Questo documento descrive in dettaglio la progettazione, l'assemblaggio e il protocollo per un sistema di alimentazione automatizzato insieme a una modifica alternativa del coperchio e della gabbia che può essere implementata su gabbie standard per roditori con modifiche minime per esperimenti optogenetici o di fotometria delle fibre. Il sistema di alimentazione offre uno strumento economico per l'alimentazione temporizzata e/o la restrizione calorica.
Articolo metodologico
Un sistema fai-da-te per l'alimentazione programmata dei roditori da laboratorio nella loro gabbia domestica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il digiuno intermittente e la ricerca sull'influenza della restrizione calorica temporizzata sulla regolazione del peso corporeo e sugli esiti dell'invecchiamento sono di tendenza, sia nella società che in laboratorio. Per studiare l'alimentazione a tempo limitato e/o la restrizione calorica in laboratorio, le quantità di cibo assegnate vengono distribuite a intervalli di tempo programmati. L'attuale tecnologia per l'alimentazione programmata dei roditori prevede gabbie specializzate con porte di ingresso del cibo recintate, tramogge digitali bloccate nel tempo o consegna manuale del cibo. Le attrezzature specializzate per tali esperimenti possono essere costose e l'alimentazione manuale spesso richiede agli investigatori di intervenire a tarda notte/mattina presto, precludendo studi prolungati. Il sistema di alimentazione automatizzato qui descritto fornisce uno strumento economico per l'alimentazione temporizzata e/o la restrizione calorica che può essere implementata su gabbie standard per roditori con modifiche minime. Il protocollo utilizza un alimentatore automatico standard dotato di un coperchio standard per gabbie di microisolatori (coperchi di gabbie per topi, criceti, ratti o porcellini d'India) e può somministrare le porzioni di cibo desiderate a intervalli di tempo programmati nella gabbia domestica dell'animale. Il nostro design può essere modificato per accettare vari alimentatori o lievi variazioni nelle dimensioni della gabbia. Forniamo la progettazione, l'assemblaggio e il protocollo per il sistema di alimentazione insieme a una modifica alternativa del coperchio e della gabbia per esperimenti optogenetici o di fotometria in fibra legata.
Introduzione
Il digiuno intermittente è un'area importante della ricerca metabolica e sull'invecchiamento. Il corretto allineamento dell'alimentazione e del ritmo circadiano può alterare l'effetto della dieta sul peso corporeo 1,2,3,4. Inoltre, il digiuno intermittente prolungato è associato a una maggiore longevità e a un miglioramento dei disturbi legati all'età 5,6,7,8. Gli studi di ricerca che implementano protocolli di digiuno a lungo termine (>20 giorni) richiedono in genere attrezzature specializzate. Sebbene sia possibile consegnare il cibo manualmente per i protocolli di alimentazione programmati, ciò potrebbe richiedere la presenza di un investigatore in numerosi punti orari fuori orario per un periodo prolungato. Ad esempio, tre orari di alimentazione a distanza di 4 ore richiederebbero la consegna manuale alle 20:00, alle 12:00 e alle 4:00; probabilmente una sfida di conformità da sostenere per più di qualche giorno.
Le alternative alla consegna manuale del cibo per i roditori da laboratorio sono 1) gabbie specializzate con accesso automatizzato al cibo o 2) sistemi di tramogge digitali che forniscono un accesso automatizzato e programmato al cibo, come FED39. I sistemi di gabbia con accesso al cibo recintato sono costosi e alcuni non forniscono un ambiente domestico adatto per studi a lungo termine. Ad esempio, le tradizionali scatole di condizionamento operante sono in grado di eseguire la consegna automatizzata di cibo, ma hanno un pavimento in griglia metallica che non è favorevole per l'edilizia a lungo termine. Il sistema BioDAQ di Research Diets fornisce cibo e acqua tramite porte esterne gategate. I cancelli automatizzati programmabili consentono studi programmati a lungo termine sull'alimentazione o sull'abbeveraggio, tuttavia il sistema è un investimento costoso. I sistemi di tramoggia meccanizzati sono un altro strumento per i protocolli di alimentazione programmata automatizzata 9,10. Le due tramogge meccanizzate citate vengono fornite con l'avvertenza di ridurre lo spazio abitativo della gabbia domestica. Gli animali affamati con cibo limitato possono masticare gli apparecchi di alimentazione e/o i detriti della gabbia possono interferire con la meccanica della tramoggia per studi a lungo termine. Infine, una tramoggia meccanizzata sviluppata dal gruppo di ricerca Takahashi insieme a Phenome Technology è stata specificamente progettata per studi di alimentazione programmata a lungo termine3. In questo sistema, una tramoggia meccanizzata è posizionata sopra la griglia di una gabbia standard con uno scivolo che eroga il cibo. Il sistema Phenome, tuttavia, non fornisce flessibilità per gli animali legati a un cavo patch (esperimenti di optogenetica/fotometria delle fibre), ed è relativamente costoso rispetto all'apparato di alimentazione automatica qui descritto.
