Un metodo di strabismo automatizzato per il comportamento di sincronizzazione temporale e le dinamiche cerebrali negli studi sul dolore del topo

Summary

Questo protocollo fornisce un metodo per tracciare lo strabismo oculare automatizzato nei roditori nel tempo in modo compatibile con il blocco temporale delle misure neurofisiologiche. Questo protocollo dovrebbe essere utile ai ricercatori che studiano i meccanismi dei disturbi del dolore come l'emicrania.

Abstract

Il dolore spontaneo è stato difficile da tracciare in tempo reale e quantificare in modo da prevenire i pregiudizi umani. Ciò è particolarmente vero per le metriche del dolore alla testa, come in disturbi come l'emicrania. Lo strabismo oculare è emerso come una metrica variabile continua che può essere misurata nel tempo ed è efficace per prevedere gli stati di dolore in tali saggi. Questo documento fornisce un protocollo per l'uso di DeepLabCut (DLC) per automatizzare e quantificare lo strabismo oculare (distanza euclidea tra le palpebre) in topi trattenuti con movimenti della testa a rotazione libera. Questo protocollo consente di abbinare la quantificazione imparziale dello strabismo oculare e di confrontarla direttamente con misure meccanicistiche come la neurofisiologia. Forniamo una valutazione dei parametri di addestramento dell'IA necessari per raggiungere il successo, come definito discriminando i periodi di strabismo e non strabismo. Dimostriamo la capacità di tracciare e differenziare in modo affidabile lo strabismo in un fenotipo simile all'emicrania indotto da CGRP con una risoluzione inferiore al secondo.

Introduction

L'emicrania è uno dei disturbi cerebrali più diffusi in tutto il mondo, che colpisce più di un miliardo di persone¹. I modelli murini preclinici di emicrania sono emersi come un modo informativo per studiare i meccanismi dell'emicrania poiché questi studi possono essere controllati più facilmente rispetto agli studi sull'uomo, consentendo così lo studio causale del comportamento correlato all'emicrania². Tali modelli hanno dimostrato una risposta fenotipica forte e ripetibile ai composti che inducono l'emicrania, come il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP). Persiste la necessità di misurazioni robuste dei comportamenti rilevanti per l'emicrania nei modelli di roditori, in particolare quelli che possono essere accoppiati con metriche meccanicistiche come l'imaging e gli approcci elettrofisiologici.

Gli stati cerebrali simili all'emicrania sono stati fenotipicamente caratterizzati dalla presenza di avversione alla luce, allodinia delle zampe, iperalgesia facciale a stimoli nocivi e smorfie facciali³. Tali comportamenti sono misurati in base al tempo totale trascorso alla luce (avversione alla luce) e alle soglie di sensibilità al tatto della zampa o del viso (allodinia della zampa e iperalgesia facciale) e sono limitati a una singola lettura per lunghi periodi di tempo (minuti o più). I comportamenti simili all'emicrania possono essere suscitati negli animali dosando composti che inducono l'emicrania come il CGRP, imitando i sintomi sperimentati dai pazienti umani con emicrania³ (cioè, dimostrando la validità facciale). Tali composti producono anche sintomi di emicrania quando somministrati nell'uomo, dimostrando la validità del costrutto di questi modelli⁴. Gli studi in cui i fenotipi comportamentali sono stati attenuati farmacologicamente hanno portato a scoperte relative al trattamento dell'emicrania e forniscono ulteriori conferme di questi modelli (cioè, dimostrando la validità predittiva)^5,6.

Ad esempio, un anticorpo monoclonale anti-CGRP (ALD405) ha dimostrato di ridurre il comportamento avverso alla luce⁵ e la smorfia facciale nei topi⁶ trattati con CGRP, e altri studi hanno dimostrato che i farmaci antagonisti del CGRP riducono i comportamenti simili all'emicrania indotti dal protossido di azoto negli animali ^7,8. Recenti studi clinici hanno dimostrato il successo nel trattamento dell'emicrania bloccando il CGRP ^9,10, portando a diversi farmaci approvati dalla FDA che prendono di mira il CGRP o il suo recettore. La valutazione preclinica dei fenotipi correlati all'emicrania ha portato a scoperte nei risultati clinici ed è, quindi, essenziale per comprendere alcuni degli aspetti più complessi dell'emicrania che sono difficili da testare direttamente nell'uomo.

