Articolo metodologico

Stabilire un modello murino di endometrio sottile

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DOI:

10.3791/67084

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1 novembre 2024

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1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Shenzhen Zhongshan Obstetrics and Gynecology Hospital (formerly Shenzhen Zhongshan Urology Hospital), 2Guangdong Engineering Technology Research Center of Reproductive Immunology for Peri-Implantation, 3School of Biomedical Engineering, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la produzione di un endometrio sottile affidabile e riproducibile con un tasso di mortalità molto basso e aderenze intrauterine minime iniettando etanolo al 95% nell'utero di topo entro 1-3 minuti.

Abstract

L'endometrio sottile (TE) è stato ampiamente riconosciuto come una causa critica di infertilità. Tuttavia, la patogenesi della TE rimane poco chiara e sono ancora urgentemente necessarie opzioni terapeutiche soddisfacenti. Sono stati sviluppati diversi modelli animali di TE, ma il modello murino che prevede la chirurgia addominale e l'iniezione di etanolo al 95% rappresenta una sfida formidabile a causa dell'alto tasso di mortalità e del rischio di aderenze intrauterine se non eseguito correttamente. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che produce TE affidabile e riproducibile con un tasso di mortalità molto basso e aderenze intrauterine minime iniettando etanolo al 95% nell'utero di topo con tempi di infusione variabili. I risultati hanno mostrato che tutti i topi hanno sviluppato con successo TE con tempi di infusione compresi tra 1 e 3 minuti, caratterizzati da una tipica riduzione dello spessore dell'endometrio e del numero di ghiandole, nonché da un'eccessiva fibrosi endometriale. Questi risultati suggeriscono che questo modello murino è adatto per lo studio dell'endometrio sottile e può fungere da piattaforma per lo sviluppo di futuri trattamenti per la TE.

Introduzione

L'endometrio sottile (TE) è una condizione grave in ostetricia e ginecologia che colpisce spesso le donne in età fertile. La TE viene diagnosticata quando lo spessore dell'endometrio misura meno di 7 mm su un'ecografia, accompagnata da una cavità uterina normale, ed è strettamente associata all'insufficienza della gravidanza 1,2. Si stima che circa l'1,5%-9,1% delle donne sottoposte a trattamento di fecondazione in vitro (IVF) sperimenterà l'TE, rendendola una sfida crescente nella medicina riproduttiva 3,4,5. Le cause più comuni di TE includono una riparazione impropria dell'endometrio dopo la separazione chirurgica delle aderenze intrauterine (IUA) e il raschiamento, che sono spesso accompagnati da una distribuzione dei vasi sanguigni interrotta e ghiandole rade 6,7,8. Ad oggi, i meccanismi cellulari e molecolari alla base della TE rimangono poco chiari. Il recupero dell'endometrio nelle pazienti con TE richiede molto tempo, sebbene il trattamento con estrogeni e la terapia con aspirina a basso dosaggio siano stati esplorati come potenziali interventi9. Pertanto, uno studio approfondito della patogenesi dell'TE è l'approccio più diretto per affrontare le sfide di questa condizione. Tuttavia, gli studi sulla patogenesi della TE si basano su modelli animali, rendendo cruciale la selezione di un modello appropriato.

La maggior parte degli studi istopatologici sull'endometrio sottile (TE) ha dimostrato che l'alterata proliferazione delle cellule epiteliali e dei macrofagi, la diminuzione dell'espressione dei recettori degli ormoni steroidei ovarici, l'eccessiva deposizione di matrice extracellulare e la senescenza cellulare sono le caratteristiche patologiche più significative di TE 6,9,10. Attualmente, sono stati sviluppati vari modelli di ratto per imitare il TE, inclusi modelli indotti da graffi 11,12,13, ischemia 14, lesioni termiche15 e lesioni chimiche 16,17,18,19. Un modello di ratto viene indotto grattando l'endometrio con un ago o un catetere, che spesso provoca aderenze intrauterine (IUA) piuttosto che TE 11,12,20,21,22. È stato riportato anche un modello di TE indotta da ischemia nei ratti, in cui l'ischemia endometriale si ottiene eseguendo la legatura bilaterale dell'arteria uterina, portando a una riduzione dello spessore endometriale. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo, tre mesi e non è ampiamente utilizzato per la ricerca14. Nel modello indotto da lesioni termiche, una sonda per inseminazione artificiale viene utilizzata per infondere acqua preriscaldata a 85 °C in un lato del corno uterino attraverso la confluenza dei due lati, rendendolo più complesso rispetto ad altri metodi15. Il modello indotto chimicamente prevede l'iniezione del 95% di etanolo nel corno uterino esposto per danneggiare l'intero endometrio. Questo modello offre i vantaggi di un basso costo e di un breve periodo sperimentale per lo studio dei meccanismi patologici e dei trattamenti nell'ET, ma è utilizzato principalmente nei ratti piuttosto che nei topi 16,17,23. Sebbene esistano vari modelli animali, in particolare modelli di ratto, ognuno ha i suoi limiti. Possono simulare solo alcuni aspetti della TE e pochi modelli murini replicano fedelmente le caratteristiche della malattia della TE pur essendo convenienti e versatili per la ricerca.