In risposta alle sfide prevalenti nei protocolli di alimentazione programmata, proponiamo un rimedio economicamente vantaggioso. Il nostro sistema automatizzato facilita la consegna precisa del cibo a intervalli predeterminati. Con una combinazione di parti stampate in 3D insieme a una mangiatoia automatica per pesci disponibile in commercio, ideiamo un sistema di alimentazione esterno fai-da-te (fai-da-te) che può essere equipaggiato su gabbie per roditori autonome che utilizzano parti superiori di microisolatori. Il sistema di alimentazione e le parti qui descritte possono essere applicati direttamente a una qualsiasi delle seguenti gabbie per roditori: topo, ratto, criceto o porcellino d'India, a condizione che le gabbie autonome utilizzino parti superiori di microisolatori. Poiché le gabbie variano in dimensioni, i posizionamenti possono variare leggermente, ma le staffe stampate in 3D, il sistema di alimentazione e il design esterno della bottiglia d'acqua sono generalmente applicabili alle gabbie per roditori autonome con coperchi per microisolatori.
Presentiamo un esempio di alimentatore automatico, ma sono disponibili molti altri alimentatori automatici standard che possono essere montati sul sistema modulare con lievi modifiche alle parti stampate in 3D. Per facilitare la regolazione del supporto stampato in 3D su alimentatori alternativi o lievi variazioni nelle dimensioni dell'ingessatura, dimostriamo un file SolidWorks tridimensionale modificabile con un file STL complementare.
Il posizionamento esterno dell'alimentatore automatico offre uno spazio completo all'interno della gabbia domestica e consente il distacco, la sterilizzazione e la ricarica o la sostituzione dell'alimentatore senza interrompere l'animale. Il sistema di alimentazione automatizzato è efficiente per registrazioni a lungo termine, conveniente e suscettibile di vari protocolli di alimentazione a tempo limitato e/o di restrizione calorica. Forniamo disegni tecnici dettagliati degli assemblaggi della gabbia, la progettazione e il protocollo per l'implementazione del sistema di alimentazione, insieme a dati di esempio. In secondo luogo, forniamo una serie di istruzioni per modificare la gabbia standard per l'uso dell'alimentatore automatico con animali che sono legati a un cavo patch per esperimenti optogenetici o di fotometria in fibra.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Massachusetts Amherst.
1. Montaggio dell'alimentatore automatico su un coperchio standard della gabbia del microisolatore (Figura 1)
- Utilizzando un utensile rotante con una rotella da 1,5", ritagliare un quadrato di 20 x 25 mm in un coperchio a gabbia per microisolatori. Posizionare l'apertura a 2,75 cm dal bordo del coperchio e centrata sopra la griglia (Figura 1B, a sinistra).
- Stampa in 3D una staffa per accoppiare l'alimentatore automatico sul coperchio della gabbia (Figura 1A e File supplementare 1). Agganciare la staffa al foro del coperchio della gabbia (passaggio 1.1; Figura 1B, al centro) e far scorrere l'alimentatore automatico sulla parte superiore della staffa fissata (Figura 1B [a destra], C).
Figura 1: Modifica e assemblaggio della staffa dell'alimentatore automatico e del coperchio della gabbia. (A) Disegno tecnico della staffa dell'alimentatore automatico (vedere i file SolidWorks/STL nel file supplementare 1 per la scala in 3D). (B) Da sinistra a destra, gabbia-top con foro 20 x 25 mm; staffa installata sulla parte superiore della gabbia e montata con alimentatore automatico Petbank. (C) Alimentatore automatico Petbank assemblato su gabbia con pellet di cibo lasciato cadere su una griglia standard con bottiglia d'acqua. Barre della scala = 25 cm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Programmazione e utilizzo dell'esempio di alimentatore automatico standard
- Per gli esperimenti a tempo, impostare prima i tempi di alimentazione e per ultimo l'orologio dell'alimentatore sincronizzato, poiché le regolazioni successive sposteranno l'ora dell'orologio.
