Method Article

Purificazione basata sul sistema MultiBac e caratterizzazione biofisica della miosina-7a umana

DOI:

10.3791/67135

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August 23rd, 2024

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1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per la produzione ricombinante dell'oloenzima miosina-7a umano utilizzando il sistema MultiBac Baculovirus e per lo studio della sua motilità utilizzando un saggio di scorrimento del filamento in vitro su misura.

Abstract

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La miosina-7a è una proteina motoria a base di actina vitale per i processi uditivi e visivi. Le mutazioni della miosina-7a portano alla sindrome di Usher di tipo 1, la forma più comune e grave di sordocecità nell'uomo. Si ipotizza che la miosina-7a formi un complesso di adesione transmembrana con altre proteine di Usher, essenziali per l'integrità strutturale-funzionale dei fotorecettori e delle cellule ciliate cocleari. Tuttavia, a causa delle sfide nell'ottenere proteine pure e intatte, gli esatti meccanismi funzionali della miosina-7a umana rimangono sfuggenti, con studi strutturali e biomeccanici limitati disponibili. Studi recenti hanno dimostrato che la miosina-7a dei mammiferi è un complesso motorio multimerico costituito da una catena pesante e tre tipi di catene leggere: catena leggera regolatoria (RLC), calmodulina e proteina 4 simile alla calmodulina (CALML4). A differenza della calmodulina, CALML4 non si lega agli ioni calcio. Sia le calmoduline sensibili al calcio che quelle insensibili sono fondamentali per la miosina-7a dei mammiferi per una corretta messa a punto delle sue proprietà meccaniche. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per produrre l'oloenzima ricombinante della miosina-7a umana utilizzando il sistema di espressione proteica MultiBac Baculovirus. Ciò produce quantità di milligrammi di proteina a lunghezza intera di elevata purezza, consentendone la caratterizzazione biochimica e biofisica. Presentiamo inoltre un protocollo per valutarne le proprietà meccaniche e mobili utilizzando saggi di motilità in vitro su misura e microscopia a fluorescenza. La disponibilità della proteina miosina-7a umana intatta, insieme al dettagliato protocollo di caratterizzazione funzionale qui descritto, apre la strada a ulteriori indagini sugli aspetti molecolari della miosina-7a nella vista e nell'udito.

Introduction

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Le miosine sono proteine motrici molecolari che interagiscono con l'actina per guidare numerosi processi cellulari 1,2,3,4. Gli esseri umani possiedono 12 classi e 39 geni della miosina5, che sono coinvolti in un'ampia gamma di funzioni fisiologiche, come la contrazione muscolare6 e i processi sensoriali7. Ogni molecola di miosina è un complesso multimerico composto da una catena pesante e da catene leggere. La catena pesante è divisa in regioni della testa, del collo e della coda. La testa contiene siti di legame dell'actina e del nucleotide che sono responsabili dell'idrolisi dell'ATP e della generazione di forza sui filamenti di actina2. Il collo è formato da diversi motivi IQ a α elicoidali in cui è legato un insieme specifico di catene leggere. Insieme funzionano come un braccio di leva per amplificare i cambiamenti conformazionali del motore in grandi movimenti 8,9,10. La coda contiene sottodomini specifici di classe e svolge un ruolo regolatorio nella regolazione dell'attività motoria della miosina e nella mediazione delle interazioni con i partner di legame cellulare 2,11.

La miosina-7a umana, un membro della miosina di classe 7, è essenziale per i processi uditivi e visivi12,13. I motivi del QI della miosina-7a umana sono associati a una combinazione unica di catene leggere, tra cui la catena leggera regolatoria (RLC), la calmodulina e la proteina 4 simile alla calmodulina (CALML4)14,15,16. Oltre a stabilizzare il braccio di leva, queste catene leggere regolano le proprietà meccaniche della miosina-7a in risposta alla segnalazione del calcio, una caratteristica che sembra essere unica per l'isoforma14 dei mammiferi.

I difetti nel gene che codifica per la catena pesante della miosina-7a (MYO7A/USH1B) sono responsabili della sindrome di Usher di tipo 1, la forma più grave di perdita combinata della vista e dell'udito nell'uomo17. Inoltre, il gene della catena leggera CALML4 è tra i geni candidati mappati per contenere l'allele causativo per USH1H, un'altra variante della sindrome di Usher di tipo 115,18. Nella retina, la miosina-7a è espressa nell'epitelio pigmentato retinico e nelle cellule fotorecettrici13. È stato implicato nella localizzazione dei melanosomi nell'epitelio pigmentato retinico (RPE)19 e nella fagocitosi dei dischi del segmento esterno dei fotorecettori da parte delle cellule RPE20. Nell'orecchio interno, la miosina-7a si trova principalmente nelle stereociglia, dove svolge un ruolo fondamentale nella creazione di fasci di capelli e nel controllo del processo di trasduzione meccano-elettrica 12,21,22.

Mentre l'importanza della miosina-7a nelle cellule sensoriali è ben consolidata, i suoi meccanismi funzionali a livello molecolare rimangono poco compresi. Questa lacuna nelle conoscenze è in parte dovuta alle sfide nella purificazione della proteina intatta, in particolare dell'isoforma dei mammiferi. Recentemente, sono stati compiuti progressi significativi utilizzando il sistema MultiBac per esprimere in modo ricombinante l'oloenzima14 completo della miosina-7a umana. Questo progresso ha permesso la caratterizzazione strutturale e biofisica di questa proteina motrice, portando alla scoperta di diverse proprietà uniche della miosina-7a umana che sono specificamente adattate per le funzioni uditive dei mammiferi14,23.

Il sistema MultiBac è una piattaforma avanzata di baculovirus/cellule di insetti specificamente progettata per l'espressione di complessi multimerici eucariotici24,25. Una caratteristica chiave di questo sistema è la sua capacità di ospitare più cassette di espressione genica, ciascuna delle quali codifica per una subunità del complesso, all'interno di un singolo baculovirus MultiBac. L'assemblaggio delle cassette di espressione multigenica è facilitato attraverso un cosiddetto modulo di moltiplicazione: un sito di endonucleasi di homing (HE) e un sito BstXI progettato per la corrispondenza che fiancheggia i siti di clonazione multipli (MCS). Questo modulo consente l'assemblaggio iterativo di una singola cassetta di espressione mediante restrizione/legatura, sfruttando il fatto che i siti di restrizione HE e BstXI vengono eliminati al momento della legatura. In questo articolo, la catena pesante della miosina-7a umana, RLC, calmodulina e CALML4 sono clonate nel modulo di moltiplicazione all'interno del vettore pACEBac1 (Figura 1A), che vengono poi assemblate in una cassetta di espressione multigenica attraverso il processo iterativo (Figura 1B). La cassetta multigenica della miosina-7a è integrata nel genoma baculovirale (bacmid) attraverso la trasposizione dell'elemento mini-Tn7 dal vettore pACEBac1 al sito bersaglio mini-attTn7 nel genoma (Figura 1C). Seguendo le procedure per la purificazione del bacmid, la produzione di baculovirus e l'amplificazione (Figura 1D, E), viene preparato il baculovirus ricombinante Myosin-7a MultiBac che può essere utilizzato per la produzione di proteine su larga scala (Figura 1F). Inoltre, le catene leggere della miosina-7a possono essere prodotte separatamente in E. coli e purificate utilizzando un tag His6-SUMO 26,27,28 scissabile. Le catene leggere purificate sono utili per studiare la loro dinamica di legame e la regolazione della miosina-7a.

La proteina miosina-7a purificata può essere sottoposta a studi strutturali, biochimici e biofisici per ottenere informazioni sulla regolazione strutturale-funzionale di questa proteina motrice. Inoltre, le sue interazioni con la rete di actina e altre proteine leganti29 possono essere esaminate utilizzando una varietà di approcci di ricostituzione in vitro. I risultati di queste analisi informeranno le proprietà biofisiche di questa miosina, portando a una comprensione meccanicistica di come la miosina-7a guida i cambiamenti del citoscheletro e, in ultima analisi, modella la morfologia e la funzione uniche delle cellule sensoriali. In questo articolo, descriviamo in dettaglio un flusso di lavoro per il saggio di scorrimento del filamento di actina che è stato specificamente adattato per la miosina-7a dei mammiferi. Il saggio di scorrimento del filamento di actina è un robusto test di motilità in vitro che studia quantitativamente il movimento dei filamenti fluorescenti di actina spinti da un gran numero di motori di miosina immobilizzati su una superficie di vetrino 30,31,32. I vantaggi di questo test includono la semplicità di configurazione, i requisiti minimi di attrezzatura (un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di una fotocamera digitale) e l'elevata riproducibilità. Inoltre, poiché il movimento dei filamenti di actina è guidato da un gruppo di motori di miosina immobilizzati, questo test è particolarmente utile per studiare la motilità di miosine monomeriche come la miosina-7a14,33. I protocolli includono diverse modifiche, dalle procedure sperimentali all'analisi di imaging, specificamente adattate alle proprietà mobili uniche della miosina-7a dei mammiferi. Con la disponibilità della proteina miosina-7a intatta e il protocollo di caratterizzazione funzionale qui descritto, questo articolo pone le basi per ulteriori indagini sui ruoli molecolari della miosina-7a nei processi sia fisiologici che patologici.

Protocol

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NOTA: Qui descriviamo un protocollo per sintetizzare l'oloenzima miosina-7a umano intatto e caratterizzare la sua motilità in vitro. Questo protocollo è diviso in tre sezioni: in primo luogo, l'espressione della miosina-7a umana utilizzando il sistema di espressione proteica del baculovirus MultiBac; In secondo luogo, purificare separatamente le catene leggere della miosina-7a utilizzando il sistema E.coli His6-SUMO; e infine, lo studio della motilità della miosina-7a umana utilizzando il saggio di scorrimento del filamento di actina.