In questo contesto, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino di endometrio sottile (TE) infondendo etanolo al 95% nella cavità uterina utilizzando un approccio a gradiente temporale con un metodo modificato24 (Figura 1). I risultati hanno mostrato che tutti i topi hanno sviluppato con successo la TE quando il tempo di infusione variava da 1 a 3 minuti, mostrando caratteristiche tipiche come riduzione dello spessore endometriale, riduzione della ghiandola e aumento della fibrosi endometriale. Questi risultati suggeriscono che il nostro modello murino è uno strumento adatto per lo studio dell'ET e può fungere da piattaforma per lo sviluppo di futuri trattamenti per l'ET.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dello Shenzhen Zhongshan Obstetrics & Gynecology Hospital (ex Shenzhen Zhongshan Urology Hospital), dove sono stati condotti tutti gli esperimenti sugli animali. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6 (età 6-8 settimane, peso 18-20 g). Tutti gli animali sono stati alloggiati in un ambiente privo di patogeni specifici (SPF) nella stessa stanza e acclimatati per una settimana prima degli esperimenti in una stanza senza agenti patogeni specifici a (22 ± 1) °C con un ciclo luce/buio di 12 ore. Hanno avuto accesso gratuito a cibo e acqua. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Identificazione dell'estro

NOTA: La fase di estro nei topi è paragonabile alla fase luteale tardiva nell'uomo, con un rivestimento endometriale relativamente spesso in questo momento. La selezione di topi in estro per l'induzione del modello garantisce che si trovino in uno stato fisiologico relativamente coerente. Inoltre, i risultati dell'assottigliamento dell'endometrio sono più pronunciati quando lo spessore dell'endometrio è relativamente spesso. Per i dettagli su questa procedura si rimanda ai rapporti precedentemente pubblicati25,26.

  1. Preparare 20 μl di soluzione fisiologica utilizzando una pipetta. Afferrando entrambi i lati delle orecchie del topo e fissando la coda del topo, inserire delicatamente la punta della pipetta nell'orifizio vaginale a una profondità di circa 2 mm. Infondere 20 μL di soluzione salina nella vagina e sciacquarla delicatamente per 5 cicli.
  2. Prelevare la soluzione salina e trasferirla uniformemente su un vetrino pulito. Lasciarlo evaporare e asciugarlo naturalmente a temperatura ambiente.
  3. Applicare 30 μL di etanolo su ogni vetrino per fissare le cellule. Lasciare evaporare l'etanolo per 5 minuti fino a quando il vetrino non si sarà asciugato.
  4. Applicare 50 μl di soluzione colorante al cristallovioletto su ciascun vetrino e colorare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti.
  5. Sciacquare ogni vetrino con acqua deionizzata per rimuovere il colorante in eccesso e ridurre le macchie non specifiche.
  6. Osservare la morfologia cellulare e determinare la proporzione dei tipi di cellule al microscopio.
  7. Osservare i cicli estrali dei topi due volte consecutivamente per garantire la stabilità. Seleziona i topi nel terzo estro per l'esperimento.
    NOTA: Il ciclo estrale nei topi dura in genere 4-5 giorni ed è diviso in quattro fasi: proestro, estro, metestro e diestro. Il proestro dura circa 24 ore ed è caratterizzato da cellule epiteliali nucleate da rotonde a ovali (Figura 2A). L'estro dura tra le 12 e le 48 ore ed è caratterizzato da cellule epiteliali cheratinizzate prevalentemente anucleate (Figura 2B). Il metestro dura fino a 24 ore ed è caratterizzato da un mix di cellule epiteliali cheratinizzate, anucleate e neutrofili (Figura 3C). Il diestro dura tra le 48 e le 72 ore ed è caratterizzato da una combinazione di neutrofili, cellule epiteliali nucleate e alcune cellule cherattinizzate anucleate (Figura 2D).

