Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori

Sommario

Studi bioenergetici e metabolomici sui mitocondri hanno rivelato il loro ruolo multiforme in molte malattie, ma i metodi di isolamento per questi organelli variano. Il metodo qui descritto è in grado di purificare mitocondri di alta qualità da più fonti di tessuto. La qualità è determinata dai rapporti di controllo respiratorio e da altre metriche valutate con la respirometria ad alta risoluzione.

Abstract

L'isolamento mitocondriale è stato praticato per decenni, seguendo le procedure stabilite dai pionieri nel campo della biologia molecolare e della biochimica per studiare le menomazioni metaboliche e le malattie. Una qualità mitocondriale costante è necessaria per studiare correttamente la fisiologia mitocondriale e la bioenergetica; Tuttavia, sono disponibili per i ricercatori molti diversi metodi di isolamento pubblicati. Sebbene diverse strategie sperimentali richiedano metodi di isolamento diversi, i principi e le procedure di base sono simili. Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo in grado di estrarre mitocondri ben accoppiati da una varietà di fonti tissutali, inclusi piccoli animali e cellule. Le fasi descritte includono la dissezione degli organi, la purificazione mitocondriale, la quantificazione delle proteine e vari controlli di qualità. La metrica primaria di controllo della qualità utilizzata per identificare i mitocondri di alta qualità è il rapporto di controllo respiratorio (RCR). L'RCR è il rapporto tra la frequenza respiratoria durante la fosforilazione ossidativa e la frequenza in assenza di ADP. Vengono discusse metriche alternative. Sebbene con questo protocollo si ottengano elevati valori di RCR rispetto alla loro fonte tissutale, diversi passaggi possono essere ottimizzati per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Questa procedura è robusta e ha costantemente portato a mitocondri isolati con valori RCR superiori alla media tra i modelli animali e le fonti tissutali.

Introduzione

I mitocondri sono organelli subcellulari che stabiliscono condizioni energetiche citoplasmatiche ottimizzate per specifiche funzioni cellulari. Mentre gli studi a livello cellulare, tissutale e di organismo possono fornire informazioni sulla funzione mitocondriale, l'isolamento degli organelli offre un livello di controllo sperimentale non possibile altrimenti. Gli isolamenti mitocondriali sono stati eseguiti a partire dagli anni '40, consentendo studi meccanicistici del metabolismo e della respirazione in una varietà di cellule e tessuti ^1,2. Anche la rilevanza storica dei mitocondri è ben documentata³. In qualità di principali produttori di ATP, i mitocondri svolgono molti ruoli chiave che sono vitali per una funzione cellulare e d'organo ottimale⁴. All'interno della matrice mitocondriale, i substrati vengono ossidati dal ciclo TCA, producendo equivalenti riducenti e portatori elettronici mobili come NADH e UQH₂ ^5,6. Il citocromo C è il terzo principale trasportatore di elettroni mobili nella rete di reazioni biochimiche mitocondriali⁷. Queste molecole vengono poi ossidate dai complessi transmembrana del sistema di trasporto degli elettroni (ETS) incorporati nella membrana mitocondriale interna⁸. Le reazioni redox dell'ETS sono accoppiate con la traslocazione del protone dalla matrice allo spazio intermembrana. Questi processi stabiliscono un gradiente elettrochimico di protoni che viene utilizzato per fosforilare ADP con Pi da F₁F₀ ATP sintasi per produrre ATP ^9,10. I singoli processi che si verificano in ciascun complesso possono essere esplorati con la respirometria ad alta risoluzione utilizzando elettrodi di tipo Clark o saggi di consumo di ossigeno su micropiastra^11,12. Inoltre, i modelli di malattia e i trattamenti che utilizzano mitocondri isolati possono determinare l'impatto o l'importanza della funzione mitocondriale nella progressione di alcune patologie. Ciò si è dimostrato fruttuoso nel campo della cardiologia, dove le alterazioni nel rilascio di carburante e substrato sono state utilizzate per chiarire come la disfunzione mitocondriale influenzi l'insufficienza cardiaca 13,14,15,16. I mitocondri sono anche noti per avere un impatto sullo sviluppo di altri stati patologici come diabete, cancro, obesità, disturbi neurologici e miopatie ^17,18. Pertanto, l'uso di mitocondri isolati o purificati consente indagini meccanicistiche sul metabolismo ossidativo e sulla produzione di ATP nel tessuto di origine.

