Articolo metodologico

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

DOI:

10.3791/67078

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26 luglio 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Abstract

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Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) che svolgono numerose funzioni che supportano la salute neuronale e l'omeostasi del SNC. Sono una delle principali popolazioni di cellule immunitarie associate all'attività della malattia del SNC, adottando fenotipi reattivi che potenzialmente contribuiscono al danno neuronale durante le malattie neurodegenerative croniche come la sclerosi multipla (SM). I meccanismi distinti con cui le microglia regolano la funzione neuronale e la sopravvivenza durante la salute e la malattia rimangono limitati a causa delle sfide nella risoluzione delle complesse interazioni in vivo tra microglia, neuroni e altri fattori ambientali del SNC. Pertanto, l'approccio in vitro di co-coltura di microglia e neuroni rimane uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni microglia-neuroni. Qui, presentiamo un protocollo per generare e co-coltivare microglia primarie e neuroni da topi. In particolare, le microglia sono state isolate dopo 9-10 giorni in vitro da una coltura gliale mista stabilita da omogenati cerebrali derivati da topi neonati tra i giorni post-natali 0-2. Le cellule neuronali sono state isolate da cortecce cerebrali di embrioni di topo tra i giorni embrionali 16-18. Dopo 4-5 giorni in vitro, le cellule neuronali sono state seminate in piastre a 96 pozzetti, seguite dall'aggiunta di microglia per formare la co-coltura. Un'attenta tempistica è fondamentale per questo protocollo, poiché entrambi i tipi di cellule devono raggiungere la maturità sperimentale per stabilire la co-coltura. Nel complesso, questa co-coltura può essere utile per studiare le interazioni microglia-neurone e può fornire più letture, tra cui la microscopia a immunofluorescenza, l'imaging dal vivo e i saggi di RNA e proteine.

Introduzione

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Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti che facilitano l'immunosorveglianza e l'omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC)1,2,3. Originano dalle cellule progenitrici eritromieloidi del sacco vitellino che colonizzano il cervello durante lo sviluppo embrionale 4,5,6 e vengono mantenute per tutta la durata della vita dell'organismo attraverso l'autorinnovamento, che comporta la proliferazione e l'apoptosi7. Allo stato stazionario, le microglia a riposo hanno una morfologia ramificata e si impegnano nella sorveglianza dei tessuti 8,9,10.

Le microglia esprimono numerosi recettori della superficie cellulare, che consentono loro di rispondere rapidamente ai cambiamenti nel SNC11,12 e di promuovere risposte infiammatorie in caso di infezioni o lesioni tissutali 12,13,14, nonché durante le malattie neurodegenerative 9,15, come la sclerosi multipla (SM)16,17. Le microglia esprimono anche recettori per vari neurotrasmettitori e neuropeptidi 18,19,20, il che suggerisce che possono anche rispondere e regolare l'attività neuronale 21,22. Infatti, la microglia e i neuroni interagiscono in varie forme di comunicazione bidirezionale 8,23 come le interazioni dirette mediate dalle proteine di membrana o le interazioni indirette attraverso fattori solubili o cellule intermedie23,24.

Ad esempio, vari neurotrasmettitori secreti dai neuroni possono modulare l'attività neuroprotettiva o infiammatoria della microglia 25,26,27. Inoltre, le interazioni dirette tra i neuroni e la microglia aiutano a mantenere la microglia in uno stato omeostatico28. Al contrario, le interazioni dirette della microglia con i neuroni possono modellare i circuiti neuronali29 e influenzare la segnalazione neuronale 30,31,32. Poiché le interruzioni di queste interazioni inducono ipereccitabilità dei neuroni30 e reattività della microglia33,34, le interazioni disregolate microglia-neuroni sono implicate come fattore che contribuisce alle malattie neurologiche33,35. Infatti, è stato descritto che le malattie psicotiche23,26 e neurodegenerative mostrano interazioni disfunzionali microglia-neuroni33. Sebbene queste osservazioni evidenzino l'importanza della comunicazione microglia-neuroni nel SNC, i meccanismi specifici di come queste interazioni regolano le funzioni microgliali e neuronali in salute e malattia sono relativamente sconosciuti.