2. Progettazione di gruppi

NOTA: Per valutare l'impatto di varie durate dell'infusione di etanolo al 95% sulla stabilità del modello TE, sono stati stabiliti sei gruppi di trattamento. Un gruppo è stato sottoposto a un intervento chirurgico fittizio senza somministrazione di etanolo per fungere da controllo per gli effetti procedurali. I topi con TE indotta da etanolo sono stati divisi in modo casuale in cinque gruppi di trattamento in base al tempo di infusione (n = 5 per gruppo) come segue:

  1. Gruppo di 1 minuto: Iniettare etanolo nella cavità uterina per 1 minuto.
  2. Gruppo di 2 minuti: Iniettare etanolo nella cavità uterina per 2 minuti.
  3. Gruppo di 3 minuti: Iniettare etanolo nella cavità uterina per 3 minuti.
  4. Gruppo di 4 minuti: Iniettare etanolo nella cavità uterina per 4 minuti.
  5. Gruppo di 5 minuti: Iniettare etanolo nella cavità uterina per 5 minuti.

3. Induzione del modello TE nei topi

  1. Anestetizzare i topi utilizzando una macchina per anestesia con isoflurano al 5% e ossigeno al 100% per 3 minuti (seguendo un protocollo approvato istituzionalmente). Mantenere l'anestesia all'1%-3% di isoflurano utilizzando un cono nasale. Applicare un unguento veterinario sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Monitorare la frequenza respiratoria con un pizzico di dita dei piedi durante tutta la procedura.
  2. Usa del nastro adesivo per fissare gli arti dei topi e tienili in posizione supina sul tavolo operatorio preriscaldato con una coperta elettronica. Tirare delicatamente la lingua dei topi per evitare l'ostruzione delle vie aeree.
    NOTA: Mantenere i topi al caldo durante l'intervento chirurgico aiuta a mantenere la funzione immunitaria e la circolazione sanguigna e previene la coagulazione. Inoltre, estrarre la lingua dei topi garantisce vie respiratorie chiare per evitare il soffocamento durante l'anestesia.
  3. Applicare la crema depilatoria sull'addome inferiore dei topi per 3 minuti. Rimuovere i peli con salviette pulite. Disinfettare l'area con etanolo al 75% e iodoforo.
  4. Praticare un'incisione di 1 cm nell'addome, a 1 cm dall'orifizio uretrale. Usa forbici e pinze sterili per estendere l'incisione fino alla cavità peritoneale.
  5. Sposta delicatamente le interiora da parte con una pinza sterile per localizzare l'utero ed esporre il corno uterino destro. Applicare le pinze emostatiche all'estremità prossimale vicino alla cervice e all'estremità distale vicino all'ovaio.
    NOTA: Il bloccaggio di entrambe le estremità del corno uterino garantisce l'assenza di perdite durante l'iniezione di etanolo, prevenendo danni alla cervice, alla vagina e all'ovaio.
  6. Instillare circa 50 μl di etanolo27 al 95% nella cavità uterina utilizzando una siringa da 25 G, con l'ago parallelo alla direzione del corno uterino. Inserire l'ago nella cavità uterina con un angolo di 30 gradi. Mantenere la siringa per 1 minuto, 2 minuti, 3 minuti, 4 minuti o 5 minuti, a seconda dei casi. Prelevare l'etanolo e sciacquare la cavità uterina con soluzione fisiologica sterile 5 volte per rimuovere l'etanolo residuo. Allo stesso modo, instillare un volume uguale di soluzione fisiologica sterile nel corno uterino sinistro come controllo, seguendo le stesse procedure.
    NOTA: Assicurarsi che l'ago della siringa sia parallelo alla direzione del corno uterino. Evitare di inserire l'ago con un angolo troppo ripido per evitare che attraversi l'intero corno uterino. Prelevare l'etanolo il più completamente possibile per evitare danni persistenti e instabilità sperimentale.
  7. Rimuovere le pinze e riportare l'utero e le interiora nella loro posizione originale.
  8. Sutura del peritoneo con suture chirurgiche in poliglicolide riassorbibili 5-0, seguita dalla sutura dell'epidermide con suture chirurgiche in poliglicolide 5-0 non assorbibili.
  9. Disinfettare l'incisione con etanolo al 75% e iodoforo, quindi riportare gli animali nella loro gabbia. Dopo l'intervento chirurgico, osservare attentamente se la frequenza cardiaca del topo aumenta gradualmente e costantemente fino a quando il topo non si riprende completamente e può muoversi normalmente (Figura 3A-H).
    NOTA: L'analgesico orale (3,2 mg/mL di paracetamolo nell'acqua potabile) è stato somministrato il giorno prima dell'intervento chirurgico ed è continuato per tutto il resto dello studio.
  10. Osserva i topi alle 9:00 e alle 15:00 ogni giorno e disinfetta l'incisione con iodoforo per assicurarti che siano in buone condizioni.

