Un modello di pancreatite cronica ostruttiva stabilito attraverso l'elettrocoagulazione

Sommario

Il presente protocollo descrive un nuovo approccio alla modellazione della pancreatite cronica ostruttiva, che prevede la visualizzazione del dotto pancreatico e l'elettrocoagulazione del dotto pancreatico per causare l'ostruzione del dotto pancreatico.

Abstract

La pancreatite cronica (CP) è una grave condizione infiammatoria che può distruggere il pancreas, portare al diabete e aumentare il rischio di cancro al pancreas, con un grave impatto sulla qualità della vita dei pazienti. Affrontare la CP è un obiettivo critico della ricerca in gastroenterologia. Abbiamo sviluppato un nuovo modello animale per superare i limiti di quelli esistenti, utilizzando topi maschi C57BL/6 di 8 settimane.

Dopo aver esposto il pancreas attraverso la chirurgia addominale su topi anestetizzati, abbiamo bloccato il dotto biliare comune vicino al fegato per evitare che il blu di metilene entrasse in esso. Un capillare è stato inserito nel dotto biliare per iniettare il colorante e dopo che il dotto pancreatico è stato colorato. Dopo che il dotto pancreatico è stato visualizzato, il pancreas è stato selezionato per l'elettrocoagulazione nei 2/3 medi e inferiori della posizione tra il dotto biliare comune e l'arteria pancreatico duodenale superiore. L'elettrocoagulazione è stata interrotta quando la soluzione colorante blu non poteva essere riconosciuta. L'addome è stato quindi chiuso e i topi sono stati normalmente sollevati. A 7, 14, 21 e 28 giorni dopo l'intervento, il pancreas è stato esaminato utilizzando la colorazione HE, la colorazione Masson e l'immunoistochimica e il siero del sangue è stato analizzato per i parametri biochimici. La patologia dopo 14 giorni corrispondeva strettamente alle caratteristiche della pancreatite cronica, così come i parametri biochimici sierici.

Introduzione

La pancreatite cronica (CP) è una grave malattia infiammatoria progressiva, che porta alla distruzione del pancreas e si manifesta con dolore addominale e disturbi digestivi. Nel tempo, può causare il diabete mellito e aumentare il rischio di cancro al pancreas. Stabilire il modello animale di CP e sviluppare strategie terapeutiche efficaci è quindi fondamentale.

Le cellule acinose esocrine pancreatiche producono e secernono un gran numero di enzimi digestivi. Quando gli organelli e la regolazione dell'omeostasi proteica sono interrotti, può portare a un'attivazione impropria del tripsinogeno intracellulare, portando infine al danno delle cellule acinose e allo sviluppo della pancreatite¹.

Studi precedenti hanno dimostrato che, i modelli murini, in particolare quelli indotti da iniezioni ripetitive di ceruleina² e legatura chirurgica dei dotti pancreatici ^3,4, sono stati determinanti nello studio della CP. La ceruleina può indurre pancreatite acuta che può passare a uno stato cronico, ma la sua mancanza di ostruzione specifica del dotto pancreatico limita il suo significato clinico nella simulazione della pancreatite ostruttiva. Sebbene la legatura chirurgica imiti meglio la natura ostruttiva della paralisi cerebrale umana, è altamente invasiva, difficile da eseguire e spesso porta a gravi effetti sistemici, ostacolando lo studio delle patologie duttali localizzate.

Per ovviare a queste limitazioni, è stato proposto un nuovo modello di CP ostruttiva attraverso l'elettrocoagulazione. Simile al principio della legatura del dotto pancreatico, blocca il dotto pancreatico ma è più facile da eseguire e ha un tasso di successo più elevato. I ricercatori hanno proposto che l'ablazione con radiofrequenza nel dotto pancreatico principale dei suini sia un metodo sicuro ed efficace per indurre l'atrofia pancreatica⁵, il che suggerisce anche che il taglio del dotto pancreatico principale con l'elettrocoagulazione ad alta frequenza può produrre effetti simili. Questa tecnica prevede la puntura retrograda del dotto pancreatico e l'iniezione di soluzione di blu di metilene per la colorazione duttale, seguita dall'elettrocoagulazione per indurre l'ostruzione duttale localizzata (Figura 1). Questo approccio precipita l'infiammazione e la fibrosi, imitando la CP ostruttiva umana, evitando una risposta infiammatoria diffusa e complicanze sistemiche. Rispetto ai modelli convenzionali, il modello di elettrocoagulazione offre diversi vantaggi: si rivolge specificamente al dotto pancreatico, riduce la variabilità e mitiga le complicanze sistemiche. Fornisce un approccio più specifico per la malattia, riproducibile e versatile per comprendere i meccanismi alla base dell'ostruzione duttale nella CP e il suo ruolo nella progressione della malattia.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l'uso e la cura degli animali della Naval Medical University. Assicurarsi che tutti i materiali chirurgici siano sterili.