Nonostante i numerosi vantaggi, gli esperimenti che utilizzano queste letture comportamentali dei roditori dell'emicrania sono spesso limitati nelle loro capacità di campionamento del punto temporale e possono essere soggettivi e soggetti a errori sperimentali umani. Molti saggi comportamentali sono limitati nella capacità di catturare l'attività a risoluzioni temporali più fini, rendendo spesso difficile catturare elementi più dinamici che si verificano su una scala temporale inferiore al secondo, come a livello di attività cerebrale. Si è dimostrato difficile quantificare gli elementi più spontanei e naturali del comportamento nel tempo con una risoluzione temporale significativa per lo studio dei meccanismi neurofisiologici. La creazione di un modo per identificare l'attività simile all'emicrania su scale temporali più rapide consentirebbe di convalidare esternamente gli stati cerebrali simili all'emicrania. Questo, a sua volta, potrebbe essere sincronizzato con l'attività cerebrale per creare profili di attività cerebrale più robusti dell'emicrania.

Uno di questi fenotipi correlati all'emicrania, la smorfia facciale, viene utilizzato in vari contesti come misura del dolore negli animali che può essere misurata istantaneamente e monitorata nel tempo¹¹. La smorfia facciale è spesso usata come indicatore di dolore spontaneo basato sull'idea che gli esseri umani (in particolare gli esseri umani non verbali) e altre specie di mammiferi mostrano cambiamenti naturali nell'espressione facciale quando provano dolore¹¹. Gli studi che misurano la smorfia facciale come indicazione del dolore nei topi nell'ultimo decennio hanno utilizzato scale come la Mouse Grimace Scale (MGS) per standardizzare la caratterizzazione del dolore nei roditori¹². Le variabili di espressione facciale della MGS includono il restringimento orbitale (strabismo), il rigonfiamento del naso, il rigonfiamento delle guance, la posizione dell'orecchio e il cambiamento dei baffi. Anche se è stato dimostrato che l'MGS caratterizza in modo affidabile il dolore negli animali¹³, è notoriamente soggettivo e si basa su un punteggio accurato, che può variare tra gli sperimentatori. Inoltre, l'MGS è limitato in quanto utilizza una scala non continua e manca della risoluzione temporale necessaria per tracciare il comportamento naturale nel tempo.

Un modo per combattere questo problema è quantificare oggettivamente una caratteristica facciale coerente. Lo strabismo è la caratteristica facciale più costantemente tracciabile⁶. Lo strabismo rappresenta la maggior parte della variabilità totale dei dati quando si tiene conto di tutte le variabili MGS (strabismo, rigonfiamento del naso, rigonfiamento delle guance, posizione dell'orecchio e cambiamento dei baffi)⁶. Poiché lo strabismo contribuisce maggiormente al punteggio complessivo ottenuto utilizzando l'MGS e traccia in modo affidabile la risposta a CGRP ^6,14, è il modo più affidabile per monitorare il dolore spontaneo nei modelli murini di emicrania. Ciò rende lo strabismo un comportamento non omeostatico quantificabile indotto dal CGRP. Diversi laboratori hanno utilizzato le caratteristiche dell'espressione facciale, tra cui lo strabismo, per rappresentare il potenziale dolore spontaneo associato all'emicrania ^6,15.