4. Raccolta dei campioni

  1. Eutanasia dei topi mediante lussazione del rachide cervicale durante l'anestesia profonda 7 giorni dopo il trattamento con etanolo al 95% (seguendo un protocollo approvato istituzionalmente).
  2. Tagliare i punti di sutura per esporre l'utero usando le forbici chirurgiche.
  3. Estrarre con cautela e lentamente l'intero utero utilizzando una pinza chirurgica. Staccare l'utero dalle viscere circostanti.
  4. Rimuovere immediatamente entrambe le corna uterine e dividere ogni corno in 3-4 piccoli segmenti.
  5. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta. Conservare il tessuto uterino in paraformaldeide al 4% per 24 ore per la fissazione.

5. Disidratazione dei tessuti

NOTA: La disidratazione dei tessuti si ottiene utilizzando un processatore automatico di tessuti (vedere la Tabella dei materiali).

  1. Posizionare i campioni fissati in formalina in cassette di tessuto.
  2. Trasferire le cassette di tessuto attraverso una serie di concentrazioni crescenti di etanolo per disidratare il tessuto come segue: etanolo al 70% per 1 ora, etanolo all'85% per 1 ora, etanolo al 95% due volte (1 ora ciascuna) ed etanolo al 100% due volte (1 ora ciascuna).
  3. Sostituire l'etanolo con xilene al 100% (135 minuti per la prima immersione, 20 minuti per ogni immersione successiva due volte) per garantire che la paraffina penetri nel tessuto.
  4. Immergere le cassette di tessuto in paraffina in un'incubatrice a 60-65 °C (3 volte, 140 minuti ciascuna) e mantenere le cassette calde fino all'inclusione.

6. Inclusione di paraffina

NOTA: Eseguire questi passaggi utilizzando un centro di inclusione tissutale modulare (vedere la Tabella dei materiali).

  1. Riempire uno stampo di cera con cera di paraffina fusa riscaldata a 55 °C.
  2. Utilizzare una pinza riscaldata per trasferire rapidamente i segmenti infiltrati dalla cassetta di inclusione allo stampo in cera, assicurandosi che la sezione trasversale di ciascun segmento poggi parallelamente alla base dello stampo.
  3. Una volta posizionati correttamente i segmenti, posizionare la parte inferiore della cassetta di inclusione sopra lo stampo per istologia.
  4. Posizionare lo stampo direttamente su una piastra di raffreddamento impostata a 4 °C per almeno 20 minuti per consentire alla paraffina di solidificarsi.
  5. Dopo che la cera si è solidificata, rimuovere il campione dallo stampo e utilizzare un rifinitore di paraffina per tagliare la cera in eccesso attorno ad esso.

7. Sezionamento della paraffina

  1. Preparare un bagnomaria a 42 °C. Mettere i blocchi di paraffina su un piatto freddo prima di tagliarli per farli raffreddare e diventare più facili da tagliare.
  2. Fissare il campione incluso in paraffina su un microtomo rotante con la superficie del tessuto rivolta verso l'alto.
  3. Sezione 20 μm alla volta per rimuovere la paraffina in eccesso che ricopre il tessuto fino a raggiungere il piano tissutale desiderato.
  4. Tagliare sezioni di 4 μm alla volta.
  5. Trasferire il nastro sezionato di paraffina nel bagnomaria caldo a 42 °C per 2 minuti.
  6. Raccogliere le sezioni dalla superficie dell'acqua e posizionarle su un vetrino da microscopio dopo averle aperte.
  7. Asciugare i vetrini in un'incubatrice a 60 °C per 30 minuti.

8. Colorazione con ematossilina ed eosina

NOTA: La colorazione con ematossilina ed eosina viene eseguita utilizzando una macchina per la colorazione automatica dei vetrini (vedi Tabella dei materiali).