All'interno di un ambiente complesso come il SNC, molteplici fattori ambientali possono influenzare le interazioni microglia-neuronali, il che limita la capacità di studiare le interazioni cellulari transitorie in vivo. Qui, presentiamo un sistema di co-coltura microglia-neuroni in vitro che può essere utilizzato per studiare le interazioni cellulari dirette tra microglia e neuroni. Questo protocollo descrive la generazione di microglia primarie e neuroni dalle cortecce di topi neonatali tra i giorni post-natali 0-2 e i giorni 16-18 dei topi embrionali, rispettivamente. I neuroni e la microglia vengono quindi co-coltivati in piastre da 96 pozzetti per esperimenti ad alto rendimento a valle. In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per dimostrare che la fagocitosi della microglia protegge i neuroni dalla morte cellulare mediata dalla fosfatidilcolina ossidata37, suggerendo che questo metodo può aiutare a comprendere i ruoli della microglia nel contesto della neurodegenerazione e della SM. Allo stesso modo, le co-colture microglia-neuroni possono anche essere utili per studiare l'impatto del crosstalk microglia-neuronale in altri contesti come le infezioni virali38 o il danno e la riparazione neuronale39. Nel complesso, i sistemi di co-coltura microglia-neuroni in vitro consentono ai ricercatori di studiare le interazioni microglia-neuroni in un ambiente manipolabile e controllato, che integra i modelli in vivo.

Protocollo

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Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati alloggiati e gestiti con l'approvazione dell'University Animal Care Committee (UACC) dell'Università del Saskatchewan e del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Per questo studio sono stati utilizzati giorni post-natali 0-2 topi CD1 maschi e femmine e embrioni embrionali giorni 16-18 (E16-18) di topi CD1 gravidi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura primaria della microglia

NOTA: È fondamentale cronometrare le colture misti di glia e neuroni in modo che le microglia siano mature e pronte per il raccolto entro 2 giorni dopo che i neuroni sono stati seminati in una piastra a 96 pozzetti.

