Esperimenti di rilassamento NMR 15N per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi

Sommario

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è in grado di caratterizzare la dinamica strutturale delle proteine in modo specifico per i residui. Forniamo un protocollo pratico per la registrazione di esperimenti di rilassamento NMR ¹⁵N R₁ e R₂ e {¹H}-¹⁵N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensibili alla scala temporale da picosecondi a nanosecondi.

Abstract

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) consente di studiare le proteine in soluzione e a temperature fisiologiche. Frequentemente, i gruppi ammidici della spina dorsale proteica o i gruppi metilici nelle catene laterali sono utilizzati come reporter della dinamica strutturale nelle proteine. Uno studio di dinamica strutturale della spina dorsale proteica di proteine globulari su campioni marcati con ¹⁵N e completamente protonati di solito funziona bene per proteine con un peso molecolare fino a 50 kDa. Quando viene applicata la deuterazione a catena laterale in combinazione con la spettroscopia ottimizzata a rilassamento trasverso (TROSY), questo limite può essere esteso fino a 200 kDa per le proteine globulari e fino a 1 MDa quando l'attenzione è rivolta alle catene laterali. Quando si studiano le proteine intrinsecamente disordinate (IDP) o le proteine con regioni intrinsecamente disordinate (IDR), queste limitazioni di peso non si applicano, ma possono andare ben oltre. Il motivo è che gli IDP o IDR, caratterizzati da un'elevata flessibilità interna, sono spesso disaccoppiati dinamicamente. Vari metodi NMR offrono informazioni sulla risoluzione atomica della dinamica strutturale delle proteine in un'ampia gamma di scale temporali, dai picosecondi fino alle ore. Le misure standard di rilassamento ^{a 15}N analizzano la flessibilità interna di una proteina e caratterizzano la dinamica della spina dorsale proteica sperimentata su una scala temporale da pico a nanosecondi. Questo articolo presenta un protocollo pratico per l'impostazione e la registrazione di esperimenti NMR ¹⁵N R₁, R₂ e heteronuclear Overhauser effect (hetNOE). Mostriamo dati esemplari e spieghiamo come interpretarli in modo semplice qualitativo prima di qualsiasi analisi più sofisticata.

Introduzione

La funzione di una proteina è determinata non solo dalla sua struttura tridimensionale, ma anche dalla sua dinamica strutturale, che comprende la sua flessibilità interna e le transizioni strutturali tra le diverse conformazioni che la proteina adotterà. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) può studiare la dinamica strutturale delle proteine in soluzione ^1,2,3. I recenti sviluppi nella NMR allo stato solido rilevata con protoni consentono anche la caratterizzazione della dinamica delle proteine in uno stato meno solubile, come, ad esempio, una membrana a doppio strato lipidico ^4,5,6. Nella NMR in soluzione, è possibile studiare la dinamica strutturale della spina dorsale proteica e delle catene laterali proteiche. Per una proteina globulare, uno studio della dinamica strutturale della spina dorsale proteica può essere raggiunto fino a 50 kDa una volta che la proteina è marcata isotopicamente a ¹⁵N. Quando si impiegano la deuterazione a catena laterale e la spettroscopia ottimizzata a rilassamento trasversale (TROSY), questo limite può essere esteso fino a 200 kDa ^7,8. Quando l'attenzione si concentra sulla dinamica della catena laterale, la gamma di proteine e complessi accessibili può essere estesa fino a 1 MDa ^2,9.

Le limitazioni di peso indicate non si applicano alle proteine intrinsecamente disordinate (IDP), che spesso mostrano un'elevata dinamica intrinseca. Oltre il 30% del proteoma eucariotico comprende IDP o regioni intrinsecamente disordinate (IDR)10,11,12,13. Svolgono un ruolo centrale in molti processi cellulari, come la trasduzione e la trascrizione^{del segnale 1}, e sono spesso coinvolti nella separazione di fase intracellulare 14,15,16,17. Gli IDP mancano di una struttura nativa tridimensionale (3D) ben definita in condizioni fisiologiche e hanno un paesaggio energetico debolmente incanalato o accidentato^17,18. A causa di una bassa idrofobicità e di una forte repulsione elettrostatica distribuita sulla spina dorsale degli IDP o degli IDR, manca una forza motrice per il ripiegamento in una struttura rigida¹⁹. Gli IDP adottano spesso una conformazione ripiegata quando sono complessi con altri partner di legame 10,20,21. Inoltre, le modifiche post-traduzionali (PTM) ampliano le possibilità di ripiegamento degli IDP o IDR^22,23. Il ripiegamento errato delle IDP è stato identificato come causa di varie malattie, comprese le malattie neurodegenerative 15,24,25,26.

Gli IDP e gli IDR mostrano un'elevata flessibilità interna 21,27,28. Gli insiemi conformazionali che mostrano la variazione delle posizioni atomiche e degli angoli diedri sono stati derivati da simulazioni di dinamica molecolare e restrizioni ottenute dai dati sperimentali 29,30,31,32. A causa della dinamica e del conseguente disordine nello stato congelato, la densità elettronica diffusa rende difficile caratterizzarli strutturalmente utilizzando metodi all'avanguardia in biologia strutturale, come la crio-EM o la cristallografia a raggi X. Inoltre, le condizioni di cristallizzazione o le tecniche di preparazione del campione per esperimenti a temperature criogeniche possono influire sullo spazio conformazionale sperimentato dagli IDP. Tuttavia, la soluzione NMR funziona bene per proteine altamente dinamiche ed è quindi adatta per studiare le IDP 16,20,22,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38.

Come introdotto in precedenza, la NMR in soluzione offre varie tecniche per studiare la dinamica interna delle proteine in un'ampia gamma di scale temporali (Figura 1), principalmente basate sul rilassamento di spin 31,33,38,39,40,41,42.

Il rilassamento di spin dei nuclei ¹⁵N nei gruppi ammidici della spina dorsale proteica è indotto da cambiamenti di orientamento dell'angolo di legame ^{1 H-15}N dovuti alla dinamica interna della proteina e ai movimenti collettivi (inclusa, quando rilevante, la diffusione rotazionale)27,43,44,45,46,47,48,49,50,51. Su scale temporali più brevi del tempo di correlazione rotazionale τ_R (il tempo necessario alla molecola per ruotare un radiante, chiamato anche tempo di correlazione globale di tumbling), l'anisotropia di spostamento chimico (CSA) e l'accoppiamento dipolare (D) sono attivi e non mediati dalla diffusione rotazionale della proteina. La dinamica interna della spina dorsale proteica, che comprende variazioni negli angoli di legame, riorientamento dei legami e rotolamento rotazionale, induce fluttuazioni stocastiche del CSA e del tensore di accoppiamento dipolare, con conseguente variazione del campo magnetico locale, portando infine al rilassamento dello spin NMR 47,48,52,53 . Queste fluttuazioni possono essere descritte da una funzione di correlazione complessiva. La trasformata di Fourier della funzione di correlazione complessiva è chiamata funzione di densità spettrale. Nella teoria semi-classica del rilassamento di Redfield, le costanti di velocità di rilassamento NMR possono essere descritte da combinazioni lineari di queste funzioni di densità spettrale⁵⁴.

Gli esperimenti di rilassamento NMR della spina dorsale ¹⁵N sviluppati nei primi anni '90 comprendono ¹⁵N R₁, R_1ρ e {¹H}-¹⁵N esperimenti nucleari sull'effetto Overhauser, sensibili alla scala temporale veloce del picosecondo (ps) e del nanosecondo (ns), più veloce del tempo di correlazione rotazionale τ_R della proteina 45,55,56,57. Per caratterizzare la dinamica della spina dorsale più lenta del tempo di correlazione rotazionale τ_R, vengono utilizzati i cosiddetti esperimenti di dispersione di rilassamento, R_1ρ, e gli esperimenti di Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sensibili alla dinamica dei microsecondi (μs) - millisecondi (ms) 44,46,58,59,60,61. Le dinamiche più lente dei microsecondi possono essere catturate mediante trasferimento di saturazione a scambio chimico (CEST) ^{a 15}N NMR⁶², spettroscopia di scambio (EXSY, da millisecondi a secondi) o NMR in tempo reale (RT) (da secondi a ore)^63,64. L'effetto PRE (paramagnetic relaxation enhancement) delle sonde paramagnetiche, così come gli accoppiamenti dipolari residui (RDC), possono essere utilizzati per valutare l'intero intervallo di dinamica da ps a ms 65,66,67,68.

Figura 1: Scale temporali della dinamica della spina dorsale proteica e finestra temporale sensibile di diversi esperimenti di dinamica NMR. La risonanza magnetica nucleare offre una varietà di metodi per caratterizzare la dinamica della dorsale proteica in un'ampia gamma di scale temporali. I diversi movimenti sperimentati dalla spina dorsale proteica sono indicati nelle rispettive scale temporali. Il tempo di correlazione rotazionale della proteina, τ_R, è il tempo di cui la proteina ha bisogno per una rotazione complessiva (di un radiante). Movimenti più veloci del tempo di correlazione rotazionale della proteina, τ_R, possono essere associati alla flessibilità interna della proteina. Vari esperimenti NMR e la loro sensibilità alle rispettive scale temporali sono indicati sotto la freccia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo seguente descrive l'impostazione degli esperimenti di rilassamento NMR di Lakomek et ^al.69 e Stief et ^al.70, utilizzando uno schema di rilevamento a coerenza quantistica singola eteronucleare (HSQC) potenziato dalla sensibilità. Prima di procedere all'implementazione sperimentale, viene fornita una breve panoramica del rilassamento di spin NMR e degli esperimenti di rilassamento NMR. A causa dei limiti di dimensioni e per mantenere comprensibile questo protocollo, questa panoramica deve rimanere semplicistica (e quindi incompleta).

Il rilassamento longitudinale o reticolo di spin, caratterizzato dal tempo T₁ o dalla costante di velocità R₁ = 1/ T₁ , descrive il ritorno della magnetizzazione all'equilibrio di Boltzmann. In equilibrio, la magnetizzazione è allineata lungo l'asse del campo magnetico esterno, che definisce l'asse z del telaio di laboratorio. Le densità spettrali alle frequenze di Larmor alte (¹H) e piccole (¹⁵N) (le frequenze di risonanza NMR, ad esempio, 600 MHz per ¹H per un magnete da 14,1 Tesla) e le combinazioni lineari di queste frequenze di Larmor contribuiscono al rilassamento di ¹⁵N R₁ , che è caratterizzato dalle costanti di velocità ^{di 15}N R₁ misurate in rad·^s-1. I movimenti su scale temporali sono inversi a queste frequenze di Larmor; quindi, i movimenti sulla scala temporale da picosecondi a nanosecondi contribuiscono alla costante del tasso di rilassamento R₁. Per le molecole che mostrano un tumbling complessivo e dove può essere definito un tempo di correlazione rotazionale, la curva R₁ (T₁) mostra un massimo (minimo) per ωτ_R = 1, con la correlazione rotazionale τ_R e la frequenza di Larmor ω dello spin in esame. Se più frequenze di Larmor contribuiscono, quella con la frequenza più bassa è quella dominante, ad esempio, ω_N nel caso di ¹⁵N R₁. Il regime di moto veloce (ωτ_R molto più piccolo di 1) si applica a piccole molecole che rotolano molto velocemente e per bassi campi magnetici e bassa viscosità. Il regime di slow motion (ωτ_R molto più grande di 1) è valido per molecole più grandi che rotolano più lentamente e per campi magnetici elevati e alta viscosità.