1. Laparotomia

1. Somministrare una miscela di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale per l'induzione dell'anestesia. Monitorare la profondità dell'anestesia valutando la perdita del riflesso del pedale e del riflesso corneale. Fornire dosi aggiuntive (20% della dose iniziale) secondo necessità per mantenere un'anestesia adeguata durante la procedura. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi. Posiziona l'animale su un termoforo per mantenere la temperatura corporea.
2. Utilizzare un rifinitore per radere i peli (~2 cm²) tra il petto e il basso addome. Disinfettare l'area chirurgica 3 volte con cicli alternati di clorexidina/iodio e alcol.
3. Fissare i topi alla placca chirurgica utilizzando del nastro chirurgico e applicare teli sterili.
4. Usa le forbici per praticare un'incisione lunga 2 cm nell'addome centrale, seguita da un'incisione di 1 cm tra la parte superiore dell'addome e il processo xifoideo.

2. Localizzazione ed esposizione del pancreas

1. Con l'aiuto di un espansore addominale, individuare l'area del pancreas in cui verrà eseguita l'elettrocoagulazione.
2. Con l'aiuto di un batuffolo di cotone sterile, identificare il duodeno dalla parte posteriore della parte superiore sinistra dell'addome e ruotare il duodeno per visualizzare il dotto biliare chiaro che collega il fegato.

3. Tracciamento del sito chirurgico

1. Utilizzare una clip microvascolare per occludere temporaneamente il dotto biliare comune prossimale e prevenire la fuoriuscita di infusione retrograda nel fegato.
2. Collegare il tubo di polietilene con un diametro interno di 0,25 mm e un diametro esterno di 0,35 mm all'ago con un diametro esterno di 0,25 mm. Utilizzare questo dispositivo per inserirlo attorno all'ampolla. Puntare alla papilla maggiore del duodeno e inserire il tubo al suo interno. Inserire il catetere nel dotto biliare a metà e interrompere l'inserimento.
3. Avviare la pompa per infusione e micropompare la soluzione di blu di metilene allo 0,2% (diluita in soluzione fisiologica allo 0,9%) alla dose di 50 μl/10 g per 2 minuti a una velocità di 50 μl/min. Il dotto pancreatico diventerà gradualmente blu.
4. Al termine della seduta, estrarre il tubo in polietilene e rimuovere la clip microvascolare.

4. Induzione della procedura di elettrocoagulazione

1. Con l'aiuto di tamponi di cotone sterili, fissare il pancreas e dirigere il coltello per elettrocoagulazione verso la parte blu per l'elettrocoagulazione. Il sito di elettrocoagulazione si trova nei 2/3 medi e inferiori tra il dotto biliare comune e l'arteria pancreaticoduodenale superiore.
   1. Per seguire questo studio, utilizzare i seguenti parametri operativi dell'elettrocoagulazione: tensione: 220 V; materiale dell'elettrodo: rame puro; Tempo di trattamento: trattamento nella posizione del pancreas evitando i vasi sanguigni per 2-3 s, fino a quando la posizione marcata blu del metilene viene sostituita da gialla o marrone dopo l'elettrocoagulazione; Dimensioni dell'area operativa: A seconda dei topi, l'area di elettrocoagulazione si trova sul retro del pancreas. Scegliere la posizione tra il dotto biliare comune e l'arteria pancreatico duodenale antero-superiore; temperatura: 300 °C.
2. Terminare l'elettrocoagulazione quando la soluzione colorante blu non è visibile.
3. Chiudere l'addome con suture riassorbibili 4-0 e la pelle con suture in polipropilene monofilamento non assorbente 4-0. Non impiegare più di 20 minuti tra la laparotomia e la sutura.
4. Trattare il gruppo di controllo allo stesso modo dei topi sperimentali, ma assicurarsi che i componenti dell'infusione siano costituiti solo da blu di metilene. Nel gruppo di controllo (Sham), somministrare l'iniezione di blu di metilene, ma non eseguire un intervento chirurgico di elettrocoagulazione.

5. Mantenere in vita gli animali

1. Per la cura postoperatoria della ferita del topo dopo un intervento chirurgico addominale, esaminare quotidianamente l'incisione per sanguinamento o arrossamento: se si verifica sanguinamento, applicare una leggera pressione con una garza sterile per fermarlo e quindi cambiare la medicazione e, se c'è arrossamento, applicare unguento all'eritromicina una volta al giorno, adottando anche misure per evitare che il topo rosicchi la ferita. Per quanto riguarda l'analgesia, somministrare carprofene (5 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale subito dopo l'intervento chirurgico, quindi una volta ogni 24 ore per 3 giorni consecutivi.

6. Metodi di analisi

1. Misurare gli indici biochimici sierici e osservare i cambiamenti patologici nel tessuto pancreatico al 7°, 14°, 21° e 28° giorno di elettrocoagulazione.
2. Anestetizzare l'animale con una miscela di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale e raccogliere circa 500 μL di sangue attraverso il plesso orbitale.
3. Tenere delicatamente la pelle sul retro per facilitare una leggera sporgenza del bulbo oculare.
4. Posizionare l'estremità del capillare nell'angolo dell'occhio e inserirla delicatamente sotto il bulbo oculare con un angolo di circa 30°-45°. Ruotare il capillare fino a quando il sangue inizia a fluire.
5. Al termine della raccolta, tenere le palpebre chiuse esercitando una leggera pressione con una garza.
6. Centrifugare il siero (1.200 × g, 15 min) e rimuovere il surnatante per la determinazione dell'amilasi, della bilirubina e dell'acido ialuronico (passaggio 6.10).
7. Anestetizzare i topi con ketamina-xilazina, confermare che sono in uno stato anestetico profondo (nessun riflesso del pedale o riflesso corneale), quindi eseguire la lussazione cervicale per l'eutanasia.
8. Posiziona i topi soppressi sul tavolo operatorio a 4 °C e usa forbici e pinze per praticare un'incisione a "V" nella parete addominale per esporre la cavità addominale. Rimuovere il pancreas dei topi e dividere l'organo in tre parti per la colorazione.
9. Processare il pancreas fissandolo in una soluzione di poliformaldeide al 4% e incorporarlo nella paraffina. Tagliare i blocchi di paraffina del pancreas in sezioni spesse 0,5 mm e colorarle con ematossilina ed eosina (HE) e con la colorazione di Masson per la visualizzazione al microscopio ottico. Utilizzare il tessuto pancreatico incluso in paraffina per l'analisi immunoistochimica.
10. Misurare l'amilasi (U/dL), la bilirubina (mmol/L) e l'acido ialuronico (μg/L) utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le raccomandazioni dei produttori.

Risultati

Gli animali sono stati divisi in un gruppo di controllo (solo iniezione di blu di metilene per la coagulazione elettrica) e un gruppo di coagulazione elettrica, per un totale di 20 topi in ciascun gruppo. Il tasso di mortalità è stato dello 0% nel gruppo di controllo e del 15% nel gruppo di coagulazione elettrica; Il tasso di successo nella costruzione del modello (numero di topi modello vivi) è stato del 71%. In ogni gruppo, una dozzina di animali sono stati scelti per la valutazione patologica. Tre topi in ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente il 7°, 14°, 21° e 28° giorno per HE, Masson e colorazione immunoistochimica. Il processo di modellazione è illustrato nella Figura 1. Dopo aver tracciato con blu di metilene, abbiamo elettrocoagulato la posizione tra il dotto biliare comune e l'arteria pancreatico duodenale anteriore superiore sul pancreas dei topi. Se l'area di elettrocoagulazione viene selezionata nella parte centrale e inferiore della posizione con un'area inferiore a un terzo, è probabile che l'effetto non soddisfi le aspettative. Tuttavia, se supera i 2/3, è probabile che i topi muoiano entro 72 ore dall'elettrocoagulazione, il che è probabilmente dovuto a una grave pancreatite acuta che si verifica dopo che il dotto pancreatico è completamente ostruito.

Da ciò, concludiamo che il 14° giorno dopo l'elettrocoagulazione, si può osservare un'immagine istologica di pancreatite cronica nel pancreas dei topi (come mostrato nella Figura 1), che non è completamente ostruito ma si forma dopo il blocco parziale del dotto pancreatico. Il tessuto al giorno 7 ha mostrato un leggero edema tissutale e il tessuto non ha mostrato evidenza di pancreatite cronica. Il giorno 14, la colorazione HE del tessuto pancreatico ha mostrato che le cellule acinose pancreatiche erano sparse. Il 21 ° giorno, il grado di infiammazione delle cellule acinose nel tessuto pancreatico si è gradualmente ripreso. C'erano segni di inversione dei cambiamenti patologici nel tessuto il giorno 28 (Figura 2). Ciò potrebbe essere dovuto a un'insufficiente elettrocoagulazione del dotto pancreatico durante il processo di elettrocoagulazione, nonché all'effetto compensatorio del dotto pancreatico rimanente dopo l'ostruzione parziale del dotto pancreatico.

La colorazione di Masson ha mostrato che il grado di fibrosi nel gruppo operatorio era significativamente più grave di quello nel gruppo operatorio fittizio. I punteggi immunoistochimici per la colorazione di col-1 e SMA (alfa-actina muscolare liscia) erano più alti (Figura 3). La presenza di pancreatite cronica nel tessuto pancreatico è stata osservata mediante analisi patologica il giorno 14 e le variazioni prima e dopo sono state confrontate mediante colorazione HE solo nell'analisi patologica successiva. Attraverso l'analisi degli indicatori biochimici sierici, le concentrazioni sieriche di amilasi, bilirubina e acido ialuronico sono risultate più elevate nel gruppo di coagulazione elettrica rispetto al gruppo di controllo, indicando l'inizio della pancreatite cronica (Figura 4).

Figura 1: Illustrazione schematica della pancreatite cronica ostruttiva indotta attraverso l'elettrocoagulazione nei topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Colorazione con ematossilina-eosina dei tessuti pancreatici nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Colorazione dell'ematossilina-eosina e di Masson e immunoistochimica del pancreas. Abbreviazioni: Col-1 = collagene alfa-1 di tipo 1; SMA = actina del muscolo alfa-liscio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi degli indici biochimici sierici dei topi in periodi diversi. (A) Concentrazione sierica di acido ialuronico (μg/L). (B) Concentrazione sierica di bilirubina (mmol/L). (C) Concentrazione sierica di amilasi (U/dL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il rischio e la gravità della pancreatite sono determinati da fattori genetici e ambientali⁶. La cura completa della pancreatite clinica è un obiettivo in gastroenterologia, con la creazione di modelli animali come primo passo. Esistono vari metodi per stabilire questi modelli, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi 7,8,9,10,11.

I chirurghi hanno utilizzato l'elettrocoagulazione ad alta frequenza per eseguire l'ablazione termica endoluminale (ETHA) nel dotto pancreatico principale per ridurre la secrezione esocrina pancreatica, riducendo così l'incidenza della fistola pancreatica postoperatoria (POPF) dopo duodenectomia pancreatica (PD)¹². Ciò suggerisce che il metodo di termoablazione che causa l'atrofia pancreatica è stato implementato nella pratica clinica. Abbiamo sviluppato un nuovo modello di pancreatite ostruttiva utilizzando il blu di metilene per visualizzare il dotto pancreatico ed elettrocoagularlo con precisione.

Per questo esperimento sono stati selezionati topi maschi di 8 settimane C57BL/6. I topi femmina hanno un ciclo riproduttivo e i livelli di ormoni nel corpo possono avere un impatto sui dati sperimentali. A 8 settimane di età, i topi erano nel fiore degli anni con organi del corpo maturi e un buon indice di salute della vita, e i topi maschi della stessa età erano di dimensioni più forti. Nel 1 mese di osservazione postoperatoria, abbiamo campionato il pancreas di topo a 7, 14, 21 e 28 giorni; I risultati ottenuti a 14 giorni sono più conformi alle caratteristiche patologiche della pancreatite.

Ci sono diversi avvertimenti a questo approccio. In primo luogo, il dotto biliare comune deve essere bloccato il più vicino possibile all'ilo epatico per facilitare l'iniezione del colorante nel dotto pancreatico. In secondo luogo, è necessario prestare attenzione alla velocità e al tempo di iniezione del colorante blu di metilene nel dotto pancreatico. Il dotto pancreatico non può essere visto con una quantità insufficiente di soluzione colorante e troppa soluzione colorante ostacolerà l'identificazione della posizione del dotto pancreatico principale nel campo chirurgico. In terzo luogo, l'elettrocoagulazione è stata interrotta quando la soluzione colorante blu non poteva essere vista. In questi esperimenti, l'intervento chirurgico viene eseguito nell'area indicata dalla colorazione blu di metilene, perché l'area del pancreas del topo che viene elettrocoagulata sarà diversa, motivo per cui la colorazione blu di metilene viene utilizzata per tracciare il dotto pancreatico. In quarto luogo, qualsiasi sanguinamento sul pancreas durante l'intervento chirurgico deve essere fermato immediatamente. Allo stesso tempo, il coltello per elettrocoagulazione dovrebbe essere utilizzato per tagliare il pancreas. Se il coltello per elettrocoagulazione è attaccato al pancreas per qualsiasi motivo, il tempo di elettrocoagulazione deve essere prolungato. Questo è il modo più comune per prevenire l'insorgenza di gravi complicanze postoperatorie causate da perdite pancreatiche.

Tuttavia, ci sono degli svantaggi in questo metodo. La competenza dell'operatore influenza direttamente l'esito dell'esperimento e l'uniformità dell'intervento chirurgico tra i diversi topi influenza il tasso di successo del modello. Questo modello simula gli effetti dei calcoli biliari o dell'ostruzione del dotto pancreatico, portando a ripetuti attacchi di pancreatite acuta, che alla fine causano pancreatite cronica. Questo potrebbe spiegare gli elevati livelli di bilirubina. Pertanto, questo modello può essere sviluppato anche come modello di pancreatite acuta in base al grado di elettrocoagulazione. I primi esperimenti sul pancreas di topi 3 giorni dopo l'elettrocoagulazione hanno mostrato le caratteristiche della pancreatite acuta, ma le complicanze postoperatorie hanno abbassato il tasso di successo del modello per la pancreatite acuta. Tuttavia, non si può escludere che il calore generato dall'elettrocauterizzazione durante il processo di elettrocoagulazione possa essersi diffuso al dotto biliare principale. Vale la pena esplorare la questione di come indurre stabilmente la pancreatite acuta attraverso l'elettrocoagulazione.

Rispetto al tradizionale metodo di iniezione della ceruleina, che richiede iniezioni ripetute per diverse settimane, il metodo dell'elettrocoagulazione consente di risparmiare tempo ed è più conveniente. Mentre l'iniezione di ceruleina dimostra un'eccellente stabilità e facilità d'uso, l'elettrocoagulazione richiede ~20 minuti e consente di risparmiare tempo per gli esperimenti successivi.

Lo sviluppo di nuovi modelli ha l'obiettivo di studiare la storia naturale della malattia e sviluppare terapie mirate. Il nostro nuovo modello animale aiuta a simulare la pancreatite cronica causata dall'ostruzione del dotto pancreatico nei topi, inclusa la pancreatite retrograda colangiopancreatografia post endoscopica (ERCP)¹³.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Clip microvascolare da 16 mm	Stronger, Ningbo, Cina
Sutura assorbibile	Fabbrica di Dispositivi Medici Jinhuan di Yangzhou	4-0	-
Carprofen	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	C830557-5g	-
Capillare	Tygon, USA	AAQ(AAD)04091	0,25 x 0,3 mm
Coltello per elettrocoagulazione	Shun Ye MEDICAL Equipment Co., LTD, Ningbo, Cina	Shun Ye BDD-YE-DF-1
Forbici per gli occhi
Iniezione di Ketamina Cloridrato (Ketaset CIII)	Zoetis Inc.	S5564	-
Soluzione di colorazione al blu di metilene	Solarbio, Shanghai, Cina	G1303
Sutura monofilamento in polipropilene 4-0 non assorbente	Jinhuan, Shanghai, Cina
Microscopio operativo	Murzider, Guangdong, Cina	MSD203
Pinze oftalmiche
Tampone rotondo della testa	Olga Sherer, Huaximedical, Cina
Ago per siringa	Minank, Zhejiang, Cina		0,25 mm
Pinze tissutali
Forbici tessuti	Shanghai Puxin Instrument Technology Corporation
Iniezione di cloridrato di xilazina	Salute Animale di Bayer	XYL-50-20	-