La quantificazione del glucosio di Bergmeyer è una tecnica enzimatica spettrofotometrica utilizzata principalmente per test clinici che misurano in modo accurato e sensibile la quantità di glucosio. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di questo metodo per i campioni microbiologici.
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Articolo metodologico
Quantificazione del glucosio Bergmeyer per campioni microbiologici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La concentrazione di glucosio è un indicatore chiave del metabolismo cellulare e potrebbe indicare il tasso di metabolismo totale, un'aberrazione nel metabolismo del glucosio e, in alcuni casi, il modo in cui le cellule accoppiano il metabolismo del glucosio al metabolismo energetico. Inoltre, i livelli di glucosio intracellulari ed extracellulari sono indicativi dello stato metabolico cellulare. Le tecniche enzimatiche, come la quantificazione del glucosio di Bergmeyer, sono più accurate e sensibili di altre tecniche, come l'acido dinitrosalicilico o i metodi di fluorescenza, che vengono solitamente utilizzati in microbiologia. Sebbene utilizzata principalmente in ambito clinico, la quantificazione del glucosio di Bergmeyer può essere applicata anche a qualsiasi cellula, ma non è stata riportata in dettaglio per batteri, funghi, lieviti o altri microrganismi.
In questo articolo, presentiamo una metodologia per quantificare il glucosio da campioni di batteri e lieviti utilizzando il metodo enzimatico di quantificazione del glucosio di Bergmeyer. La procedura ha coinvolto gli enzimi glucosio ossidasi, perossidasi e o-dianisidina dicloridrato incubati a 37 °C per 20 minuti, seguiti dall'aggiunta di acido solforico. L'assorbanza viene quindi misurata a 545 nm. È importante sottolineare che, sebbene questa tecnica presenti difficoltà nella misurazione di alte concentrazioni di glucosio (superiori a 60 g/L), è possibile misurare concentrazioni inferiori a 50 g/L utilizzando fattori di diluizione. Questo approccio enzimatico è prezioso per la ricerca e l'analisi in microbiologia e in altre aree scientifiche. La precisione e la sensibilità del metodo lo rendono utile per rilevare anche basse concentrazioni di glucosio in campioni microbiologici.
Introduzione
Il glucosio funge da fonte primaria di energia e carbonio per numerosi microrganismi, tra cui batteri, lieviti e funghi. Questi microrganismi assorbono il glucosio attraverso trasportatori situati sulla membrana extracellulare, dove subisce una serie di reazioni biochimiche all'interno della via metabolica della glicolisi per essere convertito in piruvato1. Esistono varie tecniche per la quantificazione degli zuccheri riducenti come il glucosio. Ad esempio, il reagentedi Benedict 2, l'uso dell'acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)3,4, il metodo dell'antropa5 o l'acid....
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Protocollo
1. Preparazione della soluzione
- Preparare 100 mL di tampone fosfato 0,1 M. Pesare 1,28 g di fosfato monobasico di potassio (KH2PO4) e 0,1304 g di fosfato dipotassico (K2HPO4) e aggiungerli in un becher di vetro. Ora, aggiungi 70 ml di acqua deionizzata (H2Odi) e regola il pH a 5,5 utilizzando acido cloridrico 1 M (HCl) o idrossido di potassio (KOH). Trasferire la soluzione in un matraccio tarato e portare il volume finale a 100 ml. Quindi, trasferire la soluzione in un contenitore ambrato e conservare la soluzione a 4-8 °C per un massimo di 3 mesi.
ATTENZIONE: Indossare guanti in ni....
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Risultati
L'analisi spettrofotometrica di GOX-H2SO4 ha rivelato un'unica assorbanza massima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), con valori di assorbanza aggiuntivi osservati a 545 nm. Analizzando i valori di assorbanza a diverse concentrazioni di glucosio, abbiamo ottenuto una linearità (R²) di 0,9977 per λ529 nm e R² di 0,9967 per λ545 nm (Figura 2B). La linearità, all'interno di un dato intervallo, si riferisce alla capacità di fornire risultati diret.......
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Discussione
La quantificazione del glucosio nei terreni di coltura è essenziale per comprendere la crescita microbica e l'attività metabolica, poiché il glucosio funge da fonte di energia primaria per molti microrganismi. In questo studio, abbiamo impiegato il metodo GOX-H2SO4 per misurare con precisione i livelli di glucosio nei terreni di coltura, con l'obiettivo di ottimizzare i processi microbici nei batteri o nelle fermentazioni dei lieviti. I nostri risultati sono coerent.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse
Ringraziamenti
Siamo grati per le donazioni parziali del Tecnológico Nacional de México nel Bando 2023 e 2024 per la Ricerca Scientifica, lo Sviluppo Tecnologico (16432.23-P y 19545.24-P). Ringraziamo il Consiglio Nazionale per le Scienze Umane, le Scienze e le Tecnologie (CONAHCyT) per la borsa di studio ricevuta (n. 832315) durante gli studi di dottorato (IHRH), e si ringrazia la partecipazione e la collaborazione di Wendolyne Monroy-Martínez. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microprovetta da 1,5 mL | Eppendorf | - | - |
| Microprovetta da 2,0 mL | Eppendorf | - | - |
| CaCO3 | Meyer | 471-34-1 | Carbonato di calcio |
| D-glucosio | Meyer | 50-99-7 | D-glucosio |
| Bagno a secco | FisherScientific | 11-718-4 | Seriale 911NO251. Blocco LxPxA mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5 |
| Glucosio ossidasi | Sigma Aldrich | G6125-50KU | Polvere enzimatica |
| H2O | - | - | Acqua deionizzata |
| H2SO4 | Meyer | 7664-93-9 | Acido solforico |
| HCl | Meyer | 7647-01-0 | Acido cloridrico |
| K2HPO4 | Meyer | 7758-11-4 | Fosfato dipotassico |
| KH2PO4 | Meyer | 7778-77-0 | Fosfato monopotassico |
| KOH | Meyer | 1310-58-3 | Idrossido di potassio |
| Lambda 35 | PerkinElmer-Spectrofotometro | ||
| Microtubo centrifuga | - | - | |
| -o-Dianisidina dicloridrato | Sigma Aldrich | D3252 | Perossidasi cromogenica |
| Sigma Aldrich | P8125-50KU | Enzima in polvere | |
| pH-metro | Hanna | 1131 | Hanna 1170 |
| Acetato di sodio | Meyer | 127-09-3 | Meyer |
| Spatole per pesare | - | - | - |
Riferimenti
- Huang, W. C., Tang, I. C. Bacterial and yeast cultures: process characteristics, products, and applications. Bioprocessing for value-added products from renewable resources. New Technologies and Applications. , Elsevier. 185-223 (2007).
- Hernandez-Lopez, A., et al. Quantification of reducing sugars based on the qualitative tech....
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Ristampe e permessi
