Method Article

Modello in vitro per lo studio del differenziamento e dei cambiamenti di multi-omiche su cellule epiteliali delle vie aeree murine stimolate con estratto di fumo di sigaretta

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

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Qui, descriviamo un modello in vitro per isolare e differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree murine, concentrandosi sulla loro acclimatazione all'estratto di fumo di sigaretta cronico (CSE). Il modello potrebbe essere utilizzato per caratterizzare in modo completo l'impatto multi-omico della CSE, che potrebbe fornire informazioni sulle risposte cellulari in condizioni di esposizione cronica al fumo.

Abstract

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La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è in gran parte attribuita all'esposizione al fumo di tabacco. Studiare come le cellule epiteliali delle vie aeree si adattano funzionalmente al fumo di tabacco è fondamentale per comprendere la patogenesi della BPCO. Il presente studio consisteva nella creazione di un modello in vitro utilizzando cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine per imitare l'impatto del fumo di tabacco nella vita reale. A differenza delle linee cellulari consolidate, le cellule primarie conservano proprietà più simili a quelle in vivo, tra cui i modelli di crescita, l'invecchiamento e la differenziazione. Queste cellule mostrano una risposta infiammatoria sensibile e una differenziazione efficiente, rappresentando così da vicino le condizioni fisiologiche. In questo modello, le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine sono state coltivate per 28 giorni sotto un'interfaccia aria-liquido con una concentrazione ottimale di estratto di fumo di sigaretta (CSE), che ha portato alla trasformazione di un monostrato di cellule indifferenziate in un epitelio colonnare pseudostratificato, indicativo dell'acclimatazione al CSE. Sono state quindi applicate analisi multi-omiche complete per chiarire i meccanismi con cui la CSE influenza la differenziazione delle cellule delle vie aeree basali. Queste intuizioni forniscono una comprensione più profonda dei processi cellulari alla base della progressione della BPCO in risposta all'esposizione al fumo di tabacco.

Introduction

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La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una condizione polmonare eterogenea con caratteristiche complesse, mentre i pazienti con BPCO tendono gradualmente ad essere più giovani1. Il fumo, un fattore di rischio primario per la BPCO2, ha un profondo impatto sulle cellule epiteliali delle vie aeree, che fungono da barriera iniziale contro il fumo di tabacco. Nonostante questa associazione nota, i meccanismi dettagliati attraverso i quali il fumo di tabacco induce cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree rimangono inadeguatamente esplorati. Una comprensione approfondita di queste alterazioni molecolari è essenziale per identificare i marcatori diagnostici precoci e i bersagli terapeutici per la BPCO.

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un nuovo modello in vitro utilizzando cellule epiteliali murine delle vie aeree. Queste cellule sono state sottoposte a stimolazione a lungo termine con estratto di fumo di sigaretta (CSE), consentendoci di monitorare i cambiamenti cellulari dinamici ed esplorare i cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree sotto stimolazione del tabacco a lungo termine e il meccanismo sottostante. In questo modello, il transwell è stato utilizzato per fornire l'interfaccia aria-liquido delle cellule epiteliali delle vie aeree e l'estratto di fumo di sigaretta è stato stimolato nella fase iniziale della differenziazione delle cellule epiteliali fino alla fine della differenziazione a 28 giorni. Studi precedenti hanno indagato solo la differenziazione e la stimolazione a breve termine delle cellule epiteliali delle vie aeree (dominanza della linea cellulare). Erano limitati a un unico percorso regolatorio 3,4,5,6. Tuttavia, il protocollo qui presentato utilizza cellule epiteliali primarie delle vie aeree di topo e ottimizza il processo di estrazione cellulare per una migliore attività cellulare rispetto ai precedenti metodi di coltura di cellule epiteliali delle vie aeree. Questo modello si concentra sulle alterazioni del differenziamento cellulare insieme ad analisi trascrittomiche, proteomiche, metabolomiche ed epigenomiche complete. Utilizzando l'immunofluorescenza e tecniche multi-omiche avanzate, abbiamo mirato a chiarire le risposte cellulari delle cellule epiteliali delle vie aeree all'esposizione cronica al fumo di tabacco, contribuendo così a una comprensione più profonda della patogenesi della BPCO. Questo modello può essere utilizzato per esplorare i cambiamenti nel modello di differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree e il suo meccanismo causato dalla stimolazione a lungo termine di vari inquinanti.

