Quantificazione del glucosio Bergmeyer per campioni microbiologici

Summary

La quantificazione del glucosio di Bergmeyer è una tecnica enzimatica spettrofotometrica utilizzata principalmente per test clinici che misurano in modo accurato e sensibile la quantità di glucosio. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di questo metodo per i campioni microbiologici.

Abstract

La concentrazione di glucosio è un indicatore chiave del metabolismo cellulare e potrebbe indicare il tasso di metabolismo totale, un'aberrazione nel metabolismo del glucosio e, in alcuni casi, il modo in cui le cellule accoppiano il metabolismo del glucosio al metabolismo energetico. Inoltre, i livelli di glucosio intracellulari ed extracellulari sono indicativi dello stato metabolico cellulare. Le tecniche enzimatiche, come la quantificazione del glucosio di Bergmeyer, sono più accurate e sensibili di altre tecniche, come l'acido dinitrosalicilico o i metodi di fluorescenza, che vengono solitamente utilizzati in microbiologia. Sebbene utilizzata principalmente in ambito clinico, la quantificazione del glucosio di Bergmeyer può essere applicata anche a qualsiasi cellula, ma non è stata riportata in dettaglio per batteri, funghi, lieviti o altri microrganismi.

In questo articolo, presentiamo una metodologia per quantificare il glucosio da campioni di batteri e lieviti utilizzando il metodo enzimatico di quantificazione del glucosio di Bergmeyer. La procedura ha coinvolto gli enzimi glucosio ossidasi, perossidasi e o-dianisidina dicloridrato incubati a 37 °C per 20 minuti, seguiti dall'aggiunta di acido solforico. L'assorbanza viene quindi misurata a 545 nm. È importante sottolineare che, sebbene questa tecnica presenti difficoltà nella misurazione di alte concentrazioni di glucosio (superiori a 60 g/L), è possibile misurare concentrazioni inferiori a 50 g/L utilizzando fattori di diluizione. Questo approccio enzimatico è prezioso per la ricerca e l'analisi in microbiologia e in altre aree scientifiche. La precisione e la sensibilità del metodo lo rendono utile per rilevare anche basse concentrazioni di glucosio in campioni microbiologici.

Introduction

Il glucosio funge da fonte primaria di energia e carbonio per numerosi microrganismi, tra cui batteri, lieviti e funghi. Questi microrganismi assorbono il glucosio attraverso trasportatori situati sulla membrana extracellulare, dove subisce una serie di reazioni biochimiche all'interno della via metabolica della glicolisi per essere convertito in piruvato¹. Esistono varie tecniche per la quantificazione degli zuccheri riducenti come il glucosio. Ad esempio, il reagente^{di Benedict 2}, l'uso dell'acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)^3,4, il metodo dell'antropa⁵ o l'acido fenolo-solforico⁶ possono essere impiegati. Tuttavia, questi metodi rilevano lo zucchero riducente presente nel campione, come il fruttosio e il maltosio, che possono contribuire al segnale e complicare la quantificazione accurata di un particolare zucchero.

Inoltre, richiedono un rigoroso controllo della temperatura e la manipolazione di sostanze pericolose, che possono complicare il processo e influire sulla precisione. Questi metodi possono anche subire l'interferenza di altri composti presenti nel campione, rendendo difficile una quantificazione accurata del glucosio. Al contrario, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) offre un'alternativa più precisa, consentendo la discriminazione tra glucosio e altri zuccheri riducenti, anche se con costi operativi più elevati. Questi metodi contrastanti evidenziano la continua necessità di sviluppare tecniche di quantificazione del glucosio accurate ed economiche⁷.

