Articolo metodologico

L'ablazione cellulare laser in larve di Drosophila intatte rivela la competizione sinaptica

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DOI:

10.3791/67053

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26 luglio 2024

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1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra l'ablazione laser di singoli neuroni in larve di Drosophila intatte. Il metodo consente di studiare l'effetto della riduzione della competizione tra i neuroni nel sistema nervoso in via di sviluppo.

Abstract

Il protocollo descrive l'ablazione di un singolo neurone con un sistema laser a 2 fotoni nel sistema nervoso centrale (SNC) di larve intatte di Drosophila melanogaster. Utilizzando questo metodo non invasivo, il sistema nervoso in via di sviluppo può essere manipolato in modo specifico per le cellule. L'interruzione dello sviluppo dei singoli neuroni in una rete può essere utilizzata per studiare come il sistema nervoso può compensare la perdita di input sinaptico. I singoli neuroni sono stati specificamente ablati nel sistema di fibre giganti di Drosophila, con particolare attenzione a due neuroni: la fibra gigante presinaptica (GF) e il motoneurone tergotrocanterale postsinaptico (TTMn). Il GF fa la sinapsi con il TTMn omolaterale, che è cruciale per la risposta di fuga. L'ablazione di uno dei GF nel cervello del terzo stadio, subito dopo che il GF inizia la crescita assonale, rimuove permanentemente la cellula durante lo sviluppo del SNC. Il GF rimanente reagisce al vicino assente e forma un terminale sinaptico ectopico al TTMn controlaterale. Questo terminale atipico, bilateralmente simmetrico, innerva entrambi i TTMn, come dimostrato dall'accoppiamento del colorante, e aziona entrambi i motoneuroni, come dimostrato da saggi elettrofisiologici. In sintesi, l'ablazione di un singolo interneurone dimostra la competizione sinaptica tra una coppia bilaterale di neuroni che può compensare la perdita di un neurone e ripristinare le normali risposte al circuito di fuga.

Introduzione

L'ablazione laser è uno strumento preferito per sezionare i circuiti neurali in un'ampia varietà di organismi. Sviluppato in sistemi genetici modello come vermi e mosche, è stato applicato in tutto il regno animale per studiare la struttura, la funzione e lo sviluppo del sistema nervoso 1,2,3. Qui, l'ablazione di un singolo neurone è stata impiegata per studiare come i neuroni interagiscono durante l'assemblaggio del circuito in Drosophila. Il sistema di fuga della mosca è un circuito preferito per l'analisi perché contiene i neuroni più grandi e le sinapsi più grandi nella mosca adulta, e il circuito è stato ben caratterizzato negli ultimi decenni4. Il ruolo che le interazioni neurone-neurone svolgono nell'assemblaggio del circuito della Giant Fiber è un punto focale di questa ricerca.

Un tipo di interazione che è stato un punto focale nelle neuroscienze sin dal lavoro di Hubel e Wiesel negli anni '60 è la "competizione sinaptica"5,6. In questo protocollo, l'ablazione laser è stata utilizzata per rivisitare il ruolo della competizione attraverso l'ablazione a singola cellula nel sistema di fibre giganti (GFS) di Drosophila, dove potrebbero essere scoperte le basi molecolari del fenomeno.

L'ablazione dei neuroni nel moscerino in via di sviluppo è stata difficile per una serie di motivi, tra cui la visualizzazione dei neuroni bersaglio, la precisione del metodo di ablazione e la sopravvivenza del campione. Per superare questi problemi nella GFS, il sistema UAS/Gal47 è stato utilizzato per marcare i neuroni di interesse, e un microscopio a due fotoni è stato utilizzato per rimuovere la fibra gigante presinaptica o il motoneurone a salto postsinaptico (TTMn).

In questo studio, per determinare il ruolo che i neuroni bilaterali vicini svolgono nella regolazione della connettività sinaptica e della forza sinaptica nella GFS, una delle coppie bilaterali di neuroni (GF presinaptico o motoneurone postsinaptico) è stata eliminata appena prima dello sviluppo della pupa. In questa fase di sviluppo, l'assonogenesi della GF non è stata completata8. Sono state quindi esaminate la struttura del GF e la funzione del circuito sinaptico nell'adulto, con particolare attenzione all'output del GF rimanente.

