Articolo metodologico

Una preparazione del modello modificata per la riperfusione dell'occlusione dell'arteria cerebrale media

DOI:

10.3791/67060

⸱

31 maggio 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Foshan University, 2School of Medicine, Shaanxi University of International Trade and Commerce

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive il processo di preparazione alla riperfusione dell'occlusione dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide comune.

Abstract

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Il modello di riperfusione per occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) è fondamentale per comprendere i meccanismi patologici dell'ictus e per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, tra i metodi di modellazione comunemente usati, il metodo Koizumi è spesso oggetto di esame a causa della sua legatura dell'arteria carotide comune (CCA) e della sua incapacità di ottenere un'adeguata riperfusione. Allo stesso modo, il metodo Longa è stato criticato per la disconnessione e la legatura dell'arteria carotide esterna (ECA). Questo studio mira a introdurre un metodo di preparazione del modello modificato che preservi l'integrità dell'ECA, che preveda l'inserimento di una sutura in nylon monofilamento attraverso il CCA, la riparazione dell'incisione CCA legata e il mantenimento della riperfusione dal CCA. La riperfusione del flusso sanguigno è stata confermata utilizzando l'imaging laser speckle flow. Metodi di valutazione come la scala Longa, il punteggio di gravità neurologica modificata, la colorazione con trifeniltetrazolio cloruro (TTC) e la marcatura in immunofluorescenza dei neuroni hanno dimostrato che questo approccio potrebbe indurre un danno stabile al nervo ischemico. Questo protocollo modello MCAO/R modificato è semplice e stabile e fornisce una guida preziosa per i professionisti nel campo dell'ischemia cerebrale.

Introduzione

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Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, l'ictus è rimasto la seconda causa di morte in tutto il mondo nell'ultimo decennio, con un alto tasso di incidenza, un'elevata mortalità e un alto tasso di disabilità 1,2. Con l'invecchiamento della popolazione globale, si prevede che l'incidenza dell'ictus aumenterà nei paesi in via di sviluppo, diventando potenzialmente la principale causa di morte prematura e disabilità negli adulti. Inoltre, c'è una tendenza per gli ictus che si verificano a un'età più giovane di3 anni. La perdita di forza lavoro dopo un ictus pone anche un pesante fardello sulle famiglie e sulla società4. Pertanto, lo sviluppo di trattamenti sicuri ed efficaci rappresenta una sfida importante nella ricerca sull'ictus.

I modelli animali sono strumenti cruciali per lo studio della prevenzione e del trattamento delle malattie umane. La traduzione di successo delle strategie di trattamento dell'ictus si basa sulla riproducibilità e l'affidabilità dei modelli animali di ictus 5,6. L'arteria cerebrale media (MCA) è un sito comune per l'ictus clinico, rendendo il modello MCAO il modello più vicino all'ictus ischemico umano. Il modello MCAO, preparato con il metodo della sutura, è stato favorito dai ricercatori per vantaggi quali l'assenza di craniotomia e il facile controllo del tempo ischemico. È stato utilizzato in oltre il 40% degli esperimenti neuroprotettivi7. Tuttavia, nonostante i suoi numerosi vantaggi, i dettagli operativi di questo modello rimangono un argomento controverso per molti ricercatori.

Per il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media indotta da sutura (MCAO), la riperfusione avviene ritirando la sutura. Attualmente, per l'inserimento della sutura vengono utilizzati due metodi principali: il metodo8 di Koizumi e il metodo9 di Longa. Nel metodo di Koizumi, la sutura entra nell'arteria carotide interna (ICA) principalmente attraverso l'incisione dell'arteria carotide comune (CCA), mentre nel metodo di Longa, passa attraverso l'arteria carotide esterna recisa (ECA) nell'ICA. Durante la riperfusione, il metodo Koizumi richiede la legatura permanente dell'incisione CCA e si basa sul cerchio di Willis per la riperfusione10. Tuttavia, alcuni studi suggeriscono che una riperfusione efficace non può essere raggiunta esclusivamente attraverso l'apporto compensatorio del cerchio di Willis dopo aver perso l'apporto di CCA. Inoltre, il circolo di Willis mostra un'elevata variabilità anatomica, specialmente nei topi C57Bl/6, aumentando la variabilità dell'infarto e riducendo l'affidabilità dei dati sperimentali. Di conseguenza, questo metodo è stato sempre più messo in discussione dai ricercatori11.