  1. Preparazione
    1. Preriscaldare i terreni di coltura gliale completi, che includono il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente, 50 U/mL di penicillina/streptomicina con 2,92 mg/mL di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 1 x aminoacidi non essenziali e 20 mM di HEPES in un bagno d'acqua a 37 °C.
    2. Aggiungere 5 mL di bromidrato di poli-L-ornitina (PO) da 10 μg/mL a ciascun matraccio T-75. Agitare delicatamente il pallone per assicurarsi che l'ordine di acquisto copra completamente il fondo del pallone. Incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per almeno 1 ora.
      NOTA: Questa fase di rivestimento è necessaria per facilitare l'adesione delle cellule ai palloni T-75.
  2. Isolamento di cervelli da topi neonatali P0-P2
    NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione e mantenere la sterilità dei reagenti. Garantire l'aderenza alle tecniche asettiche in tutto il processo.
    1. Prima di iniziare la dissezione, spruzzare sul piano di lavoro con etanolo al 70% o spray disinfettante nel punto in cui avverrà la dissezione. Impostare il microscopio di dissezione e posizionare la capsula di Petri sotto il microscopio. Versare 20 mL di terreno L-15 di Leibovitz nella capsula di Petri. Tenere il coperchio della capsula di Petri quando il microscopio non è in uso per ridurre la contaminazione.
    2. Metti diversi strati di carta assorbente e spruzza accuratamente i tovaglioli di carta con etanolo al 70%. Preparare gli strumenti di dissezione (forbici da dissezione, un paio di micro-pinze e pinze per tessuti) spruzzandoli accuratamente con etanolo al 70% e appoggiando gli strumenti sui tovaglioli di carta.
    3. Trasferire il topo post-natale 0-2 sui tovaglioli di carta e spruzzare accuratamente il topo con etanolo al 70%. Decapitare il topo utilizzando le forbici da dissezione (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
    4. Tenendo delicatamente la testa, creare un'incisione sulla linea mediana nel cranio partendo dal collo fino al naso. Stacca il cranio con una pinza per tessuti per rivelare il cervello.
    5. Usando una pinza per tessuti, estrai delicatamente il cervello inserendo la pinza sotto il cervello e solleva il cervello dalla testa. Inserire immediatamente il cervello nella capsula di Petri contenente 20 ml di terreno L-15 di Leibovitz.
    6. Al microscopio da dissezione, rimuovere con cautela il tronco encefalico e le meningi utilizzando un paio di micropinze. Raccogliere il cervello in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di terreno L-15 di Leibovitz.
  3. Dissociazione cerebrale, semina e mantenimento della coltura gliale mista
    NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in una cabina di biosicurezza.
    1. Tritare il cervello in circa 1 mm2 pezzi con una lama di bisturi sterile usa e getta. Trasferire con cura i cervelli tritati in una nuova provetta sterile da 50 ml.
    2. Al cervello tritato, aggiungere una concentrazione finale di tripsina allo 0,25% e incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti. Ogni 2-3 minuti, mescolare la soluzione capovolgendo delicatamente il tubo per favorire la dissociazione dei tessuti.
    3. Dall'incubatore al 5% di CO2 , trasferire le fiasche T-75 contenenti 5 mL di PO nella cappa di biosicurezza. Scartare l'PO e sciacquare i palloni 3 volte con una soluzione tampone fosfato sterile 1x (PBS). Assicurarsi di sciacquare accuratamente le fiasche poiché l'eccesso di PO è tossico per le cellule.
    4. Trasferire il tessuto digerito dal bagnomaria a 37 °C nella cabina di biosicurezza. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura gliale completo per neutralizzare la tripsina. Miscelare delicatamente la sospensione tissutale utilizzando una pipetta da 10 mL.
    5. Posizionare un colino sterile a rete di nylon da 70 μm su una provetta conica sterile da 50 ml e bagnare la rete versando circa 5 ml di L-15. Decantare con cura la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare. Rimuovere lo stantuffo da una siringa sterile da 1 ml, macinare il tessuto nella rete utilizzando lo stantuffo per eliminare i grumi di tessuto e generare una sospensione cellulare omogeneizzata.
    6. Periodicamente, versare circa 5 mL di terreno L-15 di Leibovitz nella rete di nylon da 70 μm e continuare a macinare il tessuto sulla rete con lo stantuffo della siringa da 1 mL. Quando rimane poco o nessun tessuto visibile sulla rete, scartare la rete e mettere da parte la sospensione cellulare.
    7. Miscelare la sospensione cellulare pipettando delicatamente su e giù. A ciascun pallone, aggiungere volumi uguali di sospensione cellulare contenente 1-2 cervelli con terreno di coltura gliale fino a un volume finale di 15 mL.
    8. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per una notte. Il giorno seguente, lavare le fiasche due volte con 1x PBS sterile per rimuovere cellule e detriti non attaccati.
    9. Aggiungere 15 mL di terreno di coltura gliale completo fresco alla coltura e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . Dopo 3 giorni, sostituire metà del terreno con 10 mL di terreno di coltura gliale fresco integrati con 40 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi (MCSF).
      NOTA: Successivamente, metà del terreno viene sostituito con 10 mL di terreno di coltura gliale fresco integrati con 40 ng/mL di MCSF ogni 3 giorni. La coltura viene mantenuta per 8-10 giorni prima che le microglia vengano raccolte.