Sono rimaste diverse sfide per quanto riguarda l'esecuzione di strabismo automatizzato in un modo che possa essere accoppiato con studi meccanicistici dell'emicrania. Ad esempio, è stato difficile tracciare in modo affidabile lo strabismo senza fare affidamento su una posizione fissa che deve essere calibrata allo stesso modo tra le sessioni. Un'altra sfida è la capacità di eseguire questo tipo di analisi su una scala continua invece che su scale discrete come l'MGS. Per mitigare queste sfide, abbiamo mirato a integrare l'apprendimento automatico, sotto forma di DeepLabCut (DLC), nella nostra pipeline di analisi dei dati. DLC è un modello di apprendimento automatico per la stima della posa sviluppato da Mathis e colleghi ed è stato applicato a un'ampia gamma di comportamenti¹⁶. Utilizzando il loro software di stima della posa, siamo stati in grado di addestrare modelli in grado di prevedere con precisione i punti su un occhio di topo con una precisione quasi umana. In questo modo si risolvono i problemi di assegnazione manuale ripetitiva dei punteggi, aumentando al contempo la risoluzione temporale. Inoltre, creando questi modelli, abbiamo creato un mezzo ripetibile per valutare lo strabismo e stimare l'attività cerebrale simile all'emicrania su gruppi sperimentali più ampi. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida di questo metodo per tracciare i comportamenti di strabismo in un modo che può essere limitato nel tempo ad altre misurazioni meccanicistiche come la neurofisiologia. L'obiettivo generale è quello di catalizzare studi meccanicistici che richiedono comportamenti di strabismo bloccati nel tempo nei modelli di roditori.

Protocol

NOTA: Tutti gli animali utilizzati in questi esperimenti sono stati gestiti secondo i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Iowa.

1. Preparare l'attrezzatura per la raccolta dei dati

1. Garantire la disponibilità di tutte le apparecchiature necessarie: assicurarsi che l'hardware consigliato per l'esecuzione dei DLC disponga di almeno 8 GB di memoria. Vedere la Tabella dei materiali per informazioni relative all'hardware e al software.
   NOTA: i dati possono essere raccolti in qualsiasi formato, ma devono essere convertiti in un formato leggibile dal DLC prima dell'analisi. I formati più comuni sono AVI e MP4.
2. Configura almeno una telecamera in modo che un occhio di un animale possa essere rilevato. Se entrambi gli occhi sono visibili, eseguire un filtro aggiuntivo, in quanto potrebbe causare interferenze nel tracciamento. Vedere la sezione 10 per un esempio di tale filtraggio per i dati forniti qui.
3. Installa il DLC utilizzando il pacchetto che trovi in Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
4. Nella configurazione della fotocamera, includi una singola telecamera con un angolo laterale (~90°) rispetto al mouse. Per seguire questo esempio, campionare a 10 Hz, con i topi trattenuti ma liberi di accedere all'intera gamma di movimenti della testa rispetto al corpo. Mantieni tra 2 e 4 pollici dalla fotocamera all'animale.

2. Configurazione del DLC

1. Dopo aver installato il DLC, crea l'ambiente in cui lavorare. Per fare ciò, vai alla cartella in cui è stato scaricato il software DLC utilizzando la directory di modifica con il seguente comando.
   CD folder_name
   NOTA: Qui si trova il file DEEPLABCUT.yaml.
2. Esegui il primo comando per creare l'ambiente e abilitalo digitando il secondo comando.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda attiva Deeplabcut
   NOTA: assicurati che l'ambiente sia attivato prima di ogni utilizzo del DLC.
   Dopo aver attivato l'ambiente, aprire l'interfaccia utente grafica (GUI) con il seguente comando e iniziare a creare il modello.
   python -m deeplabcut

3. Creare il modello

1. Dopo aver aperto la GUI, inizia a creare un modello facendo clic su Crea nuovo progetto in basso.
2. Assegna al progetto un nome significativo e univoco per identificarlo in seguito e inserisci un nome come sperimentatore. Controlla la sezione Posizione per vedere dove verrà salvato il progetto.
3. Seleziona Sfoglia cartelle e trova i video per addestrare il modello. Seleziona Copia video nella cartella del progetto se i video non devono essere spostati dalla directory originale.
4. Selezionare Crea per generare un nuovo progetto nel computer.
   NOTA: I video devono coprire l'intera gamma di comportamenti che osserverai (ad esempio, strabismo, non strabismo e tutti i comportamenti intermedi). Il modello sarà in grado di riconoscere solo un comportamento simile a quello nei dati di training e, se mancano alcuni componenti del comportamento, il modello potrebbe avere problemi a riconoscerlo.