Le proteine ripiegate globulari mostrano un tumbling complessivo in soluzione e può essere assegnato un tempo di correlazione rotazionale. Tuttavia, il concetto di tumbling complessivo non è più valido per le proteine intrinsecamente disordinate e spesso differisce dall'assegnazione di un singolo tempo di correlazione rotazionale. Qui, il tempo di correlazione interna residuo specifico diventa più critico.

La sequenza di impulsi descritta che misura ¹⁵velocità di rilassamento N R₁ (Figura 2) si basa su un esperimento di lettura HSQC con sensibilità migliorata con un rilevamento Echo/Anti-Echo per il rilevamento in quadratura 69,70,71. Brevi gradienti con intensità e lunghezza variabili vengono utilizzati per la selezione della coerenza e una migliore soppressione dell'acqua⁷⁰. Durante questo periodo, la polarizzazione longitudinale ^{di 15}N si rilasserà. Tempi di decadimento più lunghi portano a intensità ridotte nei piani 2D associati di questo spettro pseudo-3D (i punti dati di ritardo sono registrati nella terza dimensione). Un elemento del ciclo, descritto di seguito, viene eseguito un numero crescente di volte per ottenere tempi di rilassamento più lunghi. Poiché il rilassamento cross-correlato tra l'anisotropia di spostamento chimico ⁽CSA) di ¹⁵N e l'accoppiamento dipolare (D) di 1 H e ¹⁵N è attivo anche durante il ritardo di rilassamento, è necessario^{un impulso centrale} I-BURP-2 a 180°, selettivo sui protoni ammidici, per rifocalizzare il contributo mediante rilassamento cross-correlato (che se non rifocalizzato porterebbe a costanti di velocità di ¹⁵N R₁ distorte ed errate).

Figura 2: Schemi di sequenza di impulsi NMR per determinare le costanti del tasso di rilassamento NMR. (A) ¹⁵N R_1ρ, (B) ¹⁵N R₁ e (C) esperimento hetNOE, utilizzando uno schema di lettura HSQC^69,70 con sensibilità aumentata. Gli impulsi a 90°(x) sono visualizzati da rettangoli stretti e gli impulsi a 180°(x) da rettangoli larghi, se non diversamente indicato. Viene applicato il seguente ciclo di fase: φ₆ = y, y, -y, -y; φ₇ = y, -y, φ_rec = y, -y, -y, y. Il rilevamento in quadratura si ottiene invertendo la polarità del gradiente G5 e il ciclo di fase di φ7 (rilevamento eco/anti-eco). (A) ^{Esperimento 15}N R_1ρ: Il rettangolo nero rappresenta lo spin-lock, per il quale la durata varia per acquisire diversi ritardi di rilassamento. I triangoli prima e dopo lo spin-lock indicano gli impulsi di forma adiabatica che allineano la magnetizzazione lungo l'asse del campo magnetico effettivo B_eff. G₁₀ è un gradiente opzionale per prevenire lo smorzamento delle radiazioni della magnetizzazione dell'acqua durante la fase di evoluzione. (B) ¹⁵N R₁ esperimento: la parte tra parentesi mostra l'elemento del ciclo della sequenza, ripetuto un numero n di volte per corrispondere al ritardo di rilassamento desiderato. (C) Lo schema dell'impulso hetNOE è simile alla seconda metà degli schemi dell'impulso R₁ e R_1ρ, vale a dire il tempo di evoluzione t₁ e l'elemento di rilevamento HSQC. Tuttavia, la magnetizzazione ^{a 15}N viene eccitata direttamente senza alcun INEPT. La saturazione della magnetizzazione del protone (per ottenere un cross-relaxation tra ¹H e ¹⁵N) è ottenuta da un treno di 180 (¹H) impulsi applicati per almeno 5 s. Per l'esperimento di riferimento viene applicato un ritardo al minimo della stessa lunghezza (qui, 5 s) senza alcun treno di impulsi. G₅ è un gradiente opzionale per prevenire lo smorzamento delle radiazioni e l'inversione di polarità del gradiente G4, in combinazione con la fase φ7 = y, -y, -y, y, raggiunge il rilevamento in quadratura. Le fasi di trasferimento della magnetizzazione, rappresentate dagli operatori del prodotto, sono contrassegnate in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La costante di velocità di rilassamento R₂ descrive il rilassamento della polarizzazione trasversale (nel piano xy ortogonale al campo magnetico esterno) dovuta alla perdita di coerenza di fase tra lo spin, che porta al decadimento della magnetizzazione rilevabile^53,54. La funzione di densità spettrale alle alte e piccole frequenze contribuisce a R₂, simile a R₁. Tuttavia, il contributo maggiore a R₂ proviene dalla densità spettrale a frequenza zero. Per questo motivo, R₂ è molto sensibile al tumbling rotazionale, descritto dal tempo di correlazione rotazionale τ_R, che è dell'ordine di pochi ns per una piccola proteina globulare a temperatura ambiente. Pertanto, i movimenti più lenti della spina dorsale nell'ordine delle centinaia di ps e del regime di ns basso contribuiscono maggiormente. Le dinamiche di scambio della spina dorsale che causano una modulazione della parte isotropa del tensore di spostamento chimico dei ^{nuclei 15}N, in linea di principio, aggiungono un contributo di scambio R_2ex alle costanti di velocità R₂ 43,44,49,60,61. Negli esperimenti descritti, il contributo di R_2ex è soppresso da un blocco di spin che rifocalizza la dinamica più lentamente della frequenza circolare inversa del blocco di rotazione. Lo spin-lock è un impulso a radiofrequenza a onda continua lunga che mantiene la magnetizzazione allineata lungo l'asse del campo magnetico effettivo B_eff (la somma vettoriale del campo di spin-lock ω₁ e lo spostamento chimico sfalsato dalla frequenza portante di ¹⁵N (vedi sotto)). Il rilassamento della magnetizzazione allineata lungo l'asse B_1,eff è chiamato rilassamento R_1ρ, che ha una componente R₁ e una componente R₂. Utilizzando la formula (1), R₂ può essere calcolato da R_1ρ e R₁^44,73:

(1).

L'angolo tra l'asse del campo magnetico effettivo B_eff e il campo magnetico esterno B₀ è . ω₁ è l'ampiezza RF dello spin-lock e Ω lo spostamento chimico tra lo spostamento chimico di ¹⁵N del residuo corrispondente e la frequenza portante di ¹⁵N ^44,73.

Lo schema degli impulsi R_1ρ (Figura 2A, ⁷⁰) è molto simile allo schema ¹⁵N R₁ tranne che per il ritardo di rilassamento. Per misurare i tassi di rilassamento di ¹⁵N R_1ρ , lo spin-lock deve essere attivo dopo che la magnetizzazione è stata allineata lungo l'asse di campo efficace B_eff da un impulso adiabatico con la stessa ampiezza di radiofrequenza (RF) dello spin-lock. La lunghezza dello spin-lock verrà variata per ottenere i diversi ritardi di rilassamento.

L'effetto Overhauser nucleare allo stato stazionario {¹H}-¹⁵N (^{1 H-15}N NOE), soprannominato hetNOE in seguito, è il rapporto tra il tasso di rilassamento incrociato e il tasso di rilassamento longitudinale di ¹⁵N. Porta ad una riduzione della polarizzazione allo stato stazionario su ¹⁵N a causa del cross-rilassamento con il protone alla saturazione della polarizzazione del protone 45,53,54,74,75. Il cross-rilassamento dipende dalle funzioni di densità spettrale della somma e della differenza delle frequenze di Larmor ¹H e ¹⁵N. Pertanto, l'hetNOE è sensibile sia alla dinamica dei picosecondi veloci (< 100 ps) che alla dinamica ps-ns (a causa della sua dipendenza da R₁). La sequenza⁶⁹ (Figura 2C) si basa su una lettura HSQC con gradienti Echo/Anti-Echo per il rilevamento in quadratura. Per la saturazione della magnetizzazione del protone e l'hetNOE risultante, la magnetizzazione del protone di equilibrio viene invertita e successivamente saturata da impulsi a impulsi di 180° per circa 5 volte il ¹⁵ N T₁. Per l'esperimento di riferimento, il ritardo di recupero è uguale al ritardo di saturazione ma senza il treno di impulsi di ¹ora a 180°. Viene aggiunto un ritardo extra di D1 = 2 s per l'esperimento di riferimento e quello con saturazione di ¹H. Entrambi gli esperimenti sono registrati uno dopo l'altro e differiscono solo per l'applicazione di ^{impulsi di 1}ora e 180° (saturazione) o meno (riferimento). Il rapporto tra le intensità spettrali registrate nell'esperimento con una saturazione di ¹H diviso per le intensità dell'esperimento di riferimento (senza il treno di impulsi di protoni a 180°) dà il valore {¹H}-¹⁵N NOE (hetNOE).

Il seguente protocollo descrive l'impostazione degli esperimenti di rilassamento NMR di Lakomek et ^al.69 e Stief et ^al.70. Ci concentriamo sulle sequenze di impulsi NMR utilizzando uno schema di rilevamento HSQC con sensibilità migliorata. Gli esperimenti ¹⁵N R₁ e R_1ρ sono implementati come descritto in dettaglio da Stief et al.70, e l'esperimento hetNOE è descritto da Lakomek et ^al.69.

Protocollo

1. Preparazione del campione NMR

NOTA: La marcatura isotopica delle proteine viene eseguita per esperimenti NMR di dimensione superiore e NMR avanzati. Quando l'espressione proteica in E. coli e la purificazione delle proteine sono state stabilite utilizzando terreni ricchi (ad esempio, Luria-Bertani [LB] o 2x estratto di lievito triptone [2YT]) con una resa di diversi milligrammi per litro, la preparazione di un campione NMR marcato isotopicamente è di solito relativamente semplice.

