Articolo metodologico

Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 maggio 2025

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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L'arricchimento e il sequenziamento del DNA nascente associato alle proteine (eSPAN) sono stati sviluppati per rilevare l'abbondanza relativa di una proteina associata alla cromatina su due filamenti di DNA replicanti, rivelando così una comprensione molecolare della replicazione della cromatina e dei suoi processi accoppiati. Questo protocollo descrive le procedure eSPAN nelle cellule staminali embrionali (ES) di lievito e topi.

Abstract

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La duplicazione del genoma è orchestrata da proteine replisome, incluse le elicasi, che srotolano il DNA doppio filamento in singoli filamenti antiparalleli singoli, ognuno dei quali richiede modalità di replicazione distinte: continua (in precedenza) e discontinua (lagg). Comprendere le interazioni delle proteine associate alla cromatina con i filamenti di DNA replicanti in vivo è fondamentale per chiarire i meccanismi di assemblaggio della cromatina e riparazione del DNA accoppiati alla replicazione del DNA. Questo protocollo presenta il metodo di arricchimento e sequenziamento del DNA nascente associato alle proteine (eSPAN), progettato per quantificare i livelli relativi di proteine sui filamenti di DNA nascenti e in ritardo nei fork di replicazione. La procedura eSPAN inizia con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP, nel lievito) o scissione sotto bersagli e etichettatura (CUT&Tag; nelle cellule di mammifero) di una proteina di interesse, seguita dall'arricchimento del DNA nascente associato alla proteina tramite immunoprecipitazione di bromodeossiuridina (BrdU). Il sequenziamento di nuova generazione specifico per filamenti viene applicato al DNA ssDNA isolato. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare se una proteina è arricchita a forchette di replicazione in testa o in ritardo. L'eSPAN fornisce la preferenza per il filamento genomico delle proteine associate alla cromatina, inclusi gli istoni ai fork di replicazione.

Introduzione

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Negli organismi eucarioti, la duplicazione genomica viene avviata da più siti chiamati origini di replicazione, dove il complesso di riconoscimento delle origini (ORC) si lega e avvia la macchina proteica di reclutamento, inclusa l'elicasa CMG, per iniziare la replicazionedel DNA 1. La macchina a risposta in ciascuna origine di replicazione forma due forche di replicazione che si muovonobidirezionalmente 2,3. Le forchette di replicazione gemelle replicano i due fili genitori di DNA attraverso la sintesi continua del filamento principale e la sintesi discontinua del filamento ritardato. Data questa natura asimmetrica di ogni forchetta di replicazione, i componenti di replicazione, inclusi i DNA polimerasi sui filamenti anteriori e rallentativi, sono diversi. Analisi genetiche precedenti basate su DNA polimerasi mutanti dimostrano che DNA Pol ε e DNA Pol δ sono le principali polimerasi responsabili rispettivamente della replicazione della catena che della fase di ritardo e della ritardata. Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare la preferenza per il filamento della DNA polimerasi, tra cui Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 ed emRiboSeq o RiboSeq 9,10. Questi metodi genetici per dissezionare la specificità del filamento sono limitati alle DNA polimerasi e richiedono l'introduzione di mutazioni su ciascunaproteina 4,5,11,12. Tracciare l'associazione di qualsiasi proteina bersaglio con filamenti anteriori e rallentati delle forchette di replicazione del DNA fornirà preziose informazioni sulla replicazione del DNA. In questo impegno, abbiamo inizialmente sviluppato la tecnica eSPAN (arricchimento e sequenziamento del DNA nascente associato a proteine, Figura 1) nelle cellule di lievito. Come studio proof-of-principle, abbiamo inizialmente mostrato che Pol δ e Pol δ sono arricchiti rispettivamente su filamenti anteriori e ritardati. Abbiamo inoltre scoperto la preferenza per il filamento dei componenti chiave della replicazione del DNA, inclusa l'elicasa replicativa del DNA, la proteina di legame al DNA a filamento singolo (proteina di replicazione A), la lampada antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA) e il suo fattore di replicazione del loader C (RFC)13. È importante sottolineare che noi e altri abbiamo utilizzato questo metodo per scoprire i meccanismi del trasferimento degli istoni genitoriali, un processo che è stato insolvibile per oltre 4 decenni14, 15, 16, 17.

Il metodo eSPAN prevede due passaggi sequenziali: l'arricchimento della proteina bersaglio tramite ChIP18 o CUT&Tag 19 e l'arricchimento del DNA nascente associato alla proteina tramite immunoprecipitazione BrdU. In un ceppo standard di lievito (W303 o S288C), BrdU o EdU extracellulari non possono entrare nelle cellule e incorporarsi nei cromosomi. Questi ceppi non dispongono di un appropriato trasportatore nucleosidico per l'assorbimento della timidina né della timidina chinasi necessaria per fosforilare la timidina in TMP, che converte BrdU (o EdU) in BrdUMP (EdUMP). L'espressione del trasportatore nucleosidico equilibrativo umano 1 (hENT1) e del virus dell'herpes simplex timidina chinasi (HSV-TK) aumenta l'assorbimento della timidina e la conversione di BrdU (o EdU) in BrdUMP (EdUMP)20. Pertanto, per eseguire l'esperimento eSPAN sul lievito, i ceppi dovevano essere inseriti con una struttura BrdU-Incorporante (BrdU-Inc) (HSV-TK e hENT1)13,21.