1. Produzione di miosina-7a basata sul sistema MultiBac

  1. Creazione di una cassetta multigenica per baculovirus per l'espressione del complesso miosina-7a umano (16 giorni)
    NOTA: Richiede un ciclo di clonazione (4 giorni) per inserire i cDNA delle subunità della miosina-7a nei vettori pACEBac1 e tre cicli di clonazione per completare la legatura graduale di tutti i moduli di moltiplicazione necessari per esprimere il complesso miosina-7a, per un totale di 16 giorni.
    1. Clonare i cDNA che codificano per la catena pesante della miosina-7a (HC), la calmodulina, CALML4 e RLC nei vettori pACEBac1 utilizzando un kit commerciale che segue i protocolli del produttore (vedi Tabella dei materiali; Figura 1A). Un tag FLAG viene inserito all'estremità C della miosina-7a HC per facilitare la purificazione.
      NOTA: La miosina-7a dei mammiferi è prodotta in due isoforme di splicing, che differiscono solo per un segmento di 11 amminoacidi all'N-terminale23. Questa breve estensione N-terminale svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dell'attività ATPasica della miosina-7a14. È stato dimostrato che l'aggiunta di un tag N-terminale può interrompere la normale regolazione da parte di questa estensione N-terminale e ridurre significativamente l'attività enzimatica e la motilità del motore14. Pertanto, viene utilizzato un tag FLAG C-terminale per evitare di interrompere la regolazione naturale della proteina.
    2. Costruire la cassetta di espressione multigenica per l'oloenzima miosina-7a utilizzando la moltiplicazione endonucleasi/BstXI come descritto di seguito (Figura 1B).
      NOTA: L'endonucleasi I-CeuI produce estremità coesive compatibili con le estremità generate dal digestato BstXI. Dopo la legatura, viene creato un sito di restrizione ibrido endonucleasi/BstXI di homing che non può essere tagliato da nessuno dei due enzimi. La stessa procedura può essere ripetuta per integrare più moduli di moltiplicazione. Se sono presenti più siti di restrizione per I-CeuI e BstXI sui costrutti di inserto o vettori, questi siti aggiuntivi devono essere eliminati mediante mutagenesi sito-specifica per garantire che i siti di taglio I-CeuI e BstXI siano unici.
    3. Preparazione dell'inserto: digerire il costrutto dell'inserto (ad es. pACEBac-M7a HC) con l'endonucleasi di riferimento I-CeuI (vedere la Tabella dei materiali), quindi purificare il plasmide linearizzato utilizzando un kit di purificazione PCR (vedere la Tabella dei materiali). Inoltre, digerire il plasmide linearizzato con BstXI (vedi Tabella dei materiali), separare il frammento contenente la cassetta di espressione genica utilizzando l'elettroforesi su gel e purificare utilizzando un kit di estrazione su gel (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: I-CeuI e BstXI richiedono condizioni tampone diverse, secondo i protocolli del produttore, per raggiungere il 100% di attività. Inoltre, un taglio completo con I-CeuI richiede un minimo di 3 ore, mentre BstXI richiede solo 15 minuti di incubazione. Le digestioni devono quindi essere eseguite in sequenza.
    4. Preparazione del vettore: Linearizzare il costrutto vettoriale (ad es. pACEBac-CaM) attraverso la digestione di BstXI. La fosfatasi alcalina è inclusa nella preparazione del vettore per evitare che il plasmide vettore si leghi a se stesso (vedi Tabella dei materiali). Ottenere il prodotto della digestione mediante elettroforesi e purificarlo con un kit di estrazione su gel.
    5. Legatura: legare l'inserto trattato con I-CeuI/BstXI e il vettore trattato con BstXI con T4 DNA Ligasi (vedi Tabella dei materiali). Eseguire reazioni di legatura a temperatura ambiente (20 °C -25 °C) per 10 minuti con un rapporto 1:1 in massa del DNA dell'inserto rispetto al DNA vettore, mantenendo la massa totale vicina a 100 ng in ciascuna reazione di legatura.
    6. Trasformazione e analisi plasmidica: Trasformare le miscele di legatura in cellule DH5α (vedi Tabella dei materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore ed esaminare le colonie positive per la resistenza alla gentamicina. Purificare i plasmidi utilizzando un kit commerciale (vedi Tabella dei materiali) e verificare i cloni corretti (ad esempio, plasmidi contenenti sia M7a HC che CaM) in base a specifici modelli di digestione di restrizione e al sequenziamento del DNA degli inserti.
    7. Integrazione di più cassette di espressione genica: ripetere i passaggi da 1.1.2 a 1.1.6 per integrare ulteriori cassette geniche che esprimono altre subunità della miosina-7a.
  2. Produzione e purificazione di DNA bacmide ricombinante (4 giorni; Figura 1C).
    NOTA: Giorno 1 - Trasformazione batterica e crescita delle colonie trasformate. Giorni 2-3 - Colonie in crescita e screening per una trasformazione di successo. Giorno 3 - Selezione e striatura delle colonie positive, inizio dell'inoculazione notturna. Giorno 4 - Purificazione del DNA di bacmid.
    1. Trasformare le cellule competenti DH10Bac (vedi Tabella dei materiali) con 1 ng del plasmide pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM sequenziato seguendo le raccomandazioni del produttore.
    2. Piastra 20-200 μL delle cellule su una piastra di agar contenente 50 μg/mL di kanamicina, 7 μg/mL di gentamicina, 10 μg/mL di tetraciclina, 100 μg/mL di indolil-β-galattoside alogenato e 40 μg/mL di IPTG (vedi Tabella dei materiali) e incuba la piastra a 37°C per 48 ore per consentire lo sviluppo del colore blu intenso nei cloni negativi.
      NOTA: L'indolil-β-galattoside alogenato colora le colonie che continuano ad esprimere LacZ (indicando che la trasposizione non è andata a buon fine), consentendo la selezione di colonie bianche in cui la trasposizione ha avuto successo.
    3. Selezionare attentamente una colonia bianca isolata e far crescere le cellule per una notte in 5 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina, 7 μg/mL di gentamicina e 10 μg/mL di tetraciclina a 37 °C in un agitatore orbitale a 225 giri/min.
    4. Centrifugare la coltura a 2.465 x g per 10 minuti per pellettare l'E coli. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 300 μL di tampone P1 dal kit.
      NOTA: Sebbene qui vengano utilizzati i tamponi del kit Miniprep, il protocollo per la purificazione del prodotto bacmid varia dal protocollo fornito con il kit.
    5. Aggiungere 300 μl del tampone P2 dal kit. Mescolare capovolgendo le provette un paio di volte, quindi incubare a temperatura ambiente per 3 minuti.
    6. Aggiungere 300 μl del tampone N3 dal kit e mescolare per inversione per arrestare la reazione di lisi. Centrifugare a 17,885 x g per 10 min a 4 °C.
    7. Trasferire il surnatante in una provetta sterile pulita e ripetere la centrifugazione per altri 10 minuti.
    8. Trasferire 800 μl di surnatante in un'altra provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 mL (vedere Tabella dei materiali) e aggiungere 600 μl di isopropanolo freddo (vedere Tabella dei materiali), mescolando per inversione rigorosa. Centrifugare quindi a 17,885 x g per 20 min a 4 °C.
    9. Scartare il surnatante e individuare il piccolo pellet bianco. Lavare il pellet con 800 μL di etanolo freddo al 70% (vedi Tabella dei materiali) e centrifugare a 17.885 x g per 5 minuti a 4 °C. Aggiungere con cautela etanolo lungo la parete del tubo per evitare di disturbare il pellet.
    10. Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio con etanolo una volta. Asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 5 minuti. Aspirare accuratamente il liquido in eccesso, se necessario.
    11. Sciogliere il pellet con 20 μL di tampone EB dal kit. Assicurarsi che il pellet sia completamente sciolto agitando la provetta o mescolando delicatamente pipettando. Determinare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali).
    12. Regolare il volume del tampone secondo necessità per ottenere una concentrazione di bacmid a circa 1 μg/μL. Conservare il DNA di bacmid a 4 °C fino al momento della produzione del virus P0.
      NOTA: Il bacmide purificato può essere conservato a 4 °C e rimane efficace per diversi mesi. Abbiamo visto trasfezioni di successo con prodotti bacmid fino a 1 anno di età. In alternativa, il bacmid può essere aliquotato e conservato a -20 °C. Dovrebbero essere evitati più cicli di congelamento/scongelamento in quanto riducono l'efficienza di trasfezione.
  3. Trasfettare le cellule di insetto Sf9 con bacmid per produrre baculovirus ricombinante (6 giorni; Figura 1D)
    NOTA: Giorno 1 - Trasfezione di cellule con DNA bacmide. Giorni 2-6 - Osservare la crescita e l'espressione delle cellule. Giorno 6 - Raccolta del virus P0.
    1. Aggiungere le cellule Sf9 nei terreni di coltura (vedere la Tabella dei materiali) a una piastra a 6 pozzetti a una concentrazione di 0,33 x 106 cellule/mL con 3 mL per pozzetto. Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle celle di attaccarsi al fondo della piastra.