Il metodo glucosio ossidasi-perossidasi-acido solforico (GOX-H₂SO₄) impiega due enzimi, glucosio ossidasi (GOD) e perossidasi (POD). GOD è un enzima ossidoreduttasi molto selettivo per l'ossidazione del β-D-glucosio⁸. Questo complesso funge da catalizzatore durante la reazione che avviene quando il glucosio è in presenza di ossigeno, producendo acido gluconico e perossido di idrogeno (H₂O₂). L'H₂O₂ viene rilevato per mezzo di un accettore cromogenico di ossigeno, l'o-dianisidina, che, in seguito all'interazione con il POD, ne provoca l'ossidazione e il rilascio di H₂O₂, impedendo che l'acido gluconico venga riconvertito in glucosio (vedi Figura 1). Il colore ottenuto viene stabilizzato mediante l'aggiunta di acido solforico (H₂SO₄), che arresta anche la reazione enzimatica, evitando così possibili interferenze che potrebbero verificarsi se la reazione continuasse⁹.

Figura 1: Panoramica del metodo di quantificazione del glucosio utilizzando l'enzima glucosio ossidasi, che reagisce con il glucosio per produrre perossido di idrogeno (H₂O₂) e acido gluconico. Successivamente, l'enzima perossidasi reagisce con H₂O₂ in presenza di O-dianisidina dicloridrato. Nella fase finale, viene aggiunto acido solforico (H₂SO₄) per fermare la reazione enzimatica, ottenendo un colore rosa che viene misurato a 529 nm. Abbreviazioni: POD = perossidasi; GOD = glucosio ossidasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il metodo enzimatico GOX-H₂SO₄ è una tecnica ampiamente utilizzata per misurare la concentrazione di glucosio in campioni biologici, la maggior parte dei quali sono di interesse clinico. Tuttavia, pochi studi hanno indagato una tecnica che consenta di quantificare la quantità di glucosio in un terreno di coltura per valutarne il consumo. Pertanto, nel presente protocollo, viene presentata la metodologia per quantificare il glucosio mediante la reazione enzimatica di glucosio ossidasi, perossidasi, o-dianisidina dicloridrato e H₂SO₄ in campioni liquidi microbiologici, che nasce come una modifica del lavoro svolto da Bergmeyer⁹, utilizzando il 50% (v/v) di H₂SO₄ e quantità inferiori di reagenti.

Protocol

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare 100 mL di tampone fosfato 0,1 M. Pesare 1,28 g di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄) e 0,1304 g di fosfato dipotassico (K₂HPO₄) e aggiungerli in un becher di vetro. Ora, aggiungi 70 ml di acqua deionizzata (H₂Odi) e regola il pH a 5,5 utilizzando acido cloridrico 1 M (HCl) o idrossido di potassio (KOH). Trasferire la soluzione in un matraccio tarato e portare il volume finale a 100 ml. Quindi, trasferire la soluzione in un contenitore ambrato e conservare la soluzione a 4-8 °C per un massimo di 3 mesi.
   ATTENZIONE: Indossare guanti in nitrile durante tutto il processo di preparazione per evitare il contatto con la pelle e la potenziale contaminazione, poiché l'o-dianisidina dicloridrato è potenzialmente cancerogena.
2. Preparare una soluzione all'1% p/v di o-dianisidina dicloridrato. Pesare 0,01 g di o-dianisidina dicloridrato e metterlo in una provetta da centrifuga da 2,0 mL. Utilizzando una micropipetta da 1.000 mL, aggiungere 1,0 mL di H₂Odi per sciogliere il composto, quindi mescolare lentamente pipettando su e giù. Proteggere la soluzione dalla luce avvolgendo il contenitore in un foglio di alluminio e conservarlo a -20 °C per mantenerne la stabilità.
   NOTA: Per facilitare il supporto della provetta durante la misurazione sulla bilancia analitica, è possibile utilizzare un becher da 10 mL come supporto aggiuntivo. Questo aiuta a stabilizzare il tubo, garantendo una misurazione accurata riducendo al minimo il rischio di spostamento o inclinazione che potrebbero alterare i risultati ottenuti sulla bilancia.
3. In un matraccio tarato da 100 mL, aggiungere 10 mL di soluzione tampone fosfato seguiti da 1 mL della soluzione di o-dianisidina dicloridrato all'1% v/v. Quindi, regolare il volume finale a 100 mL con tampone fosfato per ottenere una concentrazione finale di miscela di tampone o-dianisidina allo 0,01%. Trasferisci la soluzione in un pallone d'ambra e avvolgila con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce. Conservare la soluzione a 4-8 °C per un massimo di 3-4 mesi.
   NOTA: La refrigerazione è essenziale per prevenire la decomposizione, che potrebbe compromettere l'integrità delle misure sperimentali. Per evitare la degradazione della miscela di tampone o-dianisidina, una piccola porzione di 13 mL (sufficiente per 12 campioni) può essere posta in una provetta di plastica da 14 mL su ghiaccio fino al momento dell'uso.
4. Preparare la soluzione al 50% di H₂SO₄ . Immergere un matraccio tarato da 100 mL con 30 mL di H₂Odi in un bagno di ghiaccio e lasciarlo raffreddare per 10 min. Quindi, versare lentamente 51 mL di H₂SO₄ (98% v/v) lungo le pareti del pallone, agitando accuratamente per omogeneizzare la soluzione. Attendere che la miscela si raffreddi, poiché la reazione è esotermica (genera calore). Regolare il volume finale a 100 mL con H₂Odi e trasferire la soluzione in un pallone di vetro ambrato.
   NOTA: Utilizzare una cappa aspirante e seguire tutti i protocolli di sicurezza, assicurarsi di indossare dispositivi di protezione adeguati. Preparare 50 ml di soluzione di carbonato di calcio al 40% per neutralizzare eventuali fuoriuscite che potrebbero verificarsi.
5. Preparare 50 mM di soluzione di acetato di sodio sciogliendo 0,04 g di acetato di sodio in 5 mL di H₂Odi in un becher. Regolare il pH a 5,1 utilizzando acido acetico glaciale. Infine, regolare il volume a 10 ml con H₂Odi.

2. Preparazione degli enzimi

1. In una microprovetta sterile da 2,0 mL, pesare 0,01 g di glucosio ossidasi e mescolare con 1 mL di acetato di sodio da 50 mM, pH 5,0, per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/mL. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e conservare a -20 °C.
   NOTA: La soluzione può essere conservata fino a 2 mesi a -20 °C.
2. Calcolare il volume della soluzione enzimatica V₂ necessario per ottenere l'attività enzimatica desiderata in ciascuna cuvetta di plastica (con un volume totale di 1,5 mL) utilizzando l'Eq (1): V₁C₁ = V₂C₂, dove V₁ è 1.500 μL, C₁ è 28,5 U di attività enzimatica e C₂ (la concentrazione della soluzione enzimatica) è 12.970 U/mL (10 mg dell'enzima [129.000 unità/g] in 1 mL di H₂Odi).
   V₂ = (1.500 μl × 28,5 U)/12.970 U = 3,29 μl (1)
   NOTA: Per un pipettaggio più accurato, il valore può essere arrotondato a 3,3 μl.
3. In una nuova microprovetta da 2 mL, pesare 0,0031 g di enzima perossidasi e aggiungere 1 mL di tampone fosfato, pH 5,5, per ottenere una concentrazione finale di 3,1 mg/mL. Coprire la microprovetta con un foglio di alluminio e conservare a -20 °C.
4. Calcolare il volume della soluzione di perossidasi necessario per ottenere l'attività enzimatica desiderata per cuvetta utilizzando l'Eq (1). Iniziare con un volume totale della cuvetta di 1.500 μL e un'attività enzimatica target di 1,25 U. Quindi, determinare il volume necessario della soluzione enzimatica, data la sua concentrazione di 1.551 U.
   V₂ = (1.500 μl × 1,25 U)/1.551 U = 1,208 μl
   NOTA: Per un pipettaggio più accurato, il valore è stato arrotondato a 1,20 μl.

3. Standard glicemico

1. Preparare uno standard di D-glucosio da 1 g/L aggiungendo 0,01 g di D-glucosio a 10 mL di H₂Odi in un matraccio tarato. Per diluire la concentrazione a 0,5 g/L, prelevare 500 μL della soluzione madre e mescolarla con 500 μL di H₂Odi per ottenere un volume finale di 1 mL.
   NOTA: Questo processo di diluizione è essenziale per creare soluzioni standard accurate.

