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Articolo metodologico

Determinazione della funzione ciliare e dell'impermeabilità della membrana dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree polmonari

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DOI:

10.3791/67094

⸱

21 febbraio 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In questo articolo

Sommario

La coltura dell'interfaccia aria-liquido è comunemente usata per sviluppare epitelio pseudostratificato delle vie aeree differenziando le cellule epiteliali bronchiali umane normali primarie che imitano il lato apicale delle vie aeree polmonari. Qui, descriviamo un semplice protocollo per determinarne la qualità monitorando le sue proprietà biofisiche, come la funzione ciliare e l'integrità della membrana.

Abstract

La differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree polmonari primarie nell'interfaccia aria-liquido (ALI) è una tecnica popolare per sviluppare un epitelio pseudostratificato multicellulare delle vie aeree che imita il lato apicale delle vie aeree polmonari. Mentre la differenziazione delle cellule primarie delle vie aeree polmonari è prevista, la valutazione delle proprietà biofisiche come la funzione ciliare e l'impermeabilità della membrana fornisce una valutazione della qualità dell'epitelio delle vie aeree e garantisce l'affidabilità dell'esperimento. Qui, descriviamo un protocollo semplice per lo sviluppo di epitelio pseudostratificato multicellulare delle vie aeree in coltura di ALI e valutiamo due importanti proprietà biofisiche: funzione ciliare e impermeabilità della membrana. Per determinare la funzione ciliare, abbiamo catturato il movimento ciliare di un epitelio differenziato delle vie aeree di 4 settimane utilizzando una telecamera ad alta velocità collegata a un microscopio invertito, seguito dalla quantificazione della frequenza del battito ciliare (CBF) utilizzando il sistema Simon Amon Video Analysis (SAVA). Abbiamo anche misurato la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando un volt-ohmmetro per determinare l'integrità della barriera epiteliale dell'epitelio delle vie aeree.

Introduzione

Le malattie respiratorie croniche come l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e la fibrosi cistica sono alcuni dei principali problemi di salute in tutto il mondo1. Anche la prevalenza di malattie respiratorie causate da virus come il virus dell'influenza umana A, il virus respiratorio sinciziale (RSV) e la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causano un onere economico e di salute pubblica2. Pertanto, c'è un'immensa necessità di sviluppare regimi di trattamento per le malattie respiratorie che portano a danni irreversibili ai tessuti respiratori. Il tessuto epiteliale respiratorio stesso non è solo coinvolto nell'assorbimento di ossigeno, ma fornisce anche una barriera per proteggere il corpo dall'invasione di agenti patogeni e sostanze chimiche pericolose3. L'epitelio respiratorio ha un'organizzazione cellulare complessa composta da tre tipi principali di cellule: cellule ciliate, cellule caliciformi e cellule basali. Recentemente, è stato pubblicato un rapporto sulla presenza di nuove ma rare cellule ionocitarie nell'epitelio4 delle vie aeree. Il complesso tessuto funziona in modo coordinato per fornire risposte immunitarie innate come la secrezione di peptidi antimicrobici, il rilascio di citochine per attivare una risposta immunitaria adattativa e la clearance mucociliare5. La mancanza di un modello adeguato delle vie aeree è uno degli ostacoli allo studio delle infezioni respiratorie e allo sviluppo di trattamenti.

Il modello di interfaccia aria-liquido (ALI) sta diventando uno strumento chiave per la ricerca sulle malattie respiratorie6. Si tratta di un efficace modello di vie aeree polmonari in vitro in quanto le cellule primarie delle vie aeree polmonari si differenziano in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato composto da almeno tre tipi di cellule che generalmente risiedono sul lato apicale delle vie aeree. In primo luogo, le cellule ciliate coprono la maggior parte del lato apicale delle vie aeree e contribuiscono alla clearance mucociliare. In secondo luogo, le cellule caliciformi producono muco e sono le cellule più grandi che risiedono insieme alle cellule ciliari sul lato apicale delle vie aeree. In terzo luogo, le cellule basali risiedono nello strato basale delle vie aeree e sono le cellule progenitrici che si differenziano in diverse cellule epiteliali 5,7. Sebbene gli ionociti e le cellule del ciuffo siano rari nell'epitelio delle vie aeree, possono anche svolgere un ruolo nella funzione ciliare e nella permeabilità della membrana4. Questa tecnica differisce dalla tradizionale coltura cellulare sommersa, che non imita l'ambiente polmonare in vivo. Poiché l'ALI è prodotto da cellule epiteliali primarie derivate da persone sane, pazienti con asma e BPCO, offre una piattaforma più diversificata per lo studio delle risposte alle infezioni e alla fisiopatologia della malattia.

La valutazione dello stato di salute delle colture sviluppate con ALI è un aspetto essenziale da monitorare, garantendo la vitalità, la funzionalità e la rilevanza fisiologica delle cellule in coltura. Aumenta la fiducia nell'integrità, nell'affidabilità e nella riproducibilità delle colture ALI. Come precedentemente pubblicato, il nostro gruppo ha valutato l'integrità della coltura ALI valutando due parametri biofisici: la funzione ciliare quantificando la frequenza di battito ciliare (CBF) e l'integrità della barriera epiteliale determinando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER)6,7,8. La clearance mucociliare (MCC) è una delle caratteristiche importanti dell'epitelio delle vie aeree trasportato dalle cellule ciliate. Organelli specializzati chiamati ciglia sulla superficie delle cellule ciliate battono in onde metacroniche per liberare le vie aeree dalle infezioni e dalle particelle inalate bloccate nello strato mucoso dell'epitelio delle vie aeree. L'efficacia dell'MCC dipende totalmente da una corretta attività ciliare9. Un buon CBF è indicativo di un epitelio delle vie aeree sano e intatto; quindi, il monitoraggio della CBF per le colture di ALI fornisce preziose informazioni sull'integrità dell'epitelio10. Sebbene esistano diversi modi per quantificare la CBF, ad esempio la microscopia video ad alta velocità11 e la tomografia a coerenza ottica Doppler a risoluzione di fase12, ogni metodo richiede competenze tecniche e attrezzature specializzate. In questo protocollo, forniamo un modo più semplice e meno tecnico per quantificare la CBF dell'epitelio differenziato delle vie aeree. Abbiamo anche descritto un metodo per quantificare la TEER dello stesso epitelio, che indica l'integrità e la funzione barriera dei tessuti epiteliali13.

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Protocollo

Il protocollo deve essere eseguito in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare di livello 2 di biosicurezza (cappa di biosicurezza). Tutto il mezzo e le soluzioni devono essere scongelati a 37 °C prima dell'uso. La centrifugazione deve essere eseguita a 4 °C. Tutti i materiali utilizzati nell'esperimento devono essere sterili. Le cellule primarie (donatore non identificato) sono state ottenute in collaborazione con la dottoressa Kristina Bailey presso l'University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE. Le cellule primarie provengono da donatori non identificati e le cellule non rientrano nel soggetto umano NIH. Le celle sono state ottenute in base a un accordo di trasferimento di materiale (MTA) approvato tra l'Università del North Dakota, Grand Forks, ND, e l'UNMC, Omaha, NE. Qui, abbiamo usato 4 celle NHBE passate. Sebbene sia stato dimostrato che anche le cellule NHBE di passaggio più elevato (fino al passaggio 8) si differenziano nell'epitelio delle vie aeree, utilizziamo abitualmente cellule NHBE di passaggio quattro perché non vi è alcuna differenza evidente nei profili di trascrizione dell'intero genoma tra i passaggi da 1 a 4 6,14.

1. Coltura cellulare primaria

NOTA: Un'attenta manipolazione delle celle primarie è fondamentale. L'intero protocollo deve evitare trattamenti aggressivi e un pipettaggio eccessivo delle cellule primarie.