  1. Preparare tutti i reagenti in anticipo prima di iniziare la procedura di colorazione.
  2. Immergere i vetrini in xilene al 100% rispettivamente per 10 minuti, 5 minuti e 3 minuti.
  3. Reidratare i vetrini in una serie decrescente di etanolo in acqua deionizzata come segue: etanolo al 100%, etanolo al 95% (due volte) ed etanolo all'80%, per 2 minuti ciascuno.
  4. Sciacquare gli scivoli in acqua deionizzata.
  5. Colorare i vetrini in soluzione di ematossilina per 10 minuti. Sciacquare gli scivoli in acqua deionizzata per 1 minuto o fino a quando l'acqua non è più viola.
  6. Immergere i vetrini in una soluzione di differenziazione di etanolo acido allo 0,5% due volte per 3-5 s ogni volta. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata per 1 minuto.
  7. Mettere i vetrini in un tampone azzurrante (soluzione di ammoniaca all'1%) per 1 minuto. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata per 1 minuto.
  8. Disidratare i vetrini con etanolo all'80% e poi immergerli in una soluzione di lavoro eosina-Y per 10 s.
  9. Trasferire i vetrini in etanolo al 95% e risciacquare due volte per 10 s ciascuno. Quindi, trasferire i vetrini in etanolo assoluto e disidratarli due volte per 10 s ciascuno.
  10. Immergere i vetrini in xilene al 100% per pulire il tessuto due volte, per 2 minuti ciascuno.
  11. Posiziona un vetrino coprioggetti sul fazzoletto e sigillalo con resina naturale.

9. Colorazione di Masson

  1. Deparaffinizzare il tessuto immergendo i vetrini in xilene al 100% per 10 minuti, 5 minuti e 3 minuti, rispettivamente.
  2. Dopo la deparaffinazione, immergere i vetrini in una serie decrescente di etanolo in acqua deionizzata: etanolo al 100%, etanolo al 95% (due volte) ed etanolo all'80%, per 2 minuti ciascuno.
  3. Sciacquare gli scivoli in acqua deionizzata.
  4. Colorare i vetrini nella soluzione di ferro ematossilina di Weigert per 5 minuti, quindi lavare i vetrini in acqua deionizzata per 30 s.
  5. Differenziare i colori delle strutture tissutali colorate incubando i vetrini in alcool di acido cloridrico all'1% per 15 s.
  6. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata per 30 s.
  7. Incubare il tessuto in una soluzione azzurrante per 3-5 minuti.
  8. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata per 30 s.
  9. Mettere i vetrini nella soluzione di Ponceau-Acid Fuchsin per 5-10 minuti.
    NOTA: Mescolare acqua deionizzata e soluzione acida debole in un rapporto di 2:1 per preparare la soluzione di lavoro acida debole.
  10. Sciacquare i vetrini con la soluzione di lavoro acida debole per 30 s.
  11. Differenziare il tessuto nella soluzione di acido fosfomolibdico per 1-2 minuti, quindi risciacquare le sezioni con una soluzione di lavoro acida debole per 30 s.
  12. Colorare le sezioni di tessuto con una soluzione di blu di anilina per 1-2 minuti.
  13. Disidratare rapidamente le sezioni di tessuto in etanolo al 95% per 2-3 s, seguito da etanolo al 100% due volte per 5-10 s ciascuna. Eliminare i vetrini in xilene due volte, per 1-2 minuti ciascuno.
  14. Posiziona un vetrino coprioggetti sul fazzoletto e sigillalo con resina naturale.
  15. Scolare la resina in eccesso e lasciare asciugare i vetrini.

10. Imaging e analisi

  1. Cattura le immagini delle sezioni utilizzando un sistema di scansione delle diapositive.
    NOTA: Utilizzare un obiettivo 4x o 10x per una panoramica delle sezioni; Per immagini più dettagliate, utilizzare obiettivi da 20x a 100x.
  2. Esegui analisi quantitative dello spessore dell'endometrio, del numero di ghiandole e dell'entità della fibrosi tissutale utilizzando la piattaforma di analisi delle immagini HALO.
    NOTA: Lo spessore medio si ottiene misurando la distanza verticale dalla cavità uterina al miometrio in 5 campi visivi selezionati casualmente.

11. Analisi statistiche

  1. Condurre analisi statistiche utilizzando SPSS versione 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
  2. Valutare la significatività statistica delle differenze sperimentali tra i gruppi di controllo e quelli modello eseguendo prima un test di distribuzione normale.
  3. Presenta i dati che normalmente vengono distribuiti come media ± SEM.
  4. Analizza i dati di diversi gruppi di trattamento utilizzando l'ANOVA unidirezionale. Aggiustare per confronti multipli del numero di alleli testati in ciascun locus utilizzando il metodo Bonferroni. Considera un valore P <0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Le caratteristiche principali dell'endometrio sottile (TE) sono la diminuzione dello spessore endometriale e della densità ghiandolare, insieme all'aumento della fibrosi endometriale. Questo metodo ha replicato con successo queste caratteristiche nei topi modello. L'analisi dei dati ha rivelato una diminuzione significativa dello spessore endometriale nel gruppo 1 minuto (222,3 μm ± 13,96 μm contro 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05), nel gruppo 2 minuti (168,7 μm ± 17,57 μm ± 359,2 μm 12,41 μm, P < 0,05) e nel gruppo 3 minuti (131,8 μm ± 3 μm contro 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05) rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, non è stata osservata alcuna differenza significativa nello spessore dell'endometrio tra i gruppi da 2 minuti e 3 minuti (168,7 μm ± 17,57 μm vs. 131,8 μm ± 3 μm, P > 0,05) (Figura 3A, B).

Il numero di ghiandole endometriali è stato significativamente ridotto nel gruppo di 1 minuto (4,4 ± 2,38 vs 24,4 ± 1,6, P < 0,05), nel gruppo di 2 minuti (0,8 ± 0,49 ± 1,6, P < 0,05) e nel gruppo di 3 minuti (4,4 ± 3,20 vs 24,4 ± 1,6, P < 0,05) rispetto al gruppo di controllo (Figura 3A, C). Tuttavia, non è stata osservata alcuna differenza significativa nel numero di ghiandole endometriali tra i gruppi di 1 minuto, 2 minuti e 3 minuti.

Poiché la TE si è verificata dopo il trattamento con etanolo al 95% per 7 giorni, è stato ipotizzato che lo spessore dell'endometrio potesse essere associato alla durata dell'infusione. Per indagare su questo, due gruppi aggiuntivi sono stati trattati con etanolo al 95% per 4 minuti e 5 minuti, rispettivamente. È interessante notare che i risultati hanno mostrato una grave adesione uterina quando il tempo di infusione è aumentato. (Figura 4), con la cavità uterina che diventa quasi invisibile. Inoltre, non sono state osservate ghiandole endometriali nell'utero di topo con il tempo di infusione prolungato (Figura 4).

Inoltre, il livello di fibrosi endometriale aumentava con la durata dell'infusione di etanolo al 95%, come confermato dalla colorazione di Masson, indicando un'eccessiva fibrosi nell'endometrio danneggiato (Figura 5A, B).

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Figura 1: Diagramma di flusso dell'istituzione del modello murino TE. L'intera procedura comprende i seguenti passaggi: in primo luogo, i topi sono stati lasciati acclimatare per 1 settimana prima dell'esperimento. Successivamente, sono stati monitorati due cicli estrali. I topi nel terzo estro sono stati quindi selezionati per l'istituzione del modello iniettando etanolo al 95% nella cavità uterina. Sette giorni dopo l'iniezione di etanolo, i topi sono stati sacrificati e le corna uterine sono state raccolte per ulteriori colorazioni HE e analisi di colorazione di Masson. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Identificazione dell'estro nei topi. (A) Il proestro è caratterizzato dalla predominanza di cellule epiteliali nucleate (freccia). (B) L'estro è caratterizzato dalla predominanza di cellule epiteliali cheratinizzate anucleate (asterischi). (C) Il metestro è caratterizzato da una combinazione di cellule epiteliali cheratinizzate anucleate e neutrofili (triangolo). (D) Il diestro è caratterizzato da una combinazione di neutrofili, cellule epiteliali nucleate e un basso numero di cellule cheratinizzate anucleate. Ingrandimento dell'obiettivo di 20x. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Procedura per l'induzione di TE mediante infusione di etanolo al 95%. (A) I topi vengono anestetizzati utilizzando una macchina per anestesia. (B) I peli addominali vengono rimossi. (C) Viene praticata un'incisione di 1 cm a 1 cm di distanza dall'orifizio uretrale. (D) L'utero è localizzato e un lato del corno uterino è esposto. (E) I morsetti emostatici vengono applicati su entrambi i lati del corno uterino. (F) L'etanolo al 95% viene instillato nel corno uterino e quindi lavato con soluzione fisiologica sterile. (G) I morsetti vengono rimossi e l'utero viene riposizionato. (H) L'incisione è suturata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Osservazione della morfologia endometriale nei topi utilizzando la colorazione HE al microscopio. (A) È stata esaminata la morfologia dell'endometrio sul lato danneggiato e su quello di controllo. L'utero destro è stato iniettato con etanolo al 95%, mentre l'utero sinistro è stato iniettato con soluzione fisiologica sterile come controllo. Barre della scala = 200 μm. (B) Confronto dello spessore dell'endometrio tra i gruppi Con, 1 min, 2 min e 3 min. (C) Confronto del numero di ghiandole nell'endometrio tra i gruppi di Con, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min e 5 min. Contro, controllo; **P < 0,01, ****P < 0,0001 con ANOVA unidirezionale. I dati sono rappresentati come media ±errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Fibrosi endometriale nell'endometrio del topo. (A) La colorazione tricromica di Masson è stata utilizzata per valutare la fibrosi endometriale, dove il colore blu indica la distribuzione delle fibre di collagene, nei gruppi di trattamento indicati. Barre della scala = 200 μm. (B) Un grafico a barre riassuntivo mostra il livello di fibrosi del collagene tra i diversi gruppi. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 con ANOVA unidirezionale. I dati sono rappresentati come media ±errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La TE è caratterizzata da un'insufficiente proliferazione cellulare e da cellule disfunzionali, strettamente legate all'infertilità, all'aborto spontaneo ricorrente e alle anomalie placentari 2,3. Sfortunatamente, attualmente non esiste una terapia efficace per l'TE. I modelli animali svolgono un ruolo cruciale nello studio di questa condizione. Tra il 2014 e il 2024, i ratti sono stati utilizzati come organismi modello nel 16,4% di 208.000 studi (34.200 studi) e i topi nel 22,7% (47.300 studi). L'uso crescente di topi negli esperimenti può essere attribuito ai loro vantaggi rispetto ad altri modelli, in particolare al loro potenziale negli studi di rigenerazione 28,29,30. Data l'importanza della coerenza dei modelli, vi è una crescente necessità di strumenti più compatibili per condurre studi utilizzando i topi come modelli31.

I metodi comuni per indurre i modelli di TE, come riportato in studi precedenti, includono il graffio11,12, l'ischemia14, la lesione indotta dal calore15 e la lesione indotta da sostanze chimiche 16,17,23. Per facilitare l'uso di modelli animali negli studi di TE e gettare le basi per trattamenti efficaci, Gao et al.24 hanno prima stabilito un modello di TE nei ratti SD iniettando etanolo assoluto per 5 minuti per danneggiare l'endometrio. Sebbene questo metodo limiti la crescita dell'endometrio, spesso porta a gravi aderenze nella cavità addominale, con un tasso di sopravvivenza di solo il 70%.

In precedenza, l'etanolo al 95% era utilizzato prevalentemente nei ratti a causa della sua facilità di applicazione, ma questo metodo ha generato pochi modelli murini per gli studi TE. Dopo osservazioni cliniche, una revisione completa della letteratura, pre-esperimenti, discussioni ripetute e analisi, è stato sviluppato un metodo migliorato con un tempo di infusione uterina più breve. Tecniche esperte consentono di iniettare il 95% di etanolo nella cavità uterina per creare un modello di TE con tempi di infusione variabili.

Il modello murino introdotto in questo studio si basa sui principi del modello24 di Gao. Tuttavia, sono state apportate diverse modifiche, tra cui la riduzione del tempo di infusione dell'etanolo e l'aumento della frequenza di lavaggio con soluzione salina. In questo modello, gli uteri di topo sono stati esposti tramite dissezione addominale e il 95% di etanolo è stato iniettato in un lato delle corna uterine per varie durate: 1 minuto, 2 minuti, 3 minuti, 4 minuti e 5 minuti. Grazie al controllo preciso del tempo di infusione dell'etanolo e alla procedura standardizzata, sono stati ottenuti dati stabili negli esperimenti sui topi, che hanno ridotto al minimo le deviazioni dovute alle differenze individuali tra i topi.

I risultati istologici dimostrano chiari cambiamenti nello spessore dell'endometrio, nel numero di ghiandole endometriali e nella fibrosi endometriale in vari gradi tra i topi TE, confermando l'affidabilità del modello stabilito in questo studio 3,6,9. In particolare, quando il tempo di infusione dell'etanolo superava i 4 minuti o i 5 minuti, sono state osservate gravi aderenze intrauterine (IUA). Questi risultati suggeriscono che il modello murino di TE può essere efficacemente stabilito con 1-3 minuti di infusione di etanolo al 95%, mentre tempi di infusione superiori a 3 minuti possono indurre una grave IUA.