In precedenza, fornivamo il protocollo eSPAN per le proteine di replicazione del DNA nellievito 22. Recentemente, abbiamo integrato il metodo CUT&Tag nel protocollo eSPAN nelle cellule di mammifero per affrontare passaggi tecnicamente complessi che richiedono ottimizzazione, come il cross-linking, lo shear della cromatina e per minimizzare il numero di celluleiniziali 17,23. Qui, abbiamo fornito l'eSPAN degli istoni per la visualizzazione utilizzando cellule di lievito (Figura 2). Questo metodo è utilizzato principalmente per analizzare la distribuzione delle forme modificate di istones sui filamenti di DNA replicanti. Mentre testavamo diversi segni di itoni, abbiamo usato come esempio H3K4me3, un marchio sull'istoria parentale H3. Per analizzare i componenti e i fattori dei risponditori coinvolti nella riparazione del DNA ai fork di replicazione, raccomandiamo di tagliare la cromatina in piccoli frammenti tramite sonicazione, come descritto nella nostra primapubblicazione 22. Per le cellule di mammiferi, abbiamo adottato le procedure modificate Cut&Tag per sostituire il passaggio ChIP descritto nellievito 23. Questa modifica riduce la quantità di materiale di partenza (cellule) e, cosa più importante, consente la generazione di librerie eSPAN per il sequenziamento senza l'uso di kit di preparazione del DNA a singolo filamento. Per il protocollo del lievito, abbiamo scelto di non usare il metodo Cut&Tag perché la quantità di materiale di partenza era sufficiente. Ancora più importante, abbiamo riscontrato che le procedure Cut&Tag non erano costantemente efficaci per le cellule di lievito nelle nostre mani.

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Protocollo

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NOTA: Per le linee guida per la preparazione di tamponi e reagenti, vedi le linee guida per la preparazione di tamponi e reagenti (File Supplementare 1).

1. Histone eSPAN nel lievito in germogliamento

NOTA: La maggior parte dei ceppi di lievito non dispone di un trasportatore di nucleosidi funzionante per l'assorbimento della timidina. Per etichettare efficacemente il DNA con BrdU o EdU per eSPAN, è necessario un ceppo21 positivo alla timidina chinasi (TK+). Inoltre, solo ceppi di lievito di tipo 'A' possono essere utilizzati per l'arresto del ciclo cellulare usando fattore alfa.