  1. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, aggiungere 5 mL di collagene a una piastra di coltura tissutale (TC) da 100 mm per pre-rivestire la piastra. Incubare la capsula TC con collagene a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.
  2. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, aspirare il collagene dalla piastra TC e sostituirlo con 8 mL di terreno di coltura epiteliale delle vie aeree complete (AEC) pre-scongelato integrato con penicillina-streptomicina al 2% (v/v) e amfotericina B all'1% (v/v) (Tabella 1).
  3. Scongelare un flaconcino (contenente 5 x 105 cellule) di cellule primarie normali dell'epitelio bronchiale umano (NHBE) in un bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Con una pipetta sierologica sterile da 5 mL, aggiungere 1 mL di terreno AEC completo pre-scongelato alle cellule goccia a goccia per acclimatare le cellule NHBE e raccogliere tutte le cellule in una provetta conica sterile da 15 mL.
  5. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 212 x g per 5 min a 4 °C. Scartare delicatamente il terreno dalla provetta e risospendere le cellule nelle gocce di terreno rimanenti nella provetta picchiettando delicatamente.
    NOTA: Evitare di picchiettare eccessivamente e bruscamente.
  6. Utilizzando una pipetta sierologica sterile da 5 mL, aggiungere lentamente 2 mL di terreno AEC completo alle cellule risospese e raccogliere tutte le cellule.
  7. Aggiungere le cellule alla piastra pre-aggiunta con 8 mL di terreno AEC completo. Spostare lateralmente la piastra TC per distribuire uniformemente le cellule nella piastra.
  8. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore per colture cellulari di CO2 umido all'85%-95%. Dopo 24 ore, osservare le cellule NHBE al microscopio a 10x o 20x per verificarne l'attaccamento alla piastra TC e la crescita. Se le cellule sono sospese nel mezzo, questo mostra cellule morte.
  9. Dopo 48 ore, aspirare il vecchio terreno dalla piastra TC con una pipetta sierologica sterile.
  10. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, aggiungere alle cellule 10 mL di terreno AEC completo e preriscaldato. Aggiungi lentamente il supporto in un angolo; Evitare il versamento diretto sulla parte superiore delle celle.
  11. Sostituire il supporto AEC completo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono la confluenza del 95%-100%.

2. Cultura dell'interfaccia aria-liquido

  1. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 μL di collagene a un inserto transwell pre-rivestito da 6,5 mm con membrana in poliestere a pori da 0,4 μm (d'ora in poi denominati inserti) e incubare in RT per 20 minuti.
  2. Con una pipetta sierologica sterile, aspirare il terreno dalle cellule NHBE confluenti.
  3. Aggiungere 5 mL di 1x soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con una pipetta sierologica sterile in un angolo della capsula TC.
  4. Agitare delicatamente la piastra per lavare le cellule e aspirare 1x DPBS con una pipetta sierologica sterile. Assicurarsi che le celle non si secchino in nessuna fase durante il protocollo.
  5. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 5 mL di TripsinLE alle cellule e incubare a 37 °C in un incubatore umido per colture cellulari di CO2 fino a quando tutte le cellule non sono dissociate dalla superficie inferiore della piastra.
  6. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, raccogliere tutte le cellule in una provetta conica da 15 mL. Con una pipetta sierologica sterile, aggiungere 3 mL di tripsina alla piastra TC e raccogliere eventuali cellule residue.
  7. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 212 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il terreno e picchiettare delicatamente la provetta per risospendere le cellule nelle gocce di tripsina rimanenti nella provetta.
  8. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 2 mL di terreno AEC completo alle cellule risospese.
  9. Contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un contatore automatico di cellule.
  10. Diluire le cellule con terreno AEC completo, con ogni inserto che riceve 5 x 104 cellule in un volume di 200 μl.
  11. Con una pinza sterile, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto in una piastra di coltura a 24 pozzetti.
  12. Utilizzando una pipetta P1000, aggiungere 500 μl di terreno AEC completo al pozzetto basale della piastra.
  13. Utilizzando una pinza sterile, trasferire nuovamente gli inserti nel pozzetto basale con l'aggiunta di terreni AEC completi.
  14. Con una pipetta P200, aggiungere 5 x 104 cellule NHBE risospese in 200 μl del terreno AEC completo sul lato apicale dell'inserto. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore per colture cellulari di CO2 umido all'85% - 95%.
  15. Dopo 24 ore, osservare le cellule al microscopio per vedere se hanno formato uno strato confluente nel pozzetto.
    NOTA: Se le cellule non formano uno strato confluente, sostituire il terreno AEC basale ogni 48 ore con un terreno AEC fresco e completo fino a formare un monostrato confluente. Durante la sostituzione del terreno basale, trasferire gli inserti nel pozzetto vuoto con una pinza sterile. Aspirare il vecchio terreno con una pipetta P1000, aggiungere il terreno fresco e riposizionare gli inserti in un terreno AEC fresco e completo.
  16. Una volta che le cellule sono confluenti, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto con una pinza sterile. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare tutto il terreno AEC basale.
  17. Con una pipetta P1000, aggiungere 500 μl di terreno di differenziazione dell'interfaccia aria-liquido (ALI) completo fresco integrato con penicillina-streptomicina al 2% (v/v) e amfotericina B all'1% (v/v) al pozzetto basale.
  18. Trasferire gli inserti nel pozzetto basale con l'aggiunta di un terreno ALI completo utilizzando una pinza sterile. Utilizzando una pipetta P200, aspirare delicatamente il terreno AEC apicale dal pozzetto.
    NOTA: Il lato apicale non deve essere aggiunto con l'intero mezzo ALI. Aspirare con cautela il terreno AEC dal lato apicale per evitare qualsiasi distacco cellulare.
  19. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umido per colture cellulari di CO2 . Dopo 48 ore, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto con una pinza sterile.
  20. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare il vecchio terreno e aggiungere 500 μl freschi di terreno ALI completo.
  21. Con una pinza sterile, riposizionare gli inserti nel pozzetto con terreno fresco. Continuare a cambiare il mezzo ALI completo ogni 48 ore fino al giorno 28 (quattro settimane).
  22. Il giorno 28, utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 μl di 1x DPBS sul lato apicale degli inserti e incubare a 37 °C in un incubatore per colture cellulari di CO2 umido per 30 minuti. Aspirare 1x DPBS con una pipetta P200.
    NOTA: I DPBS devono essere aggiunti versandoli sul muro anziché direttamente sulle celle. Durante l'aspirazione della DPBS, evitare di toccare l'epitelio e di pipettare energicamente perché qualsiasi danno all'epitelio può compromettere l'integrità dell'epitelio (simile ai tessuti).
  23. A partire dalla 2asettimana di differenziazione, valutare la produzione di muco osservando al microscopio un possibile strato più scuro dovuto al muco sull'epitelio. Il muco in eccesso può essere rimosso con il lavaggio DPBS. In breve, aggiungere 200 μl di 1x DPBS sul lato apicale degli inserti su una piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore per colture cellulari di CO2 umido per 30 minuti. Rimuovere il DPBS e conservare la piastra a 37 °C in un incubatore per colture cellulari di CO2 umido.