4. Configura le impostazioni

NOTA: qui è possibile definire dettagli come i punti da tracciare, il numero di fotogrammi da estrarre da ciascun video di addestramento, la dimensione predefinita del punto di etichettatura e le variabili relative al modo in cui il modello verrà addestrato.

1. Dopo aver creato il modello, modificare le impostazioni di configurazione selezionando Modifica config.yaml. Selezionare Modifica per aprire il file delle impostazioni di configurazione e specificare le impostazioni chiave relative al modello.
2. Modifica le parti del corpo per includere tutte le parti dell'occhio da tracciare, quindi modifica numframes2pick al numero di fotogrammi necessari per video di allenamento per ottenere 400 fotogrammi totali. Infine, cambia la dimensione del punto a sei in modo che la dimensione predefinita durante l'etichettatura sia abbastanza piccola da essere posizionata con precisione attorno ai bordi dell'occhio.

5. Estrai i frame di allenamento

1. Dopo la configurazione, accedere alla scheda Estrai fotogrammi nella parte superiore della GUI e selezionare Estrai fotogrammi nella parte inferiore destra della pagina.
2. Monitora i progressi utilizzando la barra di caricamento nella parte inferiore della GUI.

6. Etichetta i telai di allenamento

1. Passare alla scheda Label Frames nella GUI e selezionare Label Frames. Trova la nuova finestra che mostra le cartelle per ciascuno dei video di formazione selezionati. Seleziona la prima cartella e si aprirà una nuova GUI di etichettatura.
2. Etichetta i punti definiti durante la configurazione per ogni fotogramma del video selezionato. Dopo che tutti i fotogrammi sono stati etichettati, salvali e ripeti il processo per il video successivo.
3. Per un'adeguata etichettatura dello strabismo, utilizzare due punti il più vicino possibile alla punta più grande dell'occhio (centro) e indicare le posizioni su/giù per ogni punto. Strabismo approssimativo come media di queste due lunghezze.
   NOTA: durante l'etichettatura, il DLC non salva automaticamente l'avanzamento. Si consiglia di effettuare un salvataggio periodico per evitare la perdita dei dati etichettati.

7. Creare un set di dati di training

1. Dopo aver etichettato manualmente, passare alla scheda Train network (Train network ) e selezionare Train network (Treno rete ) per richiedere al software di avviare l'addestramento del modello.
2. Monitorare lo stato di avanzamento nella finestra di comando.

8. Valutare la rete

1. Al termine della formazione sulla rete, passare alla scheda Valuta rete e selezionare Valuta rete. Attendere qualche istante fino a quando il cerchio di caricamento blu scompare indicando che l'autovalutazione è terminata e il modello è pronto per l'uso.

9. Analizza i dati/genera video etichettati

1. Per analizzare i video, vai alla scheda Analizza video . Seleziona Aggiungi altri video e seleziona i video da analizzare.
2. Selezionare Salva risultati come csv se un output csv dei dati è sufficiente.
3. Quando tutti i video sono stati acquisiti, seleziona Analizza video in basso per iniziare l'analisi dei video.
   NOTA: questo passaggio deve essere completato prima di generare i video etichettati nel passaggio 9.5
4. Dopo che i video sono stati analizzati, vai alla scheda Crea video e seleziona i video analizzati.
5. Seleziona Crea video e il software inizierà a generare video etichettati che rappresentano i dati mostrati nella .csv corrispondente.

10. Elaborare i dati definitivi

1. Applicare le macro trovate in https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc per convertire i dati grezzi nel formato utilizzato per questa analisi (ad esempio, distanza euclidea).
2. Importa e applica le macro etichettate Step1 e Step 2 al csv per filtrare tutti i punti dati non ottimali e convertire i dati in una distanza euclidea media per i punti più centrali nella parte superiore e inferiore dell'occhio.
3. Eseguire la macro denominata Passaggio 3 per contrassegnare ogni punto come 0 senza strabismo e 1 strabismo in base al valore di soglia nello script, che è impostato su 75 pixel.
   NOTA: I parametri per queste macro potrebbero richiedere una regolazione a seconda della configurazione sperimentale (vedi discussione). La soglia per lo strabismo e il filtro automatico per il valore massimo dell'occhio sono parametri che possono essere modificati a seconda delle dimensioni dell'animale e della distanza dalla fotocamera. È inoltre possibile regolare i valori utilizzati per la rimozione dei punti non ottimali a seconda della selettività con cui i dati devono essere filtrati.