1. Per la marcatura degli isotopi, utilizzare terreni minimi M9 per l'espressione genica, dove il cloruro di ammonio ¹⁵N è l'unica fonte di azoto e il ^{glucosio arricchito con 13}C è l'unica fonte di carbonio.
2. Per la purificazione delle proteine, seguire il protocollo standard stabilito in laboratorio per la rispettiva proteina.
   NOTA: La sezione dei risultati mostra risultati rappresentativi per una IDP, la proteina monomerica SNARE Sinaptobrevina-2 (1-96). La marcatura isotopica NMR di Synaptobrevin-2 è stata eseguita come descritto in⁷⁰. Per misure di altissima precisione, si consiglia di utilizzare basse concentrazioni di D₂O, inferiori al 5%. Ciò è dovuto all'effetto isotopico del deuterio, che può essere osservato negli esperimenti di dispersione di rilassamento CPMG ¹⁵N T₂ di Hahn-Echo e ¹⁵N CPMG a bassa frequenza (non discussi qui) ma ha solo un impatto minimo negli esperimenti di ¹⁵N R_1ρ (dove è principalmente rifocalizzato)⁷⁶.

2. Preparativi per l'esecuzione degli esperimenti di rilassamento NMR sullo spettrometro

NOTA: Gli esperimenti di rilassamento NMR descritti sono specifici per gli spettrometri Bruker. Sono stati testati su sonde criogeniche e a temperatura ambiente a tripla risonanza da ¹H, ¹⁵N e ¹³C e console Avance III e Avance Neo gestite dal software Bruker Topsin 3.6 o superiore.

1. Seguire le precauzioni.
   1. Fai un briefing sulla sicurezza prima di lavorare allo spettrometro NMR.
   2. Controllare le specifiche di potenza della sonda dello spettrometro utilizzato e scegliere una lunghezza e una potenza dell'impulso appropriate per ogni impulso, ad esempio confrontando la coerenza con le voci della tabella "prosol" Topspin.
2. Importare le sequenze di impulsi.
   1. Scaricare i programmi a impulsi NMR dal sito Web indicato di seguito o dal repository esteso della Banca di Risonanza Magnetica Biologica (BMRB) (bmrbig102) nella directory /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user del computer che utilizza lo spettrometro NMR. Si prega di regolare la versione topspin (qui: topspin4.1.4 alla rispettiva versione installata sullo spettrometro).
   2. Scaricare gli impulsi a forma di NMR dal sito Web indicato di seguito o dal repository esteso della Banca di Risonanza Magnetica Biologica (BMRB) (bmrbig102) nella directory /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user del computer che utilizza lo spettrometro NMR. Si prega di regolare la versione topspin (qui: topspin 4.1.4 alla rispettiva versione installata sullo spettrometro).
3. Calibrare lo spettrometro e il campione.
   1. Impostare la temperatura di interesse. Per la calibrazione della temperatura, applicare i protocolli della struttura. Ad esempio, utilizzare un campione di metanolo-d4 e interpretare la differenza di spostamento chimico osservata utilizzando l'applicazione web NMR termometro (https://chem.ch.huji.ac.il/nmr/software/thermometer.html); Vedi anche⁷⁷.
   2. Inserire il campione (più un ulteriore 5% D₂O per il blocco) e attendere circa 10 minuti per consentire al campione di equilibrare la sua temperatura. Bloccare il segnale del deuterio (²H) (comando: blocco, selezionare H₂O+D₂O).
   3. Abbina e sintonizza i canali ¹H, ¹⁵N e ¹³C, ad esempio utilizzando la routine atma o atmm. Se non è installata alcuna unità di abbinamento e sintonizzazione automatica, abbinare e sintonizzare manualmente la sonda utilizzando il comando wobb.
   4. Eseguire lo shimming per un campo B₀ omogeneo, ad esempio utilizzando la routine topshim tg.
4. Calibrare la lunghezza dell'impulso di 90° (¹H).
   1. Usa l'esperimento zg. Utilizzare getprosol per importare i parametri della sonda. Scegliere una breve durata di 5 μs per P1. Se necessario, controllare e correggere il livello di potenza specificato della sonda per PLW1.
   2. Inizia l'esperimento con zg. Elabora i dati con efp. Regolare la fase con .ph in modo che la linea di base sia uniforme e il segnale NMR della risonanza dell'acqua sia in fase.
   3. Stimare un impulso a 360° (¹ora) prendendo un impulso comune o approssimativo a 90° (¹ora) (ad esempio, dalle specifiche dello spettrometro elencate) e moltiplicandolo per un fattore quattro. Eseguire l'esperimento ed elaborarlo.
      NOTA: La durata scelta è troppo lunga se il segnale è positivo e troppo breve se negativa. L'impulso a 360° (¹H) sarà il passaggio per lo zero.
   4. Regolare la lunghezza dell'impulso di conseguenza. Fallo in modo iterativo per trovare il passaggio per lo zero. Dividi il valore ottenuto per quattro. Questo sarà l'impulso a 90° (¹H).
      NOTA: Un'alternativa al metodo a 360° descritto è la routine pulscal , che può essere avviata dalla riga di comando e consente una calibrazione automatica degli impulsi di ¹ora.
5. Calibrare la frequenza portante O1 alla risonanza dell'acqua.
   1. Copia l'esperimento zg digitando edc nella riga di comando con un nuovo numero di esperimento. Digitare rpar per aprire i set di parametri (Figura 1A supplementare).
   2. Cercare il set di parametri ZGPR. Fare clic sul set di parametri ZGPR (Figura supplementare 1A), fare clic su Leggi, scegliere Esegui "getprosol" e fare clic su OK (Figura supplementare 1B).
   3. Modificare P1 con la lunghezza dell'impulso calibrata di 90° (¹H). Scegliere una lunghezza di saturazione di D1 = 2 s e una potenza di impulso di PLW9 di 50 dB. Impostare il guadagno del ricevitore (rg) su 16. In alternativa, eseguire la regolazione del guadagno del ricevitore digitando rga e impostando il guadagno del ricevitore sul valore specificato (ma evitare "overflow del guadagno del ricevitore").
   4. Digitare gs nella riga di comando per avviare un'acquisizione ripetuta e continua. Andare alla finestra di acquisizione e modificare l'O1 per ridurre l'area FID dominata dal segnale dell'acqua (Figura supplementare 2).
   5. Fare clic sotto l'indicatore per diminuire l'O1 e fare clic sopra l'indicatore per aumentarlo. Utilizzare il pulsante della sensibilità per modificare la dimensione del passo. Salva l'O1 corrente; Close interrompe l'acquisizione ripetuta (Figura 2 supplementare).
6. Calibrare la lunghezza dell'impulso di 90° (¹⁵N).
   1. Copiare l'esperimento zg in un nuovo numero di esperimento (digitare edc). Digitare rpar per leggere il set di parametri HSQCFPF3GPPHWG per modificare il programma di impulsi in un esperimento HSQC ^{1 H-15}N. Utilizzare l'opzione Mantieni parametri P1, O1 e PLW1 (Figura supplementare 1).
   2. Digitare getprosol 1H 1H) di lunghezza dell'impulso in μs> <90° (¹H) di intensità dell'impulso in db> nella riga di comando per importare i parametri della sonda. Impostare il numero di scansioni (NS) su 8 e le scansioni fittizie (DS) su 2.
      NOTA: < > specifica qui i valori da impostare. Ad esempio: getprosol 1H 8.5 -11.79.
   3. Esegui il primo incremento dell'esperimento digitando zg nella riga di comando. Copia il primo incremento in un nuovo numero dell'esperimento con rser 1 . Elabora i dati con efp e sfasa lo spettro con .ph. Utilizzare il primo incremento (esperimento 1D) dell'esperimento per i passaggi seguenti.
      NOTA: Il < > specificare il numero scelto per il nuovo esperimento, ad esempio rser 1 101.
   4. Digitare ased nella riga di comando per aprire i parametri della sequenza di impulsi dell'esperimento 1D. Fare clic sulla E nella riga PULPROG (vedere la Figura supplementare 3A) per aprire l'editor del programma a impulsi.
   5. Utilizzare il seguente flusso di lavoro per salvare la sequenza di impulsi con un nuovo nome: fare clic su File (angolo in alto a sinistra), Salva con nome, immettere il nuovo nome e fare clic su OK. Quindi fare clic su Imposta PULPROG sul set di dati (vedere la Figura 3B supplementare) e fare clic su OK.
   6. Modificare la sequenza originale ^{1 H-15}N HSQC (salvata con un nuovo nome, vedere 2.6.4.) moltiplicando i 90° (¹⁵N) dopo il periodo di evoluzione t₁ (prima del trasferimento all'indietro) per un fattore 2 (l'impulso di 90° (¹⁵N) è ora 180° (¹⁵N)). Premere Ctrl S per salvare la sequenza di impulsi. Impostare la lunghezza dell'impulso a 90° (¹⁵N) (P21) in modo che il segnale NMR del primo incremento svanisca (al passaggio per lo zero) (Figura supplementare 3B).
   7. Aprire l'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N (esperimento 2D) e inserire la lunghezza dell'impulso calibrata di 90° (¹⁵N) (P21). Digitare getprosol 1H ¹H) lunghezza dell'impulso in μs> <90° (¹H) intensità dell'impulso in db> 15N ¹⁵N) lunghezza dell'impulso in μs> <90° (¹⁵N) intensità dell'impulso in db> nella riga di comando.
7. Determinare le larghezze spettrali e l'appropriazione dei tempi di acquisizione.
   1. Nella finestra dei parametri di acquisizione per l'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N (digitare eda nella riga di comando), regolare l'ampiezza spettrale (parametro di acquisizione SW) e il numero di incrementi dimensionali in dimensioni dirette e indirette (parametro di acquisizione TD).
      1. Scegliere per SW, 16 ppm nella dimensione diretta (¹H) e 30 ppm in quella indiretta (¹⁵N). Scegliere per TD, 2048 nella dimensione diretta (¹H) e 512 in quella indiretta (¹⁵N).
   2. Acquisisci l'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N.
      1. Verificare che tutti i segnali di interesse vengano rilevati e che non siano presenti artefatti di aliasing nello spettro. Cambiare l'O3P se il centro dello spettro non si adatta al centro della distribuzione del segnale proteico lungo l'asse ¹⁵N.
      2. Aumentare il SW se la finestra spettrale è troppo piccola. Aumentare il TD per ottenere una risoluzione FID più elevata (controllare le specifiche della sonda per la durata massima del disaccoppiamento).
         NOTA: Questa è la configurazione generale e il punto di partenza per l'impostazione degli esperimenti di rilassamento NMR. Si raccomanda di registrare l'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N all'inizio e alla fine dell'intera serie di esperimenti e, per tempi sperimentali più lunghi, anche tra un esperimento e l'altro per monitorare l'integrità del campione.

3. Implementazione degli esperimenti di rilassamento NMR

NOTA: Le sequenze di impulsi di rilassamento NMR (Figura 2) sono disponibili presso https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences o presso il repository esteso della Banca di Risonanza Magnetica Biologica (BMRB) (bmrbig102).

1. Impostare il ¹⁵N R_1ρ rsperimento.
   1. Copiare l'esperimento HSQC (digitare edc) in una nuova directory. Digitare ased e modificare il programma di impulsi nell'esperimento ¹⁵N R_1ρ facendo clic sui tre punti della linea di parametri PULPROG nei parametri della sequenza di impulsi (ased, vedere la Figura supplementare 3A). Fare doppio clic sul programma a impulsi, fare clic su Imposta PULPROG sul set di dati (vedere la Figura 3B supplementare) e fare clic su OK.
      NOTA: Potrebbero essere visualizzati alcuni messaggi di errore. Chiudi questi messaggi.
   2. Digitare gpnam nella riga di comando per inserire tutte le forme di gradiente mancanti (gpnam1- gpnam9) come descritto nella sequenza di impulsi (Figura 4 supplementare).
   3. Digita vplist nella riga di comando. Fare clic sui tre punti (Figura supplementare 5A), File (angolo in alto a sinistra) e Nuovo (Figura supplementare 5B).
   4. Digitare un nome per una nuova vplist fittizia e premere OK. Crea la vplist fittizia (5m, 65m, 25m, 45m, 15m, 55m, 35m, 10m; una nuova riga per ogni voce vplist). Premere Ctrl S per salvare l'elenco e chiudere la finestra della vplist (Figura supplementare 5C).
   5. Fare doppio clic sul nome della vplist appena creata (Figura supplementare 5B).
      NOTA: Ciò è necessario per evitare errori di compilazione nella sequenza di impulsi. Le voci appropriate della vplist saranno determinate più avanti (punto 3.1.29.).
   6. Digitare ased per aprire i parametri della sequenza di impulsi (Figura 6 supplementare). Inserire tutte le intensità e le lunghezze del gradiente mancanti come indicato nella sequenza di impulsi (Figura 6D supplementare).
   7. Inserire per il contatore di loop L₃ (numero di punti complessi nella dimensione indiretta) 1/2 della voce ¹⁵N TD nella finestra dei parametri di ripresa (eda). Inserire per il contatore di loop L₆ il numero di punti dati di rilassamento registrati utilizzati per l'adattamento della curva di rilassamento.
      NOTA: Questo numero L₆ corrisponde al numero di voci vplist, qui: 8 (Figura 6A supplementare).
   8. Impostare l'impulso adiabatico TanhTan_half.nl, scaricato dal sito Web sopra specificato, come forma dell'impulso ¹⁵N SP8. Impostare l'impulso adiabatico TanhTan_2nd.nl dal sito Web come la forma dell'impulso ¹⁵N SP9 (Figura supplementare 6C).
   9. Impostare l'ingresso P8 alla lunghezza dell'impulso adiabatico TanhTan - sufficientemente lungo da garantire l'adiabaticità dell'impulso; qui si sceglie P8 = 3000 μs (Figura supplementare 6C).
   10. Impostare il disaccoppiamento ¹⁵N (CPDPRG 3) su uno schema di disaccoppiamento garp. Utilizzare per la lunghezza del disaccoppiamento PCPD3 200 μs (Figura supplementare 6C).
   11. Impostare il ritardo di recupero dell'interscansione su almeno D1 = 2 s o più.
       NOTA: Per la scelta di un ritardo di recupero appropriato, vedere la sezione Discussione.
   12. Impostare le scansioni fittizie (DS) su almeno 64 per l'esperimento finale (durante la configurazione, DS = 4 è sufficiente per motivi di tempo). Come punto di partenza, utilizzare un numero di scansioni (NS) di 4; utilizzare multipli di 4 se il rapporto segnale/rumore (SNR) è troppo basso (Figura 6A supplementare).
   13. Impostare l'O1 sulla frequenza portante calibrata del passaggio 2.5. Impostare l'O2P a 176 ppm e copiare l'O3P dall'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N (Figura supplementare 6A-C).
   14. Impostare la lunghezza dell'impulso P7 sulla lunghezza dell'impulso di 90° (¹⁵N) calibrata al punto 2.6. Inoltre, copiare il livello di potenza dell'impulso a 90° (¹⁵N) dal passaggio 2.6 a PLW3 e PLW7 (Figura 6C supplementare).
   15. Impostare la lunghezza dell'impulso P1 e P19 sulla lunghezza dell'impulso di 90° (¹H) calcolata al punto 2.4. (Figura 6B supplementare).
   16. Impostare il numero di incrementi nella dimensione indiretta TD = l₃ * 2 * l₆ (eda o digitare td nella riga di comando).
       NOTA: Tutti i parametri della sequenza di impulsi qui descritti sono ulteriormente annotati nella sequenza di impulsi.
   17. Impostare l'impulso di forma SP5 su una forma I-BURP2 (Iburp2.1000). Impostare la lunghezza dell'impulso P15 su 2000 μs. Aprire la visualizzazione dello strumento forma facendo clic sulla E accanto all'impulso di forma I-BURP2 nella finestra dei parametri della sequenza di impulsi Topspin (ased) (Figura 6B supplementare).
   18. Simulare l'impulso di forma con la lunghezza corretta facendo clic sul pulsante Avvia simulazione NMR. Controllare la lunghezza dell'impulso sagomato [μs] (= 2000 μs) e l'angolo di rotazione [°] (= 180°) nella finestra di simulazione. Fare clic su Avvia NMR-SIM (Figura supplementare 7A).
   19. Controllare l'intervallo di eccitazione e scegliere la lunghezza dell'impulso I-BURP2 appropriata per coprire la dispersione spettrale di ¹H della proteina, ma allo stesso tempo evitare l'eccitazione dell'acqua. Impostare P15 sulla lunghezza dell'impulso sagomato della finestra di simulazione con il miglior impulso IBURP-2 simulato (Figura 7B supplementare).
       NOTA: La lunghezza corretta viene scelta se l'I-BURP2 eccita (> un'efficacia del 95%) l'intera regione ammidica. Per simulare un impulso I-BURP2 con una lunghezza diversa, chiudere la finestra del profilo di eccitazione e modificare la lunghezza dell'impulso sagomato nella finestra di simulazione. Fare clic su Avvia NMR-SIM. Gli impulsi con una lunghezza inferiore hanno un intervallo di eccitazione più ampio in Hz.
   20. Impostare SPOFFS5 per modificare la frequenza portante dell'impulso I-BURP2 e spostare l'intervallo di eccitazione a sinistra o a destra per evitare che l'impulso I-BURP2 tocchi e disturbi la magnetizzazione dell'acqua (Figura 6B supplementare).
   21. Per determinare il livello di potenza appropriato dell'impulso sagomato, aprire lo strumento Forma Bruker, fare clic sul pulsante Avvia simulazione NMR e impostare la lunghezza dell'impulso I-BURP2 su Lunghezza dell'impulso sagomato [μs]. Ricordare la lunghezza corrispondente di un impulso rettangolare morbido a 90° (¹H), visibile nella finestra di simulazione al corrispondente impulso quadrato di 90° [μs] (Figura 7A supplementare).
   22. Tipo calcpowlev. Utilizzare l'impulso duro a 90° (¹H) (P1) in microsecondi come lunghezza di riferimento (Figura supplementare 8B) e l'impulso rettangolare morbido a 90° (¹H) corrispondente all'impulso I-BURP2 in microsecondi come nuova lunghezza (Figura supplementare 8A). Ricordare la differenza di potenza Δ in dB tra l'impulso duro a 90° (¹H) e l'impulso rettangolare morbido (Figura supplementare 8C). Copiare l'intensità dell'impulso duro a 90° (¹H) in dB su SPW5 e aggiungere la differenza memorizzata Δ in dB (Figura 6B supplementare).
   23. Per determinare il livello di potenza dello spin-lock, calcolare la corrispondente lunghezza dell'impulso di 90° (¹⁵N) dello spin-lock. Utilizzare la formula: lunghezza dell'impulso di 90° (¹⁵N) in s = 0,25 / (potenza di spin-lock in Hz).
   24. Utilizzare calcpowlev per calcolare la differenza di potenza Δ in dB tra la potenza dello spin-lock e l'impulso forte di 90° (¹⁵N) (P7). Novità: lunghezza dell'impulso di 90° (¹⁵N) dello spin-lock in μs (Figura supplementare 8A). Rif: lunghezza dell'impulso dura a 90° (¹⁵N) in μs (Figura supplementare 8B). Copiare il livello di potenza PLW7 dell'impulso duro a 90° (¹⁵N) in dB nel livello di potenza di spin-lock PLW8 (Figura 6C supplementare) e aggiungere la differenza di potenza calcolata Δ in dB (Figura 8C supplementare).