Ad oggi, sono stati sviluppati diversi modelli animali per studiare l'ET, tra cui graffi, ischemia, modelli indotti termicamente e indotti da sostanze chimiche. Il modello indotto dal graffio, sebbene più facile da eseguire, spesso porta ad aderenze intrauterine (IUA) piuttosto che a TE. Il modello TE indotto da ischemia richiede una durata molto più lunga rispetto al modello indotto da sostanze chimiche e il metodo indotto termicamente è più complesso e difficile da eseguire rispetto all'induzione chimica. Sebbene il modello indotto da sostanze chimiche sia efficiente in termini di tempo e stabile, presenta potenziali limitazioni, come traumi per gli animali e rischi di infezione o morte a causa di una tecnica impropria. Questi problemi possono essere mitigati con un'attenta formazione ed esperienza.

In conclusione, i risultati dimostrano che il modello murino TE può essere efficacemente stabilito iniettando etanolo al 95% nella cavità uterina per 1-3 minuti. Questo approccio offre un metodo promettente per studiare i meccanismi patologici e i processi di riparazione dell'ET e per sviluppare trattamenti efficaci per i pazienti con questa condizione.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo con gratitudine i referee anonimi per i loro commenti importanti e utili. Questo lavoro è stato sostenuto dallo Shenzhen Science and Technology Project (n. JCYJ20220818103207016) e la Fondazione per la ricerca di base e applicata del Guangdong (n. 2024A1515010478).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Macchina per anestesiaRWD Life ScienceR530Macchina mobile per anestesia per inalazione per piccoli animali
0,9% soluzione salinaHubei Kelun Pharmaceutical C230817A210 mL, iniezione medica
75% etanoloLIRCON6303060031500 mL, reagente disinfettante
95% etanoloGuangzhou Chemical Reagent Factory64-17-5500 mL, reagente chimico
Suture assorbibiliJinhuan MedicalCR537Spessore: 5-0; Lunghezza: 90 cm
Ammoniaca acquosaMilliporeSigma1336-21-61000 mL, reagente chimico
Elaboratore automatico di tessutiLeicaTP1020100 scatole di inclusione possono essere elaborate contemporaneamente
C57BL/6 topi Centro Animali Sperimentali della Southern Medical University 
Eosin-YBASOBA40241000 mL, utilizzato per la colorazione di sezioni di paraffina, sezioni congelate, ecc
EmatossilinaBASOBA40411000 mL, utilizzato per la colorazione di sezioni di paraffina, sezioni congelate, ecc
Piattaforma di analisi delle immagini HALOLaboratori IndicaLo strumento è caratterizzato da facilità d'uso e scalabilità, potenti capacità analitiche e l'elaborazione più rapida velocità
Morsetti emostaticiHUAYON18-50211,8 cm di lunghezza totale con ganascia da 0,7 cm
Pinze emostaticheHUAYON18-502010 cm di lunghezza totale
Microtomo rotante HistoCoreLeica149BIO000C1Lo spessore della fetta varia da 1 a 60 μ m
IndorphorADF1005500 mL, reagente disinfettante
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22-10100 mL, principio attivo 100% isoflurano
Colorazione tricromica di MassonSOLARBIOG13407 & volte; 100 mL per 100 test
Vetrino da microscopioGene TechGT100511Lunghezza: 75 cm; Larghezza: 25 cm
Centro modulare per l'inclusione tissutaleLeicaEG1150 CLo strumento contiene un tavolino freddo e un modulo di distribuzione della paraffina riscaldato, che offre flessibilità per il lavoro di inclusione
Resina naturaleSAKURA4770Film rivestito di resina, adatto per la colorazione istologica
Olympus SLIDEVIEW VS200PANOVUEVS200Lo strumento acquisisce immagini di vetrini virtuali di alta qualità e consente un'analisi quantitativa avanzata delle immagini.
Soluzione fissa di paraformaldeideServicebioG1011500 mL, fissativo universale per tessuti (neutro)
Pinze chirurgicheHUAYON18-13002,2 mm dritte, larghe 12,5 cm
Forbici chirurgicheHUAYON18-011010 cm, forbici chirurgiche in acciaio inossidabile
SiringaGentilmente600170311 mL, siringa sterile monouso con ago
Tessuto cassetteCITOTEST80106-1100-16Bianco; fessure passanti; coperchio integrato in 0ne-pezzi; le aree di etichettatura si trovano su tre lati
Tissue-Tek Prisma PlusSAKURADRS-Prisma-P-JCSLa capacità di elaborazione è di 60 vetrini contemporaneamente
XyleneGuangdong Guanghua Sci-Tech1330-20-71000 mL, solvente organico
.

Riferimenti

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