Protocol

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Il protocollo complessivo richiede 44 giorni, di cui 1 giorno per la preparazione delle cellule epiteliali delle vie aeree isolate da trachee murine, 15 giorni per la proliferazione cellulare e 28 giorni per la stimolazione CSE all'interfaccia aria-liquido. Tutti gli animali da esperimento sono ospitati nella SPF Barrier Animal Room dell'Animal Experiment Center della Capital Medical University e sono stati esaminati e approvati dall'Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee della Capital Medical University (AEEI-2020-100) per soddisfare i requisiti delle linee guida ARRIVE7.

1. Isolamento di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine da trachee murine

  1. Preparazione
    1. Preparare il terreno di espansione completo combinando 1 mL di integratore 50x e 0,05 mL di brodo di idrocortisone con 48,95 mL di terreno basale di espansione. Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.
    2. Sciogliere 7,5 mg di proteinasi e 5 mg di desossiribonucleasi I in 5 mL di F-12 di Ham per preparare una soluzione di proteinasi. Filtrarlo per sterilizzarlo e conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro 4 settimane.
    3. Preparare soluzioni antibiotiche aggiungendo 0,05 mL di 100x penicillina/streptomicina e 0,01 mL di 500x gentamicina/amfotericina a 5 mL di mezzo di espansione completo, PBS e soluzione di proteinasi (100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 10 μg/mL di gentamicina e 0,25 μg/mL di amfotericina B). Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.
    4. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e preparare la cabina di sicurezza biologica per l'isolamento cellulare. Allo stesso tempo, assicurarsi che l'attrezzatura standard per la coltura cellulare sia pronta per l'uso.
    5. Preparare piastre rivestite di collagene con coda di ratto aggiungendo collagene di coda di ratto (100 μg/mL in acido acetico 0,02 N) in piastre di coltura da 100 mm e pozzetti da 24 mm (0,05 mL/cm2). Lasciare aperto per una notte sotto la luce UV per la sterilizzazione.
  2. Isolamento delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine
    1. Utilizzare topi C57BL/6 (6-8 settimane, maschi, con SPF rialzato) per l'isolamento delle cellule epiteliali tracheali. Eutanasia con sovradosaggio di soluzione di pentobarbital sodico all'1% (circa 200 mg/kg). Usa cinque topi per una resa cellulare sufficiente.
    2. Sterilizzare il topo immergendolo in una soluzione di etanolo al 75%, non immergendo il naso e la bocca nell'alcol per evitare che l'alcol fluisca nella trachea.
    3. Seziona il mouse.
      1. Utilizzare lame e pinze chirurgiche, una serie di dispositivi per tagliare e aprire l'epidermide dalla mascella inferiore alla cavità addominale del topo.
      2. Usa un altro set di strumenti chirurgici per strappare le ghiandole tiroidee su entrambi i lati e rimuovere le connessioni tra la trachea, il tessuto muscolare circostante e l'esofago.
      3. Dopodiché, taglia con cura il torace, usa il forcipe per scavare più a fondo nella cavità toracica, estrai l'intero polmone e trova la fine della trachea.
    4. Elabora la trachea.
      1. Tagliare la trachea dalla cartilagine tiroidea al ramo tracheo-bronchiale e metterla in un terreno di espansione pre-freddo contenente quattro antibiotici.
      2. Agitare il tubo per sciacquare quanto più sangue possibile dalla superficie della trachea, tenerlo in ghiaccio e quindi iniziare l'intervento chirurgico per il topo successivo.
    5. Trasferire tutte le trachee raccolte in un tampone PBS pre-freddo contenente quattro antibiotici (200 U/mL di penicillina, 200 U/mL di streptomicina, 20 μg/mL di gentamicina e 0,5 μg/mL di amfotericina B) per il pretrattamento prima della digestione.
    6. Utilizzare una serie di strumenti chirurgici per rimuovere coaguli e altri tessuti dalle superfici della trachea, quindi tagliarli in una dimensione di 1 cm2 .
    7. Incubare il tessuto tracheale in soluzione di proteinasi a 37 °C per 40 min.
    8. Dopo 40 minuti, agitare più volte la provetta e utilizzare un colino cellulare da 40 μm per rimuovere i tessuti rimanenti. Sciacquare le trachee tritate su un colino con 5 ml di terreno di espansione, centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    9. Risospendere le cellule ottenute in 8 mL di terreno di espansione.
    10. Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
    11. Sospensione cellulare su piastra P0 su piastre da 100 mm (1 x 104 cellule vive/cm2) prerivestite con collagene di coda di ratto e coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.