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati per il protocollo erano della specie Drosophila melanogaster. Non ci sono problemi etici che circondano l'uso di questa specie. Per svolgere questo lavoro non è stato necessario un nulla osta etico. I dettagli delle specie di Drosophila , dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Allevamento di Drosophila e selezione dello stadio larvale corretto

  1. Scegliere una linea driver Gal4 che guidi l'espressione nelle cellule che devono essere ablate e ricombinarla o attraversarla con una linea reporter UAS-GFP. Allevare le mosche con cibo per mosche standard a 25 °C.
    NOTA: Per l'ablazione della fibra gigante (GF), R91H05-Gal4 o A307-Gal4 è stato ricombinato con UAS-GFP. ShakB(lethal)-GAL4 ricombinato con UAS-GFP è stato utilizzato per le ablazioni TTMn (vedi Tabella dei materiali).
  2. Seleziona le larve che hanno iniziato a emergere dal cibo e strisciano sul lato della fiala di cibo. Queste larve sono nella fase errante, che è la fase preferita per eseguire l'ablazione delle cellule GF.
    NOTA: L'ablazione può essere eseguita in qualsiasi stadio larvale. L'ultimo stadio larvale è stato importante per la manipolazione dello sviluppo del GFS perché i corpi cellulari del GF possono essere facilmente identificati nel cervello, ma gli assoni del GF non hanno stabilito connessioni con i loro bersagli in questa fase.

2. Preparazione della larva del 3° stadio

NOTA: Le larve sono state anestetizzate utilizzando un metodo simile a Burra et al.9. Per ridurre i tempi della procedura, preparare solo una larva alla volta. Una breve esposizione all'anestetico migliorerà la sopravvivenza degli animali da esperimento10.

  1. Prepara un piatto di vetro con un coperchio ben aderente. Metti un batuffolo di cotone nel piatto e, sotto una cappa aspirante, aggiungi circa 3-5 ml di etere etilico (liquido pericoloso e infiammabile, camice da laboratorio, guanti, occhiali). Coprite il piatto con il coperchio.
  2. Raccogli le singole larve del 3° stadio dalle fiale di mosca. Al 3° stadio larvale, le larve lasciano il mezzo alimentare e strisciano lungo il lato della fiala di cibo11.
    1. Assicurati che le larve siano ancora in movimento e non abbiano iniziato la formazione del pupario. Le larve che sono stazionarie e mostrano un accorciamento del corpo iniziano la pupa e non sono adatte all'ablazione. Raccogli le larve con un piccolo pennello.
      NOTA: Il 3° stadio larvale inizia dopo la seconda muta a 72 ore di sviluppo (dopo la deposizione delle uova) e dura fino alla formazione del pupario a 120 ore per le mosche allevate a 25 °C.
  3. Trasferisci una larva in un piccolo contenitore aperto. Mettere il contenitore nel piatto di vetro con etere etilico e chiudere bene il piatto. Quando si apre il piatto di vetro, posizionarlo sotto un boccaglio o in una cappa aspirante per evitare la fuoriuscita dei fumi.
    1. A intervalli di 30 s, rimuovere il coperchio con la larva dalla piastra e controllare la mobilità della larva al microscopio da dissezione. La larva viene generalmente immobilizzata entro 1 minuto. Una volta che i ganci della bocca smettono di contrarsi, la larva è pronta per il montaggio. Scartare le larve che non sono completamente immobilizzate dopo 3 minuti.
      NOTA: La parte superiore di un coperchio capovolto di una provetta per microcentrifuga (coperchio rimosso dalla provetta) può essere utilizzata come contenitore.

3. Montaggio delle larve su vetrini per l'ablazione

  1. Posizionare la larva anestetizzata su un vetrino da microscopio. Immergere la larva in una goccia di soluzione salina per insetti; Questo laverà via alcuni dei residui di cibo che potrebbero attaccarsi alla larva.
  2. Sotto il microscopio di dissezione, rimuovere la maggior parte della soluzione salina con un fazzoletto di carta. Posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto per l'ablazione GF o con il lato ventrale rivolto verso l'alto per l'ablazione TTMn. Abbassa lentamente un vetrino coprioggetti sulla larva. Aggiungere soluzione fisiologica sul lato del vetrino coprioggetti per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino.
  3. Per l'ablazione GF, controllare il posizionamento del cervello ad alto ingrandimento sul microscopio di dissezione. Assicurati che il cervello sia sdraiato in piano e sia visibile attraverso la cuticola. Spesso, il cervello sarà coperto da tessuto adiposo, rendendo impossibile la visualizzazione e l'ablazione cellulare.
    1. Per spostare il tessuto adiposo che copre il cervello, applicare una leggera pressione sul vetrino coprioggetti con una pinza e spostare il vetrino coprioggetti da un lato all'altro. Se il tessuto adiposo non può essere allontanato dal cervello in questo modo, usa invece una larva diversa.

4. Individuazione delle celle target

NOTA: Il sistema multi-fotone utilizzato per questo studio è stato montato su un microscopio verticale. È stato utilizzato un software specifico del sistema per controllare le impostazioni di acquisizione e stimolazione laser. Il sistema è stato dotato di una sorgente luminosa a epifluorescenza per localizzare i campioni. L'obiettivo era una lente ad immersione in acqua con ingrandimento 25x, una lunga distanza di lavoro di 2 mm e un NA di 1,10.