2. Coltura neuronale primaria

  1. Preparazione
    1. Scongelare l'integratore B-27 plus dal sistema di coltura neuronale B-27 plus. Terreno neurobasale più pre-riscaldato dal sistema di coltura neuronale B-27 plus, 1x Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS) a 37 °C in un bagno d'acqua.
    2. Rivestire i matracci T-25 con 5 mL di 10 μg/mL di PO e incubare i flaconi per almeno 1 ora a 37 °C. Preparare gli strumenti e le forniture per la dissezione.
      NOTA: Questa fase di rivestimento facilita l'adesione delle cellule ai palloni T-25.
  2. Isolamento cerebrale da embrioni di topo E16-E18
    NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione e mantenere la sterilità dei reagenti. Garantire l'aderenza alle tecniche asettiche in tutto il processo.
    1. Prima di iniziare la dissezione, spruzzare sul piano di lavoro con etanolo al 70% o spray disinfettante nel punto in cui avverrà la dissezione. Impostare il microscopio di dissezione e posizionare la capsula di Petri sotto il microscopio. Versare 20 mL di 1x HBSS nella capsula di Petri. Tenere il coperchio della capsula di Petri quando il microscopio non è in uso per ridurre la contaminazione.
    2. Metti diversi strati di carta assorbente e spruzza accuratamente i tovaglioli di carta con etanolo al 70%. Preparare gli strumenti di dissezione (forbici a molla, un paio di micro-pinze e pinze per tessuti) spruzzandoli accuratamente con etanolo al 70% e appoggiando gli strumenti sui tovaglioli di carta.
    3. Anestetizzare una topolina gravida tra i giorni di gestazione 16-18 usando isoflurano e sopprimere la topo mediante lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
    4. Appoggia il topo sulla schiena su un pezzo di carta assorbente imbevuto di etanolo al 70%. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70%. Sollevare la pelle del basso addome con una pinza per tessuti ed eseguire un'incisione a forma di V da questo punto alla gabbia toracica inferiore con le forbici da dissezione.
    5. Afferra le corna uterine che contengono gli embrioni con una pinza per tessuti e rimuovi delicatamente gli embrioni dalla cavità addominale. Disinfettare brevemente le corna uterine contenenti embrioni con etanolo al 70%.
    6. Sezionare un embrione dal suo sacco individuale alla volta. Usando le forbici a molla, crea un'incisione sulla linea mediana nella parte superiore del cranio, partendo dalla parte posteriore del collo fino al naso. Quindi, solleva il cranio dal sito di incisione per rivelare il cervello. Estrarre delicatamente il cervello con una pinza per tessuti e trasferire il cervello in una capsula di Petri da 10 cm contenente 15 ml di 1x HBSS.
    7. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con cura il tronco encefalico e le meningi su entrambi i lati della corteccia cerebrale con un paio di micro-pinze. Trasferire le cortecce cerebrali in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di 1x HBSS e metterle sul ghiaccio.
  3. Dissociazione cerebrale e semina di neuroni corticali in coltura cellulare
    NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in una cabina di biosicurezza.
    1. Tritare il cervello in circa 1 mm2 pezzi nella provetta conica da 50 ml con una lama di bisturi sterile monouso. Trasferire i cervelli tritati in una nuova provetta conica sterile da 50 mL.
    2. Aggiungere la tripsina alla provetta con una concentrazione finale dello 0,25%. Immergere la provetta in un bagno di acqua calda a 35-38 °C per 15 minuti e mescolare delicatamente la provetta per omogeneizzare il tessuto ogni 2-3 minuti.
    3. Estrarre il tubo dal bagno di acqua calda. Pipettare delicatamente la sospensione tissutale su e giù per dissociare ulteriormente le cellule, quindi aggiungere 0,5 ml di FBS inattivato dal calore alla sospensione omogeneizzata per neutralizzare l'attività della tripsina. Evitare le bolle d'aria per ridurre al minimo la tossicità per le cellule neuronali.
    4. Posizionare un colino sterile a rete di nylon da 70 μm su una provetta conica sterile da 50 ml e bagnare la rete aggiungendo circa 5 ml di terreno neurobasale. Filtrare la sospensione cellulare attraverso il filtro a rete di nylon da 70 μm. Utilizzando uno stantuffo della siringa da 1 mL, macinare delicatamente il tessuto nel colino cellulare. Versare periodicamente circa 5 mL di 1x HBSS continuando a macinare per lavare il filtro cellulare.
    5. Centrifugare la provetta conica a 300 x g per 5 min a 4 °C. Durante questo periodo, diluire l'integratore di B-27 plus in terreni neurobasali plus a una concentrazione finale pari a 1x da utilizzare come terreno neurobasale completo.
    6. Gettare l'PO nei matracci T-25 e sciacquare i flaconi tre volte con 5 ml di 1x PBS.
    7. Decantare con cura per rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù 2-3 mL di terreno neurobasale completo. Determinare la concentrazione cellulare e il numero totale di cellule con un emocitometro e un blu di tripano. Aspettatevi fino a 1,0 x 107 cellule per embrione.
    8. Piastra le cellule nei flaconi di T-25 rivestiti in PO con circa 2,0 x 107 cellule per pallone in 5 ml di terreno neurobasale completo. Incubare la coltura cellulare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
    9. Eseguire un mezzo cambio del terreno ogni 2-3 giorni sostituendo 2,5 mL di terreno dal pallone di coltura con un terreno neurobasale completo appena fatto.

3. Co-coltura di neuroni primari e microglia

NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in una cappa di biosicurezza sterile.