  1. Sincronizzazione delle cellule del lievito e marcatura BrdU (8 h)
    1. Inoculare una singola colonia di ceppo di lievito appropriato (TK+) in 10 mL di substrato YPD e coltivare a 30 °C su un incubatore agitato durante la notte a 220 giri/min.
    2. Misurare la densità ottica, OD600 nm, con uno spettrofotometro e diluire la coltura in 200 mL freschi di mezzo YPD con OD600 ~0,2-0,3.
    3. Fai crescere la coltura fino a OD600 ~0,4-0,5 (di solito ci vogliono 3-4 ore) a 30 °C in un incubatore a scuotimento a 220 giri al minuto.
    4. Aggiungere 300 μL di fattore α (5 mg/mL) e coltura per 1,5 ore a 25 °C, 220 rpm.
    5. Aggiungi un'altra dose di 300 μL di fattore α (5 mg/mL) e fai crescere per un'altra 1,5 ore a 25 °C, 220 rpm.
    6. Preparare la soluzione di fissazione al 37,5% di paraformaldeide e preriscaldare il mezzo (200 mL YPD +HU (idrossiurea)+ BrdU) a 30°C durante la sincronizzazione cellulare.
      ATTENZIONE: Maneggiare il BrdU con cautela, poiché si tratta di un potenziale mutageno e teratogeno. Prepara una soluzione di paraformaldeide al 37,5% in una cappa chimica per evitare l'esposizione a fumi nocivi, poiché il paraformaldeide è un potenziale cancerogeno.
    7. Controlla la morfologia delle cellule (a forma di barra) con un microscopio laser per assicurarti che almeno il 90% delle cellule del lievito sia nella fase G1 15 minuti prima dell'arresto G1 dopo 3 ore. In alternativa, eseguire un'analisi di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per confermare l'arrestoG1 24.
      NOTA: Controlla la morfologia cellulare e conferma l'arresto G1 (90% con una forma a barra) in questo passaggio.
    8. Raccogliere le celle (pellet) tramite centrifugazione a 1600 g per 5 minuti a 4 °C e lavare due volte il pellet cellulare con 20 mL di acqua fredda doppiamente distillata.
    9. Risospendere le celle in 200 mL di YPD +HU+ BrdU preriscaldati (30 °C).
      NOTA: Lo scopo del rilascio di HU è garantire che la maggior parte delle cellule di lievito si trovi nella fase S di replicazione precoce, il che migliorerà la consistenza e garantirà la riproducibilità dei risultati. Omettere l'HU è accettabile se è necessario lavorare con cellule di fase logarithmica.
    10. Coltivare le cellule su un incubatore a 30 °C, 220 giri/min per 45 minuti.
      NOTA: L'analisi FACS può essere effettuata per confermare la fase S iniziale. Per l'analisi FACS, è importante includere un campione log-phase come controllo per definire accuratamente la popolazione di cellule G1. Per un'incorporazione efficiente di BrdU, è vantaggioso iniziare con cellule a rapida crescita. Alcuni mutanti con difetti di crescita lenti tendono a mostrare scarsa efficienza di marcatura del BrdU. L'efficienza dell'incorporazione e delle prestazioni di BrdU di BrdU-IP viene valutata tramite PCR quantitativa confrontando le regioni replicate enon replicate 22 utilizzando DNA isolato dallo step 1.6.7.
  2. Fissazione e raccolta del campione (1 h)
    1. Aggiungi 6 mL di paraformaldeide al 37% appena preparati fino a una concentrazione finale dell'1%, miscela bene e incuba a 25 °C per 20 minuti con una lieve agitazione, 90 giri al minuto.
    2. Raffredda la fissazione aggiungendo 12 mL di glicina da 2,5 M, mescola bene e incuba a 25 °C per 5 minuti con una lieve agitazione a 90 giri/min.
    3. Mettere le cellule a 1600 g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Poi, lava le cellule due volte con 20 mL di acqua fredda centrifugando a 1600 g per 5 minuti.
    4. Raccogli le celle in tubi a tappo a vite da 2 mL (50 mL di cellule/tubo) e conservale a -80 °C.
      NOTA: Le celle possono essere conservate fino a un anno (punto di pausa).
  3. Lisi cellulare del lievito e frammentazione della cromatina (5 h)
    1. Scongelare i pellet cellulari, risospendere con un vortice delicato e lavare con 0,4 mL di tampone di lisi ChIP con inibitori proteasi e miscela antibiotica (prevenendo la crescita di batteri contaminanti) e centrifugare a 5.000 g per 1 minuto.
    2. Aggiungi 0,1 mL di tampone di lisi ChIP contenente inibitori della proteasi e una miscela antibiotica, seguita da circa 100 μL di perle di vetro (0,5 mm).
    3. Liso con la perla battendo per 3 cicli (30 secondi acceso/spegnito, 1 minuto spento) in una stanza fredda a 4 °C.
    4. Fai i fori sul fondo del tubo con un ago caldo da 16 G.
      NOTA: Per mantenere l'ago caldo, cerca di tenere il tubo vicino al fuoco.
    5. Raccogli il lisato annidando il tubo in un tubo vuoto di 1,5 mL con basso legame di DNA e centrifuga a 1600 g per 2 minuti, RT.