   25. Copiare il livello di potenza dello spin-lock PLW8 nei livelli di potenza SPW8 e SPW9. (Figura supplementare 6C).
   26. Per determinare il livello di potenza del disaccoppiamento a ¹⁵N, utilizzare calcpowlev per calcolare la differenza di potenza Δ tra la potenza dell'impulso di disaccoppiamento a 90° (¹⁵N) (PCPD3) e l'impulso duro a 90° (¹⁵N) (P7). Novità: PCPD3 in μs (200) (Figura supplementare 8A). Rif: lunghezza dell'impulso dura a 90° (¹⁵N) in μs (Figura supplementare 8B). Copiare il livello di potenza PLW7 dell'impulso duro a 90° (¹⁵N) in dB al livello di disaccoppiamento PLW31 (Figura 6C supplementare) e aggiungere Δ in dB (Figura 8C supplementare).
   27. Per utilizzare la compensazione della temperatura, includere #define TEMP_COMPENSATION (eliminando il punto e virgola nella sequenza di impulsi). Impostare P18 sulla durata massima dello spin-lock utilizzato nell'esperimento ¹⁵N R_1ρ .
       NOTA: Si consiglia di disattivare la compensazione della temperatura per la prima prova dell'esperimento.
   28. Nel caso di campioni marcati con ¹⁵N ¹³C, includere # per definire LABEL_CN nel programma a impulsi (eliminando il punto e virgola nella sequenza a impulsi). Impostare P4 sulla lunghezza dell'impulso calcolata con la formula in⁷⁸. Ad esempio, corrisponde a 23,70 μs a 600 MHz e 11,85 μs a 1200 MHz. Digitare calcpowlev per calcolare la differenza di potenza in dB tra P4 e l'impulso duro (¹³C). Copiare la potenza dell'impulso duro (¹³C) in dB in PLW4 e aggiungere il Δ in dB. Copiare PLW4 in PLW2 (Figura 6B supplementare).
   29. Determinare i ritardi di rilassamento per un campionamento appropriato.
       1. Esegui i primi otto FID (nel caso L₆ = 8) ed elaborali (rser < numero del nuovo esperimento>). Scegli le voci nella vplist in modo che l'intensità di picco dell'esperimento con il ritardo più lungo diminuisca ad almeno 1/e (circa il 37%), ma non meno del 25% rispetto all'esperimento con il ritardo più breve (che funge da riferimento).
       2. Regolare le voci rimanenti della vplist per ottenere un campionamento uniforme delle diminuzioni di intensità tra il FID con il ritardo più lungo e il FID con il ritardo più breve. Leggere la NOTA e le specifiche di alimentazione della sonda.
          NOTA: I residui che si rilassano lentamente domineranno il primo FID. Regolare le voci rimanenti della vplist per ottenere un campionamento uniforme delle diminuzioni di intensità tra il primo e il secondo FID. Non superare la potenza e la lunghezza massima consentita per la rotazione della sonda (consultare il manuale della sonda e le specifiche della sonda). In caso di compensazione della temperatura, controllare P18 (durata massima del blocco della rotazione), poiché verrà applicata la durata complessiva del blocco della rotazione di P18, suddivisa tra il ritardo di rilassamento e la compensazione della temperatura. Mantiene il tempo (ritardo di rilassamento) + il tempo (compensazione della temperatura) = const = P18. Per uno spin-lock a 2 kHz, preferiamo non superare una durata dello spin-lock superiore a 65 ms, utilizzando un ritardo di recupero (D1) di 2 s. In tal caso, è necessario adottare un compromesso tra la durata massima dello spin-lock e il ritardo di rilassamento più lungo a favore della durata massima consentita dello spin-lock. In caso di ritardi di recupero D1 più lunghi, potrebbero essere applicabili potenze di spin-lock più lunghe. Ciò che conta è la deposizione complessiva di potenza nella sonda nel tempo. Se sono necessarie durate di spin-lock più lunghe, aumentare le lunghezze di spin-lock solo a piccoli passi e osservare il segnale di blocco. Come regola generale, regola il livello di blocco nel terzo superiore del display del lucchetto. Se il livello di blocco si riduce di più di due quadrati durante l'esecuzione della sequenza di impulsi, la potenza di spin-lock depositata nella sonda è eccessiva.
   30. Digita rga nella riga di comando per determinare il guadagno del ricevitore. Per un buon rapporto segnale/rumore, puntare a un valore di guadagno del ricevitore (rg) compreso tra 128 e 256, che dimostra una buona soppressione dell'acqua.
       NOTA: Un guadagno del ricevitore compreso tra 128 e 256 non può essere raggiunto indica un segnale dell'acqua troppo forte. In tal caso, la potenza del gradiente e la durata vengono regolate delicatamente fino a raggiungere il guadagno del ricevitore. Vedi anche la sezione Discussione.
   31. Avviare un test dell'esperimento ¹⁵N R_1ρ digitando zg nella riga di comando. Verificare che il segnale dell'acqua sia ben soppresso per tutti i ritardi (da 1 a 8, in caso di 8 ritardi nella vplist). Controllare anche l'incremento 9, che è il secondo incremento dello schema di rilevamento in quadratura (Eco/Anti-Eco).
2. Imposta l'esperimento ¹⁵N R₁ .
   1. Copiare l'esperimento ¹⁵N R_1ρ e cambiare il programma di impulsi nell'esperimento ¹⁵N R₁ .
   2. Digitare vclist, generare un vclist e immettere il dummy vclist descritto in⁷⁰: 0, 24, 6, 20, 4, 16, 8, 12; una nuova riga per ogni voce vclist).
   3. Aperto ased. Controllare le lunghezze e le intensità del gradiente. Cambia GPZ9 al 14%.
   4. Controllare la lunghezza dell'impulso, la forma dell'impulso e l'intensità dell'impulso (i valori corretti dovrebbero essere stati copiati dall'esperimento ¹⁵N R_1ρ ).
   5. Nel caso di campioni marcati con ¹⁵N¹³C, utilizzare #define LABEL_CN nel programma a impulsi.
   6. Per l'uso della compensazione della temperatura, includere #define TEMP_COMPENSATION.
   7. Esegui i primi otto FID (nel caso L₆ = 8) ed elaborali (rser < numero del nuovo esperimento>). Scegliere le voci nella vclist in modo che l'intensità di picco dell'esperimento con il ritardo più lungo diminuisca ad almeno 1/e (circa il 37%) ma non meno del 25% rispetto all'esperimento con il ritardo più breve. Regolare le voci rimanenti della vplist per ottenere un campionamento uniforme delle diminuzioni di intensità tra il FID con il ritardo più lungo e il FID con il ritardo più breve.
      NOTA: Sono consentiti solo numeri pari per le voci vclist.
3. Impostare l'esperimento {¹H}-¹⁵N NOE.
   1. Copiare l'esperimento di rilassamento ¹⁵N R₁ e modificare la sequenza di impulsi nello schema di impulsi {¹H}-¹⁵N NOE.
   2. Impostare la durata del periodo di saturazione con il contatore di loop L₈. La spaziatura tra gli impulsi di 180° (¹H) è di 22 ms⁷⁹ (2* 1 / J_NH). Per ottenere i risultati più accurati, utilizzare un periodo di saturazione di circa 5 volte i ¹⁵N T₁(¹⁵N) della proteina. Qui: 5 s. Ciò corrisponderebbe a L8 = 230.
      NOTA: La sezione Discussione fornisce ulteriori consigli sulla scelta del periodo di saturazione/ritardo di recupero.
   3. Modificare la lunghezza e l'intensità dei gradienti come descritto nello schema degli impulsi. Usa le forme sfumate sinusoidali.20.
   4. Impostare il numero di incrementi nella dimensione indiretta uguale a TD = l₃ * 2 * 2
   5. Nel caso di campioni marcati con ¹⁵N¹³C, utilizzare #define LABEL_CN e -DLABEL_CN come ZGOPTNS.
   6. Esegui gli schemi a impulsi digitando zg nella riga di comando.