  1. Posizionare il campione sul tavolino del microscopio multifotone e utilizzare il filtro GFP per localizzare il campione in modalità epifluorescenza. Per l'ablazione GF, i corpi cellulari possono essere identificati nel cervello, come si vede nella Figura 1A, C, D. Per l'ablazione TTMn, un gruppo di quattro cellule può essere identificato dal lato ventrale nel cordone nervoso ventrale (VNC), come mostrato nella Figura 1A, B. Al termine della messa a fuoco, centrare le celle nel campo visivo e passare alla modalità a 2 fotoni.

5. Impostazione dei parametri di ablazione

  1. Regola le impostazioni del laser e il guadagno del rivelatore per visualizzare le cellule che esprimono GFP con lo scanner Galvano. Una lunghezza d'onda di 870 nm funziona meglio per visualizzare il segnale GFP. Centrare la cella nel campo visivo.
  2. Utilizzare una regione circolare di interesse (ROI) per definire l'area per l'ablazione. Assicurarsi che il ROI copra la maggior parte della superficie della cella (Figura 1E, G).
  3. Impostare il protocollo di ablazione nel software. Impostare un frame di acquisizione, quindi la stimolazione, seguita da un altro frame di acquisizione.
  4. Avviare l'impostazione della potenza del laser di stimolazione su un valore inferiore (10%-20%) ed eseguire il protocollo di stimolazione. Un'ablazione riuscita può essere riconosciuta da un cerchio chiaro al centro del soma cellulare nella posizione della ROI e da un aumento della fluorescenza che circonda la ROI (Figura 1F).
    1. Se l'ablazione non ha avuto successo e ha semplicemente sbiancato la cellula (Figura 1H), aumentare la potenza del laser con incrementi del 5% o del numero di loop uno alla volta ed eseguire nuovamente il protocollo. La potenza laser applicata era compresa tra il 10% e il 40% per il sistema utilizzato nel protocollo.
      NOTA: Le impostazioni di potenza del laser per l'ablazione dipendono in gran parte dalla profondità in cui si trovano le cellule nel tessuto e da altri fattori come il ripiegamento delle cuticole. Se le celle sono luminose e chiaramente visibili, la potenza del laser sarà all'estremità inferiore dell'intervallo. La potenza del laser sarà diversa per ogni sistema a seconda del modello di laser e dell'età del laser.

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Figura 1: Identificazione di neuroni per l'ablazione laser in larve intatte di Drosophila L3. (A) Schema della posizione del soma a fibra gigante (GF) nel cervello e del gruppo di motoneuroni contenenti il motoneurone tergotrocanterale (TTMn) nel midollo nervoso ventrale (VNC). (B) Proiezione di massima intensità dell'espressione di guida shakB(lethal)-Gal4 di GFP nel VNC larvale. La linea mediana è indicata dalla linea tratteggiata. Il cerchio indica il gruppo di neuroni contenenti il TTMn che sono bersaglio per l'ablazione laser. Barra della scala: 50 μm. (C) Vista a proiezione parziale del cervello larvale che esprime GFP sotto il controllo di A307-Gal4. Il cerchio indica il soma GF mirato per l'ablazione laser. Barra della scala: 50 μm. (D) Proiezione della massima intensità del cervello con R91H05-Gal4 che guida UAS-GFP. Entrambi i GF (cerchi) sono identificabili per posizione, forma e dimensione. Barra della scala: 50 μm. (E) GF soma vista ingrandita prima dell'ablazione laser. Il cerchio magenta indica la regione target per l'ablazione laser. Barra della scala: 10 μm. (F) GF soma vista ingrandita dopo l'erogazione della potenza laser localizzata e l'ablazione riuscita. Barra della scala: 10 μm. (G) GF soma vista ingrandita prima dell'ablazione laser. Il cerchio magenta indica la regione target per l'ablazione laser. Barra graduata: 10 μm. (H) GF soma vista ingrandita dopo l'erogazione della potenza laser localizzata e l'ablazione non riuscita (sbiancamento). Barra della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Recupero delle larve

  1. Dopo aver ablato con successo la cella, rimuovere il vetrino coprioggetti e raccogliere delicatamente le larve dal vetrino con un pennello. Metti le larve in una fiala di cibo. Le larve ricominceranno a strisciare entro 30 minuti.
    NOTA: Mantenere il tempo della procedura breve migliora i tassi di sopravvivenza degli animali. Con l'esperienza, l'esperimento può essere eseguito in poco meno di 10 minuti.
  2. Continuare ad allevare le larve in condizioni standard fino a quando non si chiudono dall'involucro pupale.

7. Testare la funzionalità del GFS nei moscerini adulti

NOTA: I seguenti passaggi sono spiegati in dettaglio in Allan e Godenschwege12 e Augustin et al.13.