Il metodo di Longa prevede l'inserimento di una sutura attraverso l'ECA recisa e quindi la legatura permanente dell'arteria carotide interna (ICA) una volta che la sutura è stata ritirata. Ciò preserva la pervietà del CCA, consentendo la perfusione sanguigna fino al 100% dei valori basali. Tuttavia, questo metodo richiede la separazione dell'arteria carotide esterna e dei piccoli rami arteriosi, il loro taglio o l'elettrocoagulazione, rendendo la procedura impegnativa. Interrompe anche l'intera struttura del flusso sanguigno del cervello, che differisce dallo stato clinicodel paziente 12. È importante sottolineare che gli studi indicano che il taglio o la legatura dell'ECA può causare lesioni ischemiche nei muscoli che controllano la masticazione e la deglutizione, influenzando la dieta animale e portando alla morte postoperatoria dell'animale e a gravi danni sensoriali e motori nei ratti13,14.

Pertanto, è urgentemente necessario un metodo di preparazione del modello modificato per affrontare questi problemi. Questo studio introduce un metodo di modellazione MCAO modificato che ripara l'incisione di inserimento del CCA e raggiunge un'efficace riperfusione. La procedura è semplice, pratica e fattibile, induce danni neurologici significativi e lesioni infartuali replicabili e fornisce una guida preziosa per i ricercatori sull'ictus.

Protocollo

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Il protocollo sperimentale è stato condotto in conformità con le linee guida del Comitato per l'uso e la cura e l'uso degli animali istituzionali presso l'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di registrazione: 2019-DL-002). Tutti i dati della ricerca sugli animali sono stati documentati seguendo le linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague Dawley (SD) di peso compreso tra 250 g ± 20 g e di età compresa tra 6 e 8 settimane. Le specifiche relative agli animali, ai reagenti e alle attrezzature impiegate sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Indurre e mantenere l'anestesia profonda nei ratti utilizzando Zoletil 50 (50 mg/kg, IM) e xilazina cloridrato (40 mg/kg, IP). Assicurarsi che la temperatura corporea sia mantenuta a 37 ± 0,5 °C utilizzando una sonda rettale collegata a un termoforo durante la procedura chirurgica. Applicare un unguento veterinario sugli occhi del ratto per evitare che si secchino.
  2. Radere i peli dalla testa e dal collo dei topi. Usa la crema depilatoria per rimuovere il pelo dalla testa e dal collo, quindi risciacqua la crema con soluzione fisiologica. Disinfettare la pelle nel sito chirurgico applicando etanolo e iodio povidone tre volte utilizzando batuffoli di cotone sterili.
  3. Praticare un'incisione di 2 cm al centro della testa del ratto lungo la direzione della sutura sagittale utilizzando un bisturi e rimuovere con cura i muscoli che coprono il cranio.
  4. Assottiglia il cranio sul lato ischemico del ratto usando un trapano per cranio. Utilizzare soluzione salina normale per raffreddare e rimuovere i detriti durante il processo di macinazione. Registrare il flusso sanguigno basale dei ratti utilizzando l'imaging a contrasto laser speckle (LSCI).
  5. Applicare etanolo e iodio povidone tre volte sulla pelle del collo utilizzando batuffoli di cotone sterili. Praticare un'incisione di 2 cm lungo la linea mediana del collo utilizzando una lama chirurgica. Utilizzare i divaricatori per tirare indietro lateralmente la pelle e le ghiandole salivari, esponendo i muscoli sternocleidomastoideo e cervicale.
  6. Separare i muscoli sternocleidomastoideo e cervicale per esporre il territorio carotideo. Identificare l'anatomia vascolare dell'arteria carotide comune (CCA), dell'arteria carotide interna (ICA) e dell'arteria carotide esterna (ECA). Sulla base dell'anatomia vascolare, separare il CCA, così come l'ECA derivato dal CCA e l'ICA15.
    NOTA: La struttura anatomica del ratto indica che la regione CCA è principalmente ricoperta da muscoli sternocleidomastoideoi e cervicali, con l'ICA e l'ECA derivati dal CCA. Dopo che la separazione espone il CCA, una forcella a forma di Y può essere vista lungo il CCA, che rappresenta l'ICA e l'ECA. Fai attenzione a non danneggiare il nervo vago, che corre parallelo al CCA.