4. Elaborazione e analisi degli esperimenti NMR registrati

NOTA: Gli spettri sono stati registrati utilizzando un sistema Bruker. L'elaborazione viene eseguita utilizzando un sistema operativo Unix o Linux. L'elaborazione degli spettri e l'analisi dei dati sono state eseguite utilizzando NMRPipe⁸⁰ e python3. Il software NMRPipe può essere scaricato all'indirizzo https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/index.html. Gli script di elaborazione basati su NMRPipe possono essere scaricati dal sito web: https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences o dal repository esteso Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) (bmrbig102). Si consiglia di utilizzare NMRPipe. Se NMRPipe non è disponibile o desiderato, è possibile utilizzare alternative come CCPN⁸¹ o SPARKY (SPARKY 3, o i suoi successori NMRFAM-SPARKY⁸² o POKY⁸³ ).

1. Elaborazione e analisi ¹⁵N R₁ rsperimento.
   NOTA: I seguenti comandi vengono eseguiti in un terminale Unix.
   1. Copiare i file nella directory scaricata R1_processing nella directory contenente i dati R1 sperimentali (directory di lavoro).
   2. Rendi i file eseguibili dal comando del terminale: > chmod u+x *.com
   3. Eseguire > bruker per aprire l'utilità di conversione NMRPipe e generare il file fid.com. Fare clic su Leggi parametri. Impostate su due il conteggio delle quote se vengono contate tre dimensioni, quindi fate nuovamente clic su Leggi parametri (Read Parameters ). Fare quindi clic su Cancella script, Aggiorna script e Salva script (Figura 9 supplementare).
      NOTA: Se la frequenza portante non è corretta, modificare la posizione centrale PPM dopo aver fatto clic su Leggi parametri la seconda volta.
   4. Esegui > ./fid.com
   5. Converti la vclist in una vplist con ms voci: ritardo in ms = 40 ms * voce di vclist. Utilizzare > cp vclist vplist e modificare la vplist.
   6. Utilizzare > ./split.com per dividere i dati pseudo 3D in otto file 2D.
   7. Modificare i valori tauValues (valori vplist nell'ordine della vplist) e i valori idxExpmt (ordine dei tauValues relativi all'ora) in nmrproc.com (Figura 10 supplementare).
   8. Utilizzare > ./nmrproc.com per elaborare i dati grezzi di tutti gli otto spettri 2D.
   9. Utilizzare > nmrDraw per disegnare gli spettri.
      1. Utilizzare lo spettro di riferimento (prima voce in vplist) per questi passaggi. Passa a quello spettro modificando la dimensione z a uno (angolo in alto a sinistra). Regolare il livello del contorno utilizzando i tasti + e - accanto al pulsante Fattore . Ridisegna lo spettro con il pulsante Disegna.
      2. Utilizzare un livello di contorno in cui tutti i segnali di interesse possono essere riconosciuti con solo pochi segnali provenienti dal rumore (il livello di contorno è al limite del livello di rumore) (Figura 11 supplementare).
   10. Correggere la fase dello spettro, digitare v per la proiezione verticale del segnale 1D e h per la proiezione orizzontale del segnale 1D. Regolare la fase con P0 e P1 (Figura supplementare 11), ricordare la differenza di fase e correggere la fase nel file nmrproc.com (Figura supplementare 10).
       NOTA: Se lo spettro è invertito nella dimensione ¹⁵N, rimuovere il -neg nella riga: | nmrPipe -fn FT -neg \ (Figura supplementare 10).
   11. Chiudi nmrDraw ed elabora di nuovo con > nmrproc.com. Per il prelievo dei picchi (dopo che lo spettro è stato sfasato correttamente e lo spettro di riferimento è stato visualizzato con un livello di contorno in cui sono presenti tutti i picchi), digitare K (Maiusc + k), premere Rileva e fare clic su Salva. (Figura supplementare 11).
   12. Copiare un elenco di picchi nella directory di lavoro e modificare -assName in ass.com con il nome dell'elenco di picchi (Figura 12 supplementare).
       NOTA: Un esempio di lista dei picchi nel formato corretto è disponibile all'indirizzo https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences
       e presso il deposito esteso della Banca di Risonanza Magnetica Biologica (BMRB) (bmrbig102).
   13. Eseguire > ./ass.com per assegnare gli spettri. Verificare l'assegnazione che lo script suggerisce per i vari picchi. Utilizzare il tasto sinistro del mouse per assegnare e il tasto destro del mouse per deassegnare i picchi. Utilizzare il pulsante Avanti per passare all'amminoacido successivo e Indietro per passare all'amminoacido precedente (Figura 13 supplementare).
       NOTA: Il livello del contorno può essere modificato con + e - nell'angolo in alto a destra. Utilizzare il pulsante Disegna per ridisegnare lo spettro con il nuovo livello di contorno (Figura supplementare 13).
   14. Dopo aver completato l'assegnazione, fare clic su Salva e quindi su Salva di nuovo. Successivamente, fare clic su Esci, Annulla ed Esci (Figura 13 supplementare).
   15. Esegui > python3 NoneDeleter.py per creare relax.tab, che contiene solo informazioni sui picchi assegnati.
   16. Eseguire > ./relax.com per generare lo script autofit.com.
   17. Esegui > ./autoFit.com per eseguire un'interpolazione di Fourier e generare pseudo rapporti dei diversi tempi di ritardo per ogni amminoacido (vengono generati axt.tab e nlin.tab ).
   18. Eseguire > ./model.com per generare lo script modelExp.com in base ai dati in nlin.tab.
   19. Esegui > ./modelExp.com per adattare la curva di evoluzione di ciascun residuo con un modello di ottimizzazione dei minimi quadrati non lineare.
   20. Esegui > bash summary.tcl -in relax.tab > t1.tab. Ignorare un potenziale messaggio di errore: GDB Avviso: possono verificarsi 21 valori mancanti nel file della tabella .
   21. Copiare t1.tab in una directory R1R2 appena creata.
2. Elaborare e analizzare l'esperimento ¹⁵N R_1ρ .
   1. Copiare i file nella directory scaricata R1rho_processing nella directory contenente i dati sperimentali R_1ρ (directory di lavoro).
   2. Esegui > chmod u+x *.com
   3. Eseguire > bruker per aprire l'utilità di conversione NMRPipe e generare il file fid.com. Vedi anche l'elaborazione degli spettri ¹⁵N R₁ .
   4. Esegui > ./fid.com
   5. Esegui > ./split.com per dividere i dati pseudo 3D in otto file 2D.
   6. Eseguire > ./nmrproc.com (modificare in anticipo i valori tauValues [vplist] e idxExpmt ) per elaborare i dati grezzi di tutti gli otto spettri 2D (Figura 10 supplementare).
   7. Esegui > nmrDraw per disegnare gli spettri e selezionare i picchi. Utilizzare lo spettro di riferimento (prima voce in vplist) per questi passaggi. Seguire la stessa procedura dell'esperimento ¹⁵N R₁ .
   8. Copiare un elenco di picchi nella directory di lavoro e modificare -assName in ass.com con il nome dell'elenco di picchi (Figura 12 supplementare).
   9. Eseguire > ./ass.com e seguire la stessa procedura dell'esperimento ¹⁵N R₁ .
   10. Esegui > python3 NoneDeleter.py per creare relax.tab, che contiene solo informazioni sui picchi assegnati.
   11. Esegui > ./relax.com
   12. Esegui > ./autoFit.com
   13. Esecuzione > ./model.com
   14. Esecuzione > ./modelExp.com
   15. Esegui > bash summary.tcl -in relax.tab > t1rho. tab. Ignora il potenziale messaggio di errore: GDB Avviso: potrebbero verificarsi 21 valori mancanti nel file della tabella .
   16. Copiare la seguente intestazione nel file t1rho.tab (i valori possono essere ottenuti dal file fid.com) (Figura 14 supplementare):
       NOTA 600MHz per T1rho
       NOTA -yOBS = 60.818 (metti qui il valore trovato in fid.com)
       NOTA -yCAR = 119,06 (metti qui il valore trovato in fid.com)
   17. Eseguire > ./extract_PPM.com per generare una tabella denominata fusionOffset.tab che contiene l'offset della frequenza di picco ¹⁵N rispetto alla frequenza portante (che sarà necessaria per calcolare l'angolo θ per l'estrazione dei dati R₂ dai dati R₁ e R_1ρ ).
3. Riassumi i dati sul rilassamento.
   1. Copiate il file t1rho.tab e il file fusionOffset.tab nella directory R1R2.
   2. Copia lo script crtR1p.tcl nella directory R1R2, regola la frequenza dello spettrometro e la potenza di spin-lock, ed esegui bash crtR1p.tcl | sort -n > R1R2.tab. (Figura supplementare 15). R1R2.tab conterrà le costanti di velocità R_1ρ adattate, l'angolo theta, le costanti di velocità R₂ e le costanti di velocità R₁ .
4. Elaborare e analizzare l'esperimento hetNOE.
   1. Copiare i file nella directory scaricata NOE_processing nella directory dei dati NOE sperimentale (directory di lavoro).
   2. Esegui > chmod u+x *.com
   3. Eseguire > bruker per aprire l'utilità di conversione NMRPipe e generare il file fid.com. Fare clic su Leggi parametri. Modificare il conteggio delle dimensioni su due se sono state contate tre dimensioni e premere nuovamente Leggi parametri . Quindi premere Cancella script, Aggiorna script e Salva script.
   4. Esegui > ./fid.com
   5. Esegui > ./split.com (prima deve essere creata una vplist con due voci (0, 1))
   6. Esecuzione > ./ft2.com
   7. Eseguire > nmrDraw per disegnare lo spettro e selezionare i picchi nello spettro di riferimento (dimensione z = 1). Estrai e ricorda il rumore (premi T = Maiusc + t). La correzione di fase e il prelievo dei picchi seguono la stessa procedura dell'esperimento ¹⁵N R₁ .
   8. Copiare un elenco di picchi nella directory di lavoro e modificare -assName in ass.com con il nome dell'elenco di picchi (Figura 12 supplementare)
   9. Eseguire > ./ass.com per assegnare gli spettri. Seguire la stessa procedura descritta per l'esperimento ¹⁵N R₁ .
   10. Esegui > python3 NoneDeleter.py per creare relax.tab.
   11. Esecuzione > ./script.com
   12. Esegui > ./autoFit.com
   13. Cambia il rumore in error_hetnoe.tcl.
   14. Esegui > bash error_hetnoe.tcl |sort -n > hetNOE.tab

Risultati

Di seguito sono riportati alcuni dati esemplari di rilassamento NMR registrati sulla proteina vescicolare SNARE Sinaptobrevin-2 (1-96), frequentemente chiamata VAMP2 (proteina associata alla vescicola 2). Per registrare i dati NMR, abbiamo utilizzato un campione di 171 μM ¹⁵N Synaptobrevin-2 (1-96) (soprannominato Syb-2 di seguito) in 50 mM di tampone MES (pH 6.0) contenente 150 mM di NaCl, 0.1 mM di TCEP e 1 mM di EDTA. Tutti i dati sperimentali sono stati registrati a 278,15 K utilizzando un volume di 250 μL riempito in una provetta campione NMR da 3 mm. Gli esperimenti sono stati eseguiti con uno spettrometro Bruker 600 MHz AVANCE III HD equipaggiato con una criosonda a risonanza quadrupla Bruker 5 mm QCI ¹H, ¹⁵N, ¹³C, ³¹P.

La Figura 3 mostra le costanti di velocità di rilassamento ¹⁵N R₁ e R₂ specifiche del residuo adattate alle curve di rilassamento NMR ottenute dagli esperimenti di rilassamento NMR. Sull'asse y, le rispettive costanti del tasso di rilassamento sono tracciate per i singoli residui lungo la sequenza proteica (sull'asse x). Inoltre, vengono mostrati i valori di NOE eteronucleare ^{1 H-15}N (hetNOE) estratti dai rapporti di intensità degli esperimenti di saturazione e non saturazione (riferimento) della misura NMR eteronucleare ^{1 H-15}N.

I dati NOE eteronucleari e le costanti di velocità ¹⁵N R₂ sono più facilmente interpretabili rispetto ai dati ¹⁵N R₁ . Pertanto, inizieremo con loro.

NOE eteronucleare:
I NOE eteronucleari {¹H}-¹⁵N sono sensibili alla dinamica interna sulla scala temporale del picosecondo veloce (<100 ps, a causa della sua dipendenza dal cross-relax) ma anche alla dinamica ps - ns (a causa della sua dipendenza da R₁ ) e possono assumere valori solitamente compresi tra 0 e (un po' meno) 1 per le proteine ripiegate. A campi più alti saranno sistematicamente più alti (ma sempre più bassi di 1).

Descrivono la flessibilità interna della proteina. Quando si confrontano i valori di hetNOE alle stesse intensità di campo, si afferma: più piccolo è {¹H}-¹⁵N NOE, più dinamico è il rispettivo residuo. Per gli IDP, si osservano tipicamente piccoli NOE residui specifici {¹H}-¹⁵N, ad esempio nell'ordine di 0,5 e più piccoli a 600 MHz. Tuttavia, si riscontrano anche {¹H}-¹⁵N NOE negativi per gli IDP, anche fino a -2 a 500 MHz. Per il Syb-2 monomerico, {¹H}-¹⁵N NOE misurato a 600 MHz è compreso tra -0,5 per l'N-terminale e 0,5 per il dominio del linker C-terminale. I valori aumentano gradualmente dal terminale N a quello C, indicando una flessibilità gradualmente decrescente/aumento della rigidità (Figura 3C).

¹⁵N R₂ costanti di velocità
¹⁵Le costanti di velocità N R₂ sono sensibili alla dinamica ps - ns che modula l'orientamento del vettore di legame N-H attraverso il tumbling complessivo della proteina, il movimento dei piani peptidici e la torsione degli angoli diedri della spina dorsale. A differenza dei valori {¹H}-¹⁵N NOE e R_1, le costanti di velocità ¹⁵N R₂ sono dominate dalla densità spettrale J(0) associata al tumbling complessivo (rotazionale) della proteina. Pertanto, per le proteine ripiegate globulari, le costanti di velocità ¹⁵N R₂ sono scalate in dimensioni in base al tumbling complessivo e alle dimensioni della proteina. Per gli IDP reali, non è possibile assegnare alcun tempo di correlazione rotazionale globale. Tuttavia, un tempo di correlazione lento dipendente dalla lunghezza della catena può essere adattato⁸⁴, come previsto per i polimeri, ma le dinamiche interne specifiche del residuo hanno un impatto maggiore sulle costanti di velocità ¹⁵N R₂ . All'interno della stessa proteina, ¹⁵costanti di velocità N R₂ consentono la discriminazione delle strutture rispetto alle regioni non strutturate con diversa mobilità interna specifica del residuo. Più piccola è la costante di velocità di ¹⁵N R₂ osservata, più mobile è il rispettivo residuo. Le costanti di velocità elevate ^{di 15}N R₂ sono caratteristiche degli elementi della struttura secondaria, come le α-eliche o i β-filamenti. Le costanti di velocità di rilassamento R₂ basse sono caratteristiche delle regioni ad anello e intrinsecamente disordinate. Per la Syb-2 monomerica (1-96), osserviamo costanti di velocità complessivamente basse di ¹⁵N R₂ coerenti con il suo carattere intrinsecamente disordinato. La rigidità interna aumenta (la mobilità diminuisce) dall'N-terminale fino al dominio del linker C-terminale prima di scendere verso il C-terminale flessibile (Figura 3B).

¹⁵costanti di velocità N R₁
Le velocità di rilassamento R₁ sono sensibili alla dinamica dei picosecondi (ps) e dei nanosecondi più veloci (ns). Tuttavia, la loro interpretazione diretta delle dinamiche interne è più complessa rispetto alle precedenti. C'è un campo T₁ (R₁) minimo (massimo) quando T₁ è tracciato in funzione della correlazione rotazionale τ_R: T_1min a τ_{R, min} = 1/ ω. Per molecole a rotolamento rapido con τ_R < τ_{R, min,} ad esempio, piccole molecole o piccole proteine globulari, costanti di velocità R₁ più basse indicano un aumento della dinamica della spina dorsale proteica (come per R₂). Nel caso di proteine più grandi, con τ_R > τ_{R, min}, è l'opposto, e costanti di velocità di rilassamento R₁ più elevate rappresentano una dinamica aumentata (opposta a R₂).