3. Determinazione della frequenza del battito ciliare

NOTA: Per la determinazione della CBF a 37 °C (se necessario), il microscopio deve essere dotato di un incubatore a camera ambiente che fornisca il 5% di CO2 a 37 °C e umidità.

  1. Accendere il microscopio con il computer collegato e la camera ambientale. Aprire lo sportello della camera per posizionare la piastra contenente gli inserti sul tavolino del microscopio.
  2. Una volta posizionata la piastra sul tavolino, chiudere la camera. Utilizzando la manopola di comando del tavolino del microscopio, spostare la piastra per portare gli inserti in vista.
  3. Selezionare la lente con ingrandimento 20x nella modalità a contrasto di fase. Osservare la lastra attraverso l'oculare del microscopio e mettere a fuoco la cellula utilizzando la manopola di sintonia.
  4. Sullo schermo del computer, fare clic sull'icona del sistema SAVA . Il programma SAVA deve essere installato sul computer collegato al microscopio.
  5. Nell'interfaccia del software, fare clic su Configura esperimento. Nella scheda successiva, fai clic su Crea esperimento.
  6. Apparirà una nuova scheda, che fornisce i dettagli della directory in cui verranno memorizzati i dati in Inserisci il nome della directory dell'esperimento e i dettagli dell'esperimento in Inserisci la descrizione dell'esperimento, quindi fai clic su OK.
  7. Fare clic su L'esperimento che è stato creato e viene visualizzato nella directory sotto gli Esperimenti.
  8. Fare clic su Modifica e fornire i dettagli del campione nella descrizione del campione. Fare clic su Aggiungi , quindi su Esci per uscire da questa scheda.
  9. Nell'interfaccia software principale nello slot dell'esperimento, selezionare l'esperimento creato dal menu a discesa dell'interfaccia principale.
  10. Fare clic su Registra video e monitorare la frequenza del battito ciliare (CBF) sullo schermo del computer. Lo schermo mostrerà il movimento ciliare focalizzato.
  11. Per ogni inserto, registra 6 diversi campi casuali per 2,1 s a 120 fotogrammi al secondo. Fare clic su Salva video per monitorare i dati CBF.
  12. Per analizzare i dati, fare clic su Analizza video nell'interfaccia del software. Nella scheda successiva, fare clic su OK.
  13. Nella scheda successiva, fare clic su Analizza tutto. Scarica il foglio di calcolo generato per ogni esperimento nella cartella di acquisizione dati SAVA del computer.
  14. Prendi la frequenza media gaussiana per la presentazione dei dati.