4. Preparazione della curva standard

1. Utilizzando una nuova microprovetta da 2 mL, aggiungere il tampone e i volumi di glucosio indicati nella Tabella 1.
2. Impostare il termobagno a secco a 37 °C. Una volta che la temperatura è stabile, aggiungere 3,3 μL di glucosio ossidasi a tutte le provette e quindi aggiungere 1,2 μL di perossidasi a ciascuna provetta. Incubare le provette a 37 °C per 20 minuti.
3. Dopo l'incubazione, aggiungere immediatamente 750 μL di 50% H₂SO₄ (v/v) a ciascuna microprovetta e lasciare raffreddare la miscela in un bagno di ghiaccio per 2 minuti. Ciò si traduce in un volume finale di 1.500 μl. Infine, trasferire la soluzione in una cuvetta di plastica e misurare l'assorbanza a 529 nm.

Tabella 1: Curva di calibrazione del glucosio per il metodo GOX-H₂SO₄ . Abbreviazioni: GOD = glucosio ossidasi; POD = perossidasi; H₂SO₄ = acido solforico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

5. Analisi di campioni microbiologici

1. Ottenere il campione coltivando batteri o lieviti in un terreno di coltura liquido in condizioni specifiche, tra cui temperatura, velocità di agitazione e tempo di incubazione. Una volta che la coltura raggiunge la densità ottica (OD) o la concentrazione cellulare desiderata, raccogliere la coltura per un'ulteriore elaborazione.
   NOTA: Pseudomonas reptilivora è stato coltivato a una velocità di agitazione costante di 300 giri/min e 28 °C, mentre Debaryomyces hansenii è stato coltivato con una velocità di agitazione di 200 giri/min a 30 °C in un agitatore orbitale. Nel caso specifico di D. hansenii, l'olio di colza commestibile è stato utilizzato anche come induttore per la produzione di lipasi.
2. Pulire l'area di lavoro con una soluzione alcolica al 70% o un detergente adatto secondo i protocolli di biosicurezza. Accendi un bruciatore per garantire l'asepsi.
3. Trasferire 100 μL di terreno di coltura in una microprovetta da 1,5 mL o 2 mL utilizzando puntali sterili.
4. Centrifugare i campioni a 7.500 × g per 7 minuti a 4 °C o a 10.000 × g per 7 minuti senza controllo della temperatura. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante, che contiene glucosio in soluzione, ed eliminare il pellet.
5. Utilizzare 0,5 μL di surnatante per concentrazioni di glucosio comprese tra 1 e 20 g/L, quindi miscelare con 749,5 μL di tampone o-dianisidina, 3,3 μL di GOD e quindi 1,2 μL di POD. Incubare le microprovette per 20 minuti a 37 °C, come descritto al punto 4.2 e aggiungere immediatamente 750 μl di 50% H₂SO₄ e lasciarle raffreddare in un bagno di ghiaccio per 2 minuti.
   1. Per concentrazioni superiori a 20 g/L, eseguire una diluizione 1:1 con H₂Odi sterile prima di procedere.
   2. Se i campioni di surnatante sono stati precedentemente congelati a -80 °C o -20 °C, scongelarli a temperatura ambiente e agitarli per 30 s prima dell'uso. Se è necessaria una diluizione, utilizzare H₂ODI sterile.
   3. Per campioni con concentrazioni di glucosio superiori a 30 g/L, eseguire una diluizione 1:1 con H₂ODI sterile, ottenendo un fattore di diluizione di 2.
6. Calcolare la concentrazione totale di glucosio in ciascun campione utilizzando l'Eq (2) in un foglio di calcolo.
   (2)
   Dove:
   x = concentrazione di glucosio (g/L) δ = volume finale di reazione (0,0015 L)
   y = assorbanza M.S. = quantità di campione utilizzato*
   NOTA: I valori b e m provengono dall'equazione che modella la linea di tendenza della curva di calibrazione per il metodo (y = mx + b). *Il valore M.S. deve essere basato sulla quantità di campione utilizzata per ottenere il rapporto alla diluizione corrispondente (cioè, se si prelevano 0,5 μL del surnatante, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); se si utilizza un fattore di diluizione (DF), moltiplicare l'assorbanza ottenuta per il DF.
   Ad esempio, se si ottiene un'assorbanza di 0,5 e si utilizza un DF di 2, il risultato sarebbe 1,0. Pertanto, y = 1,0 e questo valore deve essere inserito nell'Eq (2), come descritto in precedenza.

