Articolo metodologico

Imaging longitudinale in vivo di cellule retiniche con sierotipi virali adeno-associati su misura tramite oftalmoscopia laser a scansione confocale

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DOI:

10.3791/67106

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11 ottobre 2024

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso di vettori di virus adeno-associati (AAV) per la marcatura cellulare specifica e l'imaging in vivo utilizzando un oftalmoscopio laser a scansione confocale (CSLO). Questo metodo consente lo studio di diversi tipi di cellule retiniche e del loro contributo alla funzione e alla malattia retinica.

Abstract

La natura dinamica dei processi cellulari retinici richiede progressi nella consegna genica e nelle tecniche di monitoraggio in tempo reale per migliorare la comprensione e il trattamento delle malattie oculari. Questo studio introduce un approccio ottimizzato al virus adeno-associato (AAV), utilizzando sierotipi e promotori specifici per ottenere un'efficienza di trasfezione ottimale nelle cellule retiniche bersaglio, comprese le cellule gangliari retiniche (RGC) e la glia di Müller. Sfruttando la precisione dell'oftalmoscopia laser a scansione confocale (CSLO), questo lavoro presenta un metodo non invasivo per l'imaging in vivo che cattura l'espressione longitudinale della proteina fluorescente verde (GFP) mediata da AAV. Questo approccio elimina la necessità di procedure terminali, preservando la continuità dell'osservazione e il benessere del soggetto. Inoltre, il segnale GFP può essere rintracciato nelle RGC infettate da AAV lungo la via visiva verso il collicolo superiore (SC) e il nucleo genicolato laterale (LGN), consentendo il potenziale per la mappatura diretta della via visiva. Questi risultati forniscono un protocollo dettagliato e dimostrano l'applicazione di questo potente strumento per studi in tempo reale sul comportamento delle cellule retiniche, sulla patogenesi della malattia e sull'efficacia degli interventi di terapia genica, offrendo preziose informazioni sulla retina vivente e sulle sue connessioni.

Introduzione

Essendo l'unica parte otticamente accessibile del sistema nervoso centrale, la retina funge da modello prezioso per la ricerca neuroscientifica1. Le cellule gangliari retiniche (RGC), i neuroni di uscita della retina che trasmettono le informazioni visive al cervello, svolgono un ruolo cruciale nella funzione visiva. La loro perdita o disfunzione porta a compromissione della vista e cecità irreversibile, come si vede nel glaucoma e in altre neuropatie ottiche2. La glia di Müller, le principali cellule gliali della retina, è essenziale per mantenere l'omeostasi retinica, fornire supporto strutturale e metabolico ai neuroni, regolare i livelli di neurotrasmettitori e contribuire alla riparazione e alla rigenerazione retinica3. La loro disfunzione è implicata in varie malattie della retina, tra cui la retinopatia diabetica4, la degenerazione maculare legata all'età5 e la sindrome ischemica oculare6. Le RGC e la glia di Müller mostrano strette interazioni e interdipendenza; La glia di Müller fornisce un supporto essenziale alle RGC, mentre l'attività delle RGC può influenzare la funzione della glia di Müller 3,7. Lo studio sia delle RGC che della glia di Müller è fondamentale per comprendere la funzione retinica e sviluppare trattamenti efficaci per molteplici malattie retiniche.

Le attuali valutazioni nella ricerca retinica utilizzano principalmente tecniche come la tomografia a coerenza ottica (OCT) per misurare lo spessore dello strato di fibre nervose retiniche o le traiettorie dei fasci di assoni 8,9. Sebbene questi metodi siano preziosi per rilevare la perdita di RGC, non forniscono una visione dettagliata della morfologia RGC e delle cellule gliali a causa della risoluzione limitata. Allo stesso modo, sebbene tecniche avanzate come l'oftalmoscopia laser a scansione ottica adattiva (AO-SLO) consentano l'imaging a livello cellulare di RGC, fotorecettori e cellule gliali nella retina umana vivente10, la loro complessità tecnica e la limitata accessibilità ne limitano l'uso principalmente a contesti di ricerca specializzati. Dati questi vincoli, vi è la continua necessità di sviluppare metodi più accessibili e affidabili per lo studio approfondito di specifiche popolazioni di cellule retiniche in vivo.

Di conseguenza, questo protocollo mira a introdurre un approccio di imaging alternativo adatto per applicazioni di ricerca nelle cellule retiniche. Combina la potenza della marcatura specifica del tipo di cellula mediata da AAV con la natura non invasiva dell'imaging CSLO. I virus adeno-associati (AAV) sono vettori di consegna genica versatili noti per la loro bassa immunogenicità e capacità di trasdurre un'ampia gamma di tipi di cellule, comprese le cellule in divisione e non in divisione11. Questo li rende strumenti ideali per indirizzare specifiche popolazioni cellulari all'interno del complesso ambiente retinico. Utilizzando vettori AAV con sierotipi e promotori accuratamente selezionati, è possibile ottenere l'espressione selettiva di proteine fluorescenti in diversi tipi cellulari di interesse, come le RGC e la glia di Müller. Ad esempio, AAV2 è noto per la sua maggiore efficienza di trasduzione nelle RGC12,13, mentre AAV8 è marcatamente efficace nel colpire i fotorecettori14 e AAV9 dimostra forti capacità di trasfezione nella glia di Müller15, mostrando un'ampia efficienza in vari strati cellulari della retina. È importante notare che l'efficacia dell'AAV si basa non solo sulla scelta del sierotipo, ma anche sui promotori, che dettano l'intensità e la specificità cellulare dell'espressione del transgene, sottolineando l'importanza di un'attenta selezione per ottenere una trasduzione ottimale.

Per la marcatura RGC, questo protocollo impiega AAV2 con il promotore della sinapsina umana (hSyn). AAV2 mostra un'efficiente trasduzione delle RGC dopo l'iniezione intravitreale13 e il promotore hSyn, un promotore neuronale ubiquitario, guida un'espressione transgenica forte e specifica all'interno di queste cellule16. Per la glia di Müller, il protocollo utilizza vettori AAV9 guidati dal promotore17 di GfaABC1D, che dimostra una forte espressione transgenica in queste cellule15. Questo approccio di etichettatura mirata consente ai ricercatori di distinguere queste cellule dal tessuto retinico circostante e di tracciarle nel tempo, fornendo una base per la sorveglianza in vivo delle cellule retiniche e delle loro risposte ai cambiamenti bioambientali.