2. Occlusione dell'MCA

  1. Annodare facilmente l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide comune (CCA) utilizzando un filo di seta 3-0 per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno. Posizionare una clip per recipiente sul CCA a circa 0,5 cm dal primo nodo.
    1. Tingere di nero l'ago di una siringa da 5 ml. Crea una piccola foratura nel CCA usando l'ago tinto di nero e segna i fori di spillo in nero.
  2. Inserire la sutura in nylon monofilamento nel CCA attraverso il segno nero. Aprire la clip vascolare e guidare il filo di nylon nell'arteria carotide interna (ICA) fino a quando non si ferma con una leggera resistenza. Stringere saldamente il secondo nodo per mantenere la sutura in nylon monofilamento in posizione all'interno dell'arteria, evitando lo spostamento dalla posizione di blocco.
  3. Annotare il tempo di ischemia a questo punto e misurare il valore del flusso sanguigno sul lato ischemico utilizzando LSCI. Somministrare gocce di bupivacaina sulla ferita del collo per l'analgesia e la chiusura della ferita. Rimuovere la maschera per anestesia e lasciare che il ratto si riprenda.
    NOTA: Se la sutura in nylon monofilamento incontra difficoltà ad entrare nell'ICA, ritrarla leggermente e ritentare l'inserimento.

3. Riperfusione di MCAO

  1. Dopo 90 minuti di ischemia, anestetizzare nuovamente i ratti con isoflurano. Misurare il flusso sanguigno cerebrale dal lato ischemico utilizzando LSCI e assicurarsi che la sutura in nylon monofilamento non si sia spostata.
  2. Sciogliere i nodi sull'arteria carotide esterna (ECA) per consentire la riperfusione sanguigna. Rilasciare il nodo sull'arteria carotide comune (CCA), fissare la sutura monofilamento e ritirare la sutura. Applicare una clip vascolare prima della sutura fissa del monofilamento per prevenire il sanguinamento.
  3. Sostituire il primo nodo CCA con una clip vascolare. Utilizzare una pinzetta per ruotare lateralmente l'incisione del vaso (Figura 1). Bloccare l'incisione con una pinzetta e fissarla utilizzando un filo 6-0 per riparare l'incisione. Rimuovere la clip vascolare, verificare la presenza di perdite e confermare la riperfusione completa (Video 1).
    NOTA: Eseguire la legatura per riparare l'incisione per evitare un eccessivo bloccaggio del vaso, che potrebbe portare alla stenosi CCA.
  4. Registrare i valori del flusso sanguigno corticale cerebrale utilizzando LSCI dopo la legatura dell'incisione per confermare il successo della riperfusione. Chiudere l'incisione del collo con punti di sutura e somministrare 1.000.000 di unità di penicillina e 2 ml di soluzione salina per prevenire l'infezione e la disidratazione.
  5. Mantieni il calore fino a quando i ratti non riprendono conoscenza. Offrire cibo morbido dopo l'intervento chirurgico e monitorare i segni vitali degli animali.

4. Valutazione della funzione nervosa e del danno ischemico cerebrale

  1. Una volta che i ratti si saranno completamente risvegliati, la loro funzione neurale sarà valutata da ricercatori ignari del raggruppamento animale. Utilizzare la scala del punteggio Longa (Tabella 1) e la scala del punteggio di gravità neurologica modificata (mNSS) (Tabella 2) per valutare la funzione neurologica di tutti i ratti.
  2. Dopo 24 ore dall'intervento, sopprimere i ratti in anestesia indotta da isoflurano (isoflurano al 4% a 4 L/min di ossigeno) tramite lussazione cervicale16 (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Sciacquare il cervello con acqua ghiacciata per rimuovere il sangue rimasto.
  3. Dividi il tessuto cerebrale in 5 sezioni e colorale con TTC. Acquisisci immagini di entrambi i lati delle fette di tessuto cerebrale, misura l'area ischemica dei lati anteriore e posteriore utilizzando il software Image J e calcola il tasso di infarto utilizzando la seguente formula:
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    NOTA: S1 e S2 rappresentano l'area dell'infarto rispettivamente del proencefalo prossimale e dei lati prossimali del tronco encefalico delle fette di cervello. L'area dell'infarto di ogni fetta di cervello viene corretta utilizzando la formula di Swanson, dove h rappresenta lo spessore della fetta di cervello. Questa formula, precedentemente delineata dall'autore in una precedente ricerca17, consente un calcolo più accurato della dimensione della lesione infartuale.
  4. Analizza i dati utilizzando software statistici e grafici per valutare il tasso di successo e la stabilità del modello.
  5. Utilizzare il metodo dell'immunofluorescenza per marcare i neuroni corticali nei ratti, convalidando ulteriormente il danno neuronale causato da questo metodo. Dopo 24 ore di ischemia-riperfusione nei ratti, è stata eseguita la perfusione cardiaca utilizzando PBS pre-raffreddato per ottenere tessuto cerebrale.
  6. Incorporare e congelare il tessuto cerebrale in sezioni. Utilizzare anticorpi neuronali come il marcatore neuronale immaturo Doublecortin (DCX)18, il marcatore del nucleo neuronale Neuronal Nuclei (NeuN)18 e il marcatore dendritico neuronale Microtubule-associated protein-2 (MAP-2)19. Osservare l'espressione dei neuroni ischemici utilizzando la microscopia confocale laser.