Non mancano i protocolli di isolamento mitocondriale per la loro importanza nella ricerca bioenergetica. Inoltre, si possono trovare metodi altamente specifici su misura per sottopopolazioni di mitocondri all'interno di tessuti e cellule^19,20. Le fasi procedurali di base sono simili tra i metodi di isolamento, ma è possibile apportare variazioni alla composizione del tampone, alle fasi di omogeneizzazione e agli spin di centrifugazione per migliorare la quantità e la qualità dei mitocondri. Le modifiche a questi aspetti si basano sulla domanda metabolica del tessuto, sulla funzione generale degli organi, sulla densità mitocondriale e su altri fattori. In tessuti come il fegato e il muscolo scheletrico, gli omogeneizzatori portatili vengono utilizzati per preservare l'integrità mitocondriale e limitare i danni alle membrane mitocondriali²¹. Tuttavia, quando si isola dai reni, alcuni protocolli suggeriscono di utilizzare l'omogeneizzazione manuale o kit commerciali per ottenere risultati migliori²². Sebbene entrambi i metodi producano mitocondri funzionali, la qualità degli organelli può essere compromessa dal tempo aggiuntivo necessario per completare gli isolamenti utilizzando questi protocolli. La centrifugazione è anche vitale per l'estrazione della proteina mitocondriale, in quanto separa i componenti cellulari come nuclei e altri organelli dai mitocondri²³. Durante il processo di isolamento, si discute se la centrifugazione differenziale o basata sulla densità debba essere implementata per ottenere isolati più puri²⁴. Mentre la centrifugazione per densità può separare i mitocondri da organelli di peso specifico simile, come i perossisomi, non è ben stabilito se i mitocondri di questi metodi rappresentino meglio la funzione degli organelli in situ rispetto ai mitocondri isolati utilizzando la centrifugazione differenziale. Nel campo della fisiologia mitocondriale, la centrifugazione basata sulla densità è preferita e può essere facilmente modificata per aumentare la purezza dell'isolato. Prima della sperimentazione è necessario considerare se sono incorporate le modifiche alle forze g, alla durata della centrifugazione e al numero di spin di centrifugazione a causa della loro influenza sulla purificazione mitocondriale. Inoltre, la risospensione mitocondriale, probabilmente la fase più cruciale durante l'isolamento, differisce notevolmente tra gli studi, con l'uso di raschiatura, miscelazione basata su vortici o omogeneizzazione 23,25,26. La risospensione meccanica di questi tipi può essere troppo abrasiva e compromettere l'integrità della membrana dei mitocondri. Per questo motivo, è necessario eseguire un lavaggio delicato per correggere questo problema. Nonostante la pletora di modulazioni e metodologie suggerite, ci sono meno protocolli completi con un'elevata riproducibilità e adattabilità per i modelli di roditori.

I metodi qui descritti delineano un protocollo dettagliato, robusto e altamente riproducibile che produce mitocondri purificati e ben accoppiati da tessuto cardiaco di piccoli animali. Come dimostrato, questo metodo può essere facilmente adattato per soddisfare le esigenze specifiche di ogni esperimento e/o ambiente di laboratorio per isolare i mitocondri da reni, fegato e cellule in coltura. Ulteriori modifiche possono essere apportate per isolare i mitocondri da tessuti e altri animali non elencati qui. Vengono fornite le ricette del buffer utilizzate per tutti gli isolamenti e possono essere modificate se necessario. Analogamente ad altri protocolli pubblicati, vengono implementate l'omogeneizzazione motorizzata e la centrifugazione differenziale; Tuttavia, vengono apportate regolazioni sia al tempo di taglio che alla forza con cui i campioni vengono centrifugati per fornire costantemente isolati mitocondriali di alta qualità, a seconda della fonte di isolamento. In particolare, questo protocollo si differenzia dagli altri per l'utilizzo di un lavaggio delicato tramite pipettaggio per risospendere i mitocondri pellettati, che aiuta a preservare l'integrità della membrana mitocondriale e a mantenere la funzionalità complessiva degli organelli. La proteina mitocondriale viene quantificata mediante determinazione della proteina totale o misurazione dell'attività della citrato sintasi. L'utilità e l'ampia applicabilità di questo metodo di isolamento sono ulteriormente supportate dai valori dei rapporti di controllo respiratorio (RCR) raggiunti in vari organismi e fonti tissutali.

Protocollo

L'uso e il trattamento di tutti gli animali vertebrati sono stati eseguiti in conformità con protocolli approvati e accettati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Michigan State University. Questo protocollo è stato progettato utilizzando porcellini d'India albini Hartley maschi e femmine e ratti Sprague Dawley (SD). Per l'isolamento dei mitocondri cardiaci dalle cavie, gli animali sono stati sacrificati ad età compresa tra 4 e 6 settimane (300-450 g). I mitocondri cardiaci di ratti SD di entrambi i sessi sono stati ottenuti tra le 10 e le 13 settimane (250-400 g). Le ricette per i tamponi sono descritte nella Tabella 1 e devono essere preparate in anticipo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione sperimentale

1. Prima di iniziare l'isolamento, etichettare due provette da centrifugazione da 50 ml come "Spins 1 and 2" e "Spin 3".
2. Posizionare sul ghiaccio le provette, il tampone di isolamento (IB) appena scongelato, le forbici affilate per tritare, la sonda di omogeneizzazione assemblata e un becher da 5 ml o un contenitore di dimensioni equivalenti.
3. Posizionare il tampone respiratorio (RB) appena scongelato in un'incubatrice per riscaldarlo per i successivi saggi respiratori.
4. Pre-raffreddare una centrifuga refrigerata a 4 °C.
5. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano predisposte e che 20 μL di proteasi 7-15 U/mg di Bacillus licheniformis siano stati aggiunti alla provetta etichettata con "Spins 1 and 2".
6. Installare un sistema di pressione dipendente dalla gravità per la perfusione tramite incannulamento utilizzando un tampone per cardioplegia (CB, Tabella 1), una cannula di vetro e un tubo di plastica con una valvola di arresto collegata.
7. Disporre gli strumenti chirurgici e includere forbici e pinze adeguate per la dissezione e l'incannulamento del cuore.
   NOTA: Tutta l'acqua deve essere di qualità pura (18,2 MΩ·cm)

2. Dissezione tissutale

1. Iniettare agli animali eparina solfato sterile per via intraperitoneale alla dose di 500 U/kg.
2. Lasciare riposare l'animale nella camera di induzione per 15 minuti dopo la somministrazione di eparina. Durante questo periodo, fornire 2 L/min di gas O₂ puro per ossigenare completamente gli animali, calmarli e ridurre al minimo lo stress che potrebbe avere conseguenze negative sui tessuti di interesse.
3. Iniziare l'induzione dell'anestesia con un flusso continuo di isoflurano allo 0,5%. Dopo 1 minuto, aumentare all'1%. Continuare ad aumentare dell'1% ogni minuto fino a raggiungere il 5%. Una volta raggiunto il 5%, attendi 1 minuto e monitora il modello di respirazione dell'animale.
4. Una volta che la respirazione è rallentata e diventa affannosa (approssimativamente al minuto 6,5), spegnere l'isoflurano e il flusso di ossigeno.
5. Rimuovere rapidamente l'animale dalla camera di induzione e verificare la profondità dell'anestesia appropriata stringendo una zampa e controllando il riflesso corneale. Se l'animale risponde a uno degli stimoli, riposizionarlo nella camera di induzione, somministrare nuovamente l'anestesia e ripetere il controllo della profondità dell'anestesia.
6. Una volta raggiunta la corretta profondità di anestesia, decapitare rapidamente con una ghigliottina per sezionare il rachide cervicale e posizionare il corpo prono sul ghiaccio.
7. Praticare due incisioni verticali parallele dalle clavicole procedendo lungo la gabbia toracica laterale lungo la lunghezza del torace. Assicurati che le incisioni siano abbastanza profonde da tagliare le costole sul torace laterale, ma evita di danneggiare le strutture intratoraciche come il cuore o i grandi vasi.
   NOTA: Le dimensioni dell'incisione verticale dipendono dall'animale utilizzato. Se si utilizzano porcellini d'India e ratti, tagliare fino al diaframma (circa 6,35 cm per i ratti e 11 cm per i porcellini d'India). Se si utilizzano topi, eseguire una toracotomia standard²⁷.
8. Esporre il cuore usando un emostatico per spostare il torace anteriore e riempire la cavità toracica esposta con ghiaccio. Questo passaggio riduce al minimo il tempo di ischemia calda e migliora la vitalità degli organelli isolati.
9. Usa le pinzette per sezionare senza mezzi termini il timo e il pericardio ed esporre completamente il cuore.
10. Usando il forcipe, applicare una leggera trazione inferiore sul cuore per esporre e identificare l'aorta. L'aorta è il grande vaso più spesso che si dirama dalla base del cuore. Altri vasi di grandi dimensioni, come la vena polmonare, sono notevolmente più traslucidi dell'aorta.
11. Tagliare l'aorta a circa 4-6 mm sopra la radice aortica ma al di sotto dei punti di ramificazione carotidea.
12. Incannulare l'aorta e perfondere il cuore^28,29 con una soluzione di cardioplegia ghiacciata (CB) utilizzando una testina di pressione dipendente dalla gravità fino a quando le arterie coronarie non sono ripulite dal sangue e l'organo appare sbiancato.
    NOTA: Per i roditori di grandi dimensioni, un diametro della cannula di 1,8-2,2 mm funziona bene, mentre per i roditori più piccoli si consiglia un intervallo di diametri di 1,4-1,8 mm. La retroperfusione non dovrebbe richiedere più di 15-30 secondi perché i vasi coronarici si liberino dal sangue.
13. Isolare il miocardio ventricolare sezionando gli atri, il tessuto valvolare cartilagineo e i tessuti adiposi.
14. Porre i ventricoli in un becher da 10 ml pre-raffreddato contenente 0,1-0,2 ml di IB ghiacciato.
15. Tritare il fazzoletto con forbici chirurgiche affilate fino a quando i pezzi sono di circa 1 mm³.

