Quantificazione del glucosio Bergmeyer per campioni microbiologici

Summary

La quantificazione del glucosio di Bergmeyer è una tecnica enzimatica spettrofotometrica utilizzata principalmente per test clinici che misurano in modo accurato e sensibile la quantità di glucosio. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di questo metodo per i campioni microbiologici.

Abstract

La concentrazione di glucosio è un indicatore chiave del metabolismo cellulare e potrebbe indicare il tasso di metabolismo totale, un'aberrazione nel metabolismo del glucosio e, in alcuni casi, il modo in cui le cellule accoppiano il metabolismo del glucosio al metabolismo energetico. Inoltre, i livelli di glucosio intracellulari ed extracellulari sono indicativi dello stato metabolico cellulare. Le tecniche enzimatiche, come la quantificazione del glucosio di Bergmeyer, sono più accurate e sensibili di altre tecniche, come l'acido dinitrosalicilico o i metodi di fluorescenza, che vengono solitamente utilizzati in microbiologia. Sebbene utilizzata principalmente in ambito clinico, la quantificazione del glucosio di Bergmeyer può essere applicata anche a qualsiasi cellula, ma non è stata riportata in dettaglio per batteri, funghi, lieviti o altri microrganismi.

In questo articolo, presentiamo una metodologia per quantificare il glucosio da campioni di batteri e lieviti utilizzando il metodo enzimatico di quantificazione del glucosio di Bergmeyer. La procedura ha coinvolto gli enzimi glucosio ossidasi, perossidasi e o-dianisidina dicloridrato incubati a 37 °C per 20 minuti, seguiti dall'aggiunta di acido solforico. L'assorbanza viene quindi misurata a 545 nm. È importante sottolineare che, sebbene questa tecnica presenti difficoltà nella misurazione di alte concentrazioni di glucosio (superiori a 60 g/L), è possibile misurare concentrazioni inferiori a 50 g/L utilizzando fattori di diluizione. Questo approccio enzimatico è prezioso per la ricerca e l'analisi in microbiologia e in altre aree scientifiche. La precisione e la sensibilità del metodo lo rendono utile per rilevare anche basse concentrazioni di glucosio in campioni microbiologici.

Introduction

Il glucosio funge da fonte primaria di energia e carbonio per numerosi microrganismi, tra cui batteri, lieviti e funghi. Questi microrganismi assorbono il glucosio attraverso trasportatori situati sulla membrana extracellulare, dove subisce una serie di reazioni biochimiche all'interno della via metabolica della glicolisi per essere convertito in piruvato¹. Esistono varie tecniche per la quantificazione degli zuccheri riducenti come il glucosio. Ad esempio, il reagente^{di Benedict 2}, l'uso dell'acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)^3,4, il metodo dell'antropa⁵ o l'acid....

Protocol

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare 100 mL di tampone fosfato 0,1 M. Pesare 1,28 g di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄) e 0,1304 g di fosfato dipotassico (K₂HPO₄) e aggiungerli in un becher di vetro. Ora, aggiungi 70 ml di acqua deionizzata (H₂Odi) e regola il pH a 5,5 utilizzando acido cloridrico 1 M (HCl) o idrossido di potassio (KOH). Trasferire la soluzione in un matraccio tarato e portare il volume finale a 100 ml. Quindi, trasferire la soluzione in un contenitore ambrato e conservare la soluzione a 4-8 °C per un massimo di 3 mesi.
   ATTENZIONE: Indossare guanti in ni....

Results

L'analisi spettrofotometrica di GOX-H₂SO₄ ha rivelato un'unica assorbanza massima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), con valori di assorbanza aggiuntivi osservati a 545 nm. Analizzando i valori di assorbanza a diverse concentrazioni di glucosio, abbiamo ottenuto una linearità (R²) di 0,9977 per λ529 nm e R² di 0,9967 per λ545 nm (Figura 2B). La linearità, all'interno di un dato intervallo, si riferisce alla capacità di fornire risultati diret.......

Discussion

La quantificazione del glucosio nei terreni di coltura è essenziale per comprendere la crescita microbica e l'attività metabolica, poiché il glucosio funge da fonte di energia primaria per molti microrganismi. In questo studio, abbiamo impiegato il metodo GOX-H₂SO₄ per misurare con precisione i livelli di glucosio nei terreni di coltura, con l'obiettivo di ottimizzare i processi microbici nei batteri o nelle fermentazioni dei lieviti. I nostri risultati sono coerent.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microprovetta da 1,5 mL	Eppendorf	-	-
Microprovetta da 2,0 mL	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Carbonato di calcio
D-glucosio	Meyer	50-99-7	D-glucosio
Bagno a secco	FisherScientific	11-718-4	Seriale 911NO251. Blocco LxPxA mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Glucosio ossidasi	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Polvere enzimatica
H2O	-	-	Acqua deionizzata
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Acido solforico
HCl	Meyer	7647-01-0	Acido cloridrico
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosfato dipotassico
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosfato monopotassico
KOH	Meyer	1310-58-3	Idrossido di potassio
Lambda 35	PerkinElmer-Spectrofotometro
Microtubo centrifuga	-	-
-o-Dianisidina dicloridrato	Sigma Aldrich	D3252	Perossidasi cromogenica
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzima in polvere
pH-metro	Hanna	1131	Hanna 1170
Acetato di sodio	Meyer	127-09-3	Meyer
Spatole per pesare	-	-	-