  1. Testare le mosche adulte all'età di 2-5 giorni dopo l'eclosione. Anestetizzare le mosche con CO2 e montarle sulla cera dentale spingendo le gambe nella cera. Allargare le ali con un angolo di 90° e fissarle in posizione con la cera. Fissare la testa spingendo la proboscide nella cera.
  2. Posizionare i fili di stimolazione in entrambi gli occhi, un filo di terra nell'addome e gli elettrodi di registrazione in vetro nei muscoli di salto (TTM) su ciascun lato.
  3. Stimolare il circuito GF con singoli stimoli per misurare la latenza di risposta per entrambi i muscoli. Stimola il circuito con treni di stimoli a 100 Hz e 200 Hz, rispettivamente, per misurare la frequenza successiva per entrambi i muscoli.

8. Dissezione e marcatura del sistema a fibre giganti per l'imaging confocale

NOTA: La dissezione del SNC e l'iniezione di colorante sono descritte in Boerner e Godenschwege14.

  1. Rimuovere delicatamente la mosca dalla cera dentale con una pinza e trasferirla in una piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico sotto un cannocchiale da dissezione.
  2. Rimuovi le zampe, le ali e la proboscide con le forbici e usa gli spilli per insetti per fissare la mosca con il lato dorsale rivolto verso l'alto nel rivestimento in elastomero.
  3. Praticare un'incisione laterale lungo la linea mediana dal medio addome, attraverso l'intero torace e su per il collo, collegando il torace alla testa. Apri la mosca con spilli per insetti. Rimuovere organi e ghiandole dalla mosca senza danneggiare il sistema nervoso.
    NOTA: A questo punto, gli assoni GF possono essere iniettati con coloranti per marcare i GF e i neuroni accoppiati elettricamente13.
  4. Rimuovere la capsula cranica dalla testa per esporre il cervello.

9. Immunoistochimica del sistema nervoso

  1. Dopo la dissezione del SNC, fissare la mosca in PFA al 4% in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare per 20 minuti in PBS a RT (3 volte).
  2. Bloccare il campione per 1 ora a RT in BSA al 3% in PBS con soluzione detergente allo 0,5%.
  3. Incubare per 2-3 notti a 4 °C in BSA al 3% in PBS con soluzione detergente allo 0,3% e anti-GFP di coniglio (1:500). Lavare per 20 minuti in PBS a RT (6 volte).
  4. Incubare per una notte a 4 °C in PBS con Alexa 488 anti-coniglio. Lavare per 20 minuti in PBS a RT (6 volte).
  5. Disidratare i campioni con una serie di etanolo ascendente (50%, 70%, 90%, 100% etanolo) per 10 minuti ad ogni passaggio. Rimuovi i perni e taglia l'addome e i muscoli del volo. Trasferire il resto del torace contenente il sistema nervoso su un vetrino e coprirlo con un mezzo di montaggio come il salicilato di metile. Posizionare un vetrino coprioggetti sul campione e sigillarlo con smalto per unghie.
  6. Visualizzare il sistema nervoso su un microscopio confocale per analizzare l'anatomia del terminale GF.

Risultati

Questo metodo può essere utilizzato per manipolare lo sviluppo di specifiche reti neuronali nel sistema nervoso di Drosophila. La domanda principale di ricerca qui era la formazione di connessioni sinaptiche. La rimozione del GF presinaptico o del TTMn postsinaptico ha permesso di studiare la sinaptogenesi reattiva in questa sinapsi centrale e i meccanismi molecolari cruciali per la funzione e lo sviluppo sinaptico. Come descritto nel protocollo, è stata eseguita l'ablazione cellulare laser di uno dei GF o di uno dei TTMn e sono stati analizzati gli effetti sulla sinapsi dopo lo sviluppo della pupa nel moscerino adulto.

Per garantire che la procedura non abbia un effetto negativo sulla sopravvivenza degli animali, sono state eseguite simulazioni di ablazione in parallelo. Per le ablazioni simulate, gli animali sono stati trattati allo stesso modo degli animali da esperimento, ma gli impulsi laser sono stati erogati con una potenza laser dello 0%. Nell'82,4% dei casi, gli animali provenienti da simulazioni ablazioni si sono trasformati in mosche adulte. I GF dei moscerini finti ablati sono stati in grado di rispondere con una latenza inferiore a 1 ms e seguire una stimolazione a 100 Hz per il 79,3% degli stimoli. L'anatomia della GF era indistinguibile dalle mosche non trattate.