  1. Semina di neuroni in piastre a 96 pozzetti
    1. Aggiungere 100 μl di 10 μg/ml di PO per pozzetto e incubare i palloni per almeno 1 ora a 37 °C per rivestire i pozzetti con PO. Lavare la piastra con 1x PBS 3 volte prima di seminare le cellule e aspirare il liquido rimanente dopo l'ultimo lavaggio.
    2. I neuroni cresciuti in fiasche di T-25 vengono raccolti per la co-coltura dopo 2-5 giorni di coltura. Sostituire il terreno con 5 mL di soluzione 1x Versene con tripsina allo 0,25% e 1 mg/mL di DNasi I per staccare i neuroni dal pallone. Posizionare i palloni all'interno dell'incubatore per 5-6 minuti per la digestione e agitare delicatamente il pallone ogni 2-3 minuti per favorire il distacco delle cellule.
    3. Estrarre il pallone dall'incubatrice e controllare se le cellule sono state staccate al microscopio. Aggiungere 0,5 mL di FBS inattivato termicamente per neutralizzare la tripsina e la DNasi I. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Lavare il matraccio con 5 ml di terreno neurobasale completo una volta per massimizzare i neuroni raccolti. Raccogliere tutte le cellule nella stessa provetta conica da 15 mL.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 2-3 mL di terreno neurobasale completo.
    5. Contare le cellule con un emocitometro e aggiungere un terreno neurobasale completo per ottenere una concentrazione finale di 7,5 x 105 neuroni/mL. Seminare 100 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita in PO per ottenere 7,5 x 104 neuroni/pozzetto. Si prevede una resa di 5-6 milioni di neuroni per fiaschetta.
    6. Incubare i neuroni in una piastra a 96 pozzetti durante la notte. Aggiungere 100 μL di terreno neurobasale completo a ciascun pozzetto il giorno successivo.
      NOTA: Una volta che i neuroni mostrano un'appropriata crescita del processo neuritico (circa il giorno 3-4 dopo la semina in piastre a 96 pozzetti), sono pronti per la co-coltura con la microglia.
  2. Isolamento e co-coltura microglia-neuronale
    1. Tra 8-10 giorni di coltura mista della glia, raccogliere le microglia lavando delicatamente i flaconi T-75 con terreni di coltura gliale in ciascun pallone con una pipetta da 10 ml e trasferire le cellule e i terreni in una provetta conica sterile da 50 ml. Lavare nuovamente i palloni con 10 mL di terreno di coltura gliale fresco per staccare altre microglia dai palloni e raccogliere il terreno. Si prevede una resa di 7,5 x 105 microglia per pallone.
    2. Aggiungere 20 mL di terreno di coltura gliale fresco integrato con 20 ng/mL di MCSF in ciascun pallone. Le microglia possono essere raccolte una o due volte se la coltura di glia mista viene mantenuta.
    3. Centrifugare la raccolta cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 mL di terreno neurobasale completo.
    4. Contare le cellule con un emocitometro e il blu di tripano. Aggiungere un terreno neurobasale completo a una concentrazione finale di 2,5 x 105 cellule/mL.
    5. Dalla piastra di coltura neuronale a 96 pozzetti, rimuovere 100 μL di terreno neurobasale e aggiungere 100 μL di sospensione cellulare 2,5 x 105 cellule/mL per seminare 2,5 x 104 microglia per pozzetto di 7,5 x 104 neuroni. Incubare la coltura per una notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per consentire alla microglia di depositarsi. La co-coltura può ora essere utilizzata per esperimenti a valle.

Risultati

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Un diagramma di flusso che mostra le fasi chiave della coltura di glia mista per la microglia è mostrato nella Figura 1A. Nel complesso, il giorno 1 sono previste cellule sparse e detriti cellulari eccessivi (Figura 1B). Entro il 4° giorno, si dovrebbe osservare un aumento del numero di cellule, specialmente con la generazione di astrociti aderenti, come indicato dalla loro morfologia allungata (Figura 1C). Alcune microglia possono essere osservate sopra gli astrociti o come piccole cellule rotonde che galleggiano nei mezzi. Entro l'ottavo giorno, uno strato confluente di astrociti formerà gli strati aderenti delle cellule, mentre le microglia appariranno come cellule rotonde e luminose semi-attaccate agli astrociti o che galleggiano in mezzi (Figura 1D). Se la densità microgliale è bassa entro l'ottavo giorno, la coltura può essere incubata per ulteriori giorni prima del raccolto.