6. Validazione analitica

1. Calcolare i parametri di validazione analitica del metodo GOX-H₂SO₄ secondo quanto stabilito dal Centro Nazionale di Metrologia e dall'Ente di Accreditamento Messicano¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Calcola la precisione come percentuale del coefficiente di variazione o %CV = (S/x) × 100, dove x è la media del gruppo campione e S è la deviazione standard con un valore di accettazione del ≤10%.
   2. Determinare la linearità adattando la curva standard al modello lineare R² superiore a 0,995.
   3. Calcolare il limite di quantificazione (LOQ) utilizzando l'equazione: LOQ = yB + 10sB, dove yB rappresenta la concentrazione dell'analita che produce un segnale equivalente al segnale target e 10sB denota 10 volte la deviazione standard del bianco
   4. Calcola l'errore sistematico usando questa equazione: Inclinazione = x - m, dove x = media della concentrazione sperimentale e m è la concentrazione teorica.
   5. Determina l'accuratezza come il grado di accordo tra un valore reale e un valore teorico.
      % di recupero = (CR/CV) × 100
      Dove CR è la media della concentrazione sperimentale e CV è il coefficiente di variazione della concentrazione teorica.

7. Interferenza di altri zuccheri riducenti

1. Valutare separatamente quattro zuccheri riducenti: glucosio, fruttosio, galattosio e xilosio da una soluzione madre di 0,5 g/L. Inoltre, usa il trealosio come controllo negativo. Seguire il protocollo per tutti i campioni e misurare l'assorbanza a 545 e 529 nm.

Results

L'analisi spettrofotometrica di GOX-H₂SO₄ ha rivelato un'unica assorbanza massima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), con valori di assorbanza aggiuntivi osservati a 545 nm. Analizzando i valori di assorbanza a diverse concentrazioni di glucosio, abbiamo ottenuto una linearità (R²) di 0,9977 per λ529 nm e R² di 0,9967 per λ545 nm (Figura 2B). La linearità, all'interno di un dato intervallo, si riferisce alla capacità di fornire risultati diret...

Discussion

La quantificazione del glucosio nei terreni di coltura è essenziale per comprendere la crescita microbica e l'attività metabolica, poiché il glucosio funge da fonte di energia primaria per molti microrganismi. In questo studio, abbiamo impiegato il metodo GOX-H₂SO₄ per misurare con precisione i livelli di glucosio nei terreni di coltura, con l'obiettivo di ottimizzare i processi microbici nei batteri o nelle fermentazioni dei lieviti. I nostri risultati sono coerent...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microprovetta da 1,5 mL	Eppendorf	-	-
Microprovetta da 2,0 mL	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Carbonato di calcio
D-glucosio	Meyer	50-99-7	D-glucosio
Bagno a secco	FisherScientific	11-718-4	Seriale 911NO251. Blocco LxPxA mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Glucosio ossidasi	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Polvere enzimatica
H2O	-	-	Acqua deionizzata
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Acido solforico
HCl	Meyer	7647-01-0	Acido cloridrico
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosfato dipotassico
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosfato monopotassico
KOH	Meyer	1310-58-3	Idrossido di potassio
Lambda 35	PerkinElmer-Spectrofotometro
Microtubo centrifuga	-	-
-o-Dianisidina dicloridrato	Sigma Aldrich	D3252	Perossidasi cromogenica
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzima in polvere
pH-metro	Hanna	1131	Hanna 1170
Acetato di sodio	Meyer	127-09-3	Meyer
Spatole per pesare	-	-	-