Figura 3: Dati sul rilassamento NMR. I dati sono stati registrati e valutati seguendo il protocollo e il flusso di lavoro sopra descritti. (A) Costanti di velocità di rilassamento ¹⁵N R₁ residuo specifiche lungo la spina dorsale proteica di Syb2 (1-96). (B) ¹⁵costanti di velocità di rilassamento N_{R 2} , calcolate dai dati R_1ρ e R₁ utilizzando la formula (1). (C) velocità di trasferimento hetNOE lungo la dorsale di Syb2 (1-96). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Lettura dei parametri NMR. Viene visualizzata l'interfaccia della macro rpar . (A) Panoramica di tutti i set di parametri. La casella rossa segna la barra di ricerca. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Fare doppio clic per scegliere un set di parametri. (B) Panoramica dei parametri che possono essere importati nell'esperimento corrente. Le opzioni per eseguire getprosol o per mantenere parametri specifici dell'esperimento corrente sono contrassegnate da caselle rosse. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Posizionamento della frequenza portante di ¹ora per una soppressione ottimale dell'acqua. Viene visualizzata l'interfaccia della macro gs . Mentre l'esperimento è in loop, è possibile modificare diversi parametri dell'esperimento. Il marcatore può essere utilizzato qui per modificare il parametro scelto durante l'acquisizione. Facendo clic sopra il marcatore si alza il parametro del valore specificato in "sensibilità". L'interruttore della sensibilità può essere utilizzato per regolare la dimensione del passo del marcatore. Sul lato destro è visibile il FID in tempo reale. Per la calibrazione dell'O1, l'obiettivo è quello di ridurre al minimo l'area FID contrassegnata da un riquadro rosso, poiché il FID è solitamente dominato dal segnale dell'acqua. La riduzione dell'area FID va di pari passo con la diminuzione del segnale d'acqua e una migliore soppressione dell'acqua. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Uno sguardo più da vicino alla sequenza di impulsi ^{HSQC 1 H-15}N e ai suoi parametri di acquisizione. (A) Parametri della sequenza di impulsi dell'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N HSQCFPF3GPPHWG. Fare clic su "E" per aprire la finestra dell'editor del programma a impulsi in B. (B) Editor del programma a impulsi dell'esperimento ^{HSQC 1 H-15}N HSQCFPF3GPPHWG. La linea commentata (linea 91) con un impulso di ¹⁵N 90° mostra la linea originale per un esperimento ^{HSQC 1 H-15}N. Nella linea 92, l'impulso ¹⁵N 90° viene modificato in un impulso ¹⁵N 180°. Questa modifica rende l'esperimento ^{1 H-15}N HSQC un programma di impulsi di calibrazione per la calibrazione di impulsi duri a 90° ¹⁵N. Per modificare le sequenze di impulsi, salvare prima la sequenza con un nuovo nome. Utilizzare il seguente flusso di lavoro: fare clic su File, Salva con nome, immettere il nuovo nome, fare clic su OK e fare clic su Imposta PULPROG sul set di dati. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Impostazione dei gradienti. Viene mostrata l'interfaccia della macro gpnam per modificare le forme, le lunghezze e le intensità del gradiente. Per aprire l'interfaccia dei parametri della sequenza di impulsi utilizzata, è necessario inserire tutte le forme di gradiente GPNAM. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Impostazione dei ritardi di rilassamento. Interfaccia della macro vplist (identica alla macro vclist). (A) Interfaccia per scegliere una vplist. Cliccando sui tre punti, si apre l'interfaccia B. (B) Interfaccia per scegliere una vplist tramite DoubleClick o creare una nuova lista facendo clic su File e Nuovo. (C) L'interfaccia si apre creando un nuovo elenco o modificando un elenco esistente. L'elenco può essere salvato facendo clic su File e Salva. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 6 supplementare: Parametri della sequenza di impulsi dell'esperimento 15N R1ρ. (A-D) Tutti i parametri essenziali che devono essere modificati nel protocollo sono contrassegnati da caselle rosse e i passaggi associati. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 7 supplementare: Interfaccia della macro shapetool . Un I-BURP2 (utilizzato negli esperimenti) viene aperto come impulso di forma. (A) Parametri dell'impulso di forma selezionato. Facendo clic sul pulsante Avvia simulazione NMR contrassegnato da una casella rossa, si aprono le finestre dei parametri di simulazione con i parametri di simulazione Lunghezza dell'impulso sagomato [μs] (= 2000 μs) e Angolo di rotazione [°] (= 180°). Facendo clic sul pulsante Avvia NMR-SIM si apre la finestra di simulazione (B), che mostra la larghezza di banda di inversione dell'impulso I-BURP2. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 8: Interfaccia della macro di calcpowlev . (A) Finestra di ingresso per la lunghezza dell'impulso di cui si vuole calcolare la potenza. (B) Finestra di ingresso dell'impulso di riferimento (principalmente l'impulso duro a 90°). (C) La finestra dei risultati mostra la differenza di intensità dell'impulso in dB tra un impulso con la nuova lunghezza dell'impulso e un impulso con la lunghezza dell'impulso di riferimento. Attenzione: questa differenza è valida solo se entrambe le lunghezze dell'impulso corrispondono all'impulso identico per quanto riguarda la forma e l'angolo di rotazione. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 9 supplementare: Elaborazione degli spettri NMR: interfaccia dello strumento di conversione NMRPipe. Facendo clic su Leggi parametri vengono letti automaticamente i parametri dell'esperimento. Lo script di conversione viene visualizzato a destra. Tutti i parametri possono essere impostati individualmente. Dopo aver modificato i parametri utilizzando Clear Script, si consiglia di aggiornare loscript . Fare clic su Salva script per salvare lo script in fid.com, come mostrato a destra. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 10 supplementare: Il file nmrproc.com per l'elaborazione spettrale. Viene mostrato il codice utilizzato nel file nmrproc.com per elaborare i dati grezzi in formato NMRPipe. La voce tauValues e la voce idxExpmt devono essere impostate prima dell'elaborazione. I tauValues corrispondono alle voci vplist in ms per l'esperimento ¹⁵N R_1ρ (voci vclist ricalcolate in ms per l'esperimento ¹⁵N R₁ ). Per quanto riguarda la lunghezza del ritardo di rilassamento, le voci idxExpmt corrispondono all'ordine delle voci vplist (voci vclist per l'esperimento 15N R1). Nello script, le posizioni per modificare la fase dello spettro sono contrassegnate da caselle rosse. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 11: Visualizzazione degli spettri NMR e prelievo dei picchi. Viene mostrata una panoramica di nmrDraw con uno spettro aperto. Utilizzare i tasti + e - per modificare il fattore, che va di pari passo con una modifica del livello del contorno. La modifica della dimensione Z consente di passare da un esperimento HSQC all'altro con diversi ritardi di rilassamento. Utilizzate Disegna (Draw ) per ridisegnare lo spettro con i parametri modificati. Il cursore P0 e il cursore P1 consentono di modificare la fase dello spettro. Questi cambiamenti di fase non verranno salvati nei dati elaborati; Il cambio di fase deve essere inserito manualmente nel file nmrproc.com e il file nmrproc.com deve essere eseguito nuovamente. La macro Peak Detection consente di selezionare i picchi dello spettro al livello di contorno impostato. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 12 supplementare: Assegnazione semi-automatica dei picchi NMR con NMRDraw. Viene visualizzato il codice del file ass.com che deve essere eseguito per avviare l'assegnazione del segnale NMR. Modificare -assName nell'elenco di picco di interesse generato. Questo elenco di picchi deve essere nello stesso formato dell'elenco di picchi allegato ass.syb2.hn_1200.tab nella cartella peaklist (nella cartella zip scaricata all'https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences). Il numero rosso si riferisce al rispettivo passaggio nel protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 13: Ispezione visiva del picco NMR e dell'assegnazione. L'interfaccia della macro di assegnazione viene aperta eseguendo ass.com. Utilizzare il tasto sinistro del mouse per assegnare i picchi e il tasto destro del mouse per deassegnare i picchi. Utilizzare Avanti per passare all'aminoacido successivo e Indietro per passare all'amminoacido precedente. Con + e -, il livello del contorno può essere modificato utilizzando Disegna, che ridisegna lo spettro. Utilizzo del flusso di lavoro: Esci, Salva ed Esci salva l'assegnazione e termina il programma. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 14 supplementare: Estrazione delle costanti di velocità ¹⁵N R₂ dai dati R_1ρ e R₁ . Passaggio 1. Viene visualizzato il contenuto del file t1rho.tab. Prima di calcolare le tariffe R₂ dalle tariffe R_1ρ è necessario aggiungere un codice contrassegnato da una casella rossa. Il numero rosso si riferisce al rispettivo passaggio nel protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 15 supplementare: Estrazione delle costanti di velocità ¹⁵N R₂ dai dati R_1ρ e R₁ . Passaggio 2. Viene visualizzato il contenuto del file crtR1p.tcl. Prima dell'esecuzione, le voci nella casella rossa devono essere modificate come descritto nel protocollo. I numeri rossi si riferiscono ai rispettivi passaggi del protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo descriveva l'impostazione degli esperimenti di rilassamento NMR ¹⁵N di Lakomek et ^al.69 e Stief et ^al.70. Ci siamo concentrati sulle sequenze di impulsi NMR utilizzando uno schema di rilevamento HSQC con sensibilità migliorata. Gli esperimenti ¹⁵N R₁ e R_1ρ sono implementati come descritto in dettaglio da Stief et al.70, e l'esperimento hetNOE è descritto da Lakomek et ^al.69.

Quando si impostano gli esperimenti di rilassamento NMR, il ¹⁵N R_1ρ è il più critico, poiché la scelta di un periodo di rilassamento massimo troppo lungo o di un'ampiezza RF troppo alta dello spin-lock può danneggiare la sonda. Per il periodo di rilassamento, è auspicabile campionare la curva di decadimento completa in modo uniforme dal 100% al 25% di intensità (rispetto all'esperimento di riferimento). Per le proteine a lento rilassamento, come le IDP, con ^{una lunghezza di 15}N T₂ volte, spesso non sarà conveniente campionare la curva di decadimento nella massima estensione perché la deposizione di potenza nella sonda deve essere limitata.