    6. Aspirare il sovrandanante con attenzione senza disturbare la pellet (la cromatina sarà nella frazione di detriti cellulari).
      ATTENZIONE: Fai attenzione a non aspirare accidentalmente il pellet cellulare quando usi l'aspirapolvere.
    7. Risospendere i pellet cellulari pipettando 0,35 mL di MNase Digestion Buffer integrato con 0,5 mM di spermidina e 0,1 mM di 2-mercaptoetanolo.
    8. Aggiungi 10 unità di MNase alle reazioni, mescolale delicatamente invertendo 4-6 volte immediatamente e incuba a 37 °C a bagno d'acqua per 20 minuti.
      NOTA: Le condizioni digertive dovrebbero essere ottimizzate per ogni lotto di enzima MNasi per arricchire frazioni mono-, di- o tri-nucleosomi.
    9. Temprare la digestione della MNasi aggiungendo 5 μL di 0,5 M EDTA per una concentrazione finale di 10 mM EDTA. Mescolali delicatamente per inversione e lascia i tubetti subito nel ghiaccio per almeno 30 minuti.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte in questa fase. Le condizioni di digestione della MNasi dovrebbero essere ottimizzate per ottenere la maggior parte delle frazioni mono-, di- o tri-nucleosomi (140-450 pb)
    10. Sonica la miscela di reazione con microtubi bioruptori (1,5 mL) per 3 minuti (alta potenza, 30 secondi acceso/spento). Gira a 10.000 g per 5 minuti a 4 °C.
      NOTA: Questa breve sonicazione aiuta a rilasciare la cromatina nel buffer.
    11. Trasferisci il soprantantante in nuovi tubi e fai girare altri 10 minuti a 10.000 g a 4 °C.
    12. Raccogli il soprantantante (circa 400 μL), conserva 30 μL del campione come DNA di input e congela a -20 °C. Usa il lisato cellulare rimanente (~370 μL) nella prossima immunoprecipitazione della cromatina (passo 1.4.1).
  4. Immunoprecipitazione della cromatina istonetica (durante la notte)
    1. Aggiungere 0,5 μg di anticorpo H3K4me3 al lisato e al nutato sul rotore, 10 giri/min a 4 °C durante la notte.
      NOTA: Qui si usa H3K4me3 come esempio. La quantità di anticorpi dovrebbe essere testata sperimentalmente.
    2. Girare a 15.800 × g per 10 minuti a 4 °C e trasferire il sovrantantante in un nuovo tubo da 1,5 mL.
    3. Aggiungere 20 μL di sfere di proteina G Sepharose prelavate (3 volte lavate con tampone di lisi ChIP, nutare sul rotore per 3 minuti ciascuna, raccogliere le sfere centrifugando a 350 × g, 4 °C) e incubare a 4 °C per 2 ore.
    4. Centrifuga a 350 × g a RT e lava le perline secondo il seguente ordine.
      1. Lava due volte con 1 mL di tampone di lisi gelida per 3 minuti ogni volta a rotazione a 10 giri su un rotatore in RT.
      2. Lava una volta con 1 mL di tampone di lisi gelida e 0,5 M di NaCl buffer per 3 minuti a rotazione a 10 giri su un rotatore a RT.
      3. Lava una volta con 1 mL di tampone di lavaggio Tris/LiCl freddo per 3 minuti ruotando a 10 giri su un rotatore a RT.
      4. Lava uno con 1 mL di tampone di lavaggio RT Tris/EDTA (non tampone TE, Supplementary File 1 per la ricetta). Elimina tutto il liquido possibile dal pellet con un ago da 16 G e mezzo.
  5. Estrazione del DNA (2 h)
    1. Aggiungere 0,1 mL di resina chelante ben miscelata al 10% per l'estrazione del DNA alle perle lavate (dal passo 1.4.4.4), al campione di input (dal passaggio 1.3.12) e al vortice.
    2. Fai bollire per 10 minuti su un blocco riscaldante a 100 °C, poi raffredda a RT per fare il cross-link.
      NOTA: Le clip di bloccaggio stop-pop per i tubi delle centrifughe sono fortemente raccomandate per mantenere la tenuta di chiusura.
    3. Aggiungi 5 μL di 20 mg/mL proteasi K alle sfere e incuba a 55 °C per 30 minuti scuotendo a 400 giri/min.
    4. Far bollire le sfere su un blocco termico a 100 °C per altri 10 minuti per inattivare l'attività della proteasi K.
      NOTA: Le clip di bloccaggio stop-pop per i tubi delle centrifughe sono fortemente raccomandate per mantenere la tenuta di chiusura.
    5. Fai girare le perline a 6000 g per 2 minuti a RT e conserva il soprandante.
    6. Aggiungi 100 μL di 2XTE al pellet. Vortice e spin down a 6000 g per 2 minuti a RT.
    7. Mescola e salva i soprantativi (dai passaggi 1.5.5 e 1.5.6) sopra (circa 180 μL).
    8. Purificare campioni di 30 μL in 18 μL di tampone di eluzione (EB, fornito con kit di purificazione PCR) utilizzando colonne di purificazione del DNA per la preparazione della libreria ssDNA (dal passo 1.3.12 come input e dal passo 1.5.7 come campioni H3K4me3 ChIP-seq).
      NOTA: i campioni di DNA possono essere conservati a -20 °C per un massimo di un mese (punto di pausa).