2. Coltura di espansione e passaggio di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine

  1. Sostituire il terreno per la coltura cellulare P0 ogni 3 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 70%-80%, di solito entro 6 giorni. A questo punto, le cellule epiteliali tracheali murine possono formare un monostrato intatto con un aspetto di ciottoli (Figura 1A-D).
  2. Preriscaldare volumi sufficienti di PBS, terreno di espansione completo e kit di dissociazione cellulare privo di componenti animali (ACF) a 37 °C.
  3. Sciacquare delicatamente le cellule con 3 ml di PBS.
  4. Eseguire la dissociazione enzimatica.
    1. Aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica ACF alla piastra e incubare a 37 °C per 5 minuti. Dopo il pipettaggio, rimuovere delicatamente le cellule e trasferire la sospensione cellulare in 3 mL di soluzione di inibizione dell'enzima ACF.
    2. Ripetere l'aggiunta di 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica ACF e incubare nuovamente per 5 minuti per garantire il massimo distacco cellulare.
  5. Far girare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
  6. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di espansione.
  7. Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
  8. Sospensione cellulare su piastra P1 su diverse piastre da 100 mm (5 x 104 cellule vive/cm2) pre-rivestite con collagene di coda di ratto e coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.

3. Differenziamento e stimolazione CSE di cellule epiteliali primarie murine delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido

  1. Confermare il tipo di cella.
    1. Verificare l'origine epiteliale delle cellule isolate utilizzando un test di immunofluorescenza (IFA) con anticorpi contro le citocheratine. Seminare le cellule su vetrini rivestiti di collagene a coda di ratto e utilizzare la paraformaldeide per fissarle per almeno 12 ore dopo che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza.
    2. Lavare i vetrini 3 volte con la soluzione di PBS per 5 minuti e incubarli con il 3% di BSA e lo 0,1% di tritone X-100 in soluzione PBS a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
    3. Incubare i vetrini per una notte a 4 °C con anticorpo commerciale anti-pan citocheratina alla diluizione di 1:500.
    4. Il giorno successivo, lavare i vetrini 3 volte con la soluzione di PBS per 5 minuti e incubarli con tampone anticorpale secondario a una diluizione di 1:1000 a RT per 2 ore al buio.
    5. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini 3 volte con PBS (5 minuti per lavaggio) e aggiungere DAPI a una diluizione di 1:1000. Dopo l'incubazione in RT per 15 minuti, lavare una volta i vetrini con PBS per 5 minuti.
    6. Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza e confrontare i pattern di espressione con un controllo positivo (linea cellulare A549) e un controllo negativo (linea cellulare Raw264.7) (Figura 2).
  2. Semina le cellule per la differenziazione.
    1. Staccare e centrifugare le celle P2 come descritto in precedenza e risospendere il pellet della cella in un volume appropriato di mezzo di espansione per facilitare la placcatura di 1 x 104 cellule vive/cm2.
    2. Pipettare 1 mL di sospensione cellulare sulla camera apicale dell'inserto della membrana in policarbonato transwell. Al compartimento basale del pozzetto trans, aggiungere 1,5 mL di terreno di proliferazione.
  3. Incubare le cellule a 37 °C e cambiare completamente tutto il terreno nelle camere basale e apicale ogni 3 giorni utilizzando il terreno di espansione fino a raggiungere la confluenza. Questo richiede in genere 3-6 giorni.
  4. Preparare 50 mL di terreno di differenziazione completo aggiungendo 5 mL di ALI 10x Supplement, 500 μL di ALI Maintenance Supplement, 100 μL di soluzione di eparina e 250 μL di soluzione madre di idrocortisone a 44,15 mL di ALI Basal Medium.
  5. Prepara CSE.
    1. Far bollire una sigaretta attraverso 12,5 ml di terreno di differenziazione e poi filtrarla attraverso un filtro per pori da 0,22 μm per preparare il CSE. Per garantire la standardizzazione tra esperimenti e lotti di CSE, misurare l'assorbanza a 320 nm su uno spettrofotometro e definire la densità ottica (OD) di 1 come 100%8.
  6. Utilizzare il mezzo di differenziazione contenente un'adeguata concentrazione di CSE per stimolare le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine a rilevare gli effetti sulla differenziazione delle cellule.
  7. Lasciare che le cellule si differenzino per 28 giorni, durante i quali il mezzo della camera basale viene cambiato e il lato apicale viene lavato due volte a settimana rimuovendo il mezzo della camera apicale e sostituendo il mezzo della camera basale con il mezzo di differenziazione contenente la concentrazione appropriata di CSE.
  8. Analizza le cellule dopo l'esposizione.
    1. Dopo l'esposizione a un terreno di differenziazione contenente CSE, raccogliere le cellule e i surnatanti di coltura in qualsiasi momento (ad esempio, 0-28 giorni) per rilevare cambiamenti morfologici (ad esempio, saggio di immunofluorescenza (IFA) o colorazione con ematossilina-eosina (HE) o per procedure analitiche bioinformatiche (ad esempio, trascrittomica, proteomica, metabolomica, ecc.).