Per l'ampiezza della radiofrequenza (RF) di ¹⁵N, in teoria, maggiore è l'ampiezza RF, ν_spin-lock, meglio è, poiché è possibile rifocalizzare più processi di scambio. Come regola generale, i processi di scambio più lenti di 1 / (2π ν_spin-lock ) possono essere rifocalizzati. Tuttavia, si applicano limitazioni di potenza RF. Ad esempio, nella nostra mano, non supereremmo un periodo massimo di spin-lock di 65 ms quando viene applicata un'ampiezza RF di 2 kHz per rimanere al sicuro. Allo stesso tempo, l'ampiezza RF di spin-lock su uno spettrometro a 600 MHz dovrebbe essere superiore a 1 kHz, ad esempio 1,4 kHz a 600 MHz, che si è dimostrata sufficiente per la piccola proteina globulare gb3⁶⁹. Per coprire le larghezze spettrali ed evitare effetti di off-risonanza a intensità di campo più elevate, l'ampiezza RF corrispondente dovrebbe scalare con il campo magnetico, ad esempio 1,5 volte superiore a 900 MHz (ν_spin-lock  2 kHz). Tuttavia, deve rimanere entro i limiti della sonda. (Fare riferimento all'elenco locale delle limitazioni di potenza dello spettrometro e contattare il responsabile della struttura NMR per un consiglio.)

Per la scelta della spaziatura dei ritardi di rilassamento tra l'esperimento di riferimento (ritardo corto) e il periodo di ritardo più lungo (determinato dai fattori discussi sopra), preferiamo una spaziatura uguale dei punti dati del ritardo di rilassamento e scegliamo un numero di 8 (se il tempo di misurazione assegnato e il rapporto segnale-rumore lo consentono). Il primo incremento (e quelli successivi) sarà dominato dai residui più intensi (e spesso più lenti a rilassamento). Pertanto, a seconda dell'intervallo dinamico della proteina, i segnali NMR di diversi residui nella sequenza proteica potrebbero essere già decaduti dopo il periodo di massimo rilassamento scelto. Spaziando equamente i punti di ritardo, ci assicuriamo che le curve di rilassamento dei residui di rilassamento rapido siano coperte anche da un numero sufficiente di punti dati che campionano la curva di rilassamento.

Inoltre, una buona scelta del ritardo di recupero è essenziale per ottenere dati accurati sul rilassamento ed evitare danni a lungo termine alla sonda. Scegliamo un ritardo di recupero di almeno D1 = 2 s per evitare danni alla sonda. Per ottenere risultati accurati, la polarizzazione longitudinale della proteina ¹H e ¹⁵N deve anche avere il tempo sufficiente per tornare all'equilibrio o almeno a uno stato stabile e stazionario. ^L'1H T₁ varia solitamente tra 1 s e 4 s a 600 MHz per una proteina di piccole o medie dimensioni (fino a 20 kDa); per proteine più grandi e campi più alti, ^l'1H T₁ aumenterà ulteriormente. Per la piccola proteina globulare gb3, abbiamo trovato D1 = 3,5 s sufficiente per gli esperimenti ¹⁵N R₁ e R_1ρ . Per il piccolo IDP Syb-2 presentato in questo protocollo, abbiamo recentemente dimostrato che D1 = 2 s era adeguato^{a 70}.

L'hetNOE ^{da 15}N ha la sensibilità più bassa, poiché l'eccitazione inizia su ¹⁵N e non viene applicato ^alcunINEPT ^H-15N all'inizio della sequenza di impulsi. Inoltre, il periodo di saturazione di ¹ora e il ritardo di recupero di ¹⁵N dovrebbero essere 5 volte ¹⁵N T₁ per ottenere dati accurati. Mentre per l'IDP Syb-2 qui presentato, un ritardo di saturazione/recupero di 5 s più un ulteriore ritardo di recupero D1 di 2 s (totale 7 s) era sufficiente, per proteine più grandi e/o proteine deuterate, questo tempo può essere sostanzialmente più lungo, ad esempio 10 s o più. Tuttavia, se i dati qualitativi sono sufficientemente buoni, può essere accettato un leggero offset sistematico. In tal caso, si possono ottenere risultati ragionevoli già a 3 volte ¹⁵N T₁, poiché si raggiungerà il 95% della saturazione. In tal caso, i valori hetNOE risultanti mostreranno un offset sistematico a valori più alti.

In questo protocollo, abbiamo lavorato con ¹⁵N Syb-2 completamente protonato, che è il più efficiente in termini di costi. La deuterazione a catena laterale è consigliata per ridurre il numero di vie di rilassamento e lavorare con le coppie di spin dell'ammide della spina dorsale ^{1 H-15}N più isolate. Tuttavia, confrontando ¹⁵N²H Syb-2 e ¹⁵N syb-2, notiamo solo pochissime differenze tra campioni deuterati e completamente protonati⁷⁰. A fini pratici, i dati di rilassamento NMR sono spesso registrati sui campioni con doppia o tripla marcatura (¹⁵N¹³C o ²H¹⁵N¹³C). Le sequenze di impulsi NMR discusse sono in grado di rifocalizzare l'evoluzione dell'accoppiamento J tra ¹³C con nuclei ¹H o ¹⁵N. Ovviamente, anche le vie di rilassamento aumenteranno quando verrà introdotta la marcatura ^{con 13}C. Tuttavia, nelle nostre mani, ai fini pratici, l'errore introdotto, se esiste, è inferiore al 5% e potrebbe essere accettabile quando sono necessari solo dati qualitativi.

Quando si lavora con proteine di diverse dimensioni per la rilevazione, ci si chiede spesso se scegliere gli esperimenti rilevati da HSQC con sensibilità aumentata⁷⁰ o gli esperimenti con rilevamento TROSY⁶⁹. Per le proteine di piccole dimensioni, gli esperimenti NMR rilevati con HSQC potenziato dalla sensibilità offrono un guadagno doppio nel rapporto segnale/rumore (a condizione che si possa ottenere una buona soppressione dell'acqua). Per le proteine più grandi, gli esperimenti rilevati da TROSY vinceranno. Il pareggio è di circa 20 kDa per le proteine ripiegate. Per gli IDP, per i quali si possono ottenere basse costanti di velocità R₂ che aumentano approssimativamente linearmente con l'aumentare della lunghezza della catena, il break-even può essere spostato a pesi molecolari più elevati. Per scopi pratici, si consiglia di implementare sia gli esperimenti rilevati da HSQC che quelli rilevati da TROSY in caso di dubbio. Quindi, scegli quello che fornisce il miglior rapporto segnale/rumore nel primo incremento.

La discussione sull'opportunità di scegliere gli esperimenti rilevati da HSQC o TROSY si applica solo quando il rapporto segnale/rumore è il criterio principale. Quando sono richieste le larghezze di linea più piccole e la massima risoluzione, TROSY vincerà sempre. TROSY offre inoltre sempre la migliore soppressione dell'acqua, poiché sono necessari meno impulsi di protoni e nessun disaccoppiamento dei protoni. Rimandiamo all'articolo⁶⁹ precedentemente pubblicato per una discussione più estesa.

Un'ultima osservazione sulla questione della soppressione dell'acqua. Mentre impostare il guadagno del ricevitore (rg) su 16 può essere sufficiente sulle console Bruker Avance NEO, un guadagno del ricevitore nell'intervallo 128-256 è solitamente desiderabile per le console Bruker Avance (più vecchie). L'rg raggiungibile (determinato dal comando di Bruker rga) è spesso ottenuto dall'intensità del segnale dell'acqua residua al livello di rumore. Una cattiva soppressione dell'acqua introdurrà sempre ulteriore rumore negli spettri. Pertanto, anche se è possibile raggiungere un rg = 16 su una console Bruker Avance NEO, il segnale dell'acqua rimanente può contribuire in modo sostanziale al livello di rumore. Pertanto, il rapporto segnale/rumore sarebbe ridotto. Di conseguenza, si consiglia di puntare a un livello di rg compreso tra 128 e 256. Le sequenze di impulsi presentate⁷⁰ sono state testate a 600 MHz e 1200 MHz. Entrambe le intensità di campo funzionano con la stessa configurazione del gradiente, come scritto nella sequenza di impulsi. Li consigliamo almeno come buon punto di partenza per un'ulteriore ottimizzazione.

Come accennato nell'introduzione, gli esperimenti di rilassamento NMR discussi coprono solo l'intervallo di tempo da picosecondi a nanosecondi. Per approfondimenti sulla dinamica da microsecondo a millisecondo, ci riferiamo agli esperimenti di dispersione di rilassamento, agli esperimenti CPMG e un'estensione degli esperimenti R_1ρ con ampiezze di spin-lock variabili (o frequenze portanti) sono utilizzati 44,46,58,59,60,61,85,86 . È possibile acquisire dinamiche più lente di microsecondi ¹⁵N CEST (trasferimento di saturazione a scambio chimico) NMR⁶², spettroscopia di scambio (EXSY, da millisecondi a secondi) o RT (tempo reale) NMR (da secondi a ore)^63,64. L'effetto PRE (paramagnetic relaxation enhancement) delle sonde paramagnetiche, così come gli accoppiamenti dipolari residui (RDC), possono essere utilizzati per valutare l'intero intervallo di dinamica da ps a ms 65,66,67,68.

Tutti questi esperimenti coprono solo la dinamica della spina dorsale. Per studiare la dinamica della catena laterale, Kay e collaboratori hanno introdotto un'altra pletora di esperimenti NMR, fornendo informazioni sulla dinamica della catena laterale per proteine fino a 1 MDa ^2,87.

Per ottenere informazioni più quantitative sulla dinamica della spina dorsale delle proteine, è necessaria un'analisi combinata di tutti e tre i parametri NMR, ¹⁵N R₁, R₂ e hetNOE, che a volte coinvolge anche ulteriori parametri, come le costanti di velocità di rilassamento correlate in modo incrociato. Sono stati sviluppati diversi metodi di analisi sofisticati. Il cosiddetto approccio model-free è stato ampiamente applicato nella NMR biomolecolare 43,88,89,90,91. Inoltre, la mappatura della densità spettrale può fornire preziose informazioni 55,92,93. Sebbene si tratti di potenti metodi di analisi per proteine globulari con un tempo di correlazione rotazionale ben definito, la loro applicabilità è limitata per le IDP. Un dominio piegato è necessario per definire un tempo di correlazione rotazionale³⁹. Questo può essere parzialmente aggirato quando la funzione di correlazione C(t) può essere modellata dalla somma di funzioni a decadimento esponenziale nel caso in cui le diverse scale temporali coinvolte possano essere ben separate 23,31,84. In assenza di un tempo di correlazione rotazionale ben definito, approcci alternativi che prevedono una distribuzione dei tempi di correlazione, ad esempio l'analisi IMPACT⁹⁴ o l'analisi DETECTOR^95,96, sono un'alternativa. Inoltre, un'analisi combinata dei dati di rilassamento NMR e delle simulazioni MD è promettente anche per gli IDP⁹⁷; attualmente, stiamo ancora affrontando limitazioni di campionamento e campo di forza per le simulazioni di atomi completi di IDP più grandi^31,98.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Spettrometro Bruker 600 MHz AVANCE III HD	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	esperimenti NMR condotti