3. Purificazione mitocondriale e quantificazione delle proteine

1. Trasferire il tessuto tritato nella provetta da centrifuga pre-raffreddata etichettata "Spins 1 and 2" contenente la soluzione di proteasi.
2. Aggiungere IB ghiacciato a un volume finale di 25 ml.
3. Utilizzando un omogeneizzatore rotore-statore portatile motorizzato, disperdere il tessuto a 18.000 giri/min su ghiaccio per 20-25 s.
4. Centrifugare il tessuto omogeneizzato in una provetta etichettata "Spins 1 and 2" a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
5. Scartare il surnatante (che contiene proteasi) versandolo nella damigiana di scarto e sciacquare delicatamente il pellet con 5 ml di IB per rimuovere la proteasi residua.
6. Dopo aver eliminato il risciacquo, risospendere il pellet con IB fresco ghiacciato fino a un volume finale di 25 mL con un leggero vortice.
7. Centrifugare a 800 x g per 10 min a 4 °C.
8. Rimuovere il surnatante (contiene mitocondri) versandolo delicatamente in una provetta da 50 ml pre-raffreddata etichettata "Spin 3". Durante il versamento, fare attenzione a non rimuovere la parte superiore del pellet allentata. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta di trasferimento o una stripette per raccogliere il surnatante.
9. Centrifugare il surnatante a 8000 x g per 10 minuti a 4 °C.
10. Scartare il surnatante risultante e conservare il pellet contenente mitocondri.
11. Utilizzare un panno privo di lanugine per assorbire il surnatante in eccesso dalla parete interna del tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Mantenere il pellet a 4 °C sul ghiaccio il più possibile.
12. Per risospendere i mitocondri, aggiungere 80 μL di IB ghiacciato sul fondo della provetta. Risospendere delicatamente il pellet lavando ripetutamente IB sul pellet.
13. Per evitare la formazione di bolle, impostare una micropipetta per aspirare ed erogare tra 40 e 60 μl di volume.
14. Man mano che il pellet mitocondriale si disperde, aumentare il volume della micropipetta per risospendere in modo efficiente i mitocondri pellettati. Evitare di toccare il pellet con la punta della pipetta ed evitare di formare bolle.
15. Una volta risospesi, trasferire i mitocondri in una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata ed etichettarla come mitocondri di serie. Prendere nota del volume totale di risospensione.
16. Per determinare la concentrazione di proteine mitocondriali nel campione, eseguire un test delle proteine totali utilizzando i noti dosaggi delle proteine BCA o Bradford, come definito dalle istruzioni del produttore.
    NOTA: Una strategia alternativa o complementare per valutare la resa consiste nel determinare l'attività della citrato sintasi. Per riferimento, il contenuto mitocondriale può essere quantificato seguendo il protocollo descritto in Vinnakota et ^al.30.

4. Controlli di qualità

1. In una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata, diluire il brodo mitocondriale alla concentrazione di lavoro desiderata con IB.
   NOTA: Le scorte mitocondriali vengono diluite a 40 mg/mL per lavorare alla concentrazione finale di 0,1 mg/mL per i saggi respirometrici quando si utilizzano isolati da tessuto cardiaco.
2. Sciacquare dieci volte le camere dell'ossigrafo, i tappi e le siringhe da microlitri con acqua distillata per pulirle prima dell'uso nei saggi di respirometria.
3. Per testare la vitalità e la qualità degli isolati mitocondriali, caricare 2,3 mL di tampone respiratorio (RB) in camere ossigrafiche e lasciare che il segnale di consumo di ossigeno si equilibri a 37 °C per circa 10 minuti o quando la velocità è vicina allo 0.
4. Una volta che il segnale è equilibrato, spingere verso il basso i tappi e aspirare il tampone in eccesso che fuoriesce dal capillare del tappo.
5. Aggiungere 1 mM di EGTA utilizzando una siringa da microlitro per chelare l'eventuale residuo di calcio nei tamponi o nel campione mitocondriale.
6. Per alimentare la respirazione, aggiungere 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato.
7. Dopo l'aggiunta di substrati, aggiungere un bolo di mitocondri diluiti per raggiungere la concentrazione di lavoro e consentire la respirazione per 5 minuti. Questo periodo è chiamato LEAK o respirazione di Stato 2.
8. Al segno dei 5 minuti, aggiungere un bolo di 500 μM di ADP per avviare la respirazione dello Stato 3, chiamata anche OXHPOS, e lasciare che i mitocondri respirino fino all'anossia.
9. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo il tasso massimo di consumo di ossigeno durante lo Stato 3 per il tasso di consumo di ossigeno appena prima dell'aggiunta di ADP nello Stato 2 (vedere Figura 1).
   NOTA: Un'espressione RCR alternativa di 1 - 1/RCR può essere utilizzata anche come metrica di qualità, che è limitata tra 0 e 1; tuttavia, rende difficile differenziare la qualità utilizzando questa metrica quando l'RCR > 10 (vedere la Figura 2).
10. Sciacquare le camere e i tappi 10 volte con acqua pura per pulire l'ossigrafo per i saggi successivi. Se la respirometria è completa, riempire le camere con etanolo al 70% e posizionare i tappi nelle camere fino al successivo utilizzo.

Risultati

Al termine dell'isolamento mitocondriale, la qualità e la funzionalità degli isolati devono essere testate quantificando i tassi di consumo di ossigeno (J_O2) utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. A tal fine, le scorte mitocondriali sono state diluite a 40 mg/mL per consentire concentrazioni di lavoro di 0,1 mg/mL in 2 mL di RB per tutti i test respirometrici utilizzando mitocondri cardiaci isolati. La respirazione è stata alimentata da 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato in presenza di 1 mM di EGTA, un chelante del calcio, ed è stata lasciata equilibrare per 5 minuti per stabilire la respirazione di Stato 2. Durante questo stato, i tassi di consumo di ossigeno dovrebbero essere in media di 45-55 pmol/mL/s o 27-33 nmol/mg/min. Prestare attenzione al tasso di consumo di ossigeno dipendente dall'elettrodo ed eseguire le correzioni di sfondo appropriate quando necessario. La fosforilazione ossidativa (Stato 3) viene avviata al minuto 5 da un bolo di 500 μM di ADP. Le aggiunte al substrato e il tracciamento rappresentativo sono dettagliati nella Figura 1. I mitocondri funzionali avranno un aumento immediato di J_O2 dopo l'aggiunta di ADP, che varia a seconda della fonte tissutale, come mostrato nella Figura 2. Senza l'uso di EGTA, il calcio residuo ha effetti variabili sui tassi massimi di J_O2 durante l'OXPHOS, a seconda della concentrazione mitocondriale, della disponibilità di substrato e di altri fattori ambientali. La composizione del tampone è importante per la conservazione dell'integrità e della funzionalità della membrana mitocondriale. Tutte le ricette tampone menzionate nel protocollo sono ulteriormente dettagliate nella Tabella 1 e possono essere utilizzate per tutte le preparazioni mitocondriali qui descritte.