  6. Immunoprecipitazione BrdU (5 h)
    1. Bollire i campioni (circa 150 μL in ingresso e H3K4me3 ChIP dal passo 1.5.7) per 5 minuti su un blocco termico a 100 °C, e raffreddare immediatamente nel ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 15 μL di 10x PBS e +1,35 mL di buffer IP BrdU + 0,5 μL di anti-BrdU Ab + 1 μL di tRNA di E.coli (10 mg/mL).
      NOTA: Questo è un passo fondamentale. Usa i tubi centrifughe a basso legame al DNA per evitare il legame non specifico al DNA.
    2. Fare nutate per 2 ore su un rotore a 4 °C a 10 giri/min.
    3. Trasferire la miscela in un tubo da 1,5 mL contenente 20 μL di sfere proteiche G Sepharose (lavate tre volte con 1 mL di buffer IP BrdU e ruotare per 3 minuti ciascuno a 10 giri per ogni lavaggio a RT) e nutare per 1 ora a 4 °C sul rotore a 10 giri/min.
    4. Centrifuga a 800 × g per 1 minuto a RT e lava secondo quanto segue: tre volte con 1 mL di buffer IP BrdU freddo, 3 minuti su un rotore e una volta con 1 mL di buffer TE per 3 minuti.
    5. Gira a 800 × g per 1 minuto a RT e aspira il soprantantante.
    6. Aggiungi 100 × μL di TE + 1% di SDS buffer nelle perle rimanenti. Incuba a 65 °C per 5 minuti. Gira a 800 × g per 1 minuto a RT.
    7. Purificare il soprantantante in 18 μL di EB utilizzando colonne di purificazione del DNA (campione BrdU IP e H3K4me3 eSPAN).
      NOTA: Usa i tubi centrifughe a basso legame per evitare il legame non specifico del DNA. I campioni di DNA possono essere conservati a -20 °C per un massimo di un mese (punto di pausa).
  7. Preparazione e sequenziamento della libreria ssDNA (3 h)
    1. Preparare le librerie di DNA a singolo filamento con 15 μL di input purificato, BrdU IP, H3K4me3 ChIP ed eSPAN (passaggi 1.5.8 e 1.6.7) (inclusi i passaggi di adaptase, estensione e legazione) secondo i manuali forniti da ssDNA e il kit di preparazione della libreria di DNA a basso input e purificare il prodotto di ligatura ottenuto in 20 μL di buffer di eluzione a basso EDTA (fornito da DNA Library Prep Kit).
      NOTA: Ci sono due fasi di purificazione della legatura con il kit. Questo protocollo segue la procedura a 200 bp, <1 ng.
    2. Amplificare la libreria di DNA utilizzando un mix di reazione totale da 50 μL (reagenti forniti dal kit di preparazione della libreria ssDNA): 20 μL di libreria di DNA purificata, 4 μL di reagente W2, 10 μL di reagente W3, 1 μL di enzima W4, 1,5 μL di primer Indexes I7 (10 μM, vedi Sequenza Oligo Supplementare) e 1,5 μL di primer Indice I5 (10 μM, vedi Sequenza Oligo Supplementare), 16 μL di ddH2O priva di DNasi. Riscaldare la miscela PCR a 98 °C per 30 secondi, seguiti da 18 cicli da 10 secondi a 98 °C, 30 secondi a 60 °C, 1 minuto a 68 °C e un ciclo di 10 minuti a 68 °C.
      NOTA: Ogni libreria dovrebbe utilizzare una combinazione unica di primer i7 e i5. Il numero di cicli di amplificazione dovrebbe essere regolato in base alla quantità della libreria per evitare sovraamplificazioni, che può causare artefatti PCR. Data la quantità tipicamente bassa di DNA nei campioni eSPAN, si utilizzano fino a 18 cicli.
    3. Purificare i prodotti PCR mescolando 60 μL (1,0x volume) di sfere (preriscaldate a 30 °C) (vedi Tabella dei Materiali).
    4. Mescola accuratamente i prodotti PCR e le perline.
      1. Lascialo stare a RT per 5 minuti. Lega le perline sul supporto magnetico per 3 minuti e lava le perline due volte con (ogni volta 200 μL) etanolo appena preparato all'80%.
      2. Fai asciugare le palline all'aria per 2 minuti e eludi in un tampone a basso contenuto di EDTA da 20 μL (fornito nel DNA Library Prep Kit).
    5. Misurare la concentrazione della libreria e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti utilizzando sistemi di elettroforesi ad alta risoluzione (vedi Tabella dei Materiali).
    6. Mettere in pool una quantità uguale di librerie individuali, inclusi i campioni di input, H3K4me3 ChIP, IP BrdU ed eSPAN, ed eseguire sequenziamento parallelo a pari con la piattaforma di sequenziamento Illumina. Per il processo di analisi dei dati, si riferire alla sezione 3.
      NOTA: I criteri di valutazione per i risultati del controllo qualità sono: (i) Non vengono rilevati picchi adattatori/primer dimero (sotto 180 bp). (ii) Tutte le librerie da aggregare hanno una distribuzione di dimensioni simile e ristretta (~300 di larghezza di base). Eccessiva siccazione delle perline può causare una resa bassa; Usa una postazione di lavoro per il DNA per evitare contaminazioni. Le librerie possono essere conservate indefinitamente a -20°C (punto di pausa).