Un diagramma di flusso che mostra le fasi chiave della coltura neuronale è mostrato nella Figura 2A. In una coltura sana, i neuroni si attaccheranno e formeranno processi neuritali dopo 1-3 giorni in vitro (Figura 2B). Allo stesso modo, dopo aver seminato i neuroni in una piastra a 96 pozzetti, appariranno inizialmente rotondi, ma entro il terzo giorno i neuroni dovrebbero diventare aderenti e formare processi neuritali che si collegano con i neuroni vicini (Figura 2C). Al contrario, le colture di neuroni malsane conterranno grumi cellulari e detriti cellulari, che possono derivare da una dissociazione cellulare carente o da una cattiva gestione dei neuroni (Figura 2D).

Un diagramma di flusso che mostra le fasi chiave del protocollo di co-coltura microglia-neuroni è mostrato nella Figura 3A. Dopo aver aggiunto 2,5 x 104 microglia a 7,5 x 104 neuroni, le microglia rotonde e grandi dovrebbero apparire sopra o tra i neuroni e i processi neuritici (Figura 3B). Per visualizzare ulteriormente la co-coltura microglia-neuroni, la microglia e i neuroni da soli o in co-coltura sono stati marcati con la molecola adattatrice ionizzata legante il calcio 1 (IBA-1, rosso) e gli anticorpi tubulina βIII (TUJ1, verde)37 per la microscopia a immunofluorescenza (Figura 3C-F).

Processo di coltura cellulare: sospensione di singole cellule da cortecce di topo; passaggi mostrati nel diagramma; immagini al microscopio.
Figura 1: Panoramica della coltura primaria della microglia. (A) Diagramma di flusso delle fasi chiave nella generazione di una coltura mista di gliale. (B-D) Immagini rappresentative al microscopio a campo chiaro 10x di colture gliali miste il giorno 1 (B), il giorno 4 (C) e il giorno 8 (D). Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma del processo di coltura neuronale; Preparazione e imaging di cellule embrionali di topo in piastre T25 a 96 pozzetti.
Figura 2: Panoramica sulla coltura dei neuroni primari. (A) Diagramma di flusso dei passaggi chiave nella generazione dei neuroni. (B) Immagini rappresentative al microscopio a campo chiaro 10x che mostrano neuroni coltivati in fiasche di T-25. (C) Microscopio rappresentativo a campo chiaro 10x di neuroni coltivati in una piastra a 96 pozzetti. (D) Microscopio rappresentativo a campo chiaro 10x di un cluster neuronale malsano in una piastra a 96 pozzetti. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Flusso di lavoro di isolamento della microglia e analisi al microscopio; Le immagini in immunofluorescenza mostrano marcatori cellulari.
Figura 3: Panoramica della co-coltura microglia-neurone. (A) Diagramma di flusso delle fasi chiave per la co-coltura microglia-neuronale. (B) Immagini rappresentative al microscopio a campo chiaro 10x della co-coltura microglia-neuronale in piastre a 96 pozzetti. Barre della scala: 100 μm. (C,D) Immagini rappresentative al microscopio a immunofluorescenza dei soli neuroni (C), della sola microglia (D), della co-coltura di neuroni e microglia del giorno 2 (E) o della co-coltura di neuroni e microglia (F) di 12 giorni in una piastra a 96 pozzetti. La microglia e i neuroni sono marcati rispettivamente con IBA-1 (rosso) e tubulina βIII (verde). I nuclei sono colorati con DAPI (blu). Le immagini in immunofluorescenza sono state acquisite utilizzando un obiettivo a immersione in acqua 25x, 0,8 NA, con un microscopio a fluorescenza a campo largo. Barre della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Questo articolo descrive un protocollo per isolare e coltivare i neuroni primari di topo e la microglia primaria, che vengono successivamente utilizzati per stabilire una co-coltura microglia-neurone che può essere utilizzata per studiare come le interazioni tra microglia e neuroni regolano la loro salute e funzione cellulare. Questo approccio relativamente semplice e accessibile può fornire informazioni critiche sui meccanismi e sugli esiti funzionali delle interazioni dei neuroni della microglia nel SNC.