    2. Per ogni pozzetto, preparare una miscela di trasfezione combinando 10 μl di reagente di trasfezione lipidica cationica (vedere la Tabella dei materiali) con 250 μl di terreno MEM (Minimal Essential Medium) migliorato (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta sterile per microcentrifuga. Mescolare per inversione e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Aggiungere 1 μg (in base alla concentrazione determinata al punto 1.2.12) di miosina-7a bacmid non diluita alla miscela di trasfezione. Mescolare per inversione e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Distribuire equamente l'intera miscela DNA-lipidi goccia a goccia nei pozzetti. Lasciare un pozzetto per le cellule non trasfettate come controllo negativo.
    5. Sigillare la piastra a 6 pozzetti con una pellicola (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 27 °C per 6 giorni. Osserva la crescita e il distacco durante questo periodo. Se è presente un'etichetta fluorescente sul costrutto, verificare lo sviluppo della fluorescenza (Figura 2).
    6. Quando le cellule trasfettate mostrano segni di infezione in fase avanzata, trasferire il terreno contenente il virus dai pozzetti infetti a una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 805 x g per 10 minuti.
    7. Trasferire il surnatante in una provetta conica pulita da 15 mL, avvolgerla in un foglio di alluminio e conservarla a 4 °C. Questo prodotto è ora il virus P0 e può essere conservato e utilizzato efficacemente per un massimo di quattro mesi dalla nostra esperienza.
  4. Amplificare le scorte di baculovirus (3-5 giorni; Figura 1E)
    1. Preparare 100 mL (o il volume desiderato) di cellule Sf9 a una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL in terreni di coltura cellulare Sf9 in un pallone di Erlenmeyer da 250 mL (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Aggiungere il rapporto 1:100 (v/v) dello stock di virus P0 alla coltura in sospensione cellulare Sf9 e incubare a 27 °C in un agitatore orbitale a 135 giri/min.
    3. Monitorare la crescita ogni 24 ore fino a quando le cellule raggiungono ~90% di morte cellulare. Una volta raggiunto questo intervallo, centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 10 minuti e raccogliere il surnatante contenente il virus P1.
    4. Filtrare il surnatante utilizzando una filtrazione sottovuoto da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali). Conservare il prodotto filtrato al buio e conservarlo a 4 °C. Questo prodotto è ora il virus P1.
      NOTA: Il titolo del virus diminuisce con la conservazione a lungo termine a 4 °C. Prendere in considerazione la possibilità di creare una nuova scorta di virus se è stata conservata per più di 4 mesi, o di titolare la scorta di virus prima dell'uso nell'espressione34.
  5. Espressione proteica (60 -72 h tra l'inizio dell'espressione e la raccolta del pellet cellulare; Figura 1E)
    1. Preparare cellule Sf9 in crescita in fase logaritmica a una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL e aggiungere il virus P1 a un rapporto di 12 mL di virus per 300 mL di sospensione cellulare.
      NOTA: La resa proteica è di circa 1 mg/L. Si raccomanda di utilizzare un minimo di 1,5 L di sospensione cellulare per l'espressione di questa proteina.
    2. Coltura delle cellule a 27 °C in agitatore orbitale a 135 giri/min per circa 60 ore.
      NOTA: Piccoli campioni possono essere raccolti in diversi punti temporali e analizzati utilizzando gel SDS per valutare i livelli di espressione proteica. Inoltre, se le proteine sono fuse con tag fluorescenti, i livelli di espressione possono essere valutati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Le cellule devono essere raccolte entro e non oltre l'inizio della morte cellulare.
    3. Centrifugare la sospensione cellulare a 3,735 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule. I pellet possono essere conservati a -80 °C fino a un nuovo utilizzo o conservati per una conservazione a lungo termine. In genere utilizziamo pellet cellulari entro poche settimane, ma abbiamo recuperato le proteine attive diversi mesi dopo il congelamento.
  6. Purificazione delle proteine (2 giorni; Figura 1F)
    NOTA: Giorno 1 - Estrazione e purificazione delle proteine mediante cromatografia di affinità FLAG. Giorno 2 - Aliquotazione e congelamento dei campioni dopo la dialisi notturna. Il protocollo descritto di seguito è per la purificazione della miosina-7a da pellet cellulari da 1,5 L.
    1. Preparare il tampone master contenente 10 mM di MOPS (pH 7,2), 500 mM di NaCl, 10 mM di MgCl2, 1 mM di EGTA, 1 μg/mL di leupeptina e 100 μg/mL di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF). Filtrarlo con un filtro con pori di 0,22 μm e conservare il tampone a 4 °C (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Il PMSF è instabile in soluzioni acquose. Preparare la soluzione madre PMSF come 1 M in etanolo al 100% e conservarla a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
    2. Preparare 75 mL di tampone di estrazione integrando il Master Buffer con 3 compresse di inibitori della proteasi prive di EDTA, 2 mM di ATP e 0,1 mM di ditiotreitolo (DTT; vedere la Tabella dei materiali).
    3. Aggiungere 75 ml di tampone di estrazione al pellet mentre è ancora congelato. Lasciare il pellet nel tampone di estrazione sul ghiaccio fino a quando non si scongela. Utilizzare una pipetta sierologica per rompere il pellet per accelerare il processo di scongelamento.
    4. Utilizzando una punta da 1/2 pollice (13 mm), sonicare la risospensione sul ghiaccio per 10 minuti al 50% di ampiezza, 5 s on, 5 s off.
    5. Centrifugare il lisato totale a 33,746 x g per 30 minuti a 4 °C. Durante la centrifugazione, preparare 1,5 mL di resina FLAG lavando 3 mL del 50% di impasto liquido di resina di affinità Anti-FLAG (vedi Tabella dei materiali) con 40 mL di PBS. Pellettare la resina centrifugando a 800 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere con cura il PBS senza disturbare la resina.
    6. Aggiungere il surnatante della centrifugazione del lisato alla resina lavata e incubare con rotazione continua a 4 °C per 1 ora.
    7. Pellettare la resina centrifugando a 800 x g per 2 minuti a 4°C. Senza disturbare la resina, rimuovere il surnatante.
    8. Risospendere la resina in 40 mL di Master Buffer e centrifugare a 800 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere con cura il surnatante senza disturbare la resina. Ripetere il lavaggio 1 volta.
    9. Trasferire la resina lavata in due colonne di centrifuga in polipropilene (vedi Tabella dei materiali). Lavare ogni colonna 1 volta con 2 mL di Master Buffer. Rimuovere il Master Buffer centrifugando la colonna a 1.400 x g per 2 minuti a 4 °C. La resina verrà imballata sul fondo.
    10. Preparare un tampone di eluizione aggiungendo 100 μg/mL di peptide FLAG (vedere la tabella dei materiali) al tampone master.
    11. Aggiungere 300 μl di tampone di eluizione alla resina impaccata in ciascuna colonna e mescolare delicatamente mediante pipettaggio per garantire che la resina sia completamente idratata dal tampone di eluizione. Lasciare incubare la resina con il tampone di eluizione su ghiaccio per 10 minuti.
    12. Centrifugare le colonne a 1.400 x g per 2 minuti a 4 °C. Trasferire il flusso in una provetta da microcentrifuga pulita e tenerla in ghiaccio. Questa è la prima frazione.
    13. Ripetere i passaggi 1.6.11-1.6.12 in modo tale che vengano raccolte 4 frazioni da ciascuna colonna.
    14. Eseguire l'elettroforesi su gel SDS-PAGE35 con le frazioni di eluizione per determinarne le concentrazioni relative. Durante l'esecuzione del gel, preparare un tampone per dialisi contenente 500 mM di NaCl, 10 mM di MOPS, 2 mM di MgCl2, 0,1 mM di EGTA e 1 mM di DTT.
    15. Combina le frazioni più concentrate. Trasferire il campione in una cassetta per dialisi MWCO da 10K (vedere la tabella dei materiali) e dializzare per una notte a 4 °C. Utilizzare 1 litro di tampone per dialisi per circa 500 μl di proteine. Eseguire almeno tre sostituzioni del tampone per dialisi.
      NOTA: La colonna di centrifugazione e il metodo di eluizione per centrifugazione consentono di eluire le proteine ad alte concentrazioni (0,5-1 mg/mL). Di solito non sono necessari ulteriori passaggi di concentrazione. Tuttavia, se si desidera una maggiore concentrazione di proteine, caricare i campioni su 100.000 provette di concentrazione MWCO (vedere la Tabella dei materiali) e centrifugare a 1.400 x g per 5 minuti a 4 °C. Ripetere questo processo fino a raggiungere il volume di soluzione proteica desiderato.
    16. Il giorno successivo, scaricare con cautela il campione dalla cassetta per dialisi. Aliquotare 15 μl per provetta PCR e immergere le provette in un contenitore di azoto liquido per il congelamento rapido. Le proteine congelate possono essere conservate a -80 °C per un uso futuro (Figura 3A).
      NOTA: La resa di miosina-7a con questo metodo è solitamente compresa tra 0,5 e 1 mg/L.