Il successo dell'isolamento dei mitocondri è indicato dall'ottenimento di valori di RCR che rientrano nell'intervallo dato per ciascuna specie e fonte tissutale, come mostrato nella Tabella 2. Sulla base dei dati raccolti utilizzando questo protocollo, se si isolano i mitocondri cardiaci da cavie, ratti o topi, gli RCR dovrebbero essere rispettivamente ≥16, ≥8 e ≥5. Se si isola dal fegato o dal rene di ratto, gli RCR dovrebbero essere ≥6, mentre gli RCR dalle cellule sono considerati accettabili se superiori a 3,8. Se i valori RCR scendono al di sotto di questi intervalli o se ci sono differenze qualitative nei tracciati respirometrici, si raccomanda di eseguire un test aggiuntivo con nuovi RB e substrati per escludere problemi di contaminazione. Sebbene la trasformata 1-1/RCR limiti i valori tra 0 e 1, questa metrica non è consigliata quando si confronta la qualità mitocondriale tra sessi o specie quando il valore RCR è maggiore di 10. Per questo motivo, durante tutti gli esperimenti sono stati quantificati i valori standard di RCR (Stato 3/Stato 2 o OXPHOS/LEAK). Le informazioni relative alle modulazioni che possono essere apportate a questo protocollo per isolare meglio i mitocondri da cuori, fegato, reni e cellule di topo sono dettagliate nella Tabella 3.

Figura 1: Regioni di interesse per i controlli di qualità mediante respirometria ad alta risoluzione. Le camere respiratorie sono state caricate con 2 mL di RB e lasciate equilibrare a 37 °C fino a quando il tasso di consumo di ossigeno è stato vicino allo 0. Una volta equilibrato, è stato aggiunto 1 mM di EGTA, un chelante del calcio, insieme a 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato. Dopo l'aggiunta di questi substrati, i mitocondri sono stati aggiunti alla concentrazione di lavoro desiderata (0,1 mg/mL) e lasciati respirare per 5 minuti per raggiungere la respirazione di Stato 2 (giallo). Al minuto 5, sono stati aggiunti 500 μM di ADP per avviare la respirazione dello Stato 3 (rosso). Gli RCR sono stati determinati in base alla media temporale dei tassi di consumo di ossigeno indicati dalle caselle rosse e gialle per confrontare lo Stato 3 con lo Stato 2. Lo stato 4 è indicato dalla casella verde e rappresenta il periodo di idrolisi extramitocondriale dell'ATPasi dell'ATP e può essere utilizzato per valutare l'integrità della membrana esterna nei saggi del citocromo C. I dati visualizzati sono stati raccolti utilizzando mitocondri cardiaci di ratto SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Tracciati rappresentativi di J_O2 e rapporti di controllo respiratorio tra fonti animali e tissutali. La qualità dei mitocondri isolati è stata testata quantificando i tassi di consumo di ossigeno utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. La respirazione è stata alimentata da 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato in presenza di 1 mM di EGTA. I mitocondri e i substrati sono stati lasciati respirare per 5 minuti affinché la respirazione di Stato 2 si stabilizzasse. I tassi massimi di consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di ADP sono stati confrontati con i tassi di consumo di ossigeno dello Stato 2 prima dell'ADP per calcolare i rapporti di controllo respiratorio (RCR) per ciascun tessuto. La qualità mitocondriale è stata ulteriormente valutata calcolando i valori 1-1/RCR come caratterizzati dagli standard di efficienza del controllo P-L. I grafici a barre a destra di ciascun tracciato indicano l'RCR medio maschile (blu) e femminile (verde) e i valori 1-1/RCR ± SD per un determinato tessuto. (A), (B) e (C) si riferiscono ai dati raccolti utilizzando rispettivamente i cuori di cavia, ratti Sprague Dawley (SD) e virus della leucemia amica B (FVB). (D) ed (E) dettagliano i risultati del fegato e del rene di ratto SD, mentre (F) si riferisce alle cellule HEK293. I tre lobi epatici più grandi sono stati raccolti, mentre entrambi i reni sono stati utilizzati per l'isolamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ricette tampone. Il tampone per cardioplegia (CB), il tampone di isolamento (IB) e il tampone per la respirazione (RB) utilizzati durante il processo di isolamento devono essere preparati in anticipo secondo le istruzioni elencate. Il CB può essere conservato fino a un mese a 4 °C, mentre l'IB e il RB possono essere conservati per 4 mesi a -80 °C. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Analisi del rapporto di controllo respiratorio. L'isolamento mitocondriale per le analisi funzionali è stato condotto su un'ampia gamma di specie e fonti di tessuto in roditori maschi e femmine, nonché in cellule HEK293. La dimensione del campione di ciascun sesso, fonte tissutale e specie è dettagliata insieme ai valori medi di RCR e 1-1/RCR ± SD. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Modulazioni raccomandate al protocollo di isolamento mitocondriale per tessuti diversi per aumentare la resa proteica. Le variazioni delle quantità di proteasi e delle centrifugazioni vengono visualizzate in base alla fonte tissutale. Le quantità medie di proteine totali (mg) sono state calcolate dai risultati del saggio delle proteine BSA e dal volume di risospensione del pellet mitocondriale finale. I valori sono riportati come media ± SD. Le istruzioni in grassetto incluse nella colonna di centrifugazione consigliano se scartare, conservare o raggruppare il surnatante. Lo scarto si riferisce allo smaltimento del surnatante in un contenitore di rifiuti biologici, mentre la ritenzione e il pooling si riferiscono rispettivamente al trasferimento del surnatante nella provetta di centrifugazione successiva o alla raccolta per la centrifuga finale. Ulteriori dettagli sulle modifiche al protocollo sono disponibili nella sezione di discussione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