Risultati

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L'imaging laser del flusso di speckle ha dimostrato che prima dell'occlusione della sutura in nylon monofilamento, c'era un abbondante flusso sanguigno nell'area dell'arteria cerebrale media (MCA) e sono stati registrati i valori di flusso sanguigno di base dei ratti. In seguito all'occlusione dell'MCA, il valore del flusso sanguigno sul lato ischemico del cervello è diminuito rapidamente. Prima di prelevare la sutura, i valori del flusso sanguigno sul lato ischemico sono stati ricontrollati per confermare se la sutura stava occludendo l'MCA. I risultati hanno indicato solo un leggero cambiamento nel flusso sanguigno. Dopo aver ritirato la sutura, la perfusione del flusso sanguigno si è rapidamente ripresa (Figura 2). Il video 1 mostra anche il robusto polso di riempimento dell'arteria carotide comune, suggerendo che questo metodo può raggiungere una sufficiente perfusione del flusso sanguigno post-ischemia cerebrale.

I risultati dei punteggi della funzione neurologica (Figura 3) hanno rivelato che, rispetto al gruppo di chirurgia fittizia, il punteggio Longa del gruppo modello era 1,80 ± 0,27 (p < 0,05) e il punteggio mNSS era 7,4 ± 0,89 (p < 0,05). Questi punteggi indicano che il modello di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) preparato con questo metodo ha portato a danni neurologici significativi. Il video 2 dimostra il comportamento caratteristico dei ratti del gruppo modello che ruotano mentre strisciano, un segno distintivo delle lesioni indotte dall'ictus, confermando ulteriormente la validità di questo metodo.

La colorazione TTC ha dimostrato che il tasso di infarto nei ratti del gruppo modello era di 5,58 ± 1,79 (p < 0,05), con l'area dell'infarto che interessava principalmente lo striato e la corteccia, e la dimensione dell'infarto è rimasta relativamente stabile. La colorazione in immunofluorescenza ha illustrato la perdita di neuroni corticali in seguito a ischemia-riperfusione (Figura 4). Questi risultati indicano collettivamente che questo metodo può stabilire un modello MCAO/R stabile adatto a valutare l'efficacia preclinica dei farmaci.