2. Purificazione delle catene leggere RLC e CALML4 utilizzando il sistema E. coli His6-SUMO (7 giorni)

NOTA: Giorni 1-4 - Clonazione e purificazione dei plasmidi. Giorno 5 - Trasformazione batterica. Giorni 6-7 - Purificazione, aliquotazione e congelamento delle proteine finali.

  1. Clonare i cDNA che codificano per RLC e CALML4 in un vettore pET-SUMO, che contiene una sequenza His6 prima di SUMO per facilitare la purificazione. Quando necessario, il dominio His6-SUMO può essere scisso dalla proteina di fusione utilizzando una proteasi SENP226,36.
  2. Per ogni proteina della catena leggera, trasformare le cellule competenti di E. coli BL21 (vedi Tabella dei materiali) con il plasmide e iniziare una coltura liquida notturna di 5 mL con le cellule trasformate.
  3. Il giorno successivo, inoculare i 5 ml di coltura notturna in 1 litro di brodo Luria-Bertani (LB) contenente 50 μg/ml di kanamicina. Lasciare crescere la coltura a 37 °C con agitazione continua a 270 giri/min fino a quando la densità ottica (O.D.) raggiunge 0,6 - 1,0.
    NOTA: Il valore del diametro esterno raddoppia circa ogni 20 minuti una volta raggiunto 0,2. Monitorare frequentemente il O.D.
  4. Avviare l'espressione proteica aggiungendo alla coltura 250 μM di isopropil b-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). Incubare per 3-5 ore a 37 °C o 16 °C durante la notte con agitazione continua a 270 giri/min.
  5. Pellettare E. coli centrifugando la sospensione cellulare a 4,347 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  6. Preparare un tampone di risospensione contenente 50 mM di Tris-HCl, 1 M di NaCl, 5 mM di Imidazolo e glicerolo al 10%, pH 7,4 (vedere la Tabella dei materiali). Mantenere il ghiaccio.
  7. Risospendere il pellet in 15-25 mL di tampone di risospensione e trasferire la sospensione in un becher pulito, regolando il volume totale a 35 mL. Aggiungere DNasi e RNasi alla sospensione in un rapporto di 1:1000 (v/v) per una concentrazione finale rispettivamente di 1 μg/mL e 2 μg/mL. Aggiungere alla sospensione una compressa di inibitore della proteasi senza EDTA, 4 mM di 2-mercaptoetanolo e 1% di Triton X (vedere Tabella dei materiali). Conservare in ghiaccio per 20 min.
  8. Sonicare la sospensione del pellet in acqua ghiacciata con 1 s acceso e 1 s spento per un totale di 1 minuto al 100% di ampiezza. Lasciare il lisato omogeneizzato a 4 °C con rotazione continua per 2 h.
    NOTA: L'aggiunta di Triton X aiuta a lisare le cellule in preparazione alla sonicazione.
  9. Centrifugare i lisati a 26.900 x g per 45 min a 4 °C. Mentre ciò accade, inizia a preparare la resina di cobalto (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare 500 μL di resina di cobalto per 1 L di coltura di E. coli . Lavare la resina 2 volte con acqua ultrapura e una volta con il tampone di sospensione centrifugando a 4.347 x g per 2 minuti a 4 °C.
  10. Dopo la centrifugazione del lisato, unire il surnatante con la resina lavata e sfondare delicatamente a 4 °C per 30 minuti.
  11. Centrifugare la sospensione di resina lisato a 4.347 x g per 2 minuti a 4 °C. La resina verrà imballata nella parte inferiore del tubo. Senza disturbare la resina, rimuovere il surnatante.
  12. Lavare la resina con il tampone di risospensione centrifugando a 4.347 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante. Ripetere i lavaggi fino a quando il surnatante non è incolore.
  13. Preparare il tampone di eluizione contenente 50 mM di Tris HCl, 300 mM di NaCl, 5 mM di imidazolo, glicerolo al 10%, 4 mM di 2-mercaptoetanolo e 0,25 μM di proteasi SENP2 (vedere la Tabella dei materiali). Tienilo in ghiaccio.
  14. Risospendere la resina in 1 mL di tampone di risospensione e incubarla per una notte a 4 °C con rotazione continua.
  15. Il giorno successivo, centrifugare a 4.347 x g per 2 minuti per pellettare la resina. Raccogli il surnatante, che contiene la proteina della catena leggera scissa e la proteasi.
  16. Aggiungere 1 mL di tampone di eluizione alla resina. Ripetere la centrifugazione e raccogliere il surnatante.
  17. Rimuovere la proteasi mediante cromatografia liquida proteica veloce (FPLC). In breve, preparare la colonna di esclusione dimensionale (vedere la Tabella dei materiali) con un tampone contenente 50 mM di Tris-HCl, 300 mM di NaCl, 10% di glicerolo e 5 mM di DTT (pH 7,4). Concentrare il surnatante a 500 μl utilizzando una provetta di concentrazione da 10.000 MWCO. Caricare il campione concentrato su una colonna collegata a un sistema cromatografico automatizzato utilizzando una siringa, farla scorrere con un tampone contenente 50 mM di Tris-HCl, 300 mM di NaCl, 10% di glicerolo e 5 mM di DTT (pH 7,4). Monitorare le frazioni raccolte utilizzando una spettrofotometria ultravioletta. Raccogliere le frazioni proteiche con un peso molecolare corrispondente alle catene leggere.
    NOTA: La proteasi può anche essere rimossa mediante cromatografia di affinità se un tag di purificazione (ad esempio, tag GST) viene ingegnerizzato nella proteasi.
  18. Eseguire un gel SDS-PAGE con le frazioni di eluizione per determinare la purezza e le concentrazioni relative delle proteine della catena leggera in ciascuna frazione. Le frazioni desiderate sono quelle che contengono proteine concentrate della catena leggera senza bande di proteasi visibili. Combinare le frazioni proteiche desiderate e concentrarle utilizzando una provetta di concentrazione35 da 10.000 MWCO.
  19. Aliquote di congelamento rapido di proteine in azoto liquido e trasferimento immediato a -80 °C per la conservazione a lungo termine (Figura 3B).
    NOTA: La resa di RLC e CALML4 utilizzando il sistema His6-SUMO di E. coli è di circa 1-2 mg/L.

3. Saggio di scorrimento del filamento di actina su misura per miosina-7a (3 ore)

NOTA: I metodi utilizzati in questa sezione sono simili a quelli descritti per altre miosine31 con le principali modifiche che sono l'incubazione e l'applicazione della miosina in tampone ad alta forza ionica e il lungo intervallo richiesto per ottenere una misurazione accurata degli spostamenti da fotogramma a fotogramma.

  1. Preparare 20 μM di actina filamentosa (F-actina) polimerizzando l'actina globulare (G-actina) in tampone di polimerizzazione (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7,0)) a 4 °C durante la notte. Etichettare la F-actina aggiungendo 1,2 volte l'eccesso molare di rodamina-falloidina (vedi Tabella dei materiali). Coprire con un foglio di alluminio e incubare su ghiaccio per almeno 2 ore.
    NOTA: La G-actina può essere acquistata da venditori commerciali (vedi Tabella dei materiali) o purificata dalla polvere di acetone di muscolo di coniglio31,37. La F-actina marcata può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 mesi a questa concentrazione.
  2. Preparare una camera di flusso come descritto in precedenza31. Posizionare brevemente due strisce di nastro biadesivo a 2-3 mm di distanza l'una dall'altra su un vetrino da microscopio pulito e trattato con nitrocellulosa (vedi Tabella dei materiali). Posizionare il vetrino coprioggetti con il lato in nitrocellulosa rivolto verso il basso sulle strisce, creando una camera di flusso con un volume approssimativo di 10 μl (Figura 4).
  3. Esecuzione del saggio di scorrimento del filamento di actina
    1. Alla camera di flusso, aggiungere un volume di 0,2 mg/mL di proteina miosina-7a umana purificata in 500 mM di tampone di motilità NaCl (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Lasciare incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: È fondamentale aggiungere la miosina-7a in un tampone ad alto contenuto di sale in quanto ciò allevia lo stato di autoinibizione e consente alla miosina-7a di aderire alla superficie nella conformazione attivata.
    2. Lavare la camera di flusso con volumi a tre camere di 1 mg/mL BSA (vedere la Tabella dei materiali) in 150 mM di tampone di motilità NaCl (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)) aspirando il liquido utilizzando un panno pulito all'uscita per assorbire il liquido in eccesso. Incubare per 1 minuto dopo il 3° lavaggio.
    3. Far fluire un volume di camera di F-actina marcata con rodamina da 10 nM in tampone di motilità NaCl da 150 mM attraverso la camera di flusso. Monitorare il legame dei filamenti di actina alla superficie con un microscopio a fluorescenza con obiettivo 100x. La densità dei filamenti di actina dovrebbe essere ottimale (Figura 5A), garantendo un numero sufficiente di filamenti nel campo visivo per l'inseguimento, ma abbastanza rado da evitare la sovrapposizione di più filamenti, il che complica l'inseguimento.
    4. Lavare la camera di flusso con volumi a tre camere di 150 mM di tampone di motilità NaCl per rimuovere i filamenti di actina non legati e l'eccesso di rodamina-falloidina.
    5. Avviare la motilità aggiungendo un volume della camera del tampone finale (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2,5 mg/ml glucosio, 100 μg/mL glucosio ossidasi, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
    6. Registra immagini su un microscopio a fluorescenza utilizzando l'eccitazione a 561 nm per visualizzare l'actina marcata con rodamina falloidina. Individuare un'area del vetrino con la densità di actina desiderata (Figura 5A) e acquisire immagini ogni 30 s per 30 minuti.
      NOTA: La velocità della miosina-7a nei mammiferi è di circa 5 nm/s. Quando si imposta la frequenza dei fotogrammi di acquisizione, è importante assicurarsi che gli spostamenti dei filamenti tra i fotogrammi siano sufficientemente lunghi (più di un pixel) per consentire un tracciamento accurato. I movimenti dei subpixel tra i fotogrammi possono causare una sovrastima della velocità. La frequenza dei fotogrammi di 30 s consente ai filamenti di actina di muoversi di circa 150 nm tra i fotogrammi, corrispondenti a più di due pixel sul microscopio. Tuttavia, è necessario prestare attenzione che si possa osservare uno spostamento significativo sul microscopio utilizzato. Se disponibile, la registrazione multiposizione può essere utilizzata per raccogliere contemporaneamente diversi campi visivi per l'analisi.
  4. Analisi del movimento dei filamenti di actina utilizzando il programma FAST (installato su un Mac)38.
    NOTA: Il programma FAST utilizzato qui è solo una delle molte opzioni per quantificare il movimento del filamento. Abbiamo scelto di utilizzare FAST perché è automatizzato, veloce e non richiede software a pagamento. Altre opzioni includono algoritmi basati su MATLAB come FIESTA, metodi basati su ImageJ/FIJI come MTrack2 e Manual Tracking e metodi basati su Python come Philament39.
    1. Scarica e installa il programma FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - versione compatibile con python3 con un modulo aggiuntivo per la conversione di file nd2. NB: La versione originale di python2 può essere trovata all'indirizzo github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. Eseguire il programma FAST come descritto in38 utilizzando un valore di tolleranza di 33 per mantenere solo i filamenti in movimento regolare.
      NOTA: Se le immagini contengono problemi meccanici con il tavolino o la raccolta di più serie contemporaneamente, i filmati devono essere prima stabilizzati. Per questo, consigliamo il plugin FIJI Image Stabilizer, disponibile per il download al seguente indirizzo - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. Utilizzare il programma FAST per analizzare le immagini .tif appena create impostando prima i valori -xmax e -ymax. Questi impostano i parametri per il grafico a dispersione emesso dal programma e rappresentano la lunghezza massima del filamento (in nm) e la velocità massima del filamento (in nm/s). In questo esempio abbiamo utilizzato 20.000 nm per -xmax e 20 nm/s per -ymax per garantire l'acquisizione di tutti i dati (Figura 5D).
    4. Utilizzare -px per impostare la dimensione dei pixel dell'immagine acquisita, che qui sarà di 65 nm, e -minv per impostare la velocità minima (in nm/s) richiesta a un filamento per l'inclusione nell'analisi. Per la bassa velocità della miosina-7a in questo esempio, utilizzare 0,1 nm/s.
    5. Usa -maxd per impostare la distanza massima consentita tra i fotogrammi per i filamenti da collegare. Questo è impostato per evitare di collegare filamenti separati tra i fotogrammi e in questo esempio, utilizziamo il valore predefinito di 2000 nm.
    6. Use-pt per impostare la tolleranza per le fluttuazioni della velocità del filamento e includere solo i filamenti con movimenti fluidi. In questo esempio viene utilizzata una soglia di tolleranza del 33%. Ciò significa che i filamenti con una deviazione standard della velocità superiore al 33% della media della velocità saranno esclusi da ulteriori analisi.
    7. Infine, utilizzare -d per indicare la cartella contenente gli stack di .tif per l'analisi. L'intera stringa di comando con i parametri e i valori forniti sarà: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [nome della cartella contenente filmati].
      NOTA: Il programma FAST emetterà grafici a dispersione (Figura 5D) con i dati grezzi associati, che possono essere estratti per l'analisi e la visualizzazione in altri programmi (Figura 5C). Produrrà anche un grafico dei percorsi dei filamenti tracciati (Figura 5B), che dovrebbe essere utilizzato per verificare che il tracciamento funzioni come previsto. Esempi dei grafici e altre possibili visualizzazioni dei dati sono inclusi di seguito.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il complesso miosina-7a purificato e le proteine della catena leggera possono essere valutate mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE, come mostrato nella Figura 3. La banda sopra l'indicatore di 200 kDa corrisponde alla catena pesante miosina-7a (255 kDa). Le tre bande che migrano tra i marcatori di 22 e 14 kDa dall'alto verso il basso sono rispettivamente RLC (20 kDa), calmodulina e CALML4. Mentre la calmodulina e la CALML4 hanno un peso molecolare simile di circa 17 kDa, le due proteine possono essere separate utilizzando un gel di tris-glicina al 16%.