- Assicurarsi che l'alimentatore sia sufficientemente carico. Tenere premuto il pulsante Impostazioni finché l'impostazione dell'ora sullo schermo non lampeggia.
- Continuare con l'impostazione dell'ora . Utilizzando le frecce su e giù, regolare l'ora sul primo periodo di alimentazione programmato desiderato.
- Impostare il numero di assegnazioni per questo punto temporale (indicato dal numero di punti accanto all'impostazione del feed). Ripetere i passaggi 2.2-2.4, per un massimo di altri due punti temporali.
- Caricare le camere dell'alimentatore automatico con le porzioni di cibo desiderate di ≤1,5 g di cibo standard per roditori. Se è necessario più cibo, impostare l'alimentatore in modo che fornisca più lotti in un determinato momento. L'alimentatore di esempio ha 16 camere.
NOTA: Il cibo può essere ordinato a misura o tagliato con le forbici. - Etichettare una camera con nastro adesivo o vernice per confermare la rotazione programmata della camera e l'erogazione del cibo. Controllare quotidianamente durante il funzionamento degli alimentatori.
3. Sistema di gabbia modificato per animali legati con l'alimentatore automatico
- Inserto di ricambio opzionale per animali legati a un cavo patch (Figura 2)
- Taglio laser di un pezzo di acrilico trasparente di 3 mm di spessore secondo le specifiche della Figura 2A (vedere anche il file supplementare 2). L'inserto in acrilico è progettato con linguette per agganciarsi alla parte superiore della gabbia. La fessura centrale (190 x 5 mm) consente il passaggio del cavo patch. Il foro quadrato da 20 x 25 mm si adatta alla staffa dell'alimentatore automatico; 20 fori di ventilazione consentono la circolazione dell'aria fresca.
- Utilizzando un cacciavite a testa piatta o uno strumento a cuneo, sollevare il coperchio superiore della gabbia perforata di un coperchio per microisolatore standard. Lavorare per sganciare le linguette dalle fessure delle linguette e rimuovere sia l'inserto perforato che la carta da filtro (Figura 2C, a sinistra e al centro).
- Sotto il piano forato e la carta da filtro è presente una griglia di supporto interna a coste. Utilizzare un utensile rotante e un disco da taglio da 1,5 pollici per rimuovere la griglia di supporto; seguendo gli indicatori a freccia mostrati al centro della Figura 2C. Dopo aver tagliato per rimuovere la griglia di supporto, limare per levigare il bordo tagliato.
- Inserire l'inserto della piastra acrilica di ricambio (passaggio 3.1) nella parte superiore della gabbia. Iniziare l'installazione facendo scorrere le linguette della piastra nelle fessure delle linguette lungo uno dei bordi corti e poi uno dei bordi lunghi e premere delicatamente finché la piastra non scatta in posizione (Figura 2C [a destra], D).
- Staffa esterna opzionale per bottiglia d'acqua per animali legata a un cavo patch (Figura 3)
- Praticare una porta per il sorseggiatore della bottiglia d'acqua: foro di 11 mm di diametro, a 50 mm dal pavimento, centrato sul bordo corto della gabbia (Figura 3B e File supplementare 3).
- Su entrambi i lati del foro centrale (± 27,5 mm), praticare due fori di 6 mm di diametro. Facoltativamente, utilizzare un punzone quadrato da 8 mm per praticare fori quadrati (mostrato nella Figura 3B).
- Stampa in 3D una staffa esterna per borraccia (Figura 3A e File supplementare 4). Montare la staffa della bottiglia d'acqua sul fondo della gabbia con i bulloni a testa tonda (2 cm di lunghezza, 6 x 1 mm o 0.75" di lunghezza 1/4 x 20; Figura 2B, C).
- Per una bottiglia d'acqua, montare una provetta conica standard da 50 ml, tappata con un gruppo sipper/tappo (tappo #7 con sipper curvo da 3-1/2", vedere la tabella dei materiali) sulla staffa esterna. Rabboccare l'acqua ogni 2-3 giorni.