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Figura 1: Diagramma schematico della legatura del connettore di CCA. Il cerchio giallo indica il punto di inserzione e il sito di legatura della spina del filo, mentre la posizione di legatura (freccia gialla) indica il punto in cui l'arteria carotide comune (CCA) è stata legata con il filo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini del flusso sanguigno a macchie laser ai tempi dei ratti sul lato ischemico pre, post-occlusione e pre e post-riperfusione. (A) Immagini del flusso sanguigno cerebrale dei ratti, dove le aree blu indicano valori di flusso sanguigno bassi e le aree rosse indicano valori di flusso sanguigno elevati. Barre della scala: 200 mm. (B) Variazioni dell'ischemia-riperfusione cerebrale nei ratti, presentate come media ± deviazione standard, con una dimensione del campione di n = 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Risultati dei punteggi dell'area dell'infarto e della funzione neurologica nel gruppo fittizio e nel gruppo modello. (A) La colorazione TTC rappresentava le aree infartuate del tessuto cerebrale sia nel gruppo fittizio che nel gruppo modello, con le aree bianche che indicavano il tessuto infartuato e le aree rosse che indicavano il tessuto normale. (B) Vengono presentati i risultati quantitativi dei punteggi Longa e mNSS, nonché il tasso di infarto. La significatività statistica rispetto al gruppo fittizio è indicata da *p < 0,05, con una dimensione del campione di n = 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Risultati del danno del neurone corticale nel gruppo sham e nel gruppo modello. Espressione di NeuN (A), DCX (B) e MAP-2 (C) nei neuroni corticali. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Diagramma dell'occlusione e della riperfusione MCA di Koizumi, Longa e del metodo modificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Prove motorie/forte>Scambio ferroviario
Sollevare il ratto per la coda3
1 Flessione dell'arto anteriore
1 Flessione dell'arto posteriore
1 testa spostata > 10° rispetto all'asse verticale entro 30 s
Posizionare il ratto sul pavimento3
0 Camminata normale
1 Incapacità di camminare dritto
2 Girando verso il lato paretico
3 Caduta verso il basso sul lato paretico
Test sensoriali2
1 Test di posizionamento (test visivo e tattile)
2 Test propriocettivo (sensazione profonda, spingendo la zampa contro il bordo del tavolo per
stimolare i muscoli degli arti)
Prove di bilanciamento del fascio6
0 Bilancia con postura stabile
1 Afferra il lato della trave
2 abbraccia la trave e un arto cade dalla trave
3 Abbraccia la trave e due arti cadono dalla trave, o gira sulla trave (>60 s)
4 Tenta di bilanciarsi sulla trave ma cade (>40 s)
5 Tenta di bilanciarsi sulla trave ma cade (>20 s)
6 Cadute: nessun tentativo di equilibrio o di aggrapparsi alla trave (<20 s)
Riflessi assenti e movimenti anomali4
1 Riflesso della pinna auricolare (scuotere la testa quando si tocca il meato uditivo)
1 Riflesso corneale (sbattere le palpebre quando si tocca leggermente la cornea con il cotone)
1 Riflesso di sussulto (risposta del motore a un breve rumore dovuto allo scatto di un foglio per appunti
1 Convulsioni, mioclono, miodistonia
Numero massimo di punti18

Tabella 1: Punteggio di gravità neurologica modificato.

Gol Zea-Longa
PunteggioSintomo
0 puntiNessun deficit neurologico
1 puntoLieve: incapace di estendere completamente la zampa anteriore destra quando la coda è sollevata
2 puntiModerato: cerchi a destra/sinistra quando si cammina
3 puntiGrave: cade a destra/sinistra quando si cammina
4 puntiIncapacità di camminare spontaneamente con perdita di coscienza

Tabella 2: Punteggi Zea-Longa.

Video 1: Passaggi chiave per la riparazione della legatura dell'incisione CCA durante la riperfusione nei ratti. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Video comportamentali di ratti sottoposti a MCAO/R. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

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Il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) indotta da una sutura in nylon monofilamento è il metodo più comune utilizzato per la preparazione di modelli MCAO. Questo approccio è ampiamente adottato negli studi preclinici e ha ottenuto il riconoscimento di molti professionisti grazie alla sua semplicità, alla mancanza di necessità di craniotomia, al trauma chirurgico minimo e alla capacità di ottenere la riperfusione.

Esistono due tecniche chirurgiche classiche per il filamento intraluminale MCAO: il metodo Koizumi8 e il metodo Longa9. La principale differenza tra questi metodi risiede nel modo in cui la sutura viene introdotta per occludere l'MCA. Nel metodo Koizumi, la sutura viene inserita attraverso l'incisione dell'arteria carotide comune (CCA) nell'arteria carotide interna (ICA). L'estremità anteriore della sutura è rivestita di silicone per bloccare il punto di partenza dell'MCA. Al contrario, nel metodo Longa, la sutura viene inserita nell'ICA attraverso l'arteria carotide esterna recisa (ECA). L'estremità anteriore della sutura è espansa in una forma sferica per bloccare il punto iniziale dell'MCA (Figura 5). Durante la riperfusione, la sutura viene ritirata delicatamente per ripristinare il flusso sanguigno.

