NIS Ricerca avanzata | Nikon | Software di acquisizione e analisi dei dati | |
| Paraformaldeide (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Salina tamponata con fosfato) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Compresse |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Vetrino per microscopio Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | soluzione detergente |
| UAS-10xGFP | Bloomington Centro di stoccaggio Drosophila | 32185 |
Riferimenti
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