4. Quantificazione della resistenza elettrica transepiteliale

NOTA: La quantificazione TEER necessita di liquido sul lato apicale dell'epitelio delle vie aeree. Per stabilire questo protocollo, aggiungere 100 μL di 1x DPBS sul lato apicale dell'epitelio delle vie aeree negli inserti che contengono già il mezzo basale (sperimentale) o 500 μL di 1x DPBS.

  1. Accendere l'ohmmetro a volt EVOM2 utilizzando l'interruttore di alimentazione. Collegare il resistore di prova all'EVOM2 nello slot INPUT.
  2. Monitorare la lettura sullo schermo EVOM2. Se è superiore o inferiore a 1000, necessita di calibrazione. Usando una pinza, ruotare l'interruttore ADJ sull'ohmmetro a volt EVOM2 finché non mostra una lettura uniforme di 1000.
  3. Prendi un inserto vuoto per la lettura del controllo sperimentale. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 μL di 1x DPBS sul lato apicale dell'inserto vuoto, mentre 500 μL di 1x DPBS vengono aggiunti sul lato basale con una pipetta P1000.
  4. Scollegare la resistenza di prova e collegare l'elettrodo STX2 allo slot INPUT su EVOM2. Pulire delicatamente l'elettrodo STX2 con etanolo al 70%.
  5. Inserire l'elettrodo STX2 nell'inserto vuoto con 1x DPBS, mantenendo la gamba dell'elettrodo più corta sulla parte apicale di ciascun inserto e la gamba dell'elettrodo più lunga sulla parte basale.
  6. Registrare la lettura stabile sullo schermo EVOM2, poiché la lettura può fluttuare a causa del movimento o di altri motivi indeterminati.
  7. Inserire l'elettrodo STX2 nell'inserto con epitelio differenziato per 28 giorni, mantenendo la gamba dell'elettrodo più corta sulla parte apicale di ciascun inserto e la gamba dell'elettrodo più lunga sulla parte basale nel mezzo.
  8. Registrare la lettura stabile sullo schermo EVOM2. Esegui diverse letture indipendenti per calcolare una media affidabile. Sottrarre lo sfondo (lettura dell'inserto vuoto) dalla lettura dell'inserto sperimentale per il calcolo.

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Risultati

Sono state valutate sia la funzione ciliare che l'impermeabilità della membrana dell'epitelio delle vie aeree ottenute dalla differenziazione delle cellule primarie NHBE di due donatori indipendenti anonimizzati (due adulti sani non fumatori o adulti con BPCO, donne di età superiore ai 50 anni). Per determinare la funzione ciliare, abbiamo determinato la CBF dell'epitelio differenziato delle vie aeree a 28 giorni. Abbiamo osservato che la CBF ha raggiunto almeno 3 Hz per entrambi gli epiteli delle vie aeree, che era para...

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Discussione

L'epitelio primario delle vie aeree umane (coltura ALI) è sempre più utilizzato come modello polmonare in vitro per valutazioni biologiche volte a studiare funzioni e meccanismi e a ridurre l'uso di animali14. ALI presenta diversi vantaggi rispetto a qualsiasi coltura sommersa monostrato. Ad esempio, fornisce un epitelio delle vie aeree pseudostratificato simile a un tessuto che imita il lato apicale delle vie aeree polmonari

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH P20GM113123 e dalla sovvenzione pilota UND SMHS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x DPBSThermo Fisher Scientific, USA14190-144
Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle vie aereePromoCell, GermaniaC-21060
Amfotericina BThermo Fisher Scientific, USA15290-026
Ohmmetro EVOM2 voltWorld Precision Instruments, USANon applicabile
Soluzione di eparinaTecnologie STEMCELL, USA07980
Tecnologie STEMCELLstock di idrocortisone07926
Microscopio: Leica DMI8 (microscopio Leica) con fotocamera ad alta velocità da 120 f/sec (Basler) associata al microscopio. Microsope fissato anche con incubatore a camera di stadio i8.Leica, USANon applicabile
Penicillina-StreptomicinaCorning, USA30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium Tecnologie STEMCELL, USA05002
PureColAdvanced BioMatrix, USA5005
Sistema di analisi video Sisson-Ammons (SAVA). Software V.2.1.15 Amson Engineering, USANon applicabile
, USA

Riferimenti

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