Per ogni animale da esperimento, l'ablazione è stata verificata anatomicamente. Negli animali ablati con GF, il GF non ablato è stato iniettato con colorante e sottoposto a imaging (vedi sotto). Se solo un assone GF era visibile nel connettivo cervicale (CvC), si presumeva l'ablazione dell'altro GF. L'ablazione potrebbe anche essere verificata attraverso l'assenza di un soma marcato con GFP sul lato ablato del cervello (Figura 2A, cerchio). Per valutare l'ablazione di TTMn, è stato analizzato il segnale GFP nel VNC adulto, dove il soma TTMn e il dendrite possono essere facilmente identificati. L'assenza del TTMn su un lato è stata facilmente riconosciuta a causa della mancanza di soma e dendriti (Figura 2B, cerchio).

Per testare la funzione del GFS nei moscerini trattati, sono stati registrati potenziali sinaptici dai muscoli del salto12,13, che sono innervati dal TTMn (Figura 3A). I GF formano una sinapsi elettrochimica mista con il dendrite mediale15 TTMn. Il terminale GF non è ramificato e mostra una tipica curvatura laterale che si oppone al dendrite TTMn nella regione sinaptica (Figura 3D, Figura 4A punta di freccia). Nelle mosche di controllo, ogni GF innerva esclusivamente il suo motoneurone omolaterale. Nelle registrazioni dalle fibre TTM, la forza della connessione è stata valutata analizzando la latenza di risposta alla stimolazione a 1 Hz e la frequenza successiva alla stimolazione a 100 Hz (Figura 3B, C). I moscerini di controllo hanno mostrato una latenza media di risposta inferiore a 1 ms e potevano seguire una stimolazione a 100 Hz per il 78,1% degli stimoli (Figura 3B). Dopo che sono state eseguite le registrazioni fisiologiche, il campione è stato sezionato per rivelare il SNC e i GF, che sono stati iniettati con un colorante con una miscela di TRITC-destrano e neurobiotina. La grande molecola di destrano etichetta l'assone e il terminale del GF ma non passa attraverso le giunzioni gap. La neurobiotina può attraversare le giunzioni gap tra GF e TTMn e il segnale della neurobiotina è stato rilevato nel dendrite postsinaptico (Figura 3E, F, punte di freccia). Questo accoppiamento del colorante della neurobiotina ha confermato l'accoppiamento elettrico tra i due neuroni. La neurobiotina può essere rilevata anche in molti altri neuroni del VNC che sono collegati attraverso giunzioni gap al GF16 (Figura 3E, F).

Gli stessi test fisiologici e anatomici sono stati eseguiti dopo l'ablazione di un GF in L3. L'assone della maggior parte (13/15) dei restanti GF nei moscerini di ablazione mostra una divisione del terminale in due rami: uno nella solita posizione omolaterale e uno che attraversa la linea mediana in una posizione omologa controlaterale al GF intatto (Figura 3G, freccia). Ogni ramo è stato accoppiato con colorante a uno dei dendriti TTMn (Figura 3H, I, punte di freccia). Le registrazioni fisiologiche dei TTM hanno confermato questa connessione sinaptica di un GF a entrambi i TTMn, anche se più debolmente del normale. Le latenze di risposta TTM erano superiori a 1 ms per entrambi i lati e le frequenze successive a 100 Hz erano del 37,1% per il TTMn omolaterale al GF intatto e del 28% per il TTM controlaterale (Figura 3C).

Poiché l'ablazione di un GF ha causato l'innervazione di entrambi i neuroni bersaglio rimanenti, l'esperimento successivo mirava ad osservare la risposta dei GF vicini quando uno mancava di un normale motoneurone bersaglio omolaterale. Per questo esperimento, uno dei neuroni postsinaptici è stato eliminato e sono state valutate l'anatomia e la funzione del TTMn rimanente, nonché la morfologia dei terminali GF. Quando si visualizzavano sia i TTMn che i GF negli animali adulti di controllo, la regione del presunto contatto sinaptico era chiaramente visibile (Figura 4A, punte di freccia). Ogni dendrite mediale TTMn è stato apposto al terminale presinaptico GF omolaterale. Piccole proiezioni di dendriti TTMn da entrambi i lati erano a contatto con la linea mediana (Figura 4C; riquadro). L'accoppiamento del colorante con la neurobiotina era notevolmente visibile in entrambi i TTMn (Figura 4D, punte di freccia).

Quando un TTMn è stato ablato, la morfologia del dendrite mediale TTMn rimanente è stata modificata. Il dendrite mediale in questi esemplari estendeva un ramo lungo e spesso lungo la linea mediana (Figura 4I, K; frecce gialle). Inoltre, le sporgenze più sottili verso entrambi i terminali GF si estendevano anteriormente (Figura 4E, G; punte di freccia gialle). Il GF, omolaterale al TTMn, mostrava la sua consueta anatomia con un terminale che sporgeva lungo il dendrite TTMn.