L'adesione ai metodi descritti in modo conciso in questo protocollo garantirà l'isolamento di mitocondri ben accoppiati dal tessuto cardiaco di piccoli roditori, oltre ad altri tipi di tessuto e fonti. Nel complesso, il processo dovrebbe durare un totale di 3-3,5 ore, durante le quali tutti i tessuti, i campioni e gli isolati animali dovrebbero rimanere in ghiaccio a 4 °C il più possibile per limitare la degradazione. Questa procedura è robusta e può essere modificata in diversi modi per adattarsi meglio agli obiettivi sperimentali e ai modelli utilizzati. Una modulazione che può essere effettuata durante il processo di dissezione tissutale è l'esclusione dell'eparina. L'eparina viene somministrata per prevenire la formazione di coaguli di sangue³¹ ma non è necessaria se il cuore viene incannulato e perfuso abbastanza rapidamente (entro 1,5 minuti dalla decapitazione). Inoltre, la perfusione del cuore con CB è raccomandata per i roditori più grandi, quindi quando si lavora con cuori di topo o altri organi si consiglia di includere lavaggi IB prima della macinazione e dell'omogeneizzazione iniziale. Questa fase consente di scartare il sangue trasportato dal processo di dissezione. Altri cambiamenti includono alterazioni della velocità di omogeneizzazione e centrifugazione per aumentare la resa delle proteine mitocondriali. Quelli descritti sopra servono per isolare i mitocondri cardiaci da porcellini d'India e ratti. È importante sottolineare che questo protocollo può essere adattato per isolare i mitocondri dal fegato, dai reni, dai cuori e dalle cellule dei roditori. Le modifiche raccomandate al volume della proteasi, all'omogeneizzazione e alla centrifugazione in base a specifici tipi di tessuto e animali sono ulteriormente dettagliate nella Tabella 3.

Dopo la formazione del pellet mitocondriale purificato dalla fase finale di centrifugazione, i mitocondri devono essere risospesi in IB pre-raffreddato. Il volume di IB aggiunto dipende dalle dimensioni del pellet mitocondriale, ma è di circa 80 μl per porcellini d'India e ratti. Se si isola da cuori di topo, vengono aggiunti 60 μL di IB per la risospensione. Quando si isolano per la prima volta i mitocondri, si consiglia di aggiungere volumi più piccoli di IB in modo da non diluire la soluzione madre. A causa della consistenza dei pellet mitocondriali formati dopo la purificazione dei campioni dal fegato e dai reni, è necessario aggiungere molto meno IB (20 μL) per la risospensione. Altri metodi suggeriscono l'uso della risospensione meccanica tramite raschiatura che può essere abrasiva per le membrane mitocondriali e ridurre l'integrità complessiva^32,33. Quando si utilizza questo protocollo, si consiglia di lavare delicatamente il pellet con IB per migliorare la qualità dei mitocondri. Durante questo processo, fare attenzione a non produrre bolle o disturbare il pellet con la punta della pipetta, poiché ciò può portare alla rottura della membrana e al ripiegamento errato delle proteine³⁴. Solo spingendo fino al primo arresto della pipetta si può ridurre la probabilità di formare bolle. Il lavaggio delicato delle pipette deve essere effettuato fino a quando l'intero pellet non è in sospensione. La resa totale di risospensione dovrebbe essere di 150-200 μl per i mitocondri cardiaci di cavie e ratti e apparire di colore marrone chiaro. I campioni più concentrati avranno una tonalità più scura di marrone e possono essere diluiti per adattarsi all'intervallo di concentrazione di lavoro desiderato dopo la quantificazione della proteina mitocondriale.

I saggi proteici standard che utilizzano BSA sono ottimali per la quantificazione delle proteine mitocondriali³⁵. I saggi delle proteine devono essere ritardati e incubati per le durate e le temperature raccomandate, come definito dal protocollo del produttore. Per i mitocondri isolati, l'incubazione a 37 °C per 30 minuti consente uno sviluppo del colore ben distribuito e una quantificazione accurata delle proteine. Durante la quantificazione della quantità totale di proteine, si raccomanda inizialmente di diluire i mitocondri risospesi e l'IB in rapporti di 1:50, 1:100 e 1:200 per garantire che i risultati del dosaggio delle proteine rientrino nell'intervallo di calibrazione. Ulteriori dettagli su come condurre saggi proteici utilizzando BSA come standard sono forniti nel kit del produttore, pertanto le raccomandazioni qui elencate potrebbero non essere applicabili. Dovrebbe essere eseguito anche un test CS per determinare il contenuto mitocondriale in ciascun campione. Questo test è ben consolidato e consente un'ulteriore normalizzazione se si studiano le differenze biologiche tra i sottotipi mitocondriali³⁶.