Il video 1 e la Figura 5 mostrano un caratteristico saggio di scorrimento del filamento di actina con miosina-7a di mammifero. Una caratteristica immediata rivelata da questo test è la lenta motilità della miosina-7a. Il video viene riprodotto a una velocità 500 volte superiore a quella normale per visualizzare meglio il movimento dei filamenti di actina guidati da questa miosina. Questo test può essere modificato per studiare ulteriormente come fattori esterni come la temperatura, la forza ionica e la viscosità della soluzione influenzano l'attività della miosina-7a. Inoltre, le proteine leganti la miosina-7a possono essere introdotte nella cellula a flusso per studiare i loro effetti sulle interazioni e sulla motilità dell'actomiosina.

figure-results-1
Figura 1: Flusso di lavoro per la produzione di oloenzimi miosina-7a basata sul sistema MultiBac. (A) Inserire i cDNA che codificano per la catena pesante della miosina-7a, RLC, CALML4 e calmodulina nei siti di clonazione multipli (MCS) del vettore pACEBac1. (B) Costruire la cassetta di espressione multigenica per codificare il complesso miosina-7a legando iterativamente i vettori pACEBac1 che contengono i cDNA della catena pesante della miosina-7a, RLC, CALML4 e calmodulina. (C) Integrare la cassetta multigenica della miosina-7a nel genoma del baculovirus attraverso la trasposizione dell'elemento mini-Tn7 dal vettore pACEBac1 al sito bersaglio mini-attTn7 nel genoma. (D) Produrre baculovirus che esprimono il complesso miosina-7a trasfettando le cellule Sf9 con il bacmide ricombinante contenente la cassetta multigenica miosina-7a. (E) Il baculovirus può essere amplificato inoculando il virus P0 in una coltura di sospensione cellulare Sf9 e raccogliendo il surnatante. Il prodotto risultante, il virus P1, può essere utilizzato per l'espressione proteica su larga scala. (F) Flusso di lavoro per la purificazione basata su colonna di affinità FLAG del complesso miosina-7a. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini fluorescenti rappresentative di cellule Sf9 trasfettate con bacmid che esprime miosina-7a con un tag GFP C-terminale. Le immagini mostrano la normale progressione dell'infezione da baculovirus: le cellule iniziano a esprimere la miosina-7a intorno al giorno 4 dopo la trasfezione, con quasi tutte le cellule che si infettano entro una settimana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Gel SDS del complesso miosina-7a purificato e proteine a catena leggera. (A) Oloenzima umano purificato a lunghezza intera con il sistema MultiBac. Sono indicate le catene pesanti (HC) e le catene leggere. (B) RLC e CALML4 purificati utilizzando il sistema His6-SUMO. La calmodulina (CaM) viene acquistata (vedi Tabella dei Materiali) e purificata dal cervello bovino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Flusso di lavoro per l'assemblaggio della camera di flusso e i saggi di scorrimento dell'actina. Un vetrino coprioggetti trattato con nitrocellulosa viene attaccato a un vetrino da microscopio utilizzando due pezzi di nastro biadesivo. Questo crea una camera di flusso con un volume di circa 10 μL. Le proteine vengono aggiunte in sequenza alla camera, mentre le soluzioni in eccesso vengono espulse attraverso il canale utilizzando carta velina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Risultati rappresentativi dei saggi del filamento di actina a scorrimento e dell'analisi di tracciamento. (A) Esempio di fotogramma da una registrazione timelapse che mostra il movimento del filamento di actina guidato da motori miosina-7a decorati in superficie. (B) Immagine di tracciamento del filamento emessa dal programma FAST per lo stesso campo visivo mostrato in (A). (C) Istogramma rappresentativo della velocità di planata dell'actina generata dalla miosina-7a dei mammiferi: 4,2 ± 1,4 nm/s (media ± deviazione standard; il numero di tracce = 550). (D) Esempio di output generato automaticamente dal programma FAST che mostra la lunghezza e le velocità del filamento calcolate. %STUCK mostra la percentuale di filamenti che si ritiene siano bloccati in base al taglio di velocità minimo fornito dall'utente. MVEL rappresenta la velocità media di tutti i filamenti non bloccati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Saggio di scorrimento del filamento di actina eseguito con miosina-7a. La miosina-7a umana purificata a figura intera è attaccata alla superficie. Questo filmato è stato acquisito a 1 fotogramma ogni 30 s con un'esposizione di 200 ms. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la produzione della proteina ricombinante della miosina-7a umana da cellule di insetti. Sebbene il sistema Sf9/baculovirus sia stato utilizzato per produrre una varietà di miosine 40,41,42,43, solo recentemente la miosina-7a dei mammiferi è stata purificata con successo utilizzando il sistema baculovirale MultiBac 14. Si è scoperto che la miosina-7a dei mammiferi si associa a tre tipi di catene leggere, tutte essenziali per l'integrità strutturale e funzionale della proteina14. Questo è in contrasto con il suo omologo invertebrato e la maggior parte delle altre miosine, che tipicamente si legano solo a uno o due tipi di catene leggere44,45. Ciò significa che per sintetizzare l'oloenzima miosina-7a umano, almeno quattro geni diversi devono essere espressi contemporaneamente in ciascuna cellula Sf9. In questo caso, il sistema MultiBac offre vantaggi significativi rispetto alla co-infezione con più baculovirus perché garantisce rapporti riproducibili delle subunità del complesso miosina-7a in ciascuna cellula infetta. In effetti, Belyaev et al. lo hanno dimostrato statisticamente: all'aumentare del numero di tipi di virus, la probabilità che le cellule ricevano un rapporto virus uguale diminuisce drasticamente46. Ad esempio, con due tipi di virus, solo il 12,78% delle cellule raggiunge un rapporto uguale, mentre questa percentuale scende allo 0,29% quando vengono utilizzati quattro tipi di virus, supponendo che ogni tipo di virus sia distribuito tra le cellule in modo indipendente. Questa variabilità può essere problematica quando le proteine della subunità devono assemblarsi in un rapporto costante per produrre la massima resa del complesso. Sebbene questo articolo si concentri sulla miosina-7a nei mammiferi, è sempre più evidente che il sistema MultiBac offre un approccio più ottimizzato per la produzione di complessi multimerici rispetto al metodo di co-infezione, in particolare per le proteine con più subunità e prodotte in basse rese.

Diversi fattori sono fondamentali per ottenere una produzione ad alto rendimento della proteina miosina-7a utilizzando questo metodo. Innanzitutto, è fondamentale determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule Sf9 . Ciò consente la massima produzione di proteine, riducendo al minimo gli effetti dannosi della lisi cellulare e della morte causati dal virus. La produzione di complessi proteici basati su MultiBac mostra spesso un picco ritardato nell'espressione rispetto ai sistemi baculovirali monocistronici o quando esprimono proteine più piccole. Abbiamo scoperto che il momento migliore per raccogliere le cellule infettate dal virus MultiBac della miosina-7a è tra le 60 e le 65 ore dopo l'infezione. Si raccomanda vivamente di monitorare continuamente i livelli di espressione proteica durante tutto il processo. Ciò può essere ottenuto utilizzando la microscopia fluorescente se un tag proteico fluorescente è fuso o attraverso l'analisi SDS-PAGE in caso contrario. Inoltre, è importante monitorare contemporaneamente la vitalità cellulare per identificare il momento ottimale per ottenere la massima resa proteica con una morte cellulare minima.

La miosina-7a è una grande miosina monomerica suscettibile alla degradazione delle proteine14. Per evitare la degradazione durante il processo di purificazione, è importante assicurarsi che tutti i tamponi siano pre-raffreddati e che tutte le procedure siano eseguite a 4 °C. Inoltre, è fondamentale ridurre al minimo l'esposizione della miosina-7a alle proteasi. Oltre all'utilizzo di cocktail di inibitori della proteasi, si consiglia di mantenere l'incubazione del lisato cellulare con la resina FLAG a solo 1 ora. Non è stato dimostrato che l'estensione di questa durata migliori significativamente il legame con la resina o aumenti la resa proteica totale e può comportare un rischio maggiore di degradazione delle proteine.

Una caratteristica distintiva della miosina-7a dei mammiferi, rispetto alle isoforme delle specie inferiori44, è la sua combinazione di componenti unici della catena leggera. Queste catene leggere svolgono importanti ruoli regolatori nella funzione della miosina-7a. Ad esempio, la calmodulina interagisce dinamicamente con la catena pesante della miosina in modo dipendente dal Ca2+ 47, modulandone la motilità e l'output meccanico, un meccanismo che sembra specificamente adattato alle cellule ciliate uditive dei mammiferi14. Mentre le esatte affinità di legame della calmodulina con i singoli motivi del QI devono ancora essere determinate nel contesto dell'intera molecola, abbiamo osservato che una parte della calmodulina si dissocia gradualmente man mano che le catene leggere in eccesso nel lisato cellulare vengono rimosse durante la purificazione. Ciò può alterare le proprietà meccaniche della miosina-7a. Per mitigare questo problema, impieghiamo colonne di centrifugazione combinate con una centrifugazione delicata per la fase di eluizione. Ciò consente di eluire le proteine in un piccolo volume e ad alta concentrazione, il che può ovviare alla necessità di fasi di concentrazione. Questa pratica accorcia il processo di purificazione totale delle proteine e riduce al minimo il rischio di dissociazione delle catene leggere. Nei saggi di planata dell'actina, includiamo le proteine della catena leggera in eccesso nel tampone finale per garantire che le catene leggere native rimangano legate con la catena pesante della miosina-7a.

La necessità di catene leggere in eccesso rappresenta una delle numerose differenze tra il saggio di scivolamento dell'actina con miosina-7a e quello di altre miosine ben studiate come la miosina-2. I saggi della miosina-2 vengono generalmente eseguiti a bassa forza ionica (ad esempio, 50 mM). Quando la forza ionica viene aumentata verso il fisiologico (150 mM), i filamenti di actina tendono a staccarsi e la motilità rallenta. Nel caso della miosina-7a, la motilità è bloccata a bassa forza ionica e lo scivolamento è osservato solo a 150 mM o uguale. A causa dell'autoinibizione della miosina-7a a lunghezza intera, viene applicata al vetrino in una soluzione ad alta forza ionica in modo simile a come i filamenti di miosina vengono disciolti prima dell'applicazione per consentire alle proteine di legarsi in un orientamento e una conformazione che consentano il successivo scivolamento.

La bassa velocità osservata nei saggi di planata dell'actina con miosina-7a introduce alcune sfide nell'acquisizione e nell'analisi dei dati di motilità. Infatti, la traslocazione è di diversi ordini di grandezza più lenta rispetto alla miosina del muscolo scheletrico, che è stata utilizzata quando questo test è stato originariamente sviluppato30. Questa bassa velocità può portare a difficoltà di misurazione accurata e a una sovrastima della velocità che scala con il frame rate48. La precisione di localizzazione di qualsiasi metodo di tracciamento è finita e anche un oggetto statico ha un apparente spostamento di posizione tra immagini successive. All'aumentare della frequenza di campionamento, ciò porta a un valore artificialmente alto per la velocità. Questo effetto è vero per qualsiasi tipo di test di motilità, ma l'effetto relativo è molto piccolo per i test in cui si verifica un grande movimento di diversi pixel tra i fotogrammi. Prendendo punti dati a intervalli molto lunghi (ogni 60 s, 90 s, ecc.), è possibile verificare che la velocità misurata sia accurata poiché il valore non dovrebbe essere influenzato dalla frequenza di campionamento. Poiché l'intervallo di registrazione per la miosina-7a è così lungo, il ritardo può essere sfruttato per registrare da più posizioni durante la stessa acquisizione. Ciò consente di registrare più filmati contemporaneamente. Uno svantaggio di questo metodo è che le imperfezioni meccaniche con lo stadio porteranno a un'ulteriore deriva dovuta al cambio di posizione. Questo può essere spiegato utilizzando la stabilizzazione dell'immagine come descritto sopra.

Nella versione originale Python2 del software FAST (github.com/turalaksel/FASTrack), ogni punto dati di output rappresenta una velocità per un filamento all'interno di una finestra a N fotogrammi (5 fotogrammi per impostazione predefinita). Una versione Python3 modificata del software (github.com/NeilBillington/FASTrack3) include un output aggiuntivo in cui i punti dati sono su base filamento per filamento. I grafici predefiniti prodotti dal software si basano sul set di dati N del tipo a finestra. Entrambi i tipi di output sono ugualmente validi e, sebbene l'output originale produca molti più punti dati per filmato, in genere utilizziamo i dati basati sui filamenti poiché questi sono più direttamente paragonabili ai metodi esistenti per quantificare lo scorrimento del filamento e forniscono informazioni più intuitive sul numero di filamenti con velocità specifiche in un particolare filmato. Si noti che anche in questa analisi del tipo di filamento, il numero di punti dati non corrisponderà esattamente al numero reale di filamenti poiché il tracciamento si interrompe quando i filamenti si incrociano e vengono quindi rilevate nuove tracce non appena emergono dopo l'incrocio.

I limiti dei metodi descritti in questo articolo sono che la proteina dei mammiferi viene espressa nelle cellule di insetti. Sebbene molte di queste proteine, inclusa questa, siano state espresse con successo in questo modo, ci sono altri sistemi di espressione che possono imitare più da vicino l'ambiente nativo della proteina. I sistemi di espressione dei mammiferi potrebbero introdurre importanti modifiche post-traduzionali alla proteina che sono assenti nel sistema degli insetti. Lo stesso vale in misura ancora maggiore per l'espressione in un sistema batterico, come qui utilizzato per la produzione di catene leggere di miosina. Ciononostante, riteniamo che la relativa semplicità e l'elevata resa in questi casi superino i potenziali limiti. Il test di motilità in vitro utilizzato per caratterizzare la proteina è limitato nella quantità di informazioni che può fornire sulla proteina. Ad esempio, molti aspetti della regolazione della miosina sono mascherati o aggirati dal test e quindi non possono essere studiati con questa tecnica. Esistono molti altri tipi di saggi, come la motilità di una singola molecola, l'intrappolamento ottico e le tecniche biochimiche e biofisiche, per studiare le proprietà della miosina in vitro, ma il saggio di scorrimento del filamento è scelto qui come metodo per misurare l'attività della miosina perché richiede meno proteine rispetto a molti saggi biochimici, è semplice da eseguire e dove può essere dimostrata la motilità di successo. ci dice che la proteina è attiva sia biochimicamente che meccanicamente.

Il flusso di lavoro qui descritto rappresenta una serie di metodi per produrre la proteina miosina-7a di alta qualità e caratterizzarne le proprietà meccaniche. Sebbene questi metodi siano specificamente adattati a questa classe di miosina, le procedure di espressione e purificazione sono più generalmente utili come linea guida per la produzione di questo tipo di proteina labile, costituita da diversi polipeptidi distinti e con tendenza alla dissociazione e alla degradazione. Inoltre, i metodi di caratterizzazione sono utili per tutti i tipi di proteine motorie e, in particolare, le considerazioni sull'acquisizione dei dati e sui parametri di analisi sono destinate ad essere utili per chiunque misuri la velocità di traslocazione di motori molecolari a bassa velocità.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la Microscopy Imaging Facility e il Visual Function and Morphology Core della West Virginia University per la discussione e l'aiuto con l'analisi delle immagini. Questo lavoro è supportato dai fondi per le startup della West Virginia University School of Medicine a R.L. Questo lavoro è supportato anche dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), dal Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence (Vs-CoBRE) (P20GM144230) e dal NIGMS West Virginia Network of Biomedical Research Excellence (WV-INBRE) (P20GM103434).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette per microcentrifuga da 1,7 mLVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ASintesi peptidica personalizzata
22x22mm N. 1,5 vetrini coprioggettiVWR48366-227
Provette da centrifuga coniche da 250 mLNunc376814
250 mL Erlenmyer ventilato Pallone per agitatoreIntelixBioDBJ-SF250VP
2-MercaptoetanoloVWRM131
75x25x1 mm Vetrini per microscopio VistavisionVWR16004-42
Proteina di actina (>99% pura)CitoscheletroAKL99
Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5Millipore SigmaUFC510024
Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-4Millipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMilliporeSigma A2220
ATP Millipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Colonna per cromatografia monouso Bio-Rad732-6008
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher
Siero Bovino AlbuminaMillipore Sigma5470
BstXI EnzimaNew England BiolabsR0113S
CalmodulinaMillipore Sigma208694
CatalasiMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Sistema di EspressioneThermo FisherK30001
Cocktail di inibitori della proteasi completi e privi di EDTA RocheDiagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DitiotreitoloMillipore SigmaDO632
DL-DitiotreitoloMillipore SigmaDO632
DNasi I, spettro chimicoFisher Scientific18-610-304
Nastro biadesivoDepot909955
EGTA, grado di biologia molecolareMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, grado di biologia molecolareMillipore Sigma324626-25GM
EtanoloThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Reagente di trasfezioneGibcoA38915
ProgrammaFASThttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Fisherbrand  Modello 505 Sonic DismembratorFisher Scientific FB505110
Soluzione di reagente alla gentamicinaGibco15710-06410 mg/mL in acqua distillata
Glucosio Millipore SigmaG5767
Glucosio ossidasiMillipore SigmaG2133
GliceroloInvitrogen15514-011
HisPur Cobalt ResinThermo Fisher89966
Enzima CeuINew England BiolabsR0699S
Stabilizzatore d'immagine Pluginhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanoloFisher ScientificA451SK
KanamicinaFisher ScientificAAJ67354AD
Punte per pipette con orifizio grandeFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, polvere prontaThermo FisherJ75851-A1
Inibitore della proteasi della leupeptinThermo Fisher78435
Cloruro di magnesioThermo FisherJ61014.=E1M
Cloruro di magnesioThermo FisherJ61014.=E1M
Efficienza massima DH10Bac Competent CellsGibco10361012
Provette per microcentrifuga, 1.7mLVWR87003-294
Provette per microcentrifuga, provetteVWR87003-294
VWR87003-2941,7 ml
Modello Nikon: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con obiettivo
Fotocamera per microscopioORCA-Fusion BT
Unità laserAndor iXon Ultra
Miller' s LB BrodoCorning46-050-CM
MOPS Millipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Spettrofotometro UV-Vis a microvolumeThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Spettrofotometro UV-Vis a microvolumeThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alfa E.coli competente (alta efficienza)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocellulosaLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Siero ridotto MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
Kit di purificazione PCR rapida QIAquick (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rodamina falloidinaInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
proteasiPMID:17591783Purificato in laboratorio
Cellule Sf9Thermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Terreni privi di siero CompletoGibco12658-027
Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer G3, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Cloruro di sodioMillipore SigmaS7653
Cloruro di sodioMillipore SigmaS7653
Sistema di filtrazione monouso a sgancio rapido StericupMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva 29148721
T4 DNA ligasiNew England BiolabsM0202S
T4 DNA ligasi tampone - 10X con 10mM ATPNew England BiolabsB0202A
Tetraciclina cloridratoMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerican Bioanalytical9002-93-1
15519028 Office per microcentrifuga da 1,7 ml, microscopio daTIRF 100X SENP2

References

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