La risposta del GF "orfano" privo di un motoneurone bersaglio è stata di primario interesse. Nella maggior parte dei casi (61,5% degli animali), il GF orfano mostrava un terminale diviso con un terminale sul lato omolaterale e l'altro terminale che attraversava la linea mediana e sporgeva verso il dendrite TTMn controlaterale (Figura 4J, frecce). Questi rami incrociati del GF erano sempre più piccoli di quelli osservati nell'esperimento complementare quando il GF vicino è stato ablato (Figura 3F). Il terminale omolaterale entrava in contatto con il ramo TTMn che si estendeva lungo la linea mediana (Figura 4I, freccia gialla). Nel 23% dei campioni, il GF orfano ha attraversato la linea mediana (Figura 4F, freccia) e si è proiettato lungo uno dei rami anteriori del TTMn (Figura 4E, punte di freccia gialle) ed è stato accoppiato con colorante al TTMn rimanente (Figura 4H, punta di freccia).

Altri due fenotipi sono stati osservati nei moscerini per l'ablazione TTMn (Figura 4M). In un moscerino su 13, entrambe le GF hanno fatto la curva normale e sono rimaste sui rispettivi lati del sistema nervoso. In un altro caso, la GF orfana mostrava il fenotipo binfinito, in cui la GF orfana non creava un terminale e si fermava prima dell'area in cui di solito si piega. Per tutti e quattro i fenotipi, le registrazioni TTM sul lato del TTMn intatto erano paragonabili alla fisiologia del wildtype (WT) con latenza di risposta inferiore a 1 ms e frequenza successiva a 100 Hz al 100% o vicina al 100%. La rimozione di un target può consentire a entrambi i GF di condividere il TTMn di target rimanente. Nella maggior parte dei casi, entrambi i GF stabiliranno una connessione con il TTMn rimanente. Generalmente, la GF orfana mostrerà un terminale bilaterale. Nelle mosche di controllo, i GF non attraverseranno mai la linea mediana; tuttavia, in circa l'85% dei moscerini di ablazione TTMn, un GF ha attraversato la linea mediana per entrare in contatto con il TTMn controlaterale. L'innervazione di un TTMn da parte di due GF non ha influenzato negativamente la funzione sinaptica.

È interessante notare che l'assenza del GF vicino ha un effetto maggiore rispetto all'assenza del motoneurone bersaglio. Il terminale bilaterale formato in assenza del GF controlaterale è molto più grande e più ovviamente funzionale rispetto ai cambiamenti quando il bersaglio viene rimosso.