Dopo la determinazione delle proteine, il materiale mitocondriale deve essere diluito per ottenere la concentrazione di lavoro finale desiderata per i saggi di respirometria. I mitocondri isolati da porcellini d'India e cuori di ratto vengono diluiti a 40 mg/mL e 5 μL di questo stock vengono aggiunti alla camera respiratoria per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,1 mg/mL. In caso di isolamento da cuori di topo singolo o da reni e fegato, la diluizione del ceppo mitocondriale può non essere necessaria. È inoltre possibile aggiungere volumi maggiori di mitocondri per ottenere le concentrazioni desiderate. I tassi di consumo di ossigeno durante lo Stato 2 compresi tra 35 e 55 pmol/mL/s sono accettabili per la maggior parte delle analisi respirometriche²⁸. I dettagli relativi alle modalità di conduzione e analisi degli RCR sono spiegati nella Figura 1 e nella sezione dei risultati rappresentativi; Tuttavia, è importante notare che la respirazione è alimentata da piruvato e malato. Altre condizioni del substrato, come il succinato e il rotenone, risulteranno in valori RCR diversi poiché il rapporto P/O e altre variabili bioenergetiche sono diverse³⁷. L'uso del piruvato e del malato come combustibili per le vie respiratorie consente di ottenere un turnover del ciclo di TCA e una produzione quasi massima di equivalenti riducenti; tuttavia, la massima attività del ciclo del TCA e la funzione ETS accoppiata si ottengono con 5 mM di piruvato, 1 mM di L-malato e 20 mM di succinato. Quando si stimola la fosforilazione ossidativa per quantificare i tassi di consumo di ossigeno durante lo Stato 3, l'ADP viene aggiunto a concentrazioni almeno 10 volte il K_D stimato per l'ADP del traslocatore nucleotidico dell'adenina³⁸. Ciò può essere ottenuto con boli superiori a 350 μM di ADP, ed è per questo che 500 μM è stato utilizzato in tutti i saggi sperimentali. Se la durata dello Stato 3 è troppo breve, è possibile utilizzare concentrazioni mitocondriali più basse per prolungarla. Per un'ulteriore analisi della respirazione, è possibile effettuare modulazioni alla concentrazione di ADP che viene introdotta nel sistema per adattarsi meglio ai parametri sperimentali³⁹. Durante lo sviluppo di questo protocollo, è stato utilizzato un test del citocromo C per valutare l'integrità della membrana esterna degli isolati mitocondriali⁴⁰. Se i valori RCR sono inferiori agli intervalli previsti, eseguire il test del citocromo C per valutare se il danno alla membrana esterna è significativo. Per fare ciò, aggiungere 10 μM di citocromo C alla camera respiratoria e confermare che l'aumento della respirazione è inferiore al 5 o al 10% del tasso di Stato 4. Gli intervalli attesi sono stati trovati da studi pubblicati in precedenza e sono specifici per specie, tessuto e substrato. Se l'aggiunta di citocromo c stimola la respirazione allo Stato 4 superiore al 10%, l'ultima centrifuga di 8.000 x g può essere ripetuta per rimuovere i mitocondri danneggiati. Detto questo, il danno alla membrana esterna può essere una parte del fenotipo di una malattia e, quindi, il test del citocromo C dovrebbe essere interpretato tenendo presente questo⁴¹. Una volta ottenuti valori di RCR costantemente elevati con bassi (<10%) effetti stimolati dal citocromo C, questo test diventa necessario e consigliato solo se i valori di RCR si trovano al di fuori degli intervalli accettabili. Se il test del citocromo C è <10% e i valori RCR sono al di fuori dell'intervallo previsto, come dettagliato nella Tabella 2, ripetere il test respirometrico con nuovo RB dopo aver lavato con acqua distillata 10 volte. Se si osservano ancora tassi ridotti, è necessario produrre nuovi reagenti (piruvato, malato, EGTA e ADP) per diagnosticare il problema. Inoltre, i saggi del citocromo C possono essere condotti tramite ELISA e l'uso di coloranti mitocondriali come TMRE^33,42. A seconda del tipo di tessuto e della fonte, queste opzioni possono essere più adatte per determinare l'integrità della membrana esterna.

Sebbene non vi siano limitazioni importanti nell'utilizzo di questo protocollo per isolare i mitocondri cardiaci, è importante notare che è necessario fare alcune considerazioni quando si utilizzano questi metodi. La qualità degli isolati mitocondriali è fortemente influenzata dalla temperatura e dal tempo impiegato sia per perfondere il cuore che per risospendere il pellet purificato. Pertanto, potrebbe essere necessaria la familiarità con questi processi per ottenere RCR comparabili a quelli qui riportati. Inoltre, la composizione dei tamponi e delle soluzioni utilizzate durante il processo di isolamento è importante in quanto influisce direttamente sull'integrità e sulla funzione mitocondriale⁴³. I tamponi elencati nella Tabella 1 sono forniti come riferimenti e hanno permesso l'isolamento di mitocondri ben accoppiati in una varietà di fonti tissutali, ma possono essere apportate modifiche per limitare la quantità di cloruro nelle analisi respiratorie in quanto ciò può interferire con la traslocazione nucleotidica dell'adenina e la funzione ETS²⁸. La composizione del tampone può anche essere modificata per isolare meglio i mitocondri epatici. Poiché il fegato è ricco di concentrazioni di acidi grassi, si consiglia di lavare l'organo e il tessuto macinato con un tampone contenente concentrazioni elevate di BSA se si osservano RCR al di fuori dell'intervallo previsto. Sebbene la qualità degli isolati mitocondriali ottenuti da sezioni di fegato sia ben accoppiata e costante, questa alterazione potrebbe comportare un miglioramento della funzione degli organelli. Va anche riconosciuto che l'isolamento dei mitocondri dalle cellule che utilizzano questi metodi richiede una grande quantità di cellule in coltura, il che rappresenta una potenziale limitazione. Inoltre, questo protocollo non è specificamente progettato per gli isolati cellulari, ma si è dimostrato efficace quando è stato implementato. Pertanto, i metodi di isolamento mirati per le cellule in coltura possono essere di migliore utilità. In alternativa, per valutare la qualità mitocondriale, i ricercatori possono optare per sonde fluorescenti per calcolare gli RCR. I metodi spettrofluorimetrici sono una scelta popolare, soprattutto se vengono estratte quantità inferiori di proteine^44,45.

Nel complesso, questo protocollo può essere utilizzato per isolare in modo coerente mitocondri cardiaci ben accoppiati da piccoli animali come porcellini d'India e ratti. Può essere facilmente modificato per aumentare la resa proteica modificando la velocità di omogeneizzazione, i tempi di centrifugazione e il numero di spin per consentire l'isolamento mitocondriale da cuori, fegato, reni e cellule di topo. Inoltre, questo protocollo è abbastanza generale e robusto da essere stato utilizzato per studiare la funzione mitocondriale di specie non mammifere come la lampreda di mare⁴⁶, nonché per eseguire analisi strutturali utilizzando la microscopia classica e crioelettronica^40,47. Mentre molti studi recenti si concentrano sull'esplorazione del comportamento mitocondriale in sistemi cellulari e tissutali intatti, l'ampiezza e la profondità delle informazioni estratte dai mitocondri isolati utilizzando questi metodi rivelano impatti sulla metabolomica, sullo stress ossidativo e sulla produzione di ATP che non saranno mai privi di merito. L'isolamento di mitocondri ben accoppiati consente ai ricercatori di studiare aspetti chiave dello sviluppo e della progressione della malattia che non sono altrimenti possibili in modelli di cellule intere. Grazie alla versatilità di questo protocollo, i cambiamenti nell'energia mitocondriale osservati in patologie come le malattie cardiovascolari, il diabete e i disturbi neurologici possono essere esplorati utilizzando la metodologia qui descritta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			per microcentrifuga da 1,7 mL
		vetro da 10 mL	Per la disezione e la macinazione di organi
Provette			Centrifugazione
Adenosina 5'-difosfato sale monopotassico diidrato	Sigma	A5285	Saggi di respirometria
Kit di analisi delle proteine BSA	Thermo Scentific	PI23225	Quantificazione delle proteine mitocondriali
Destrosio	Sigma	DX0145	Per tampone (CB)
Glicole etilenico bis(2-ammino-etiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico	Sigma	E4378	Per tamponi (CB e IB) e saggi di respirometria
Cannula in vetro	Radnoti		Perfusione cardiaca di porcellino d'India e ratto
Eparina sodica mucosa suina	Sigma	SRE0027-250KU	Iniezione di IP animale
Respirometro			Elettrodo di tipo Clark; ossigrafo con camere da 2 mL
Camera di induzione
Isoflurano	Sigma	792632	Anestetico
Acido L-malico	Sigma	02288-50G	Saggi di respirometria
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma	M9272	Per tampone (RB)
Mannitolo	Sigma	MX0214	Per siringhe tampone
		Microlitri	Dimensioni che vanno da 5– 50 µ L
Lettore			Deve essere in grado di incubare a 37 ° C
MOPS	Sigma	475898	Per tutti i tamponi
O2 serbatoio
OMNI THQ Omogeneizzatore	OMNI International	12-500	Omogeneizzatori statore a rotore simili funzioneranno
pipette			Volumi di  2– 20 µ L; 20– 200 µ L; 200– 1000 µ L
Cloruro di potassio	Sigma	P3911	Per tamponi (RB e CB)
Fosfato di potassio bibasico	Sigma	795496	Per tamponi (IB e RB)
Proteasi da Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Cloruro di sodio	Sigma	S9888	Per tampone (CB)
Piruvato di sodio	Fisher bioreagenti	BP356-100	Saggi di respirometria
Saccarosio	Sigma	8510-OP	Per tampone (IB)
		dissezione chirurgica	Dipende dalla fonte animale e tissutale
Centrifuga			Deve raffreddarsi a 4 ° C