L'oftalmoscopia laser a scansione confocale (CSLO) è una tecnica di imaging non invasiva che fornisce immagini ad alta risoluzione della retina vivente, consentendo la visualizzazione in tempo reale di popolazioni di cellule retiniche marcate in fluorescenza 18,19,20. Un raggio laser focalizzato esegue la scansione della retina, catturando la luce emessa che passa attraverso un foro stenopeico per eliminare i segnali sfocati, ottenendo immagini più nitide con un contrasto migliorato. Questo protocollo utilizza un sistema Heidelberg Spectralis CSLO, che è stato ampiamente utilizzato per l'imaging delle cellule retiniche in animali vivi, compresi gli studi che visualizzano RGC21,22 e microglia23 marcati con transgenici. Utilizzando l'unità HRA CSLO con un laser a 488 nm e filtri appropriati, i ricercatori possono visualizzare RGC marcati in fluorescenza o glia di Müller in animali vivi dopo l'iniezione intravitreale di vettori AAV portatori di geni reporter fluorescenti. Il protocollo di imaging longitudinale, con sessioni settimanali che coprono sia la retina centrale che quella periferica, tiene traccia dei cambiamenti nel tempo. Per dare priorità al benessere degli animali, il protocollo utilizza il sistema di tracciamento oculare automatico (ART) dell'unità HRA CSLO, che consente un'acquisizione precisa delle immagini senza la necessità di anestesia generale o lenti a contatto.

Questo protocollo sfrutta la potenza combinata di AAV e CSLO per consentire il monitoraggio longitudinale di specifici tipi di cellule retiniche in vivo. Abbinando la specificità del tipo cellulare della marcatura mediata da AAV con le capacità di imaging non invasive e ad alta risoluzione di CSLO, questo metodo consente ai ricercatori di studiare i cambiamenti dinamici nelle RGC e nella glia di Müller in risposta a vari stimoli o interventi. Queste intuizioni hanno un potenziale significativo per informare lo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche per le malattie della retina.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Capital Medical University di Pechino. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J di quattro settimane (di peso compreso tra 15 e 20 g) e alloggiati in stanze a temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12/12 ore. Il cibo e l'acqua standard per roditori erano disponibili ad libitum. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Trasfezione di cellule retiniche mediata da AAV

NOTA: Per la trasduzione mirata delle RGC, questo protocollo utilizza AAV2-hSyn-eGFP, che incorpora il promotore hSyn per guidare l'espressione robusta della GFP potenziata. La glia di Müller è mirata utilizzando AAV9-GfaABC1D-eGFP. Per ottenere un'efficienza di trasduzione ottimale e una robusta espressione transgenica, si raccomanda un titolo AAV minimo di 1 x 1012 genomi virali (vg)/mL per le iniezioni intravitreali nei topi13.

  1. Aderire a rigorosi protocolli di sicurezza durante l'esecuzione di procedure di trasfezione di cellule retiniche mediate da AAV per prevenire l'esposizione accidentale e garantire un ambiente di lavoro sicuro.
  2. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono vettori virali all'interno di una cabina di biosicurezza (BSC) certificata. Dotare il personale di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi camici da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi, per tutta la durata della procedura.
  3. Smaltire correttamente tutti i materiali taglienti e a rischio biologico in conformità con i protocolli di sicurezza istituzionali per mantenere la conformità e salvaguardare tutto il personale di laboratorio.

2. Preparazione di vettori virali e animali

  1. Ottenere i vettori AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP conservati a -80 °C. Scongelare i vettori sul ghiaccio immediatamente prima dell'uso per preservarne l'integrità virale.
  2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico alla dose di 50 mg/kg. Confermare la profondità dell'anestesia testando i riflessi del piede posteriore prima di ulteriori azioni.
  3. Taglia i baffi per evitare interferenze con l'area chirurgica durante la procedura. Disinfettare l'orbita con una soluzione di iodio povidone al 20% per 2 s, quindi risciacquare abbondantemente con soluzione fisiologica sterile.
  4. Applicare una goccia di proparacaina allo 0,5% per via topica per ridurre al minimo il disagio e prevenire movimenti oculari involontari.

3. Manipolazione e iniezione intravitreale di vettori virali

  1. Trasferire 1 μL della soluzione AAV selezionata (AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP) in un pezzo di pellicola di paraffina pulita e preraffreddata per evitare fluttuazioni di temperatura che potrebbero influenzare l'attività virale.
  2. Aspirare la soluzione di AAV utilizzando una siringa di vetro Hamilton con ago smussato da 33 G sotto il microscopio chirurgico oftalmico.
  3. Posizionare il topo in decubito ventrale sotto il microscopio. Inclinare leggermente la testa per sollevare il lato oculare destinato all'iniezione. Regola e ottimizza l'ingrandimento del microscopio per identificare chiaramente la regione superiore dell'orbita del topo.
  4. Inserire l'ago 1-2 mm posteriormente al limbus al margine sclerale superiore dell'occhio nella cavità vitreale. Iniettare lentamente le soluzioni AAV per evitare il riflusso o danni indotti dalla pressione.
    NOTA: Posizione del sito di iniezione: Eseguire l'iniezione nel quadrante temporale superiore dell'occhio, circa 1 mm posteriormente al limbus. Scegliere questa posizione per evitare i principali vasi sanguigni e ridurre al minimo il rischio di danni alle lenti. Evitare i siti di iniezione troppo vicini al limbus per prevenire la penetrazione dell'iride o l'abrasione del cristallino. Evitare la vascolarizzazione: utilizzare un microscopio operatorio per esaminare attentamente il sito di iniezione pianificato per i vasi sanguigni visibili prima dell'iniezione. Se sono presenti imbarcazioni, regolare leggermente il punto di ingresso per evitarle. Inserire l'ago con un angolo poco profondo, parallelo all'iride, per ridurre ulteriormente il rischio di danni vascolari. Evitare iniezioni ripetute nella stessa area per ridurre il rischio di emorragia sottoretinica.
  5. Tenere l'ago in posizione per 30 secondi per consentire ai vettori di disperdersi all'interno della camera vitreale e depositarsi sulla superficie retinica, massimizzando così le possibilità di trasduzione riuscita.
  6. Estrarre lentamente l'ago per ridurre al minimo il rischio di riflusso del vitreo.
  7. Applicare un unguento antibiotico topico sul sito di iniezione subito dopo l'iniezione. Assicurarsi che l'unguento sia applicato in modo uniforme per coprire completamente la superficie oculare, prevenendo infezioni e infiammazioni oculari.
    NOTA: L'unguento antibiotico contiene 1 mg/g di desametasone, 3500 UI/g di neomicina solfato e 6000 UI/g di polimixina B solfato.
  8. Posiziona il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia e monitoralo attentamente per eventuali segni di angoscia o anomalie. Una volta che si sono completamente ripresi e non mostrano complicazioni, riportali nelle loro gabbie con accesso a cibo e acqua normali.