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Figura 2: Esempi di ablazioni riuscite nel SNC adulto. (A) Proiezione della massima intensità di un cervello di mosca adulto dopo l'ablazione larvale con GF. GFP (verde) è guidato da A307-GAL4. Il cerchio indica l'area in cui manca la GF ablata. La punta della freccia punta verso il GF rimanente che esprime GFP sull'altro lato del cervello. Il GF è stato riempito con TRITC-destrano (rosso). L'assone sporge posteriormente verso il VNC. Barra della scala: 20 μm. (B) Proiezione dell'intensità massima di un VNC adulto in cui un TTMn è stato ablato in L3. Il TTMn rimanente (punta di freccia) esprime GFP sotto il driver shakB (letale). L'area del TTMn mancante è indicata dal cerchio. Barra della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: L'ablazione larvale di una fibra gigante (GF) provoca la ramificazione bilaterale del terminale presinaptico del GF rimanente. (A) Schema del setup sperimentale per testare la struttura e la funzione del sistema di fibre giganti adulte (GFS). L'elettrodo di registrazione misura la latenza e la successiva frequenza delle uscite del motoneurone tergotrocanterale (TTMn) ai muscoli tergotrocanterali (TTM) in seguito alla stimolazione del cervello nell'animale intatto. Dopo la dissezione del sistema nervoso, il colorante è stato iniettato negli assoni GF al connettivo cervicale (CvC). (B,C) Tracce di esempio per la latenza di risposta TTM e la frequenza successiva a 100 Hz (n rappresenta il numero di TTM registrati da ciascuna situazione con la latenza media e la frequenza successiva mostrate). (B) Gli animali di controllo con due GF intatti mostrano latenze TTM inferiori a 1 ms e frequenze successive vicine al 100% a 100 Hz. (C) Il singolo GF rimanente negli animali ablati innerva entrambi i TTMn. Le latenze per entrambi i TTMn sono più lunghe rispetto ai controlli e, dopo 100 Hz, la frequenza è significativamente diminuita. (D-I) Proiezione della massima intensità di pile di immagini confocali per GF riempiti di colorante. TRITC-destrano (D,G,F,I in rosso) e neurobiotina (E,H,F,I in grigio) sono stati co-iniettati. La neurobiotina può attraversare le giunzioni gap tra il GF e il TTMn, marcando i neuroni postsinaptici. Le linee tratteggiate indicano la linea mediana. (D) Anatomia tipica della GF degli animali di controllo con la curva terminale. (E,F) La neurobiotina marca, molti neuroni postsinaptici accoppiati elettricamente ai GF. I dendriti TTMn trans sinapticamente marcati sono indicati da punte di freccia. (G) Dopo l'ablazione, il GF rimanente sviluppa un terminale extra (freccia), che attraversa la linea mediana per innervare il TTMn controlaterale. (H,I) Entrambi i TTMn (punte di freccia) sono accoppiati con colorante allo stesso GF. Barre della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. L'ablazione larvale di un motoneurone tergotrocanterale (TTMn) provoca l'innervazione del TTMn rimanente da parte di entrambe le fibre giganti (GF). (A-L) Le proiezioni di massima intensità di pile di immagini confocali di TTMn marcate con GFP (verde) sotto il controllo di shakB(lethal)-Gal4 e le GF sono state riempite con TRITC-destrano (magenta) e neurobiotina (rosso). La linea tratteggiata indica la linea mediana del sistema nervoso. (A-D) Campioni di controllo con entrambi i TTMn intatti. I GF fanno la loro tipica curvatura terminale lontano dalla linea mediana per contattare il TTMn (A,B), e ogni GF entra in contatto con un TTMn. I dendriti TTMn si incontrano sulla linea mediana (C). Ogni GF è colorante accoppiato al suo TTMn (D, punte di freccia bianche). (E-H) Il TTMn sinistro è stato ablato. Il dendrite mediale del TTMn rimanente sporge lungo la linea mediana (G, freccia gialla). Il GF orfano attraversa la linea mediana (freccia bianca) nella regione sinaptica e contatta il dendrite TTMn controlaterale (E,F). I GF sono accoppiati con colorante al TTMn rimanente (H, punta di freccia). (I-L) Esempio di un altro fenotipo GF in cui il TTMn sinistro è stato ablato. Il dendrite mediale del TTMn rimanente sporge lungo la linea mediana (I e K, freccia gialla). Il GF orfano sinistro forma un terminale bilaterale; un ramo sporge controlateralmente e l'altro rimane omolaterale (J, frecce) per connettersi al TTMn. Barre di scala: 20 μm. (M) Schema dei quattro diversi fenotipi GF osservati negli animali in ablazione TTMn. n indica il numero di animali in ogni classe. Vengono fornite le medie con errore standard per la latenza di risposta TTM e la frequenza successiva (FF) a 100 Hz per il lato del TTMn intatto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'ablazione cellulare con un microscopio a 2 fotoni si è dimostrata un metodo di grande successo per manipolare lo sviluppo del circuito neuronale in Drosophila. Poiché questo metodo non è invasivo, provoca danni minimi all'animale. I dati supportano l'utilità di questa manipolazione cellulo-specifica di circuiti noti.

Fondamentale per il successo dell'ablazione è stata la selezione del driver Gal4 più appropriato. Poiché il GFS è ben studiato, sono state descritte molte linee di driver Gal4 specifiche7. La maggior parte dei driver Gal4 sono molto limitati ma ancora espressi in molti altri neuroni. Una sfida è stata quella di identificare in modo affidabile le cellule bersaglio nell'animale intatto. Per gli animali con un'etichetta GFP chiaramente visibile, l'ablazione poteva essere eseguita a bassa potenza laser e spesso richiedeva solo una prova. Negli animali in cui il tessuto adiposo copriva il cervello o l'espressione della GFP era debole, la delezione delle cellule bersaglio richiedeva una maggiore potenza laser e più loop di esposizione laser. I corpi cellulari GF si trovavano a circa 100 μm di profondità dal lato dorsale del cervello. Per gli esperimenti in cui le cellule bersaglio si trovano a una profondità maggiore, potrebbe essere utile eseguire l'ablazione negli stadi larvali più precoci, quando il sistema nervoso è più piccolo.

In precedenti esperimenti in laboratorio, sono stati esplorati diversi metodi per l'ablazione cellulare. L'utilizzo del sistema UAS/Gal4 per guidare l'espressione delle tossine ha anche portato alla delezione di neuroni specifici. Tuttavia, è molto più difficile controllare la delezione di singole cellule ed evitare effetti fuori bersaglio. L'altra difficoltà è controllare la tempistica esatta dell'evento di delezione cellulare. L'ablazione cellulare laser ha consentito un controllo preciso sulla posizione target e sui tempi di delezione, ma c'erano ancora alcune sfide da superare prima che il metodo fosse perfezionato e fossero raggiunte percentuali di successo superiori all'80% (sopravvivenza animale e ablazione cellulare riuscita). Il tasso di sopravvivenza degli animali è stato influenzato negativamente dalla lunga esposizione all'etere etilico e dai lunghi tempi di procedura. Gli studi hanno dimostrato che è possibile ottenere alti tassi di sopravvivenza all'impupamento (78%) e all'eclosion negli adulti (67%) con un'esposizione di 3,5 minuti delle larve di Drosophila L3 all'etere etilico10. L'esposizione per 3,5 minuti assicurerà che l'animale rimanga immobile per un massimo di 8 ore. Per l'ablazione cellulare laser, gli animali devono rimanere immobili per 30 minuti o meno. Pertanto, il tempo di esposizione all'etere etilico può essere mantenuto ben al di sotto di 3,5 minuti. Nella maggior parte dei casi, le larve erano completamente immobili entro 1 minuto.

I risultati dell'ablazione laser dimostrano che il GF può essere ablato in modo pulito e l'effetto sul GF controlaterale adiacente è facilmente valutabile. Il risultato dell'ablazione è stato chiaro e coerente. In 13 delle 15 ablazioni a singola cellula, i restanti partner GF mostrano un terminale bilaterale che non è mai stato osservato negli animali di controllo. Questo terminale bilateralmente simmetrico è facilmente riconoscibile e l'insolito ramo controlaterale è di dimensioni simili a un terminale normale ed è accoppiato al motoneurone bersaglio controlaterale. Il terminale bilaterale è accoppiato a colorante a entrambi i motoneuroni bersaglio e funziona quasi wildtype nella maggior parte dei campioni, guidando sia il motoneurone bersaglio normale-omolaterale che il motoneurone bersaglio controlaterale con latenze e frequenze successive vicine ai valori di controllo.

L'esperimento complementare, un'ablazione unilaterale di un motoneurone bersaglio, fornisce un confronto interessante. Il motoneurone rimanente mostra spesso una crescita dendritica reattiva, estendendo un processo attraverso la linea mediana nello spazio normalmente occupato dal vicino eliminato. Sebbene questo dendrite non sia grande come quello eliminato, dimostra una reazione simile a quella dei GF che mancano del loro compagno bilaterale. Al contrario, il GF ora privo di bersaglio risponde solo modestamente al bersaglio assente, estendendo processi minori lungo la linea mediana e lungo i restanti dendriti dei motoneuroni. Questa modesta risposta contrasta nettamente con la drammatica risposta del GF a un GF bilateralmente omologo mancante, in cui si forma un grande terminale controlaterale per completare il terminale normale e formare un terminale bilaterale.

Recentemente è stato condotto un esperimento di ablazione parallela sugli input presinaptici del GF nel cervello, dove è stato rivelato un tipo simile di "competizione" per lo spazio sinaptico17. Gli input visivi al GF affiancano il glomerulo dove i neuroni di proiezione visiva (VPN) raggiungono i dendriti GF. L'eliminazione di un gruppo di VPN (in questo caso geneticamente) dimostra che le VPN rimanenti prendono il sopravvento e innervano parte dello spazio sinaptico del vicino assente e producono un recupero fisiologico compensatorio della risposta visiva agli stimoli incombenti. Quando le prime afferenze arrivate vengono eliminate, quelle arrivate più tardi occupano spazio e non sono più occupate. La principale somiglianza fenomenologica con il presente lavoro è l'apparente ruolo che l'occupazione fisica gioca nel determinare l'equilibrio tra i vari input. I terminali di uscita dei due GF sembrano competere tra loro per lo spazio sinaptico fisico.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli esperimenti sul microscopio a 2 fotoni sono stati eseguiti presso l'Advanced Cell Imaging Core del FAU Stiles-Nicholson Brain Institute. Ringraziamo la Jupiter Life Science Initiative per il sostegno finanziario.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Proteina fluorescente anti-verde, coniglioFisher ScientificA11122Concentrazione 1:500
Apo LWD 25x/1.10W ObiettivoNikonMRD77220immersione in acqua lunga distanza di lavoro
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BatuffGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetrametilrodamina, 10.000 MW, Lisina Fissabile (fluoro-Rubino)Fisher ScientificD1817
Ricetta salinadi Drosophila da Gu e O'Dowd, 2006
Etere etilicoFisher ScientificE134-1Pericolo, Liquido infiammabile
Cibo per mosche B (ricetta Bloomington)LabExpress7001-NV
Salicilato di metileFisher ScientificO3695-500
Provetta per microcentrifuga 1,5 mLEppendorf22363204
Vetrino coprioggetto per microscopio 18x18 #1,5Fisher Scientific12-541A
Vettore tracciante di neurobiotina LaboratoriSP-1120
Microscopio multi-fotone Nikon A1RNikonsu un supporto verticale per microsope FN1
Elementi NIS Ricerca avanzataNikonSoftware di acquisizione e analisi dei dati
Paraformaldeide (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Salina tamponata con fosfato)Fisher BioReagentsBP2944-100Compresse
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Vetrino per microscopio SuperfrostFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000soluzione detergente
UAS-10xGFPBloomington Centro di stoccaggio Drosophila32185

Riferimenti

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
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  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
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  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
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  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

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