Il metodo Longa prevede l'introduzione della sutura nell'arteria carotide interna (ICA) attraverso l'arteria carotide esterna recisa (ECA). Questo processo richiede la separazione e la disconnessione dell'ECA, nonché la separazione e la rimozione di piccoli rami, che vengono poi tagliati utilizzando una penna per elettrocoagulazione per prevenire il sanguinamento. Di conseguenza, questo metodo richiede un funzionamento attento e preciso. Inoltre, l'estremità residua corta dell'ECA recisa può facilitare lo scivolamento della sutura durante l'inserimento, aumentando ulteriormente la complessità della procedura. Questa sfida è particolarmente pronunciata quando si prepara un modello murino di ischemia cerebrale, poiché spesso richiede l'uso di un microscopio per garantire l'accuratezza, aumentando così la complessità complessiva dell'operazione.

La preoccupazione principale con il metodo Koizumi risiede nella legatura dell'arteria carotide comune (CCA), che provoca la riperfusione compensatoria del tessuto cerebrale sul lato ischemico esclusivamente attraverso il Circolo di Willis. Il CCA è un ramo cruciale dell'arco aortico dal cuore e funge da arteria principale che fornisce la perfusione del flusso sanguigno cerebrale. Pertanto, il modello di ischemia-riperfusione cerebrale creato con il metodo Koizumi sperimenta spesso uno stato di ipoperfusione. Questa ipoperfusione non è limitata alla regione dell'arteria cerebrale media, ma si estende a tutto l'emisfero ischemico sullo stesso lato. Anche dopo 35 giorni di modellazione, il valore del flusso sanguigno non ritorna al basale, suggerendo che il metodo Koizumi dovrebbe essere considerato come un modello ischemico con ipoperfusione cronica piuttosto che un modello di ischemia-riperfusione10.

Al contrario, il metodo Longa può raggiungere un valore del flusso sanguigno del 100% negli animali MCAO/R. Tuttavia, è fondamentale notare che il raggiungimento della completa ricanalizzazione non significa necessariamente che il metodo Koizumi debba essere abbandonato. Quando si considera la traduzione clinica, il metodo Koizumi può essere più adatto per i pazienti con ricanalizzazione lenta spontanea dopo l'occlusione dell'arteria. Tuttavia, questo fenomeno è relativamente raro nella pratica clinica. Solo una piccola percentuale di pazienti con ictus ischemico soddisfa i criteri per la trombolisi e riceve un trattamento efficace entro la finestra temporale del trattamento20,21. Inoltre, alcuni pazienti non raggiungono la completa rivascolarizzazione anche dopo la terapia trombolitica22. Pertanto, il metodo Koizumi può essere utilizzato per simulare le condizioni di tali pazienti.

D'altra parte, il metodo Longa consente ai vasi di ricanalizzarsi rapidamente dopo l'occlusione, rendendolo più adatto per simulare pazienti che ricevono un'efficace terapia trombolitica o trombectomia nella pratica clinica. Per la simulazione di pazienti che non sono stati sottoposti a terapia trombolitica, il modello di ischemia cerebrale permanente preparato con il metodo Koizumi può offrire un'occlusione più completa e una procedura chirurgica più semplice.

Il metodo Longa per indurre l'occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) può portare a un danno da riperfusione più significativo preservando la ricanalizzazione vascolare derivata dall'arteria carotide comune (CCA)23,24. Tuttavia, è importante notare che l'arteria carotide esterna (ECA) deve essere tagliata e legata in modo permanente durante il metodo Longa, che interrompe l'intera struttura del flusso sanguigno del cervello e non è coerente con i pazienti clinici. Inoltre, le arterie linguale, mascellare e occipitale sono rami dell'ECA13. Pertanto, il taglio o la legatura permanente dell'ECA può causare disturbi alimentari e alcolistici, con conseguente perdita di peso25. Studi precedenti hanno indicato che le morti dei topi a seguito di modelli MCAO sono principalmente dovute a un'inadeguata assunzione di cibo o acqua piuttosto che a lesioni ischemiche cerebrali14,26. Inoltre, la legatura dell'ECA può ridurre il flusso sanguigno retinico e indurre danni alla retina sotto forma di morte cellulare27.

Inoltre, l'indicatore più importante per la ricerca sull'ictus è il volume dell'infarto; Tuttavia, è stato dimostrato che il volume di infarti indotti dal metodo di sutura ha una deviazione standard significativa, anche seguendo rigorosi protocolli chirurgici e di raccolta dati. Nei rapporti precedenti, il volume dell'infarto era associato al grado di riperfusione28 e la riperfusione del modello di ictus preparato con il metodo di Koizumi dipende dalla circolazione di Willis 29,30,31. Tuttavia, è stato dimostrato che il ciclo di Willis ha un'elevata variabilità anatomica, specialmente nei topi C57Bl/6, dove il 90% degli animali può mancare di una o due arterie comunicanti posteriori32, che è il determinante chiave dell'elevata variabilità nel danno ischemico33. Pertanto, preservare la perfusione di CCA può ridurre la variabilità del volume dell'infarto34. È stato riportato che il coefficiente medio di variazione delle dimensioni dell'infarto negli studi sull'ictus era del 29,5%31, il che ha contribuito alla bassa potenza statistica degli studi sull'ictus. Rappresenta anche un'enorme sfida per la potenziale scoperta di farmaci. Ciò aumenta indubbiamente i costi di sviluppo e traduzione clinica e può portare i ricercatori a perdere farmaci potenzialmente efficaci. Aumenta anche il numero di animali da includere nell'analisi statistica dell'esperimento, il che viola ulteriormente il principio delle 3R dell'etica animale.

Pertanto, in questo studio, i metodi di modellazione sono stati modificati per garantire l'integrità della struttura del flusso sanguigno del tessuto cerebrale e una sufficiente riperfusione dopo l'ischemia cerebrale. Le principali modifiche includono due passaggi: (1) l'inserimento della sutura nel CCA utilizzando un ago da siringa da 5 ml invece di praticare una piccola incisione; questo passaggio riduce l'incisione del CCA ed è più favorevole alla legatura dell'incisione; (2) ritirare la sutura e utilizzare fili di seta più sottili per legare l'apertura dell'ago del CCA, senza influire sulla perfusione del flusso sanguigno del CCA. Naturalmente, anche questo richiede un'attenta operazione chirurgica, ma è diverso dall'introduzione della sutura tramite ECA; questo metodo preserva l'integrità della struttura del flusso sanguigno cerebrale consentendo al contempo il pieno riperflusso del flusso sanguigno attraverso il CCA, semplificando la procedura operativa e riducendo la variabilità del volume dell'infarto. Alcuni ricercatori hanno utilizzato metodi di ricerca simili per riparare le incisioni con la colla tissutale, ma questo ha il potenziale per la trombosi, che porterà effetti incontrollabili. E ci vuole più tempo per stabilizzare l'incisione25.

In conclusione, questo studio fornisce un approccio modificato alla preparazione del modello di ischemia-riperfusione cerebrale che consente un'adeguata perfusione sanguigna dopo il ritiro del filamento e può provocare volumi di infarto significativamente riproducibili e danni neurologici. Tutti i risultati di cui sopra dimostrano che il metodo modificato è fattibile e riproducibile e può fornire un riferimento per i professionisti per preparare modelli per facilitare l'efficace traduzione clinica dei farmaci ischemici cerebrali.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82173781 e 82373835), dal progetto di ricerca post-dottorato (BKS212055), dal progetto di innovazione scientifica e tecnologica del Foshan Science and Technology Bureau (2320001007331), dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515010806), dai progetti chiave sul campo (produzione intelligente) delle università generali nella provincia del Guangdong (2020ZDZX2057) e dai progetti di ricerca scientifica (innovazione caratteristica) del generale Università nella provincia del Guangdong (2019KTSCX195).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema per anestesia animaleRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Mantenitore di temperatura per animaliRayward Life Technology Co., Ltd69020
Cy3 anticorpo secondarioWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB21303
Anticorpo DAP1Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdAnticorpo
DCXWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB13434
Siero di capraBeyotime Biotechnology Co., LTDC0265
GraphPad PrismGraphPad SoftwareGraphPad Prism 8.0
ImageJNational Institutes of HealthImageJ software
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
Sangue macchiettato al laser sistema di imaging a flussoRayward Life Technology Co., LtdAnticorpo PeriCam PSI NR
MAP-2Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11128
Trapano cranico portatile in miniaturaRayward Life Technology Co., Ltd87001
sutura monofilamentoRayward Life Technology Co., Ltd250-280g
Anticorpo NeuNWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11138
agente di inclusione OCTBIOSHARPBL557A
Penicillina sodicaChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
Soluzione rapida di recupero dell'antigene per sezioni congelateBeyotime Biotechnology Co., LTDP0090
SD rattiSPF (Pechino) Biotechnology Co., Ltd.250-280g
Triton X-100Beyotime Biotechnology Co., LTDST795
TTCChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.
G1012 2019030101

Riferimenti

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