4. Imaging in vivo con CSLO

  1. Preparazione degli animali
    1. Selezionare il topo infetto da AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP dopo 4 settimane di iniezione intravitreale. Applicare una goccia di una soluzione oculare contenente lo 0,5% di tropicamide e lo 0,5% di fenilefrina sulla superficie dell'occhio per dilatare la pupilla a circa 2 mm di diametro22.
      NOTA: Si raccomanda un minimo di 4 settimane di intervallo di tempo di trasduzione dell'AAV per la marcatura fluorescente ottimale delle cellule retiniche dopo l'iniezione intravitreale13. Inoltre, nei nostri esperimenti di schiacciamento del nervo ottico (ONC), le retine sono state visualizzate a 4 settimane dopo l'infezione, nonché il giorno 7 e 14 dopo la lesione da schiacciamento. Questi punti temporali sono stati scelti per catturare sia l'espressione iniziale di AAV che la progressione dei cambiamenti retinici dopo ONC.
    2. Coprire la piattaforma di imaging con un pezzo del tampone di pulizia per evitare la possibile contaminazione di escrementi animali durante il processo operativo.
      NOTA: La piattaforma di imaging personalizzata offre ampio spazio per la pronazione dell'animale, garantendo stabilità e riducendo al minimo i movimenti durante il trattenimento manuale per un'acquisizione ottimale dell'immagine.
    3. Trasferire con cautela il mouse sulla piattaforma di imaging e attendere un periodo di acclimatazione di 2-5 minuti prima dell'imaging per ridurre al minimo lo stress e facilitare l'adattamento all'ambiente di imaging.
    4. Con l'assistenza di un secondo tecnico, trattenere delicatamente l'animale mantenendo uno stato di coscienza durante tutta la procedura. Fornire un intervallo di riposo di 10 s dopo 15 s di imaging per consentire l'ammiccamento degli occhi e mantenere l'umidità corneale.
      NOTA: Strofinare delicatamente la pelle del cuoio capelluto per indurre il sollevamento spontaneo delle palpebre, evitando l'uso di trattenute palpebrali forzate o dispositivi aggiuntivi come clip, riducendo così il rischio di lesioni agli occhi. L'anestesia generale non viene impiegata per preservare la chiarezza ottica durante sessioni di imaging prolungate, poiché ha il potenziale per esacerbare l'opacità transitoria della lente. Bilancia l'acquisizione di immagini di alta qualità con il comfort e la sicurezza degli animali durante tutta la procedura. Completa l'intera procedura entro 5 minuti per garantire il benessere dell'animale e mantenere la qualità dell'imaging.
    5. Regolare la postura della testa e allineare l'obiettivo della fotocamera regolando con precisione la manopola di messa a fuoco (Figura 1B) e il micromanipolatore (Figura 1C) per puntare la regione di interesse (ROI) per la successiva imaging in vivo .
  2. Configurazione del sistema
    1. Collegare un obiettivo grandangolare da 55° senza contatto sulla fotocamera per espandere il campo visivo dell'area del fondo oculare.
    2. Impostare la ruota portafiltri in posizione A (angiografia) per abilitare l'acquisizione della modalità di imaging con angiografia a infrarossi (IR) e fluorescente (FA) (Figura 1A). Accendere il laser e l'alimentatore per attivare il sistema di imaging CSLO.
    3. Apri il software Heidelberg Eye Explorer e crea un nuovo esame facendo clic sull'icona Nuovo paziente nella parte superiore della barra dei menu. Inserisci le informazioni pertinenti sull'animale e accetta la curvatura corneale predefinita di 7,7 mm nella finestra pop-up.
    4. Selezionare il pulsante giallo di avvio (Figura 1E) sullo schermo del pannello di controllo per avviare la modalità di imaging dal vivo.
  3. Imaging CSLO in vivo
    1. Selezionare la modalità IR (Figura 1G) con autofluorescenza a lunghezza d'onda di eccitazione di 820 nm sul pannello di controllo. Per ottenere immagini ad alta risoluzione, l'High Res. La modalità (HR) viene attivata tramite l'interfaccia della finestra o il pannello di controllo manuale (Figura 1F).
      NOTA: L'imaging a riflettanza infrarossa (IR) è in genere il primo passo dell'imaging oftalmico CLSO, acquisito prima dell'angiografia con fluoresceina (FA), per fornire una visione di base. Anche l'illuminazione, gli artefatti minimi e la messa a fuoco nitida sui principali vasi retinici sono fondamentali per l'affidabilità della messa a fuoco del piano z e il raggiungimento di immagini IR di alta qualità.
    2. Spostare l'obiettivo verso l'occhio del mouse utilizzando il joystick con il micromanipolatore XYZ per una regolazione fine. Esaminare la trasparenza ottica e ruotare la manopola della sensibilità (Figura 1D) in senso antiorario per ridurre la luminosità dell'immagine del fondo oculare al 40%-60%, evitando così la sovraesposizione del fondo oculare e migliorando la visualizzazione dei dettagli retinici.
    3. Regolare la manopola di messa a fuoco e il micromanipolatore fino a quando il disco ottico e i vasi retinici non sono identificati in modo univoco sul fondo oculare.
      NOTA: Criteri del piano focale ottimale: (1) Vista del fondo oculare illuminata in modo uniforme senza angoli scuri. (2) Illuminazione uniforme che circonda il disco ottico senza macchie scure focali o distorsioni. (3) Forma chiara del lume dei grandi vasi retinici con il movimento visibile del flusso sanguigno.
    4. Passa alla modalità FA (Figura 1H) con un laser blu a stato solido a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e un filtro barriera a 500 nm. Ruotare la manopola della sensibilità (Figura 1D) in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine del fondo oculare al 50%-107% per illuminare l'area retinica interessata.
    5. Impostare il valore medio ART (una barra blu in basso a sinistra dell'interfaccia software) su almeno 15 per migliorare il rapporto segnale/rumore. Questa funzione calcola la media di una serie di B-scan acquisiti nella stessa posizione, migliorando la qualità dell'immagine.
      NOTA: Sebbene un valore medio ART più elevato generalmente migliori la qualità dell'immagine attraverso la media, prolunga anche la durata della scansione. Questa durata prolungata potrebbe potenzialmente aumentare il rischio di disidratazione corneale e affaticamento degli animali, fattori che devono essere attentamente considerati, soprattutto nell'imaging degli animali da svegli.
    6. Riallinearsi al piano interno della retina, mirando in modo specifico alle RGC che esprimono GFP o alle cellule gliali di Müller. Vengono effettuate regolazioni di precisione per garantire un'illuminazione nitida della popolazione cellulare desiderata, come il soma RGC e gli assoni, o il corpo cellulare Müller. La sensibilità dell'imaging è bilanciata per ottenere una visualizzazione ottimale e prevenire la sovrasaturazione delle cellule GFP-positive.
      NOTA: Per ottenere le immagini con chiarezza e luminosità comparabili del segnale GFP, l'acquisizione della sensibilità dovrebbe essere costante per tutti i topi nell'esperimento.
    7. Premere la manopola della sensibilità (Figura 1D) per avviare la modalità ART, che genera un'immagine media in tempo reale online. Attendere che la barra blu (che rappresenta il valore medio ART) in basso a sinistra dell'interfaccia software abbia raggiunto il valore ART impostato (≥ 20 fotogrammi) e toccare il pulsante Acquisisci sull'interfaccia di controllo per acquisire le immagini del fondo oculare.
      NOTA: Per la modalità ART, l'eye-tracking è incorporato per compensare automaticamente i piccoli movimenti oculari durante l'imaging in vivo , consentendo una messa a fuoco costante sul piano focale retinico selezionato.
    8. Una volta acquisite le immagini desiderate, uscire dalla modalità ART premendo la manopola della sensibilità sul pannello touch.
      NOTA: Per prevenire l'essiccazione corneale e consentire l'ammiccamento spontaneo degli occhi, sono state implementate pause di 10 secondi ogni 15 secondi durante il processo di imaging.
    9. Per navigare tra le aree nasali e temporali della retina, muovere la testa della telecamera orizzontalmente mentre si osserva l'immagine dal vivo sullo schermo. Una volta raggiunta la regione di destinazione, regolare la messa a fuoco e avviare il processo di imaging come descritto nei passaggi 2.3.1-2.3.8.
      NOTA: Mantenere movimenti lenti e controllati della fotocamera garantendo un'illuminazione uniforme e brillante del fondo oculare. Se compaiono aree scure, utilizzare il micromanipolatore per regolare la posizione della telecamera verticalmente e ricentrare la retina.
    10. Per visualizzare la retina superiore, regolare delicatamente la postura della testa del mouse in una posizione a faccia in su. Inclinare moderatamente la testa della telecamera verso l'alto per allinearla con la regione retinica superiore. Regolare nuovamente la messa a fuoco secondo necessità e procedere con l'imaging.
    11. Al termine dell'imaging, tutte le regioni retiniche desiderate escono dalla finestra di acquisizione e le immagini vengono salvate automaticamente. Applicare un lubrificante topico sull'occhio dell'immagine per mantenere l'idratazione corneale.
    12. Per iniziare l'esame dell'occhio controlaterale, riposizionare l'animale sul lato opposto della piattaforma e ripetere i passaggi 2.3.1-2.3.11.

