Determinazione della funzione ciliare e dell'impermeabilità della membrana dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree polmonari

Summary

La coltura dell'interfaccia aria-liquido è comunemente usata per sviluppare epitelio pseudostratificato delle vie aeree differenziando le cellule epiteliali bronchiali umane normali primarie che imitano il lato apicale delle vie aeree polmonari. Qui, descriviamo un semplice protocollo per determinarne la qualità monitorando le sue proprietà biofisiche, come la funzione ciliare e l'integrità della membrana.

Abstract

La differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree polmonari primarie nell'interfaccia aria-liquido (ALI) è una tecnica popolare per sviluppare un epitelio pseudostratificato multicellulare delle vie aeree che imita il lato apicale delle vie aeree polmonari. Mentre la differenziazione delle cellule primarie delle vie aeree polmonari è prevista, la valutazione delle proprietà biofisiche come la funzione ciliare e l'impermeabilità della membrana fornisce una valutazione della qualità dell'epitelio delle vie aeree e garantisce l'affidabilità dell'esperimento. Qui, descriviamo un protocollo semplice per lo sviluppo di epitelio pseudostratificato multicellulare delle vie aeree in coltura di ALI e valutiamo due importanti proprietà biofisiche: funzione ciliare e impermeabilità della membrana. Per determinare la funzione ciliare, abbiamo catturato il movimento ciliare di un epitelio differenziato delle vie aeree di 4 settimane utilizzando una telecamera ad alta velocità collegata a un microscopio invertito, seguito dalla quantificazione della frequenza del battito ciliare (CBF) utilizzando il sistema Simon Amon Video Analysis (SAVA). Abbiamo anche misurato la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando un volt-ohmmetro per determinare l'integrità della barriera epiteliale dell'epitelio delle vie aeree.

Introduction

Le malattie respiratorie croniche come l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e la fibrosi cistica sono alcuni dei principali problemi di salute in tutto il mondo¹. Anche la prevalenza di malattie respiratorie causate da virus come il virus dell'influenza umana A, il virus respiratorio sinciziale (RSV) e la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causano un onere economico e di salute pubblica². Pertanto, c'è un'immensa necessità di sviluppare regimi di trattamento per le malattie respiratorie che portano a danni irreversibili ai tessuti respiratori. ....

Protocol

Il protocollo deve essere eseguito in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare di livello 2 di biosicurezza (cappa di biosicurezza). Tutto il mezzo e le soluzioni devono essere scongelati a 37 °C prima dell'uso. La centrifugazione deve essere eseguita a 4 °C. Tutti i materiali utilizzati nell'esperimento devono essere sterili. Le cellule primarie (donatore non identificato) sono state ottenute in collaborazione con la dottoressa Kristina Bailey presso l'University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE. Le cellule primarie provengono da donatori non identificati e le cellule non rientrano nel soggetto umano NIH. Le ....

Results

Sono state valutate sia la funzione ciliare che l'impermeabilità della membrana dell'epitelio delle vie aeree ottenute dalla differenziazione delle cellule primarie NHBE di due donatori indipendenti anonimizzati (due adulti sani non fumatori o adulti con BPCO, donne di età superiore ai 50 anni). Per determinare la funzione ciliare, abbiamo determinato la CBF dell'epitelio differenziato delle vie aeree a 28 giorni. Abbiamo osservato che la CBF ha raggiunto almeno 3 Hz per entrambi gli epiteli delle vie aeree, che era para.......

Discussion

L'epitelio primario delle vie aeree umane (coltura ALI) è sempre più utilizzato come modello polmonare in vitro per valutazioni biologiche volte a studiare funzioni e meccanismi e a ridurre l'uso di animali¹⁴. ALI presenta diversi vantaggi rispetto a qualsiasi coltura sommersa monostrato. Ad esempio, fornisce un epitelio delle vie aeree pseudostratificato simile a un tessuto che imita il lato apicale delle vie aeree polmonari

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle vie aeree	PromoCell, Germania	C-21060
Amfotericina B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
Ohmmetro EVOM2 volt	World Precision Instruments, USA	Non applicabile
Soluzione di eparina	Tecnologie STEMCELL, USA	07980
Tecnologie STEMCELL	stock di idrocortisone	07926
Microscopio: Leica DMI8 (microscopio Leica) con fotocamera ad alta velocità da 120 f/sec (Basler) associata al microscopio. Microsope fissato anche con incubatore a camera di stadio i8.	Leica, USA	Non applicabile
Penicillina-Streptomicina	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	Tecnologie STEMCELL, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sistema di analisi video Sisson-Ammons (SAVA). Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Non applicabile