2. Histone eSPAN con cella ES del mouse

NOTA: L'eSPAN degli istoni con cellula ES del topo è essenzialmente identica a unprotocollo 23 precedentemente pubblicato.

  1. Marcatura BrdU e raccolta di campioni per cellule ES di topo (3 h)
    1. Coltivare cellule ES di topo in un mezzo di coltura cellulare ES a 37 °C con un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per raggiungere una confluenza del 70%-80%. In generale, per l'eSPAN degli istoni erano necessarie circa 1 milione di cellule. Produrre le cellule semi un giorno prima degli esperimenti per assicurarsi che le cellule crescano a una fase esponenziale.
    2. Cambia il mezzo e incuba le cellule con BrdU a una concentrazione finale di 50 μM per 30 minuti a 37 °C con un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 .
      NOTA: L'efficienza dell'etichettatura BrdU può essere monitorata tramite analisi quantitativa PCR. In alternativa, l'analisi immunofluorescenza o FACS può essere utilizzata per monitorare l'efficienza di incorporazione del BrdU. Le celle non marcate possono essere usate come controllo negativo. Queste sono le condizioni standard di etichettatura per le cellule ES del topo. Si raccomanda di adeguare le condizioni di etichettatura per cellule con tassi di proliferazione e durata della fase S variabili.
    3. Sciacquare le cellule due volte delicatamente con PBS ghiacciato.
    4. Tripsinizzare e raccogliere le cellule pelletando a 200 × g per 5 minuti.
    5. Pipetta delicatamente le cellule fino al mezzo per risospese, poi contale. Centrifuga il numero necessario di celle a 500 × g per 5 minuti a RT.
    6. Sospendere il pellet cellulare in 4 mL di tampone di lavaggio tramite pipetto e scartare il sovrantantante. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti a RT.
    7. Sospezione nuovamente dei pellet con 4 mL di tampone di lavaggio e centrifuga a 500 × g per 5 minuti a RT.
    8. Scartare il sovrandanante e risospendere le celle nel wash buffer.
    9. Posizionare le sfere magnetiche rivestite in ConA (usare 10 μL di sfere per 250000 celle; aumentare la scala usando più celle) e risospendere in 1 mL di tampone di legame. Dopo molteplici inversioni, posizionare i tubi sul supporto magnetico per permettere alle sfere di depositarsi.
    10. Usando una pipetta o un aspirapolvere a bassa velocità, scartare i soprantativi. Ripeti due passaggi di lavaggio e sostieni di nuovo le perline nel buffer di ribindaggio.
    11. Aggiungi perline magnetiche pre-lavate rivestite in ConA ai campioni. Mescola bene e ruota a RT per 10-20 minuti.
    12. Metti i tubi su un supporto magnetico per scartare tutti i soprantantanti.
  2. Tagmentazione19 per cellule ES topo (2 giorni)
    1. Risospendere le sfere (sfere magnetiche rivestite in ConA legate alle cellule del passaggio 2.1.10) in 200 μL di tampone anticorpali geliferi. Aggiungi IgG come controllo negativo o le concentrazioni appropriate di anticorpi primari contro le proteine di interesse.
    2. Mescola bene e nuta a 4 °C durante la notte.
    3. Mescola 2 μg dell'anticorpo secondario e una quantità adeguata di pA-Tn5 al rapporto molare 1:2. Porta il volume totale a 8 μL/campione con glicerolo al 50% (v/v). Pipetta più volte per mescolare bene e incubare a RT per 1 ora.
    4. Metti i campioni CUT&Tag su un supporto magnetico per 30 secondi e scarta tutti i soprantantanti. Aggiungi 1 mL di buffer Dig-wash al pellet delle perline e inverti più volte.
      NOTA: Da questo passo ai successivi passaggi di lavaggio (passaggi 2.2.5-2.2.6), si consiglia di incubare le perle nei tamponi per 3-5 minuti dopo il passaggio di inversione per evitare il legame non specifico.
    5. Metti i tubi su un supporto magnetico e rimuovi tutti i soprantantanti. Aggiungere 200 μL di buffer Dig-300 per risospendere le sfere e aggiungere 8 μL della miscela di anticorpi secondari e pA-Tn5 a ciascun campione. Dopo aver mescolato bene con la pipettura più volte, incubare a RT per 1 ora.
    6. Metti i tubi su un supporto magnetico e rimuovi tutti i soprantantanti. Aggiungi 1 mL di buffer Dig-300 per sospendere le perline e inverti più volte.
    7. Metti i tubi su un supporto magnetico e rimuovi tutti i soprantantanti. Ripeti il passaggio del lavaggio altre 3 volte.
    8. Rimuovere completamente i soprantativi e aggiungere 250 μL di tampone di tagmentazione per risospendere le perle e incubare a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: Si raccomanda una lieve agitazione per la fase di reazione su un termomiscelatore perché le sfere possono sedimentarsi sul fondo dei tubi.
    9. Metti i tubi su un supporto magnetico e rimuovi tutti i soprantantanti. Usa 1 mL di buffer di lavaggio TAPS per sospendere le sfere e inverti più volte.
    10. Metti i tubi su un supporto magnetico e scarta tutti i soprantantanti.
    11. Aggiungere 250 μL di tampone Dig-300 contenente 15 mM di EDTA, 0,1% (p/v) SDS e 0,1 mg/mL di proteinasi K nelle restanti sfere. Vortice per mescolare bene e incubare a 37 °C durante la notte con lievi scuoti.
  3. Purificazione genomica del DNA e taglatura in vitro nelle cellule ES del topo (durante la notte)
    NOTA: Il DNA genomico delle stesse cellule per eSPAN viene estratto e preparato per la taglatura in vitro , utilizzata per BrdU-IP-ssSeq. La taglatura genomica del DNA e il suo successivo BrdU-IP-ssSeq sono a scopo di normalizzazione di eSPAN.
    1. Risospendere le cellule in 300 μL di tampone e vortice di lisi genomica del DNA alla massima velocità finché non sono visibili pellet.
    2. Per ogni campione, aggiungi RNasi A a 100 μg/mL. Una volta unite, incubare a 37 °C per 10 minuti.
    3. Aggiungi 100 μL di soluzione di precipitazione proteica a ciascun campione. Mescola bene vortice e centrifuga a 15.000 g a RT per 3 minuti.
    4. Salva il sovrandanante trasferendolo in nuovi tubi da 1,5 mL. Aggiungi 1x volume di isopropanolo ai campioni e mescola bene.
    5. Gira alla massima velocità in RT per 3 minuti per mettere in pellet il DNA genomico. Versa via con cura i soprantativi.
    6. Aggiungi 1 mL di etanolo al 70% (v/v) appena preparato a ogni campione e inverti più volte. Centrifuga alla massima velocità a RT per 3 minuti.
    7. Centrifuga a 15.000 g per 1 minuto a RT e rimuovi l'etanolo rimanente usando una pipetta P20. Lascia asciugare all'aria per 5-10 minuti.
    8. Aggiungi 50 μL diddH 2O e crea un vortice breve per risospendere il DNA genomico. Sciogliere a 65 °C per 30 minuti.
    9. Centrifugare brevemente e trasferire i soprantativi su nuovi tubi da 1,5 mL. Quantificare la concentrazione di DNA tramite spettrofotometro.
    10. Impostare la reazione di etichettatura in vitro come indicato nella Tabella 1.
    11. Mescola bene e incuba per 30 minuti a 37 °C con una lieve scuotita.
    12. Aggiungi 10 mM di EDTA, SDS allo 0,1% (p/v) e 0,1 mg/mL di proteinasi K a ciascun campione. Mescola bene vorticando e incuba durante la notte a 37 °C con scuotere.
  4. Estrazione del DNA e sostituzione di oligo-oligoterapia (3 h)
    NOTA: Sia il fenolo-cloroformio-isoamil (PCI) sia la purificazione a colonna possono essere applicati per l'estrazione del DNA. Qui vengono fornite procedure dettagliate utilizzando la purificazione delle colonne.
    1. Aggiungi 1,25 mL (5x volume) di buffer di binding (fornito con il kit di purificazione PCR) ai campioni (passaggi 2.2.11. e 2.3.12.) e mescola bene invertendo più volte.
    2. Carica la miscela nelle colonne di purificazione del DNA (in tubi di raccolta da 2 mL) e centrifuga per 30 s a 10.000 × g a RT. Scartare il flusso diretto.
    3. Aggiungere un buffer di eluzione da 600 μL (incluso nel kit) alle colonne e centrifugare per 1 minuto a 10.000 × g a RT. Scartare il flusso through.
    4. Centrifuga alla massima velocità per 2 minuti per rimuovere completamente il buffer residuo. Metti le colonne in nuovi tubi da 1,5 mL con coperchi aperti e lascia asciugare all'aria per 1 minuto.
    5. Aggiungi 32 μL di ddH2O senza DNasi (o 10 mM Tris·HCl, pH = 8,0) al centro della membrana e lasciala riposare per 1 minuto. Centrifugare alla massima velocità per 2 minuti e il DNA CUT&Tag è ora in soluzione.
    6. Aggiungere 32 μL di campione di DNA CUT&Tag in un nuovo tubo PCR, poi aggiungere 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM ciascuno), 4 μL di buffer 10x Ampligase e 2 μL di rep-B (10 μM). Batti delicatamente e mescola pipettando.
    7. Spegni brevemente e esegui il seguente programma per la sostituzionedell'oligo 23.
      50 °C, 1 min
      45 °C, 10 min
      Rampa a 37 °C, 0,1 °C/s
      37 °C, fermi
    8. Nel termociclatore, aggiungere 1 μL di DNA polimerasi T4 e 1 μL di Ampligase a ciascun tubo (volume finale, 40 μL/campione). Mescola con pipettura delicata.
    9. Continua la reazione a 37 °C nel termociclatore per 30-60 minuti.
      NOTA: Il DNA può essere memorizzato a -20 °C se non procede verso l'IP BrdU subito dopo questo passaggio (punto di pausa sicuro).
  5. Immunoprecipitazione BrdU (essenzialmente la stessa del protocollo del lievito) (2 h)
    1. Trasferire i campioni in tubi a basso legame di DNA da 1,5 mL. Bolli i campioni per 5 minuti su un blocco termico a 100 °C, e raffredda subito nel ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 15 μL di 10x PBS e +1,35 mL di buffer IP BrdU + 0,5 μL di anti-BrdU Ab + 1 μL di tRNA di E.coli (10 mg/mL).
    2. Butato per 2 ore su un rotore a 4 °C.
    3. Trasferire la miscela in un tubo contenente 20 μL di perle di proteina G Sepharose (lavate tre volte con 1 mL di tampone IP BrdU, ciascuna per 3 minuti).
    4. Incubare a 4 °C per 1 ora.
    5. Girare a 800 × g per 1 minuto e lavare secondo quanto segue: tre volte con 1 mL di buffer IP BrdU freddo, 3 minuti su un rotore; una volta con 1 mL di buffer TE per 3 minuti.
    6. Centrifuga a 800 × g per 1 minuto e aspira il soprantantante.
    7. Aggiungi 100 μL di buffer TE + 1% SDS nelle restanti perle. Incubare a 65 °C per 15 minuti. Gira a 800 × g per 1 minuto.
    8. Purificare il soprandanante in 18 μL di tampone di eluzione (fornito con il kit) utilizzando colonne di purificazione del DNA (campione BrdU IP e H3K4me3 eSPAN).
  6. Amplificazione e sequenziamento PCR (1,5 h)
    1. Amplificare e etichettare i campioni della libreria di DNA a singolo filamento utilizzando diverse combinazioni di indici. Prepara la reazione PCR aggiungendo i seguenti componenti ((DNA purificato [ChIP o ESPAN], primer indicizzato I5 [1 μL], primer indicizzato I7 [1 μL], NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 μL], ddH2O fino a 20 μL), mescolando i campioni tramite pipetto e girando brevemente.
    2. Riscalda la miscela PCR a 98 °C per 30 secondi, seguita da 12-14 cicli da 10 secondi a 98 °C e 20 secondi a 63 °C, e un ciclo di 2 minuti a 72 °C.
    3. Purificare i prodotti PCR con 18 μL di sfere paramagnetiche (0,8x volume) in 20 μL di tampone a basso contenuto EDTA.
    4. Misurare la concentrazione della libreria e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti utilizzando sistemi di elettroforesi ad alta risoluzione.
    5. Mettere in pool una quantità uguale di librerie individuali, inclusi i campioni di input, H3K4me3 ChIP, IP BrdU ed eSPAN, ed eseguire sequenziamento parallelo a pari con la piattaforma di sequenziamento Illumina.

3. Analisi dati eSPAN per cellule di lievito (1 giorno)

NOTA: Questo processo di analisi dei dati si applica solo ai dati sul lievito; l'analisi dei dati eSPAN per le cellule ES può essere seguita come illustrato in una recentepubblicazione 23.

  1. Estrai file di sequenza grezzi, taglia le sequenze degli adattatori tramite gli strumenti Trim Galore e rimuovi le letture inferiori a 10 bp per ridurre la dimensione del file di output ed evitare crash dei programmi di allineamento. Assicurati che i file siano nel formato file1_1.fq, file1_2.fq per le letture accoppiate:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --lunghezza 10 - abbinata
  2. Genera file indice papillon per il genoma di riferimento:
    bowtie2-build genome.fa
  3. Mappa le letture al genoma di riferimento corrispondente (genoma Saccharomyces (sacCer3) per il lievito) usando Bowtie 2:
    Bowtie2 -X genoma -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --locale --no-coda di rondine ---nessuno-discordante --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
  4. Rimuovere le letture multimap con SAMtools e duplicare le letture con Sambamba tools:
    Vista samtools -BHS - Q 40 input.bam -o output.bam
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
  5. Usa deeptools per generare i file di copertura di lettura più importanti su filamenti Watson e Crick separatamente per ogni campione da file clean bam:
    bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
    bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
  6. Calcola il bias medio in ciascuna posizionedel nucleosoma 25 per ogni campione basandosi sulla formula: log2 le letture dirette (filamento Watson)/retro (filamento Crick) dopo il posizionamento di riferimento dei nucleosomi sono state separate25. Gli script R per questi calcoli sono disponibili su https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Per un calcolo standard, usa i seguenti comandi.
    NOTA: Questo passaggio si applica solo ai dati sul lievito; il calcolo del bias per le celle ES può essere seguito come illustrato in una recentepubblicazione 23.
    Script cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. Se necessario, regolare il bias del filo in base al bias BrdU:
    Script normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --bersaglio target_list --controllo control_list
    NOTA: "matrix_files" è un elenco di file generati dal cal_bias. Alfabeto R separato da virgole. ad esempio 'file1', 'file2', 'file3'. "classes_list" è un elenco di classi di esempio corrispondenti a ogni file separato da virgole (ad esempio, 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" è un elenco di condizioni di campionamento corrispondenti a ciascun file e separate da virgole. Ogni file sarà abbinato per classe e condizione per l'aggiustamento del bias. "target_list" è un elenco delle classi tratte dal classes_list. Definirà le classi che agiranno come dati da regolare dai controlli (ad esempio, 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "control_list" è un elenco delle materie tratte dalla lista delle classi. Definirà le classi che agiranno come dati da regolare dai controlli. Assicurati che la lunghezza della lista sia la stessa di quella del target_list (ad esempio, 'brdu')
  8. Dopo il calcolo e la regolazione, raggruppa i campioni e crea visualizzazioni dei dati.
    Rscript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g gruppo 1,gruppo 2 --intervallo=T
    -s richiede una lista di file di bias generati dagli script sopra
    -o è il file di output
    -g definisce i gruppi sperimentali da calcolare, cioè repliche biologiche per tracciare il bias medio.
    --intervallo T o F, per mostrare errori standard sui grafici all'interno dei gruppi sperimentali.
    NOTA: Le informazioni sulle origini della replicazione sono state definite dai dati IP BrdU. Le informazioni sulla posizione del singolo nucleosoma sono state ottenute da un articoloprecedentemente pubblicato 25. Per l'analisi dei dati delle celle ES del topo, le informazioni di origine sono state ottenute dal datasetOK-seq 26, e il calcolo medio del bias dovrebbe seguire il protocollo descritto nel lavoroprecedente 23.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eSPAN può essere utilizzato per acquisire informazioni specifiche del filamento riguardo a una proteina bersaglio, come istones e modifiche agli istoni. In questo risultato rappresentativo, sono stati effettuati processi di raccolta del campione e eSPAN seguendo lo schema descritto nella Figura 2 utilizzando il sistema del lievito di gemiola. Il trattamento e la raccolta del campione seguono la condizione della fase S precoce trattata dall'idrossiurea secondo questo protocollo. Furono impieg...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La rilevazione delle proteine associate a filamenti di replicazione avanzati e rallentati è importante per comprendere i meccanismi di replicazione della cromatina e il processo associato, direttamente rilevanti per la ricerca sul cancro umano e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Sono stati impiegati diversi metodi, come il gel 2D, l'immunoprecipitazione nativa della Cromatina (nChIP), iPOND e la cattura nascente dellacromatina 29,30,31, per studiare la replicazione del DNA e processi correlat...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dei National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) e dall'Hormel Startup Fund (C.Y.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020
1,5 mL tubi a basso legame di DNA  Eppendorf22431021
Buffer Ampligase 10xLucigenA1905B
10x PBS e nbsp;Corning21-040-CV
10x TBSBioRad1706435
16 G x 1-1/2 in. Ago BD PrecisionGlidBD in Biologia305198
KIT DI BIBLIOTECA DI ACCEL-NGS 1S PIÙ DNATecnologie Integrate del DNA10009817kit di preparazione per la libreria ssDNA e DNA a basso input 
Bioanalizzatore Agilent 2100  AgilentBioanalisi 2100
Agilent DNA 1000 kit  Agilent5607-1504
Ampligase LucigenA0110KManeggiare con attenzione il paraformaldeide, è infiammabile, solido e pericoloso.
AMPure XPBeckmanA63881
Reagente SPRI AMPure XPBeckman CoulterA63882
Anticorpi anti-BrdU  BD in Biologia555627
Anticorpi anti-H3K4me3 abcamab8580
Contatore cellulari automatico , modello TC10BioRad145-0001
Bacitracina Sigma11702
Bacto peptone Thermo Fisher Scientific211830
Benzamidina Cloridrato SigmaB2417Solidi combustibili
BrdU SigmaB5002Maneggia BrdU con attenzione, poiché è un potenziale mutageno e teratogeno.
BSANew England BiolabsB9000S
CaCl2SigmaC4901
Incubatore di colture cellulari  Thermo Fisher Scientific  Incubatore a CO2 modello Forma serie II con camicia d'acqua3140
Mezzo di coltura cellulare  
Linea cellulare ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200– Dimensione 400 a maglia secca
Cloroformio Sigma366919
Perle magnetiche rivestite di concanavalina A (ConA)  Poliscienze86057-10
DigitoninaMillipore300410-5MG
DMSOSigmaD8418
E. coli  tRNA Sigma10109541001
Etanolo Thermo Fisher ScientificBP2818100Maneggia l'etanolo con attenzione, è infiammabile
GlucosioSigmaG7021
Glicerolo SigmaG5516
HCl SigmaH1758
HEPES SigmaH3375
Isopropanol Thermo Fisher ScientificBP26324Maneggiare con cura l'isoproprogenolo, è infiammabile
KAPA HiFi HotStart Ready MixRoche7958889001
KClSigmaP9541
KOHsigma221473Maneggia il KOH con attenzione, è corrosivo
Vuoto a bassa velocità
Supporto magnetico MilliporeLSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal CyclerEppendorf5331
MgCl2SigmaM8266
Nucleasi micrococciale  (MNase)WorthingtonLS004798
Kit di purificazione PCR MinElute & nbsp;Qiagen28006
Picchiatore per mini-perlineMini BeadBeater 24 Disruptor607
Mini-centrifuga Eppendorf5424R
MnCl2Sigma244589
Shaker multipiattaformaFisherbrand02-217-765
Incubatore multipiattaforma a shakerBenchmarkINCU-SHAKER 10L
Blocco termico multitermico & nbsp;EppendorfTermomixer C
N-[Tris(idrossimetil)metil]-3-aminopropanosolfonico acido   (BATTE)SigmaT5130200– Dimensione 400 a maglia secca
NaCl SigmaS9888
NaOH SigmaS8045Maneggia il NaOH con attenzione, è corrosivo
NEBNext HiFi 2 volte; Mix master PCRNew England BiolabsM0541
NP-40 Igepal CA-630Thermo ScientificJ61055. AP
Paraformaldhidesigma158127Maneggiare con attenzione il paraformaldeide, è infiammabile, solido e pericoloso.
enzima pA-Tn5  Addgene121137
PefablocSigma11429868001
Fenolo-cloroformio-isoamil alcol  Invitrogen15593049
Pipetta P1000, P200, P20 e P2Eppendorf2231300004
PMSFSigma10837091001
Compressa cocktail inibitore della proteasiSigmaS8830
Compressa cocktail per inibitori della proteasi SigmaS8830
Proteina G-perle di sepharosi GE Healthcare17-0618-02
Soluzione di precipitazione proteicaQiagen848023
Soluzione di precipitazione proteicaQiagen848023Maneggia il KOH con attenzione, è corrosivo
Soluzione di precipitazione proteica  Qiagen848023
Proteinasi K Sigma311584401
QIAquick kit di purificazione PCR  Qiagen28106
RNase ASigma10109169001
SDS SigmaL3771
Spettrofotometro Thermo Scientific.2000/2000c
Spermidina SigmaS2626
T4 DNA PolNew England Biolabs, M0203
Centrifuga da tavolo  Beckman CoulterAllegra X-5
Tris Sigma11814273001
Triton X-100 SigmaT8787
estratto di lievito  Thermo Fisher Scientific212730

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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