5. Elaborazione e analisi delle immagini

  1. Esportazione e preparazione delle immagini
    1. Aprire il software Heidelberg Eye Explorer e selezionare la sessione di imaging CSLO desiderata con una buona qualità. Scegli immagini singole o consecutive della stessa posizione retinica con impostazioni di sensibilità coerenti nel tempo.
    2. Escludete le immagini sfocate con scarsa messa a fuoco o chiarezza corneale, assicurandovi che per l'analisi vengano utilizzate solo immagini con una chiara visualizzazione delle strutture retiniche. Esporta queste immagini in formato TIFF per un'ulteriore elaborazione.
  2. Allineamento e ritaglio dell'immagine
    1. Raggruppa le immagini per occhio di topo in base alla stessa regione retinica.
      NOTA: Le immagini originali acquisite dal sistema CSLO vengono salvate nel seguente formato: TIFF, con una dimensione di 1536 x 1536 pixel, una risoluzione di 5,69 um/pixel e un valore ART di ≥15.
    2. Per gli esami di follow-up, importare le immagini in un software di elaborazione delle immagini adatto. Ruotare e allineare le immagini in base alle esigenze in modo che corrispondano all'orientamento dell'immagine di base. Quando salvate o esportate le immagini elaborate, utilizzate impostazioni che mantengano la massima qualità possibile dell'immagine per ridurre al minimo i potenziali artefatti di compressione.
    3. Allineare le immagini CSLO da una serie temporale dello stesso occhio ruotandole in modo che corrispondano alla rispettiva immagine di base utilizzando il sistema vascolare e il disco ottico come punti di riferimento.
      NOTA: Esamina attentamente ogni immagine allineata e, prima di procedere al ritaglio, assicurati che soddisfi i seguenti criteri: (1) Acquisizione completa della regione retinica: l'immagine deve comprendere completamente la regione retinica di interesse prevista, inclusi i punti di riferimento chiave come il disco ottico e i principali vasi sanguigni; (2) Assenza di artefatti da movimento: l'immagine deve essere priva di sfocature, striature o duplicazioni di strutture causate dal movimento degli occhi durante l'imaging; (3) Distorsione minima: l'immagine deve rappresentare accuratamente la struttura retinica senza deformazioni, stiramenti o artefatti di compressione che potrebbero derivare dagli angoli di imaging o dagli effetti dell'obiettivo. (4) Bilanciamento delle metriche di qualità dell'immagine: valutazioni dei livelli di rumore di fondo (deviazione standard delle intensità dei pixel in aree prive di struttura < 5 (scala 0-255)); rapporto segnale/rumore (SNR >20), coerenza dell'illuminazione (coefficiente di variazione tra sei quadranti dell'immagine <10%) e uniformità dell'immagine (coefficiente di variazione in regioni omogenee <15%).
    4. Seleziona l'immagine ruotata ed esportala in formato TIFF. Per ogni punto temporale, utilizzare lo strumento di ritaglio per selezionare e ritagliare in modo casuale 5-10 aree (300 x 300 pixel ciascuna) contenenti celle GFP positive dalle immagini di qualità approvata. Esporta ogni immagine ritagliata singolarmente in formato TIFF per ulteriori analisi.
  3. Misurazione dell'intensità della fluorescenza
    1. Aprite le immagini CSLO ritagliate (scala di grigi a 8 bit, 300 x 300 pixel) in ImageJ/Fiji.
    2. Per esaminare le variazioni complessive dei segnali fluorescenti, misurare l'intensità totale della fluorescenza per immagine ritagliata utilizzando Analizza > Misura (o Ctrl + M). Registra il valore "Media", che rappresenta l'intensità media di fluorescenza GFP dell'intera immagine ritagliata.
  4. Quantificazione RGC
    1. In ImageJ/Fiji, regolare la soglia di intensità delle immagini CSLO ritagliate utilizzando Image > Adjust > Brightness/Contrast (Regolazione luminosità/contrasto) per ottenere una visualizzazione ottimale dei singoli corpi di soma bianchi sullo sfondo nero.
      NOTA: Determinare una soglia personalizzata dopo aver esaminato il batch di immagini ritagliate o applicare un algoritmo di soglia coerente (ad esempio, il metodo5 di Huang in ImageJ/Fiji). Per il metodo di Huang: (1) Converti le immagini in scala di grigi a 8 bit (Tipo di > immagine > 8 bit). (2) Accedere allo strumento di soglia (Immagine > Regola > soglia). (3) Selezionare Huang come metodo di soglia. (4) Visualizza l'anteprima della segmentazione e fai clic su Applica. La soglia verrà calcolata automaticamente e visualizzata sull'istogramma dell'immagine.
    2. Attiva il plug-in Cell Counter e fai clic su ciascun soma RGC positivo per il conteggio. Registra il numero totale di celle contrassegnate nella regione analizzata. Ripetere questa procedura per tutte le immagini ritagliate da ciascun punto temporale di follow-up.
  5. Analisi dei dati
    1. Esporta i dati sulla conta delle cellule e sull'intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo o in un software statistico (ad esempio, GraphPad Prism).
    2. Eseguire test statistici appropriati sulla base del disegno sperimentale e delle ipotesi corrispondenti. Interpreta i risultati e concludi.

Risultati

Seguendo il protocollo presentato, diverse cellule retiniche sono state visualizzate e tracciate con successo in vivo utilizzando una combinazione di consegna genica mediata da AAV e CSLO. AAV2-hSyn-eGFP ha trasdotto efficacemente le RGC, determinando una robusta espressione di eGFP in tutta la retina, come confermato da CSLO e dalla colocalizzazione con il marcatore specifico per RGC, la proteina legante l'RNA con splicing multiplo (RBPMS), che si trova specificamente nello strato di cellule gangliari (Figura 2 e Figura 3). Il protocollo ha anche confermato la capacità di colpire la glia di Müller utilizzando AAV9-GfaABC1D-eGFP. La visualizzazione CSLO ha rivelato un'espressione diffusa di eGFP, in particolare all'interno degli strati retinici interni, in linea con il segmento di distribuzione principale noto della glia di Müller. Il segnale positivo alla GFP è anche altamente colocalizzato con il marcatore gliale di Müller glutammina sintetasi (GS), confermando ulteriormente la specificità di questo approccio (Figura 2E, F e Figura 3B). Questi risultati hanno riaffermato la versatilità della somministrazione genica assistita da AAV per lo studio di diversi tipi di cellule retiniche. Per confermare la capacità di colpire la glia di Müller, è stato utilizzato AAV9-GfaABC1D-eGFP. L'imaging CSLO ha rivelato un'espressione diffusa di eGFP, in particolare all'interno degli strati retinici interni, coerente con la distribuzione nota della glia di Müller (Figura 2E, F). Questo pattern di espressione selettiva è stato ulteriormente convalidato dall'alto grado di colocalizzazione osservato tra il segnale GFP e il marcatore gliale di Müller glutammina sintetasi (GS) (Figura 3B).

Per quantificare la specificità e l'efficienza dell'approccio di targeting virale sia per le RGC che per la glia di Müller, è stata eseguita un'analisi di colocalizzazione per confrontare la fluorescenza GFP con i marcatori standard di tipo cellulare (Figura 3B, D). Sono stati analizzati un totale di 6 occhi di topo. Per le RGC mirate con AAV2-hSyn-GFP, l'efficienza di trasduzione è stata del 64% ± 3%, mentre la specificità di trasduzione è stata del 68% ± 3%. Per la glia di Müller bersaglio con AAV9-GfaABC1D-GFP, l'efficienza di trasduzione è stata del 58% ± 2% e la specificità di trasduzione è stata del 71% ± 2%. Questi risultati dimostrano che questo approccio di somministrazione genica mediato da AAV consente la marcatura selettiva di tipi di cellule retiniche distinte, evidenziando la sua versatilità per lo studio dei processi cellulari e molecolari nella retina.

Per valutare l'idoneità di CSLO per il monitoraggio longitudinale delle perturbazioni delle cellule retiniche, è stato eseguito un modello transitorio di ONC in topi infetti da AAV2-hSyn-eGFP. Nell'arco di due settimane è stato osservato un progressivo declino del segnale eGFP e del numero di RGC (Figura 4). La sopravvivenza all'RGC è stata quantificata con tre metriche: intensità della fluorescenza CSLO, conta delle cellule in vivo per le immagini CSLO e conta RGC ex vivo delle cellule RBPMS-positive. Dopo l'elaborazione delle immagini come descritto nel passaggio 4, almeno 10 regioni di interesse (ROI) sono state ritagliate da ciascuna retina (6 occhi in totale), assicurando che ogni ROI comprendesse la stessa posizione retinica e mostrasse chiari segnali cellulari in ogni momento. L'intensità della fluorescenza CSLO è stata quindi quantificata misurando l'intensità media all'interno di ciascun ROI ritagliato in ogni punto temporale. In vivo, la conta cellulare è stata ottenuta contando manualmente le singole RGC GFP-positive all'interno dello stesso ROI ritagliato in ogni momento. Infine, le retine sono state raccolte per l'immunocolorazione RBPMS e le cellule RBPMS-positive sono state contate all'interno di 24 aree definite visualizzate per settore retinico per ciascuna retina. Sono state riscontrate correlazioni negative significative tra tutte e tre le metriche di sopravvivenza RGC (intensità di fluorescenza CSLO, conta cellulare in vivo e conta cellulare RBPMS-positive ex vivo ) e il tempo post-ONC (p < 0,001 per tutti, Figura 4C), dimostrando una progressiva perdita e degenerazione di RGC. È importante sottolineare che non sono state osservate differenze significative tra i diversi gruppi sperimentali in termini di densità iniziale di RGC o tasso di declino, indicando una coerenza grossolana nel modello ONC e nell'approccio di imaging. Questi risultati sono coerenti con studi precedenti sul danno da RGC dopo ONC e convalidano l'efficacia di questo protocollo basato su CSLO come strumento non invasivo e affidabile per il monitoraggio della salute dell'RGC.

Per studiare ulteriormente le proiezioni assonali RGC all'interno della via visiva, è stato utilizzato un approccio a doppia marcatura con la combinazione della marcatura eGFP mediata da AAV con la subunità B (CTB) della tossina del colera tracciante anterograda24. I topi hanno ricevuto un'iniezione intravitreale di CTB e sono stati sacrificati 2 giorni dopo per l'analisi istologica. La colocalizzazione dei segnali eGFP e CTB nei nervi ottici ha confermato il tracciamento positivo degli assoni RGC (Figura 5A). Per studiare ulteriormente i cambiamenti dei segnali dopo la lesione assonale, i topi sono stati sottoposti a schiacciamento unilaterale del nervo ottico (ONC), un modello di danno acuto RGC25. In breve, i topi sono stati anestetizzati e un nervo ottico è stato esposto e schiacciato a circa 1 mm dietro il globo utilizzando una pinza sottile per 5 secondi, inducendo una significativa assotomia RGC e successiva degenerazione. A seguito di lesione dell'ONC, è stata osservata una marcata riduzione dell'intensità di eGFP e CTB, indicando una sostanziale perdita di fibre nervose e un'interruzione del trasporto assonale. Ulteriori analisi delle sezioni cerebrali hanno rivelato proiezioni RGC al collicolo superiore (SC), una struttura mesencefalica coinvolta nell'integrazione sensomotoria e nei movimenti oculari, e al nucleo genicolato laterale (LGN), il centro primario di trasmissione delle informazioni visive alla corteccia visiva. Dopo l'ONC, è stata rilevata una diminuzione dell'intensità della GFP nel lato controlaterale della lesione (Figura 5B-E). Questi risultati dimostrano l'utilità di questo metodo per studiare la degenerazione assonale RGC e mappare i loro modelli di proiezione in vivo, offrendo una potenziale alternativa ai tradizionali metodi di tracciamento invasivo.

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Figura 1: Sistema di imaging per oftalmoscopio laser a scansione confocale (CSLO) e interfaccia del pannello di controllo per l'imaging retinico dal vivo. (A-D) Componenti del sistema di imaging: queste immagini rappresentano i componenti chiave del dispositivo HRA CSLO. (A) La leva del filtro è impostata sulla posizione "A" per l'imaging combinato con riflettanza infrarossa (IR) e angiografia con fluoresceina (FA). (B) La manopola di messa a fuoco regola la messa a fuoco fine dell'obiettivo. (C) Il micromanipolatore consente il posizionamento, l'allineamento e l'illuminazione precisi del fascio di luce verso la retina attraverso più gradi di libertà (ad esempio, assi X, Y, Z) e rotazione. (D) La manopola della sensibilità controlla la luminosità delle immagini IR e FA regolando l'amplificazione del segnale luminoso rilevato. Premendo la manopola si avvia la media dell'immagine, che combina più fotogrammi per ridurre il rumore e migliorare il rapporto segnale/rumore. (E-H) Interfaccia del pannello di controllo: gli screenshot mostrano il pannello di controllo CSLO con le impostazioni utilizzate per l'acquisizione e la visualizzazione delle immagini dal vivo. (E) Viene avviato il pannello di controllo dell'acquisizione. (F) Si consiglia la modalità ad alta risoluzione per una qualità dell'immagine ottimale. (G) Le impostazioni di imaging IR sono evidenziate, consentendo la visualizzazione delle strutture retiniche e dei vasi sanguigni. (H) Le impostazioni di imaging FA visualizzano le opzioni per l'imaging a fluorescenza a punto singolo e multipunto, consentendo il rilevamento di segnali fluorescenti all'interno delle cellule retiniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Imaging CSLO in vivo di cellule retiniche marcate in fluorescenza dopo trasfezione di AAV in topi C57. (A) La cronologia sperimentale dell'imaging longitudinale assistito da CSLO dopo la trasfezione di AAV nell'occhio di topo. (B) Immagini CSLO rappresentative delle regioni superiore e centrale di una retina di topo C57 dopo 4 settimane di espressione di AAV2-hSyn-eGFP. Barra della scala: 500 μm. (C) Un montaggio retinico cucito manualmente da (B) mostra la distribuzione delle cellule retiniche che esprimono eGFP. Barra della scala: 500 μm. (D) Un'immagine CSLO ingrandita dell'area inscatolata in (C) e la corrispondente immagine al microscopio confocale di un flatmount retinico. La colocalizzazione di eGFP (verde) con il marcatore RGC RBPMS (rosso) conferma l'espressione mediata da AAV nelle cellule gangliari retiniche (esempi cerchiati). Barra della scala: 50 μm. (E) Un montaggio cucito manualmente di una retina di topo C57 4 settimane dopo l'iniezione con AAV9-GfaABC1D-eGFP, che dimostra l'espressione di eGFP specifica per la glia di Müller. Barra della scala: 500 μm. (F) Un'immagine CSLO ingrandita dell'area inscatolata in (E) e la corrispondente immagine al microscopio confocale di un flatmount retinico. La colocalizzazione di eGFP (verde) con il marcatore gliale di Müller glutammina sintetasi (GS, rosso) conferma l'espressione mediata da AAV nelle cellule gliali di Müller (esempi cerchiati). Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Specificità del tipo cellulare della consegna genica mediata da AAV nella retina di topo. (A) Immunoistochimica di una sezione retinica e flatmount da topi C57 dopo 4 settimane di infezione da AAV2-hSyn-eGFP. La colocalizzazione della GFP (verde) con RBPMS (rosso) conferma l'espressione RGC-specifica. Barra della scala: 50 μm. (B) Quantificazione dell'efficienza e della specificità della trasduzione di AAV2-hSyn-GFP nelle RGC. L'efficienza è rappresentata come la percentuale di RGC RBPMS-positive che esprimono anche GFP nella flatmount retinica. La specificità è rappresentata dalla percentuale di cellule GFP-positive che sono anche positive per RBPMS nella sezione retinica (n = 6 occhi da 4 topi). (C) Colorazione in immunofluorescenza di una sezione retinica e flatmount da topi C57 dopo 4 settimane di infezione da AAV9-GfaABC1D-eGFP. La colocalizzazione della GFP (verde) con la GS (rosso) conferma l'espressione specifica della glia di Müller. Barra graduata: 50 μm. (D) Quantificazione dell'efficienza e della specificità di trasduzione di AAV9-GfaABC1D-GFP nella glia di Müller. L'efficienza è rappresentata come la percentuale di glia di Müller GS-positiva che esprime anche GFP nel flatmount retinico. La specificità è rappresentata dalla percentuale di cellule GFP-positive che sono anche positive per GS nella sezione retinica (n = 6 occhi da 3 topi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Monitoraggio longitudinale CSLO della sopravvivenza dell'RGC dopo schiacciamento acuto del nervo ottico (ONC) nei topi AAV2-hSyn-eGFP. (A) Un diagramma schematico della cronologia sperimentale del danno acuto del nervo ottico dopo l'infezione da AAV. (B) Imaging CSLO longitudinale della stessa retina in un topo AAV2-hSyn-eGFP al basale, 7 giorni e 14 giorni dopo l'ONC, visualizzando le RGC che esprimono segnali GFP. Immagini ingrandite delle aree boxed sono mostrate a destra, insieme a immagini rappresentative al microscopio confocale di flatmount retinici che dimostrano la morfologia e la distribuzione di RGC. Barre della scala: 100 μm. (C) La quantificazione della sopravvivenza dell'RGC nell'arco di due settimane dopo l'ONC è stata valutata misurando la variazione percentuale sia del numero di cellule che dell'intensità fluorescente del CSLO rispetto al basale (media ± SEM). Non sono state osservate differenze significative tra i gruppi in ogni punto temporale (ANOVA unidirezionale). L'analisi di regressione lineare ha rivelato correlazioni negative significative tra il tempo post-infortunio e le metriche di sopravvivenza RGC basate sulla fluorescenza GFP (r² = 0,945, p < 0,001), sulla colorazione RBPMS (r² = 0,888, p < 0,001), sulla conta delle cellule CSLO (r² = 0,511, p < 0,001) e sull'intensità della fluorescenza CSLO (r² = 0,7486, p < 0,001). n = 6 topi/gruppo/punto temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Mappatura assistita da AAV delle proiezioni assonali RGC lungo il percorso visivo. (A) Immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza di una coppia di nervi ottici da un topo AAV2-hSyn-eGFP, che dimostrano assoni RGC marcati con GFP (verde) e la colocalizzazione con il tracciante assonale anterogrado tossina B del colera (CTB, magenta). Il pannello superiore fornisce una panoramica dell'intero nervo ottico (barra della scala: 1000 μm), mentre il pannello inferiore offre viste ingrandite delle regioni scatolate (barra della scala: 100 μm). Due settimane dopo la lesione dell'ONC, sia i segnali GFP che CTB mostrano una marcata riduzione in tutto il nervo ottico (lato sinistro), indicando la perdita assonale e l'interruzione della RGC lungo la via visiva. (B) Proiezioni assonali RGC al collicolo superiore (SC). Le sezioni coronali del cervello di un topo AAV2-hSyn-eGFP 2 settimane dopo l'ONC evidenziano gli assoni RGC marcati con GFP (verde) e la colorazione CTB (magenta) all'interno del SC. Sinistra (L): SC controlaterale; Destra (R): SC omolaterale (lato lesionato ONC). Barra della scala: 1000 μm. (C) Una vista ingrandita della regione scatolata in (B) dimostra la colocalizzazione dei segnali GFP e CTB (immagine unita), evidenziando i fasci assonali RGC e i loro modelli di proiezione all'interno della SC. Barra della scala: 100 μm. (D) Proiezioni assonali RGC al nucleo genicolato laterale (LGN) dopo ONC, rivelando assoni RGC marcati con GFP (verde) e colorazione CTB (magenta) all'interno del LGN. Sinistra (L): LGN controlaterale; Destra (R): LGN omolaterale (lato lesionato da ONC). Barra della scala: 1000 μm. (E) Una vista ingrandita della regione boxed in (D) evidenzia i fasci assonali RGC e i loro modelli di proiezione all'interno dell'LGN. Barra della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo presentato descrive in dettaglio un metodo robusto e accessibile per la sorveglianza in vivo di specifiche popolazioni di cellule retiniche, sfruttando la potenza sia della consegna genica mediata da AAV che dell'imaging CSLO. Questo approccio offre diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, facilitando gli studi longitudinali della dinamica delle cellule retiniche e delle loro risposte a lesioni o malattie in condizioni fisiologiche o patologiche.

Il successo di questo metodo dipende da diversi passaggi critici. In primo luogo, il raggiungimento di un'efficienza ottimale di trasduzione dell'AAV è fondamentale per un'espressione robusta e specifica del reporter fluorescente nella popolazione cellulare bersaglio. Questo può essere influenzato da fattori come la selezione del sierotipo AAV, il titolo virale e la tecnica di iniezione 13,15,16. In secondo luogo, la corretta manipolazione e contenzione degli animali durante l'imaging CSLO sono essenziali per ridurre al minimo gli artefatti di movimento e mantenere la qualità dell'immagine. L'utilizzo di una piattaforma di imaging personalizzata e l'assenza dell'anestesia generale contribuiscono a ottenere una visualizzazione chiara e coerente delle strutture retiniche. In terzo luogo, è necessaria un'attenta ottimizzazione dei parametri di imaging CSLO, comprese le impostazioni di messa a fuoco, sensibilità e media, per ottenere immagini ad alta risoluzione con rumore minimo e un rapporto segnale/rumore ottimale26. Infine, per affrontare le potenziali limitazioni e garantire l'affidabilità dei dati, abbiamo implementato rigorose misure di controllo della qualità delle immagini e aumentato il numero di animali nel nostro disegno di studio.

Il sistema Spectralis HRA CSLO è dotato di tracciamento oculare automatico che migliora l'imaging clinico longitudinale. La sua funzione di tracciamento automatico in tempo reale (ART) può bloccarsi su una specifica area retinica durante l'imaging, riducendo gli artefatti di movimento. Per l'imaging clinico umano, il sistema include anche un algoritmo per il tracciamento a lungo termine della stessa posizione anatomica della retina27. Tuttavia, queste tecnologie non sono ottimizzate per gli studi sui roditori a causa delle significative differenze anatomiche tra gli occhi umani e quelli dei roditori. Gli occhi dei roditori sono molto più piccoli (3-4 mm di diametro rispetto ai 24 mm degli esseri umani) e mancano di alcuni punti di riferimento come la macula, presentando sfide uniche per il tracciamento automatizzato28. Di conseguenza, i ricercatori che studiano i modelli di roditori si affidano principalmente a metodi manuali, utilizzando punti di riferimento anatomici come i modelli dei vasi e la testa del nervo ottico per localizzare specifiche regioni retiniche e mantenere piani di imaging coerenti tra le sessioni13,22. Questo approccio è necessario non solo a causa dei punti di riferimento limitati negli occhi dei roditori, ma anche a causa di potenziali cambiamenti retinici sostanziali indotti da manipolazioni sperimentali, che potrebbero confondere i sistemi automatizzati non progettati per queste sfide specifiche. Pertanto, lo sviluppo di algoritmi specializzati di tracciamento oculare e allineamento per l'imaging retinico dei roditori rappresenta una direzione futura cruciale. In particolare, l'adattamento di algoritmi di tracciamento a lungo termine per l'uso di piccoli animali potrebbe migliorare significativamente la precisione e la riproducibilità degli studi longitudinali.

Mentre le tecniche istologiche tradizionali richiedono il sacrificio di animali e precludono studi longitudinali, questo metodo di imaging CSLO assistito da AAV offre un approccio non invasivo per il monitoraggio della dinamica delle cellule retiniche in vivo. Questo approccio si basa su lavori precedenti che dimostrano l'utilità dell'imaging cSLO per tracciare i cambiamenti longitudinali in specifiche cellule retiniche dopo lesioni, in particolare nei modelli animali che utilizzano la marcatura di proteine fluorescenti transgeniche 19,21,22,29. Questi studi hanno evidenziato la capacità di CSLO di visualizzare una serie di eventi delle cellule retiniche in vivo, tra cui la morte cellulare, la sopravvivenza e potenzialmente anche la migrazione o la crescita del processo. Questo protocollo estende l'applicazione di questa tecnica per studiare la trasduzione mediata da AAV di specifiche popolazioni di cellule retiniche, consentendoci di monitorare gli effetti a lungo termine della somministrazione di AAV e dell'espressione transgenica all'interno della retina e fornendo informazioni cruciali sulla progressione delle malattie retiniche e sull'efficacia degli interventi terapeutici. Le attuali valutazioni cliniche che utilizzano l'OCT si concentrano principalmente sulla perdita di assoni RGC misurando lo spessore dello strato di fibre nervose retiniche9, ma mancano della risoluzione per valutare la morfologia individuale di RGC o il coinvolgimento delle cellule gliali. Sebbene AO-SLO consenta l'imaging a livello cellulare nella retina umana vivente10, la sua complessità e la sua disponibilità limitata ne limitano l'uso principalmente in contesti di ricerca. Inoltre, la differenziazione dei tipi di cellule gliali all'interno di AO-SLO richiede spesso metodi di marcatura aggiuntivi30. Questo metodo supera queste limitazioni fornendo un approccio più completo e accessibile per la visualizzazione e il monitoraggio delle singole RGC e di altre popolazioni di cellule retiniche marcate in fluorescenza nel tempo. Ciò apre la strada per studiare le risposte cellulari in varie condizioni, aiutando nello sviluppo di terapie mirate. Inoltre, la combinazione dell'imaging CSLO assistito da AAV con l'optogenetica31 o l'imaging del calcio32 può approfondire ulteriormente la comprensione della funzione delle cellule retiniche e dei suoi ruoli nell'elaborazione visiva, nello sviluppo dei circuiti e nella rigenerazione.

Nonostante la forza di questo approccio, è necessario riconoscere alcune limitazioni e potenziali considerazioni sulla risoluzione dei problemi. Può verificarsi variabilità nell'efficienza di trasduzione dell'AAV, che richiede l'ottimizzazione dei parametri di iniezione o del titolo virale per specifici tipi di cellule o condizioni sperimentali. L'imaging CSLO può essere influenzato da fattori come le opacità corneali, l'instabilità del film lacrimale e i movimenti oculari, che richiedono un attento monitoraggio e regolazioni durante l'acquisizione dell'immagine. Inoltre, la limitata profondità di penetrazione di CSLO limita la visualizzazione agli strati retinici interni, escludendo potenzialmente strutture più profonde come i fotorecettori33. Il sistema Spectralis cSLO consente una chiara visualizzazione delle caratteristiche e dei modelli cellulari distinti all'interno della retina34. Sebbene questa modalità di imaging possa facilitare l'osservazione di singole cellule in determinate condizioni, come dimostrato in un precedente lavoro sulla visualizzazione di singole RGC in topi Thy1-YFP scarsamente marcati22, può porre sfide per la quantificazione di singole cellule in scenari densamente marcati. Ad esempio, in questo studio, la marcatura di massa delle RGC con eGFP a seguito di infezione retinica mediata da AAV può talvolta ostacolare la chiara visualizzazione delle singole cellule, in particolare nelle aree con variazioni nei livelli di espressione e sovrapposizione cellulare. Questa sfida è ulteriormente aggravata dall'imaging della glia di Müller, poiché la loro morfologia allungata, che copre l'intero spessore retinico35, rende difficile catturare una singola cellula all'interno di un singolo piano focale utilizzando cSLO. La valutazione dell'efficienza dell'infezione della glia di Müller mediata da AAV9, quindi, si basa principalmente sulla valutazione dei modelli di trasduzione e della distribuzione complessivi utilizzando l'imaging CSLO.

Inoltre, mentre la media ART nel sistema HRA migliora la qualità dell'immagine, l'aumento della durata della scansione presenta limitazioni pratiche, soprattutto nell'imaging di animali svegli. Il valore medio ART selezionato di 15 serve a bilanciare la qualità dell'immagine con il tempo di scansione, fornendo una riduzione del rumore sufficiente pur mantenendo una durata di scansione ragionevole. Per ridurre al minimo il disagio e lo stress degli animali, le procedure di imaging devono essere ottimizzate per l'efficienza, impiegando personale qualificato esperto nella manipolazione e nell'imaging di animali svegli e monitorando diligentemente gli animali per segni di disagio o secchezza corneale durante le sessioni di imaging. Queste misure sono state fondamentali per garantire sia la qualità dei dati che il benessere degli animali, evidenziando l'importanza di considerare entrambi i fattori quando si utilizza la media ART per l'imaging retinico in vivo in modelli animali svegli.

Riconoscendo queste limitazioni e le potenziali fonti di variabilità, i ricercatori possono adottare le misure appropriate per ottimizzare i protocolli di imaging, ridurre al minimo gli artefatti e garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei loro dati.

Nel complesso, questo metodo accessibile e facilmente implementabile offre un potente mezzo per studiare la complessa interazione tra RGC e glia di Müller, soprattutto in risposta a lesioni o malattie. Consentendo ai ricercatori di visualizzare e quantificare queste interazioni dinamiche, questo approccio facilita la scoperta di nuovi meccanismi cellulari e molecolari alla base delle patologie retiniche. Questo, a sua volta, fa luce sullo sviluppo di strategie terapeutiche mirate e sul miglioramento delle contromisure contro le malattie.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (82130029). La Figura 2A e la Figura 4A sono state create con BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago calibro 33Hamilton Corp., Reno, NV, USA7803-05Per iniezione intravitreale
0,5% proparacaina Fornitore verificato - Santen Pharmaceutical Co., Ltd.Anestetici topici
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., CinaTitolo del virus: 2,7 x 1012 genomi virali (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., CinaTitolo del virus: 4,5 x 1012 genomi virali (vg)/mL 
BetadineAzienda medica sana001651Antisettici topici
Pinze scelari corneali (dentate)Mingren Eye Instruments, CinaMR-F301APer la protezione delle palpebre durante l'iniezione intravitreale
Pinze Dumont 05 #FST51-AGT5385Per lo schiacciamento del nervo ottico
PrismaGraphPad Prism, USADisegno grafico e analisi statistica
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, GermaniaModalità"IR" e "FA" per l'imaging CSLO
Immagine J/FijiNational Institutes of Health, USAElaborazione delle immagini
Maxitrol unguento antibioticoAlcon Laboratories, INC. USA0065-0631Antibiotici topici
Siringa da microlitriHamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01Per iniezione intravitreale
Mydrin-P Soluzione oftalmicaSanten Pharmaceutical Co., Ltd, GiapponeDilatazione della pupilla
Microscopio chirurgico oftalmico Leica AG, Heerbrugg, SvizzeraM220Per operazioni chirurgiche
Pentorbarbitol SodiumSigma Aldrich, USA57-33-0Generical Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, USAAllineamento e ritaglio delle immagini
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, GermaniaLubrificante topico 

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