Figura 2: Montaggio della piastra acrilica sulla parte superiore della gabbia. (A,B) Disegni tecnici della piastra acrilica e del tappo della porta di alimentazione. (C) Sinistra, parte superiore della gabbia standard con inserto forato e filtro. Centratura, rimozione dell'inserto forato e del filtro (la griglia rigata deve essere ritagliata lungo le linee indicate con la freccia). A destra, la lastra acrilica è scattata in posizione. (D) Montaggio completo del coperchio. Barre della scala = 25 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Assemblaggio della staffa della bottiglia d'acqua. (A) Disegno tecnico della staffa della bottiglia d'acqua stampata in 3D. (B) Modifiche alla gabbia e montaggio della staffa della bottiglia d'acqua; (C) Staffa installata; (D) Assemblaggio completo della gabbia. Barre della scala = 10 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Riepilogo dell'assemblaggio completo della gabbia con l'alimentatore automatico. (A) Gabbia standard con griglia metallica, (B) gabbia modificata per animali legati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Uno studio di restrizione calorica (21 giorni) per indurre l'infertilità in topi femmina (design dell'alimentatore automatico e della gabbia, Figura 4A)
La carenza cronica di energia è sufficiente a inibire la fertilità nei mammiferi, una risposta che si conserva sia nei roditori che nell'uomo 11,12. In questo studio, utilizziamo la restrizione calorica per indurre la perdita di peso corporeo a lungo termine. Topi...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Nei modelli animali preclinici, la restrizione calorica è un potente strumento sperimentale per manipolare e studiare con precisione il metabolismo. La perdita di peso sostenuta ha implicazioni nell'obesità, nel diabete, nell'invecchiamento, nella fertilità e nella menopausa (un tipo di invecchiamento riproduttivo), tutti importanti endpoint traslazionali. I paradigmi di restrizione calorica, tuttavia, possono essere difficili da sostenere per un tempo prolungato. In questo manoscritto, ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Jason Lê è supportato dal programma di formazione alla ricerca post-diploma di maturità finanziato dal National Institutes of Health.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| # 7 Tappo con 3-1 / 2 "tubo sorso curvo senza palla | Labex | 2067 | |
| AN75 fondo della gabbia del mouse | Ancare | AN75HT | |
| Alimentatore automatico per pesci per acquario | Petbank-tek.com | distribuzione Amazon (#B0BRCWP16K) | |
| Microfiltro per roditori Tappi in | Ancare | N10MBTPLF | |
| , un foro | United Scientific | S24009 | |
| cibo per roditori standard | Prolab IsoPro 3000 |
Riferimenti
- Arble, D. M., Bass, J., Laposky, A. D., Vitaterna, M. H., Turek, F. W. Circadian timing of food intake contributes to weight gain. Obesity (Silver Spring). 17 (11), 2100-2102 (2009).
- Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metab. 15 (6), 848-860 (2012).
- Acosta-Rodriguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metab. 26 (1), 267-277.e2 (2017).
- Gallop, M. R., Tobin, S. Y., Chaix, A. Finding balance: understanding the energetics of time-restricted feeding in mice. Obesity (Silver Spring). 31 (Suppl 1), 22-39 (2023).
- Hua, L., et al. Time-restricted feeding improves the reproductive function of female mice via liver fibroblast growth factor 21. Clin Transl Med. 10 (6), e195(2020).
- Strilbytska, O., Klishch, S., Storey, K. B., Koliada, A., Lushchak, O. Intermittent fasting and longevity: From animal models to implication for humans. Ageing Res Rev. 96, 102274(2024).
- Di Francesco, A., Di Germanio, C., Bernier, M., de Cabo, R. A time to fast. Science. 362 (6416), 770-775 (2018).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian rhythms, and time-restricted feeding in healthy lifespan. Cell Metab. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Matikainen-Ankney, B. A., et al. An open-source device for measuring food intake and operant behavior in rodent home-cages. Elife. 10, e66173(2021).
- Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of rhythmic food intake in mice using a custom-made feeding system. J Vis Exp. (190), (2022).
- Kreisman, M. J., Tadrousse, K. S., McCosh, R. B., Breen, K. M. Neuroendocrine basis for disrupted ovarian cyclicity in female mice during chronic undernutrition. Endocrinology. 162 (8), ebqab103(2021).
- Allaway, H. C., Southmayd, E. A., De Souza, M. J. The physiology of functional hypothalamic amenorrhea associated with energy deficiency in exercising women and in women with anorexia nervosa. Horm Mol Biol Clin Investig. 25 (2), 91-119 (2016).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Chen, Y., Lin, Y. C., Kuo, T. W., Knight, Z. A. Sensory detection of food rapidly modulates arcuate feeding circuits. Cell. 160 (5), 829-841 (2015).
- Mandelblat-Cerf, Y., et al. Arcuate hypothalamic AgRP and putative POMC neurons show opposite changes in spiking across multiple timescales. Elife. 4, e07122(2015).
- Kahnau, P., et al. A systematic review of the development and application of home cage monitoring in laboratory mice and rats. BMC Biol. 21 (1), 256(2023).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rhythms in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 271-281 (2015).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso