È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo

1.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

10 gennaio 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

In questo articolo

Sommario

La modellizzazione dell'eritropoiesi fornisce una preziosa opportunità per comprendere il significato biologico degli attori in questo processo e per valutare nuovi approcci terapeutici che possono alleviare i difetti di differenziazione. Qui, descriviamo un metodo semplice e affidabile per differenziare in modo efficiente le cellule staminali ematopoietiche CD34+ e le cellule progenitrici ex vivo.

Abstract

L'eritropoiesi, un processo notevolmente dinamico ed efficiente responsabile della generazione della quota giornaliera di globuli rossi (circa 280 ± 20 miliardi di cellule al giorno), è fondamentale per il mantenimento della salute individuale. Qualsiasi interruzione di questo percorso può avere conseguenze significative, portando a problemi di salute. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che il 25% della popolazione mondiale presenti sintomi di anemia. Questo protocollo descrive come generare cellule eritroidi umane sia in vitro utilizzando cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC) da fonti come il sangue del cordone ombelicale (UCB) o sangue prelevato da donatori sani, sia ex vivo con HSPC isolate dal midollo osseo dei pazienti. Utilizzando l'approccio genetico, i geni di interesse possono essere modulati nelle HSPC e il loro impatto sull'eritropoiesi può essere monitorato in varie fasi del processo di differenziamento. Questo metodo consente lo screening di composti che perturbano, migliorano o salvano la capacità delle HSPC di differenziarsi in cellule eritroidi mature e di studiare il ruolo dei geni di interesse durante il processo di differenziamento eritroide.

Introduzione

Ogni giorno circa 280 miliardi di globuli rossi (RBC) vengono prodotti nel midollo osseo per garantire il trasporto di ossigeno in tuttoil corpo1. L'eritropoiesi è un processo di differenziazione finemente regolato che produce globuli rossi maturi e funzionali da cellule staminali ematopoietiche. Molte malattie, sia acquisite che congenite, possono influenzare questo processo, tra cui la sindrome mielodisplastica, l'anemia aplastica, la talassemia e l'anemia diseritropoietica congenita2.

La manifestazione clinica dell'eritropoiesi interrotta è l'anemia, una delle principali cause di morbilità in tutto il mondo. I sintomi dell'anemia vanno da affaticamento, mancanza di respiro e vertigini a condizioni pericolose per la vita, come insufficienza cardiaca e arresto cardiaco3. Con l'anemia che colpisce 1,8 miliardi di persone in tutto il mondo4, la modellazione dell'eritropoiesi ex vivo al fine di studiare queste condizioni e i loro meccanismi sottostanti rimane una priorità globale. Il metodo qui descritto mira a fornire un modello semplice e robusto per lo studio della differenziazione eritroide sia sana che malata. Questo modello consente la dissezione dei ruoli di geni specifici in questo processo e consente di testare composti che potrebbero giovare ai pazienti anemici. Storicamente, la modellazione dell'eritropoiesi inefficace ha avuto molte sfide, tra cui una scarsità di cellule staminali in alcuni midollo osseo malati e difficoltà a imitare la nicchia del midollo osseo.

Studi precedenti hanno utilizzato protocolli simili o più complessi; ad esempio, Bondu et al. hanno utilizzato un cocktail di citochine tra cui eritropoietina (EPO), fattore di cellule staminali (SCF) e interleuchina-6 (IL6) per 4 giorni prima di rimuovere IL6 dal cocktail di differenziazione eritroide, al contrario, Yip et al. hanno aggiunto EPO al loro cocktail di citochine solo dopo 7 giorni di coltura liquida. Elvarsdóttir et al. hanno sviluppato un modello di coltura tridimensionale (3D) per cellule CD34+ per facilitare la massima espansione e maturazione delle cellule eritroidi, compresa la generazione di isole eritroblastiche ed eritrociti enucleati, che sono importanti per studiare fenomeni come i sideroblasti ad anello 5,6,7,8. Questo protocollo utilizza solo tre citochine durante l'espansione delle cellule (ad esempio, SCF, trombopoietina [TPO] e tirosin-chinasi 3 FMS-simile [FLT3]) e tre citochine mantenute durante l'intero processo di differenziazione (ad esempio, EPO, IGF1 e SCF). Uno dei criteri chiave condivisi tra questi diversi studi è l'uso di cellule CD34+. Sebbene l'origine di queste cellule vari, sono costantemente impiegate in questi diversi protocolli. Le fonti possono variare dalla raccolta non invasiva di UCB a procedure più invasive per ottenere campioni di midollo osseo adulto che possono essere raccolti da pazienti mobilizzati con fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) o da punture di midollo osseo. In generale, i modelli di coltura liquida vengono trasportati per 14 giorni, mentre i modelli 3D possono mantenere le cellule per periodi più lunghi. Questi protocolli sono essenziali per modellare le malattie genetiche e le interruzioni dell'eritropoiesi. Gli approcci genetici, come i knockdown dell'RNA a forcina corta (shRNA), possono essere impiegati per silenziare i geni di interesse e studiare il loro ruolo nell'eritropoiesi. L'impatto del silenziamento genico può quindi essere monitorato in varie fasi della differenziazione, fornendo un modello umano ex vivo della produzione di globuli rossi per studiare l'anemia sia in salute che in malattia. Questo protocollo include la trasduzione di cellule del sangue del cordone ombelicale CD34+ con shRNA che esprimono costitutivamente un gene reporter, come la proteina a fluorescenza verde potenziata (EGFP), consentendo ai campioni di essere ordinati mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Le cellule vengono quindi incubate in mezzi di differenziazione per 2 settimane e monitorate mediante analisi di citometria a flusso e colorazione immunochimica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

La ricerca sui campioni primari è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali (riferimento REC: 21/EE/0133; ID del progetto IRAS: 283103).

1. Produzione di lentivirus

NOTA I lentivirus devono essere prodotti in un laboratorio di livello di biosicurezza L2 in condizioni sterili. Devono essere indossati tutti i DPI necessari per questo laboratorio, compresi i doppi guanti. Il materiale contaminato viene decontaminato con disinfettante virucida prima dello smaltimento in un bidone autoclavato. Qui, per illustrare il processo, viene utilizzato uno scramble (controllo) di shRNA che ospita un gene reporter EGFP.

Giorno 1

  1. Scaldare la gelatina a 37 °C a bagnomaria fino a quando non si scioglie completamente. Diluire la gelatina allo 0,1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  2. Rivestire una pirofila da 150 mm con 2 mL di gelatina allo 0,1%. Utilizzare 2 piatti per virus. Incubare le piastre per 30 minuti a 37 °C.
  3. Seminare 5 milioni di cellule HEK293T per capsula rivestita di gelatina in 20 ml di terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) al 10% e porre le cellule in un incubatore a 37 °C.

Giorno 2

  1. Verificare che le celle abbiano raggiunto circa il 50% di confluenza. Sostituire il terreno con 22 mL di DMEM al 10% senza disturbare lo strato cellulare 2 ore prima della trasfezione.
  2. Preparare la miscela di trasfezione.
    NOTA: Viene preparata una miscela di trasfezione per piatto, poiché un volume maggiore potrebbe influire sulla formazione del precipitato di calcio-fosfato.
    1. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga da 15 mL come segue: 32 μg di plasmide, 20 μg di plasmide PAX (pCMVdR8.74), 9 μg di plasmide VSVG (pMD.G2) e portare il volume fino a 1125 μL utilizzando H2O.
    2. Aggiungere 125 μl di CaCl2 alla reazione e incubare 5 minuti a temperatura ambiente (RT) su un rullo.
    3. Preparare 1,25 ml di 2x HEPES in una provetta da centrifuga separata da 15 ml.
    4. Aggiungere 2 HEPES goccia a goccia alla miscela di reazione mentre si agita delicatamente, quindi posizionare la miscela su un rullo per 10 minuti a RT.
  3. Erogare la reazione goccia a goccia sulle cellule a spirale e posizionare le cellule in un'incubatrice a 37 °C dopo aver spostato delicatamente la piastra a forma di croce per omogeneizzare il terreno.

Giorno 3

  1. Cambiare il terreno con 16 mL di DMEM al 10% senza disturbare lo strato della cellula.

Giorno 4

  1. Raccogliere il surnatante e conservarlo a 4 °C per una notte. Aggiungere 16 mL di DMEM fresco a ciascuna piastra senza disturbare lo strato cellulare.

Giorno 5

  1. Raccogli il surnatante e fai pool con il surnatante dal giorno 4. Filtro per eliminare i detriti con un filtro da 0,45 μM.
  2. Trasferire ogni 30 mL (giorno 4 + giorno 5) di surnatante in una provetta conica per l'ultracentrifugazione. Aggiungere i tubi in un secchio girevole, se necessario con adattatori per il fondo conico.
  3. Bilanciare le provette faccia a faccia con una precisione di 0,02 g e ultracentrifugare a 90.000 x g per 2 ore a 4 °C.
  4. Scartare il surnatante e aggiungere 200 μl di terreno di coltura di cellule staminali per provetta. Chiudere le provette con parafilm e incubare le provette in una cella frigorifera per 2-4 ore sotto agitazione.
  5. Preparare un'aliquota di 20 μl di ciascun virus e conservare i flaconcini a -80 °C. Conservare 2 μL di ciascun virus e aggiungere 400 μL di DMEM.
    NOTA: Questa diluizione verrà utilizzata per la titolazione.

2. Titolazione del lentivirus

NOTA I lentivirus devono essere manipolati in un laboratorio di livello di biosicurezza L2 in condizioni sterili. Devono essere indossati tutti i DPI necessari per questo laboratorio, compresi i doppi guanti. Il materiale contaminato viene decontaminato con disinfettante virucida prima dello smaltimento in un bidone autoclavato.

  1. Seminare HEK293T in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 50.000 cellule/pozzetto in 500 μl di DMEM al 10%.
    NOTA: Utilizzare 6 pozzetti per virus e conservare un pozzetto per le cellule non trasdotte.
  2. Eseguire la trasduzione. Aggiungere i diversi pozzetti: 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL e 64 μL del virus diluito dal passaggio 1.13. Omogeneizzare delicatamente.
  3. Cambiare il terreno 24 ore dopo aggiungendo 500 μl di DMEM al 10%.
  4. Al giorno 4 dopo la trasduzione, preparare le cellule per la citometria a flusso.
    1. Preparare il tampone FACS con PBS, siero fetale bovino al 2% (FBS), penicillina-streptomicina all'1% (P/S), acido etilendiamminotetraacetico 2 mM (EDTA) e 1/2.000 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
    2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di tampone FACS direttamente con EDTA a ciascun pozzetto.
    3. Staccare le cellule pipettando su e giù.
  5. Filtrare le cellule attraverso un colino da 40 μm e trasferirle in provette FACS.
  6. Determinare la percentuale di cellule EGFP mediante citometria a flusso.
  7. Imposta i seguenti cancelli:
    1. Impostare DAPI rispetto alla dispersione laterale (SSC-A) per escludere le celle morte.
    2. Imposta l'altezza SSC (SSC-H) rispetto all'area SSC (SSC-A) per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle.
    3. Impostare l'area di dispersione diretta (FSC-A) rispetto a SSC-A per bloccare le celle e rimuovere i detriti in base alle dimensioni.
    4. Impostare la proteina a fluorescenza verde (GFP) rispetto a SSC-A per selezionare le cellule GFP+ .
  8. Titolo il virus.
    1. Calcola la concentrazione di particelle (numero di particelle/mL) per ogni condizione:
    2. Cellule EGFP x Fattore di diluizione virus (200) x Numero di cellule seminate x1000)/ volume del virus.
      NOTA: Ad esempio, le cellule sono state trattate con 64 μL di virus diluito a 1/200. Dopo l'analisi della citometria a flusso, il 54% delle cellule era EGFP+. In tali condizioni, il titolo sarà (54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 particelle/mL.

3. Trasduzione delle cellule CD34+ isolate dal sangue del cordone ombelicale

NOTA Questa parte viene eseguita in condizioni sterili. Qui, le cellule UCB CD34+ (purezza >85%) vengono trasdotte con uno shRNA (controllo) che ospita un reporter eGFP. L'esperimento viene eseguito con tre repliche tecniche. La proporzione deve essere adattata al numero di campioni.

Giorno 1

  1. Preparare i seguenti supporti e buffer:
    1. Preparare il terreno di scongelamento: FBS integrato con l'1% di P/S e 10 μg/mL di DNAsi
    2. Preparare il tampone FACS: PBS integrato con 1% P/S e 2% FBS (± 10 μg/mL di DNAsi)
    3. Preparare i terreni di stimolazione (nel terreno delle cellule staminali) aggiungendo 150 ng/mL di SCF, 150 ng/mL di FLT-3, 10 ng/mL di IL-6, 25 ng/mL G-CSF, 20 ng/mL di TPO e 1% di HEPES.
  2. Scongelare 100.000 cellule UCB CD34+ immergendole per 30 s nel bagno d'acqua a 37 °C. Aggiungere 1 mL di terreno di scongelamento goccia a goccia in ciascuna fiala e quindi risospendere delicatamente pipettando su e giù.
  3. Trasferire delicatamente la sospensione cellulare goccia a goccia in un totale di 5 mL di terreno di scongelamento.
    NOTA: Per evitare di perdere le cellule, tenere da parte un'aliquota di 2 ml di terreno di scongelamento che verrà utilizzata alla fine per lavare il puntale e il flaconcino.
  4. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT. Lavare le celle in 10 mL di tampone FACS + DNAsi.
  5. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g in RT. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di stimolazione (punta di lavaggio e tubo con mezzo di stimolazione).
  6. Contare le cellule utilizzando 5 μl di sospensione cellulare e 5 μl di blu di tripano.
    NOTA: Puntare a un minimo di 75.000 celle totali (25.000 celle/condizione).
  7. Trasferire i 2 mL di sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti e incubare per ≥4-6 ore a 37 °C.
    NOTA: Tutte le cellule (75.000-100.000) vengono seminate in un pozzetto in questa fase.
  8. Raccogliere le cellule in provette FACS e rabboccare con 1 mL di terreno di cellule staminali. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT.
  9. Scongelare il virus e aggiungere il volume necessario ai mezzi di stimolazione con una molteplicità di infezione (MOI) di 30.
  10. Risospendere le cellule pellettate in terreni contenenti virus a 100.000 cellule per 100 μL di virus in 1 pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere PBS ai pozzetti vuoti e incubare per una notte a 37 °C.

Giorno 2

  1. Preparare il terreno di espansione (nel terreno di coltura delle cellule staminali) aggiungendo 150 ng/mL di SCF, 150 ng/mL di FLT3-L e 20 ng/mL di TPO.
  2. Aggiungere l'intero volume di sospensione cellulare dal pozzetto della piastra a 96 pozzetti alle provette FACS con 1 mL di terreno di coltura per cellule staminali. Lavare il pozzetto e la punta con terreno di coltura di cellule staminali, ottenendo l'aggiunta di 2 mL di terreno di cellule staminali alla sospensione cellulare nella provetta FACS.
  3. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT.
  4. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di terreno di espansione. Aggiungere la sospensione cellulare in un pozzetto per piastra a 24 pozzetti (lavare il pozzetto e la punta nel processo per ottenere un totale di 2 ml). Incubare le cellule per 4 giorni a 37 °C.
    NOTA: Lo smistamento delle cellule viene quindi eseguito il giorno 7.

4. CD34+ : Smistamento cellulare EGFP+ e differenziazione eritroide

NOTA Questa parte viene eseguita in condizioni sterili.

  1. Preparare i seguenti supporti e buffer.
    NOTA: I terreni con citochine devono essere preparati freschi:
    1. Preparare il buffer FACS integrando il PBS con l'1% di P/S e il 2% di FBS.
    2. Preparare il terreno di espansione (nel terreno di coltura delle cellule staminali) aggiungendo 150 ng/mL di SCF, 150 ng/mL di FLT3-L e 20 ng/mL di TPO.
    3. Preparare i terreni di differenziazione eritrocitaria (nel terreno delle cellule staminali) aggiungendo 25 ng/mL di SCF, 3 U/mL di EPO e 50 ng/mL di IGF1.
    4. Preparare 2 terreni di differenziazione eritrocitaria (in terreno di coltura di cellule staminali) aggiungendo 50 ng/mL di SCF, 6 U/mL di EPO e 100 ng/mL di IGF1.
  2. Aggiungere l'intero volume di cellule in una provetta FACS separata (lavare il pozzetto e la punta nel processo con terreno di coltura con cellule staminali). Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT. Risospendere le celle pellettate in 100 μl di tampone FACS.
  3. Aggiungere 5 μL di CD34 Ab/provetta e incubare al buio a 4 °C per 20 minuti.
  4. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone FACS con DAPI (diluizione 1/2000 in tampone FACS) e centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT.
  5. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS con DAPI (diluizione 1/2000 in tampone FACS) e filtrare le cellule attraverso un filtro da 40 μM prima della cernita.
  6. Preparare le perline per il controllo:
    1. Aggiungere 0,5 μL di anticorpo CD34 (Ab) a 1 goccia di perle in 100 μL di PBS e incubare al buio a 4 °C per 20 minuti.
    2. Aggiungere 1 ml di PBS. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di PBS.
  7. Preparare linee cellulari leucemiche per il controllo della GFP.
    NOTA: Utilizzare qualsiasi linea cellulare GFP+ disponibile come controllo; Al suo posto si possono usare le perline.
    1. Aggiungere le cellule GFP- (2 provette FACS con 100.000 cellule) e GFP+ (1 provetta FACS con 100.000 cellule) nella provetta FACS.
      NOTA: Un totale di 3 tubi.
    2. Lavare le celle in 1 mL di tampone FACS. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT.
    3. Risospendere 100.000 cellule GFP- in 500 μL di tampone FACS (non colorato), 100.000 cellule GFP- in 500 μL di tampone FACS con DAPI (1/2000 di diluizione in tampone FACS) (colorate DAPI) e 100.000 cellule GFP+ in 500 μL di tampone FACS (cellule GFP+ ).
      NOTA: I tubi di controllo verranno utilizzati per le impostazioni di gating e compensazione sul citometro a flusso. Se le celle utilizzate sono GFP al 100%, le cellule GFP- possono essere aggiunte alla provetta (50.000 celle GFP- e 50.000 celle GFP+).
    4. Filtrare le celle attraverso un colino da 40 μm prima della cernita.
  8. Imposta i seguenti cancelli:
    1. Impostare DAPI rispetto alla dispersione laterale (SSC-A) per escludere le celle morte.
    2. Impostare l'altezza SSC rispetto all'area SSC (SSC-A) per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle.
    3. Impostare l'area di dispersione in avanti (FSC-A) rispetto a SSC-A per rimuovere i detriti in base alle dimensioni.
    4. Impostare GFP rispetto a SSC-A per selezionare le celle GFP+ .
    5. Impostare CD34 (PerCP-Cy5.5) rispetto a SSC-A per selezionare le cellule CD34+ .
  9. Capovolgere la provetta FACS di raccolta prima della raccolta delle celle per rivestire le pareti della provetta con FBS.
  10. Raccogli le cellule nel terreno delle cellule staminali.
    NOTA: Puntare a 75.000-80.000 celle (25.000 celle x 3)
  11. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT e risospendere le cellule in 3 mL di terreno di differenziazione eritroide.
  12. Risospendere e quindi erogare 1 mL per pozzetto in 3 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Riempi tutti i pozzetti esterni con PBS.
  13. Eseguire una mezza deplezione del terreno a giorni alterni e sostituirlo con un terreno di differenziazione eritrocitaria 2x.
    1. Per rinfrescare il supporto, assicurarsi che le celle si siano depositate sul fondo della piastra. Appoggiare delicatamente la piastra ed estrarre 500 μL di terreno.
    2. Aggiornare aggiungendo 500 μl con un mezzo di differenziazione eritroide con citochine 2x.
    3. Trasferire le cellule il giorno 6 in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno per ottenere un volume finale di 2 mL.

5. Analisi della differenziazione eritroide mediante citometria a flusso due volte alla settimana dal giorno 6 al giorno 14

  1. Preparare i seguenti supporti e buffer.
    1. Preparare il buffer FACS integrando il PBS con l'1% di P/S e il 2% di FBS
    2. Preparare i terreni di differenziazione eritrocitaria (nel terreno delle cellule staminali) aggiungendo 25 ng/mL di SCF, 3 U/mL di EPO e 50 ng/mL di IGF1.
  2. Raccogliere 200 μl di cellule da ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti e sostituirle con 250 μl di 2x terreno di differenziazione eritroide. Aggiungere 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta.
  3. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT. Risospendere le celle pellettate in 100 μl di tampone FACS.
  4. Aggiungere 1 μL di CD71 Ab (1/100), 1 μL di CD34 Ab (1/100) e 1 μL di CD235a Ab (1/100) e incubare al buio a 4 °C per 20 min.
  5. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone FACS con DAPI (diluizione 1/2000 in tampone FACS). Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT.
  6. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS con DAPI (diluizione 1/2000 in tampone FACS).
  7. Preparare le perline per il controllo:
    1. Aggiungere 1 perlina di compensazione delle gocce a due provette in 100 μL di PBS, quindi aggiungere 0,55 μL di un singolo anticorpo a ciascuna provetta per effettuare controlli di colorazione singola (uno per CD34, uno per CD71 e uno per CD235a).
      NOTA: 1 goccia è sufficiente per entrambi i comandi.
    2. Incubare al buio a 4 °C per 20 min. Aggiungere 1 ml di PBS.
    3. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di PBS.
  8. Preparare una linea cellulare leucemica per il controllo.
    NOTA: Le celle K562 esprimono il marcatore CD71 e possono essere utilizzate come controllo positivo per impostare il FACS.
    1. Aggiungere le cellule GFP- (2 provette FACS con 100.000 cellule) e le cellule GFP+ (1 provetta FACS con 100.000 cellule) nella provetta FACS.
    2. Lavare le celle in 1 mL di tampone FACS. Centrifugare per 8 minuti a 320 x g a RT.
    3. Risospendere 100.000 cellule GFP- nel tampone FACS (non colorate), 100.000 cellule GFP- nel tampone FACS con DAPI (diluizione 1/2000 nel tampone FACS) (colorate DAPI) e 100.000 cellule GFP+ nel tampone FACS (cellule GFP+ ).
  9. Imposta i seguenti cancelli:
    1. Impostare DAPI rispetto alla dispersione laterale (SSC-A) per escludere le celle morte.
    2. Impostare l'altezza SSC rispetto all'area SSC (SSC-A) per escludere gli aggregati di celle e selezionare singole celle.
    3. Impostare l'area di dispersione in avanti (FSC-A) rispetto a SSC-A per rimuovere i detriti in base alle dimensioni.
    4. Impostare CD235a (APC-Cy7) rispetto a CD71 (PE).
    5. Impostare CD34 (PerCP-Cy5.5) rispetto a SSC-A.
  10. Eseguire un campione di celle GFP non colorate e celle completamente colorate per regolare le tensioni in modo che le celle si trovino nella posizione corretta.
  11. Far scorrere perline, celle GFP+ e celle colorate con DAPI. Compensare e applicare la compensazione alle impostazioni del citometro.
  12. Eseguire gli esempi e registrare gli eventi.

6. Analisi del differenziamento eritroide mediante colorazione di Giemsa

  1. Preparare 5 barattoli per la colorazione dei vetrini:
    1. Preparare un barattolo per la colorazione dei vetrini con la soluzione di blu di eosina-metilene di May-Grünwald 1:1 e PBS.
    2. Preparare un barattolo per la colorazione dei vetrini con 2,5 mL di brodo Giemsa + 50 mL di PBS.
    3. Preparare un barattolo per la colorazione dei vetrini con acqua distillata.
    4. Preparare un barattolo per la colorazione dei vetrini con PBS.
    5. Preparare un barattolo per la colorazione dei vetrini con metanolo freddo ghiacciato.
  2. Raccogliere 100.000 cellule per una colorazione ottimale, aggiungere 1 mL di PBS e centrifugare 300 x g per 5 minuti.
  3. Scartare il terreno e risospendere in 150 μl di PBS.
  4. Preparare i vetrini, la carta da filtro e l'adattatore conico in una citocentrifuga e far cadere lentamente la preparazione delle cellule nell'adattatore conico.
  5. Centrifugare a 800 x g per 3 min. Rimuovere i vetrini e metterli nel barattolo di metanolo nel ghiaccio per 15 minuti.
  6. Immergere i vetrini nella soluzione di May-Grünwald per 5 minuti e agitare di tanto in tanto per garantire una colorazione corretta.
  7. Quindi, immergere i vetrini nel barattolo PBS fino a quando nessuna macchia fuoriesce.
  8. Immergere i vetrini nella soluzione di Giemsa per 20 minuti e agitare di tanto in tanto per garantire una colorazione corretta.
  9. Immergere con cura i vetrini con PBS fino a quando non si cancella più la macchia.
  10. Lasciare che le diapositive rimangano in PBS per altri 3 minuti.
  11. Immergere rapidamente i vetrini in acqua distillata e asciugarli all'aria a RT.
  12. Aggiungi una goccia di resina sintetica su ogni punto delle cellule e aggiungi delicatamente un vetrino coprioggetti sopra.
  13. Lasciare asciugare i vetrini per 1 ora a RT e sigillare il vetrino coprioggetti con smalto per unghie per evitare che scivolino per evitare che si secchino.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Le cellule CD34+ del sangue del cordone ombelicale o del midollo osseo vengono prima scongelate, stimolate e trasdotte con uno shRNA che esprime GFP (Figura 1A). Le cellule CD34+GFP+ vengono selezionate 4 giorni dopo la trasduzione, secondo la strategia di gating illustrata nella Figura 1B. I risultati rappresentativi hanno mostrato la maturazione delle cellule CD34+ dopo la trasduzione e lo smistamento FACS. Le cellul...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Qui, abbiamo descritto un metodo efficiente e affidabile per indurre la differenziazione eritroide di cellule staminali ematopoietiche CD34+ (HSPC) isolate dal midollo osseo adulto (BM) o dal sangue del cordone ombelicale (UCB). Questa pipeline include l'editing/modifica di cellule primarie per studiare la funzione di qualsiasi gene di interesse durante il processo di differenziazione eritroide. Questo metodo è stato utilizzato con successo per studiare la rilevanza funzionale...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

C.P., S.B. e K.RP. sono stati sostenuti dal programma HARP, dalla Barts Charity (G-002167), dal Kay Kendall Leukaemia fund (KKL1149) e dall'Academy of Medical Sciences (SBF004\1099). Ringraziamo la Dott.ssa Pantelitsa Protopapa per la colorazione MGG e l'acquisizione al microscopio. Ringraziamo anche le strutture di citometria a flusso e microscopia del Barts Cancer Institute, Queen Mary University di Londra. Ringraziamo l'ente di beneficenza britannico Anthony Nolan per averci fornito le unità di sangue del cordone ombelicale utilizzate in questo manoscritto.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2x HEPESMerck51558
PerlineThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 anticorpoBD Biosciences347222
CD71 PE anticorpoBiolegend 334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX supporto di montaggio VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
GelatinaMerckG1393
Soluzione di GiemsaAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
EPO umanoPeproTech100-64
Ligando Flt-3 umanoPeproTech300-19
Umano G-CSFPeproTech300-23
Umano IGF1PeproTech100-11
Umano IL-6PeproTech200-06
Umano SCFPeproTech300-07
Umano TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesNA
May-Grunwald soluzione Scanner ad alta produttività Generon26250-01
Pannoramic 250 3DHISTECHNA
Penicillina/StreptomicinaThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificCellule
Medium Tecnologie delle cellule staminalimedie9655
staminali NA

Riferimenti

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Differenziamento eritroidecellule staminali ematopoieticheeritropoiesi ex vivoeritropoiesi in vitrocitometria a flussoanticorpo CD34linea eritroideterreni per il differenziamento eritroidecolorazione con Annessina V
Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.