Per ottenere una co-coltura ottimale, diversi aspetti critici di questo protocollo richiedono un'attenzione particolare. Durante gli isolamenti cerebrali (passaggi 1.2.6 e 2.2.7), le meningi attaccate alla superficie del cervello embrionale e post-natale devono essere rimosse completamente prima di raccogliere i tessuti. Come altri protocolli neurogliali, la rimozione incompleta delle meningi può causare la contaminazione della coltura cellulare con cellule endoteliali o cellule derivate dal sangue 40,41,42. Inoltre, quando si coltivano i neuroni primari (passaggi 2.3.7 e 3.1.4), è fondamentale generare una sospensione a singola cellula ed evitare aggregazioni cellulari prima di seminare i neuroni in fiasche o piastre a 96 pozzetti. Gli aggregati neuronali non aderiranno correttamente alla coltura e porteranno a un eccessivo stress neuronale e alla morte cellulare. Inoltre, il trattamento prolungato dei neuroni con tripsina quando si tenta di dissociarli dalle fiasche di T-25 può causare la morte cellulare indesiderata (passaggio 3.1.2). Per mitigare questo, i neuroni possono essere seminati direttamente in piastre a 96 pozzetti alla densità cellulare desiderata dopo la dissociazione dal cervello embrionale (passaggio 2.3.7). Inoltre, in questo protocollo, è stato selezionato un rapporto neurone/microglia 3:1 che rappresenta parzialmente un'elevata quantità di microglia che può essere presente nel microambiente del SNC durante la neuroinfiammazione. In alternativa, il rapporto tra le cellule nella co-coltura può essere regolato in base alle esigenze sperimentali. Inoltre, il punto temporale selezionato per i neuroni di co-coltura può essere esteso se si mira a valutare stati neuronali più maturi.

In particolare, quando si dissociano i neuroni da fiasche di T-25 a piastre a 96 pozzetti, l'uso della sola tripsina può provocare una dissociazione incompleta e la formazione di grumi cellulari invece di una coltura monostrato in piastre a 96 pozzetti (Figura 2D). Per risolvere questo problema, i neuroni possono essere dissociati dal pallone di T-25 utilizzando 1 soluzione di Versene contenente 1 mg/mL di DNasi I. Altri fattori che contribuiscono all'aggregazione neuronale e alla ridotta vitalità includono la triturazione incompleta della sospensione cellulare, l'inadeguata neutralizzazione della tripsina con FBS inattivato dal calore, l'eccessiva centrifugazione o la prolungata formazione di pellet cellulari. Pertanto, garantire una corretta dissociazione tissutale e la generazione di una sospensione di una singola cellula sono fondamentali per stabilire una co-coltura sana di microglia e neuroni.

Questo protocollo mira a ricapitolare le interazioni microglia-neuroni in vitro per comprendere meglio l'importanza funzionale delle loro interazioni nel SNC. Mentre sono stati sviluppati altri tipi di sistemi di co-coltura, come la coltura di singole popolazioni cellulari su superfici diverse per consentire il trattamento indipendente di due popolazioni cellulari43,44, questo sistema di coltura mista consente il contatto diretto e ravvicinato di microglia e neuroni. Inoltre, se mantenuto correttamente attraverso i cambi di semiterreno ogni 3 giorni, questo sistema di coltura mista può rimanere sano da 12 giorni (Figura 3F) a potenzialmente 3 settimane, consentendo studi a lungo termine delle interazioni neuronale-microglia45.

Sebbene la relativa semplicità del sistema di co-coltura sia vantaggiosa per l'accessibilità, una limitazione chiave di questo approccio è che la coltura cellulare bidimensionale non rappresenta completamente l'ambiente tissutale del SNC. Infatti, una tri-coltura di microglia, neuroni e astrociti ha dimostrato di imitare la risposta neuroinfiammatoria in vivo in modo più affidabile rispetto alla microglia o alla co-coltura astrocita-neurone46,47. Inoltre, i recenti sviluppi nei sistemi di organoidi cerebrali con microglia e altre cellule gliali, inclusi astrociti e oligodendrociti, sono più adatti per studiare l'architettura tissutale tridimensionale (3D) e le interazioni del SNC48. Allo stesso modo, un sistema di tricoltura 3D umana comprendente neuroni, microglia e astrociti si è dimostrato efficace nel modellare la condizione di Alzheimer49. Altre co-colture umane di microglia-neuroni possono essere fisiologicamente più rilevanti per gli studi sulle malattie neurodegenerative. Ad esempio, la co-coltura di microglia e motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane50 può essere utile per studiare malattie come la sclerosi laterale amiotrofica51. Tuttavia, data la relativa abbondanza e il basso costo della generazione di neuroni primari e microglia dai topi, la valutazione della co-coltura microglia-neuroni in piastre a 96 pozzetti può essere un approccio ad alto rendimento per studiare i meccanismi e le implicazioni funzionali delle interazioni microglia-neuronali. I saggi a valle possono includere l'utilizzo dell'imaging su cellule vive per determinare i cambiamenti funzionali cellulari in tempo reale, il sequenziamento dell'RNA per determinare i cambiamenti trascrizionali cellulari, la microscopia a immunofluorescenza per determinare i cambiamenti fenotipici cellulari, la spettrometria di massa per determinare i cambiamenti cellulari e proteomici o il saggio di immunoassorbimento enzimatico e il western blot per misurare le proteine secrete nel surnatante di co-coltura.

Poiché le microglia sono importanti mediatori della salute e delle malattie del SNC, questa co-coltura può essere utilizzata anche per studiare l'effetto di molecole e composti correlati alla malattia sulla comunicazione bidirezionale microglia-neuronale. Nel contesto della SM, la microglia attivata può assumere un ruolo distruttivo, contribuendo al peggioramento della patologia 52,53. Ad esempio, possono secernere citochine pro-infiammatorie e specie reattive dell'ossigeno, oltre a promuovere l'attivazione degli astrociti45. Questo protocollo può aiutare a interrogare ulteriormente il ruolo dannoso della microglia trattando la microglia nella co-coltura con citochine infiammatorie trovate elevate nella SM e valutando i risultati della salute dei neuroni. In alternativa, questa co-coltura microglia-neuroni è stata utilizzata per mostrare l'effetto protettivo della microglia sui neuroni in risposta alla fosfatidilcolina ossidata, un prodotto ossidativo scoperto nella MS54. Inoltre, l'apoptosi neuronale rimodella l'espressione genica della microglia durante lo sviluppo promuovendo la sopravvivenza e la fagocitosi della microglia55. Pertanto, questo protocollo può anche aiutare a determinare l'impatto della morte neuronale sul fenotipo e sulla funzione della microglia.

In sintesi, questo protocollo descrive la generazione e la co-coltura di neuroni primari derivati dal topo e microglia in vitro. La co-coltura microglia-neuroni impostata in piastre a 96 pozzetti può essere un approccio ad alto rendimento per interrogare i meccanismi e la funzione delle interazioni della microglia con i neuroni nel contesto della salute e della malattia del SNC, inclusa la SM.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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JP riconosce il sostegno finanziario del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e del College of Medicine dell'Università del Saskatchewan. YD riconosce il sostegno finanziario del College of Medicine Startup Fund dell'Università del Saskatchewan, del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), dell'MS Canada Catalyst Grant (1019973), del Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) e del Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. La Figura 1A, la Figura 2A e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di Petri da 10 cm Pescatore07-202-011Sterile
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Sistema di coltura neuronale Gibco 
Microscopio di dissezioneVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Siero fetale bovino ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
EmatocitometroHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci 15630080
Leibovitz' s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 
Fattore stimolante le colonie di macrofagi.Peprotech315-02
Micro-PinzeRWDF11020-11Autoclavato/Sterile
Aminoacidi non essenzialiCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillina Streptomicina Glutammina (100x)Gibco103780-16
Po-L-ornitina bromidrato SigmaP3655-100MG
Piruvato di sodio (100 mM)Gibco11360-070
Forbici a mollaRWDS11008-42Autoclave/Sterile
Lama chirurgicaFeather08-916-5D
Palloni sterili T-25Fisher10-126-9
T-75 fiasche Fisher13-680-65
Pinza per tessutiCodman30-4218Forbici per tessuti sterilizzate in autoclave/sterili
RWDS12052-10Trypan blu sterilizzato in autoclave/sterile
.Thermofisher Sci 15250-061
Tripsina (2,5%)ThermoFisher Sci15090046
Microscopio a immunofluorescenza a campo largoZeiss
A365340121083027

Riferimenti

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