Results

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Differenziazione
Le cellule epiteliali delle vie aeree murine si sono differenziate con successo dopo la coltura in un'interfaccia aria-liquido con un mezzo di differenziazione per 28 giorni. La presenza di cellule ciliate e caliciformi è stata dimostrata mediante saggio di immunofluorescenza del marcatore ciliale acetilato α-Tubulina (verde; Figura 3A) e il marcatore calicenico Mucin5AC, rispettivamente6 (rosso; Figura 3B).

Determinazione della concentrazione di CSE per il differenziamento cellulare
Stimolare le cellule epiteliali isolate con diverse concentrazioni di CSE per 24 ore. I risultati hanno mostrato che le cellule epiteliali diminuivano in vitalità cellulare quando la concentrazione di CSE era superiore al 6% (p <0,05, Figura 4A). Al fine di mantenere l'attività cellulare sotto stimolazione a lungo termine, sono stati utilizzati terreni di coltura contenenti il 2%, 4% e 6% di CSE per stimolare la differenziazione delle cellule epiteliali per 28 giorni. Inoltre, i risultati hanno mostrato che con l'aumento della concentrazione di CSE, non c'è stata una morte cellulare significativa nelle cellule epiteliali (Figura 4B), ma c'è stato un cambiamento graduale nel numero di cellule transmembrana intercellulari resistenti (TEER) (Figura 4C) ed esfoliate (Figura 4D). Inoltre, è stata osservata una riduzione complessiva delle cellule differenziate e delle cellule ciliate quando le colture cellulari epiteliali delle vie aeree murine sono state esposte cronicamente a CSE (Figura 4E-H). Pertanto, il mezzo di differenziazione contenente il 6% di CSE è stato scelto per disregolare la funzione della barriera epiteliale e ridurre il numero di cellule ciliate senza una diminuzione della vitalità cellulare, differenziando le cellule epiteliali per 28 giorni.

Analisi multi-omica
Sono stati raccolti due gruppi di cellule stimolate con terreno differenziale contenente lo 0% o il 6% di CSE per 28 giorni. L'mRNA totale è stato estratto per l'analisi trascrittomica. Dopo la preparazione della libreria, il sequenziamento, il controllo di qualità, la mappatura delle letture al genoma di riferimento e la quantificazione dell'espressione genica, è stata analizzata l'espressione differenziale dei geni tra i due gruppi. Il pacchetto R di clusterProfiler è stato utilizzato per condurre un'analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) per i geni che mostravano un'espressione differenziale, con aggiustamenti apportati per tenere conto delle discrepanze di lunghezza del gene (Figura 5A). L'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG) funge da database completo che facilita la comprensione delle funzionalità e dei ruoli dei sistemi biologici complessi a vari livelli, tra cui quello cellulare, organismico ed ecologico, integrando dati a livello molecolare derivati da ampi set di dati come quelli prodotti dal sequenziamento genomico e dalle metodologie sperimentali ad alto rendimento (Figura 5B). Per la proteomica, le proteine totali sono state estratte da due gruppi di cellule a 28 giorni dopo le colture con terreni differenziali contenenti lo 0% o il 6% di CSE. Dopo il test di qualità delle proteine, la rimozione del sale, l'idrolisi enzimatica delle proteine, la marcatura dei peptidi con Tandem Mass Tags (TMT), la separazione delle frazioni, l'analisi LC-MS, l'identificazione delle proteine e la quantificazione delle proteine, è possibile definire le proteine differenzialmente espresse tra due gruppi. L'analisi OB è stata condotta utilizzando il programma interproscan rispetto al database di proteine non ridondanti (Figura 6A) e KEGG è stato utilizzato per analizzare il percorso (Figura 6B). Per la metabolomica, i surnatanti di coltura sono stati raccolti da due gruppi di cellule epiteliali delle vie aeree a 28 giorni dopo le colture con terreno di differenziazione contenente lo 0% o il 6% di CSE. Dopo l'analisi, l'identificazione e la quantificazione dei metaboliti HPLC-MS/MS, è possibile definire i metaboliti differenziali tra i due gruppi. Il database KEGG (Figura 7A), il database del metaboloma umano (Figura 7B) e il database delle mappe lipidiche (Figura 7C) sono stati utilizzati per annotare tutti i metaboliti. Il database KEGG è stato utilizzato per analizzare le funzioni di questi metaboliti differenziali e le vie metaboliche (Figura 7D). Per l'epigenomica, l'ATAC-seq è stato eseguito come precedentemente riportato9. I nuclei sono stati estratti da due gruppi di cellule a 28 giorni dalla coltura con terreno differenziale contenente lo 0% o il 6% di CSE, e il pellet dei nuclei è stato risospeso nella miscela di reazione della trasposasi Tn5. La reazione di trasposizione è stata incubata a 37 °C per 30 minuti. Dopo aver aggiunto un adattatore, la preparazione della libreria, la valutazione della qualità, il clustering e il sequenziamento, è possibile definire l'epigenomica differenziale tra due gruppi. L'analisi dell'arricchimento di GO di geni differenzialmente correlati al picco riflette direttamente la distribuzione numerica di geni differenzialmente correlati al picco in elementi OB arricchiti in processi biologici, componenti cellulari e funzione molecolare (Figura 8A). Il database KEGG è stato utilizzato per analizzare le funzioni di questi geni e percorsi differenziali (Figura 8B).

Geni che codificano per proteine a giunzione stretta
I dati trascrittomici hanno mostrato che dopo la stimolazione a lungo termine di CSE, c'era una diminuzione dell'espressione di numerosi geni che codificano per proteine a giunzione stretta, tra cui Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 e Ocln (Figura 9A), in cui la ridotta espressione di Cldn3 e Ocln è stata ulteriormente confermata dal Western-Blot e dall'immunoistochimica (IHC) (Figure 9B-E). Questi dati suggeriscono che l'esposizione a CSE riduce notevolmente l'espressione delle proteine della giunzione stretta delle cellule epiteliali delle vie aeree.

Espressione di citochine e chemochine
Oltre alla rottura delle connessioni strette, la trascrittomica ha anche mostrato che dopo la stimolazione a lungo termine di CSE, l'espressione di alcune citochine e chemochine, tra cui Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 e Il33 è aumentata, ma l'espressione di Ccl5 è diminuita (Figura 10A). Il test Luminex ha inoltre confermato che c'erano concentrazioni aumentate di CXCL-5, CSF-3 e IL-1α (Figura 10B-D) ma diminuite di CCL-5 (Figura 10E) nel surnatante delle cellule epiteliali delle vie aeree mure. Questi risultati suggeriscono che l'esposizione al CSE agisce selettivamente sull'espressione di citochine e chemochine.

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Figura 1: Crescita delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine. (A) Le cellule appena isolate appaiono rotonde e trasparenti. (B) Entro il 2° giorno dopo l'isolamento, le cellule espanse si sono formate in isole di piccole cellule. (C) Entro il giorno 4, la formazione di isole cellulari più grandi. (D) Entro il giorno 6, oltre il 90% di fusione con la morfologia del ciottolo. (ingrandimento 4x; barre della scala: 250 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Saggio di immunofluorescenza di marcatori cellulari epiteliali. Espressione della citocheratina nelle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine, A549 (controllo positivo) e Raw264.7 (controllo negativo). Nuclei colorati con DAPI (ingrandimento 63x; barre di scala: 40 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Saggio di immunofluorescenza per marcatori di cellule ciliate e caliciformi. I marcatori utilizzati sono stati acetilati (A) α-tubulina e (B) Mucina 5AC per confermare le cellule ciglia e le cellule caliciformi, rispettivamente (100 ingrandimenti; barre della scala: 10 μm nel pannello A e 50 μm nel pannello B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Impatto delle concentrazioni di CSE sulle cellule epiteliali. (A) Vitalità cellulare a 24 ore al variare delle concentrazioni di CSE. (B) Vitalità cellulare a 28 giorni. (C) Misurazione TEER. (D) Conteggio delle cellule esfoliate. (E-H) Immunofluorescenza per cellule ciliate (verdi) e caliciformi (viola) a concentrazioni di CSE dello 0%, 2%, 4% e 6% (ingrandimento 20x; barre della scala: 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi di arricchimento di OB e KEGG per l'espressione genica. (A) Significato del termine OB nel processo biologico arricchito, nella componente cellulare e nella funzione molecolare. (B) Proporzione di geni differenzialmente espressi nelle vie KEGG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Analisi dell'espressione proteica. (A) Grafico a barre dell'arricchimento GO che mostra l'espressione proteica differenziale. (B) Analisi della via KEGG basata su proteine differenzialmente espresse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Analisi della via KEGG dei metaboliti. (A) Annotazione di tutti i metaboliti utilizzando il database KEGG. (B) Annotazione di tutti i metaboliti utilizzando il database del metaboloma umano. (C) Annotazione di tutti i metaboliti utilizzando il database Lipidmaps. (D) La distribuzione di metaboliti differenzialmente espressi in varie vie KEGG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Analisi dell'espressione genica differenzialmente correlata al picco. (A) Grafico a barre dell'arricchimento GO che mostra l'espressione proteica differenziale. (B) Analisi della via KEGG basata su proteine differenzialmente espresse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Espressione della proteina a giunzione stretta in cellule epiteliali murine delle vie aeree con o senza stimolazione con CSE. (A) Mappa termica dell'espressione della proteina a giunzione stretta nel trascrittoma. (B-E) I livelli di espressione di (B,C) Cldn3 e (D,E) Ocln nelle cellule epiteliali murine delle vie aeree sono stati rilevati mediante Western Blot e immunoistochimica per Cldn3 e Ocln (80 ingrandimenti; barre della scala: 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Analisi dell'espressione delle citochine. (A) Mappa termica del trascrittoma dell'espressione delle citochine. (B-E) Saggio Luminex per i livelli di CXCL-5, CSF-3, IL-1α e CCL-5 in cellule con/senza stimolazione con CSE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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La BPCO è una comune malattia infiammatoria cronica delle vie aeree. L'esposizione al fumo di tabacco porta all'infiammazione cronica delle vie aeree, al rimodellamento delle vie aeree e alla distruzione strutturale dei polmoni, che è il risultato dell'interazione di varie cellule strutturali e cellule immunitarie10. In quanto prima linea del sistema immunitario innato nel polmone, le cellule epiteliali delle vie aeree svolgono un ruolo molto importante durante lo sviluppo della malattia11. In quest'ottica, chiarire come le cellule epiteliali cambino e regolino le cellule a valle sotto la stimolazione di sostanze nocive è un problema scientifico che deve essere risolto con urgenza.

Recentemente, sono stati riportati diversi modelli animali di BPCO che hanno superato alcune limitazioni12. In questi modelli si possono osservare livelli moderati di infiammazione delle vie aeree neutrofile, una firma infiammatoria Th1/Th17, una marcata iperproduzione di muco, un aumento del rimodellamento delle vie aeree, una diminuzione della funzione polmonare e spazi aerei allargati. Sebbene questi modelli richiedano solo 1 mese per stabilire cambiamenti simili alla BPCO, ciò che è accaduto nei topi esposti al fumo di sigaretta entro 1 mese non è ancora chiaro. L'uso della stimolazione CSE a lungo termine ha il vantaggio di essere più facilmente calibrato, il che significa che le cellule epiteliali delle vie aeree possono essere esposte a stimoli di sigaretta il più gravi possibile senza morire, proprio come le cellule epiteliali delle vie aeree nei fumatori. In questo caso, il monitoraggio dei cambiamenti patologici dinamici che portano all'infiammazione delle vie aeree e alla formazione di enfisema è fondamentale per comprendere ulteriormente la patogenesi della BPCO rilevante per il fumo. Pertanto, abbiamo stabilito un modello in vitro per imitare lo stato del fumo e abbiamo cercato di monitorare i cambiamenti dinamici durante l'esposizione di CSE alle cellule epiteliali delle vie aeree. Inoltre, le cellule epiteliali delle vie aeree relativamente purificate rendono lo studio multi-omico più facile di quello dei tessuti interi, il che può aiutarci a trovare le risposte molecolari e cellulari nell'esposizione delle cellule epiteliali delle vie aeree al CSE e a identificare i percorsi chiave e i bersagli terapeutici della BPCO ad alto rendimento.

Qui, il protocollo che descrive l'isolamento delle cellule epiteliali tracheali murine è adattato dai protocolli di Hilaire et al.13 e You et al.14 con alcune modifiche. Nel protocollo utilizzato in questo studio, le cellule epiteliali delle vie aeree murine sono state propagate e differenziate in una struttura pseudostratificata contenente cellule ciliate e caliciformi utilizzando un'interfaccia aria-liquido e un mezzo contenente CSE, stabilendo così un modello di acclimatazione cronica al CSE. I seguenti eventi sono i punti chiave del presente modello.

Considerando che la lussazione cervicale potrebbe affaticare meccanicamente il collo e danneggiare fisicamente le cellule epiteliali, e l'anestesia con cloralio idrato potrebbe anche avere un impatto sulle vie aeree, il pentobarbital sodico è stato utilizzato per l'eutanasia15. Durante le procedure chirurgiche sui topi, immergere solo il collo e le aree inferiori per evitare che l'alcol entri nel naso potrebbe aumentare la vitalità delle cellule epiteliali delle vie aeree16. I dati preliminari del presente studio hanno dimostrato che le cellule epiteliali delle vie aeree sottoposte a intubazione tracheale o immersione in alcol avevano una bassa vitalità e non riuscivano ad espandersi. Inoltre, per ottenere cellule epiteliali delle vie aeree senza eritrociti, è necessario prestare attenzione nelle procedure chirurgiche per evitare la contaminazione del sangue durante l'isolamento delle vie aeree principali.

Anche nei topi privi di patogeni specifici, le vie aeree hanno colonizzato microbi significativi. L'aggiunta di antibiotici appropriati nel mezzo di espansione delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine P0 è essenziale per evitare la contaminazione da agenti patogeni batterici o fungini. Una soluzione cocktail di penicillina, streptomicina, amfotericina B e gentamicina17 assicura efficacemente l'espansione delle cellule epiteliali delle vie aeree murine P0 in un ambiente sterile in vitro . Esperimenti preliminari hanno dimostrato che se non vi è un'efficace inibizione della contaminazione batterica, le cellule epiteliali delle vie aeree murine P0 moriranno prima del primo passaggio.

Nei metodi di digestione, sono stati testati sia 4 °C che 37 °C. I risultati degli esperimenti preliminari hanno indicato che il digest a 37 °C ha superato i 4 °C in termini di efficienza temporale, vitalità cellulare e resa cellulare.

Prima della semina delle cellule epiteliali, il collagene della coda di ratto veniva disciolto in acido acetico e utilizzato per il rivestimento delle piastre di coltura per migliorare l'adesione delle cellule epiteliali18. Tuttavia, la densità del rivestimento di collagene non deve essere né troppo alta né troppo bassa; Una densità insufficiente non riesce a fornire condizioni di adesione adeguate, mentre una densità eccessiva provoca residui cristallini sulla superficie della coltura.

Un passaggio fondamentale è mantenere in vita più cellule epiteliali ed evitare la contaminazione da fibroblasti. Per raggiungere questi obiettivi, si raccomanda che 1) l'utilizzo del kit di dissociazione cellulare senza componenti animali possa isolare delicatamente le cellule epiteliali e ridurre il danno cellulare non necessario e 2) l'uso di un terreno differenziale contenente idrocortisone possa inibire la crescita dei fibroblasti e promuovere la proliferazione delle cellule epiteliali.

Le tradizionali colture monostrato sommerse di cellule epiteliali delle vie aeree sono state un punto fermo nella ricerca respiratoria e negli studi tossicologici. Tuttavia, questi metodi non riescono a replicare accuratamente le caratteristiche differenziate dei tessuti epiteliali delle vie aeree riscontrate in vivo. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo optato per un modello epiteliale alternativo delle vie aeree. Questo modello si basa sulla coltivazione di cellule primarie delle vie aeree su scaffold di membrana microporosa, come quelli forniti dai sistemi transwell, in un'interfaccia aria-liquido19. L'esposizione della superficie apicale all'aria ambiente in questa configurazione di coltura ALI è fondamentale per favorire la differenziazione cellulare, imitando così più da vicino le condizioni in vivo 20.

Se la differenziazione non è efficace, è fondamentale valutare le potenziali ragioni. Ciò include la possibilità che le cellule epiteliali delle vie aeree possano aver subito un passaggio eccessivo, che può compromettere la loro capacità di differenziazione. Inoltre, è imperativo garantire che l'accumulo di muco e liquidi all'interno della camera apicale sia completamente eliminato durante il processo di scambio bisettimanale dei terreni, poiché il contenuto residuo può ostacolare il processo di differenziazione.

Sebbene questo modello presenti alcune limitazioni, rimane uno strumento prezioso per la ricerca. Una limitazione è che l'uso di un terreno contenente CSE per stimolare le cellule epiteliali delle vie aeree potrebbe non replicare completamente le condizioni in vivo sperimentate dalle cellule epiteliali delle vie aeree nei fumatori. Inoltre, la vitalità delle cellule epiteliali ciliate differenziate in vitro è in genere limitata a un mese. Nonostante questi vincoli, il modello integra efficacemente diversi aspetti chiave: facilita lo studio della differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido, l'acclimatazione a lungo termine al CSE e l'applicazione dell'analisi multi-omica in un certo periodo di tempo. Questo approccio completo offre un quadro sofisticato e olistico per future indagini sui meccanismi fisiologici e patologici delle cellule epiteliali delle vie aeree. Inoltre, aiuta nell'identificazione di potenziali biomarcatori e bersagli terapeutici per le malattie delle vie aeree. Ci auguriamo che la nostra esperienza fornisca informazioni utili per coloro che vorrebbero utilizzare questo modello per studi pertinenti.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Soluzione di penicillina/streptomicinaGibco15140122
24 mm Transwell con 0,4 µ m Inserto a membrana in poliestere a poriBIOFILTCS016012
40 &; micro; m Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicina / AmfotericinaSoluzione GibcoR01510
acetilato &alfa;-TubulinaCST# 5335
Acetil -& alfa ; -Tubulina (Lys40) (D20G3) XP Coniglio mAb  cellsignal#5335
Kit di dissociazione cellulare libera da componenti animaliStemcell05426
Anticorpo anti-pan citocheratinaabcamab7753
SigarettaMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deossiribonuclasi I dal pancreas bovinoSigma-AldrichDN25
Desossiribonuclasio I da pancreas bovinoSigmaDN25
Ham' s F-12Sigma-AldrichN6658
Soluzione di eparina Stemcell07980
Soluzione madre di idrocortisoneStemcell07925
Mucina 5ACabcamab212636
Occludinaproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Soluzione di penicillina-streptomicinaGibco15140122
PneumaCult-ALI
Cellule staminali05002 
PneumaCult-ALI 10x IntegratoreStemcell05003 
PneumaCult-ALI Integratore di mantenimentoStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x IntegratoreStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Cellulestaminali05041
Pronasi ESigma-AldrichP5147
Collagene a coda di rattoCorning354236
Trypan BlueCellule staminali07050 
sterili medie basali medie basali

References

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