Results

Qui, forniamo un metodo per il rilevamento affidabile dello strabismo ad alta risoluzione temporale utilizzando DeepLabCut. Abbiamo ottimizzato i parametri di allenamento e fornito una valutazione dei punti di forza e di debolezza di questo metodo (Figura 1).

Dopo aver addestrato i nostri modelli, abbiamo verificato che erano in grado di stimare correttamente i punti superiore e inferiore della palpebra (Figura 2), che fungono da punti di coordinate per la misura della distanza euclidea. La distanza euclidea è definita come la lunghezza media delle distanze tra i due punti superiore e inferiore dell'occhio. Il nostro modello è stato in grado di rilevare casi di strabismo (Figura 2A) e strabismo (Figura 2B). I punti blu indicano i punti utilizzati per determinare la distanza euclidea per ogni fotogramma. I punti verdi, gialli, arancioni e viola sono stati utilizzati per aiutare il modello a stimare correttamente la distanza euclidea e diminuire il valore di verosimiglianza quando la testa si trova in una posizione non ottimale (cioè, tenendo conto del movimento della testa e dei cambiamenti di posizione tra le sessioni). Abbiamo quindi convalidato l'accuratezza del modello utilizzando una serie di metodi diversi.

Per convalidare il numero ideale di fotogrammi utilizzati per il modello, abbiamo addestrato e testato quattro modelli di dimensioni variabili (Figura 3). Per prima cosa abbiamo confrontato i valori di errore quadratico medio (RMSE) tra i dati di test e quelli di addestramento per convalidare la capacità dei modelli di prevedere con precisione i dati di test su cui non erano stati addestrati. Questo confronto ha mostrato che la variabilità tra i punti etichettati manualmente e i punti etichettati dal modello si stabilizzava dopo 300 fotogrammi. Questa tendenza è correlata alle medie riportate per la probabilità che sembravano stabilizzarsi dopo 300 fotogrammi etichettati. Abbiamo utilizzato questi valori di verosimiglianza riportati per filtrare i punti inferiori a 0,92. Questi valori di verosimiglianza indicano il grado di certezza del modello che un determinato punto sia stato etichettato correttamente in base ai dati di addestramento. Abbiamo calcolato la media di questi valori per i punti che contribuiscono alla metrica della distanza euclidea per esaminare le prestazioni dei modelli l'uno rispetto all'altro. Sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa tra 300 e 400 fotogrammi, abbiamo utilizzato 400 fotogrammi perché la media era superiore al valore di verosimiglianza di 0,95, che si avvicina alla nostra soglia per il filtraggio manuale e si allinea con la soglia utilizzata in modelli simili per la stima della posa¹⁶.

Un altro modo in cui abbiamo convalidato l'accuratezza del modello è stato con una matrice di confusione che confrontava i fotogrammi annotati manualmente con i fotogrammi etichettati con DLC. Due individui ciechi hanno annotato manualmente 300 fotogrammi dello stesso occhio in otto video. Abbiamo utilizzato questi dati per costruire una matrice di confusione per valutare veri e falsi positivi e negativi (Figura 4), in cui i dati valutati manualmente sono stati utilizzati come verità di base. Per i DLC, è stato registrato un valore positivo di strabismo quando la distanza euclidea è stata registrata come inferiore a 75 pixel (cioè l'animale strizza gli occhi) e un valore negativo è stato registrato per valori superiori a 75 pixel (cioè l'animale non strizza gli occhi). Abbiamo trovato un valore predittivo positivo del 96,96%, che è la percentuale di tempo in cui il modello prevede con precisione lo strabismo rispetto a uno strabismo annotato manualmente. Abbiamo trovato un valore predittivo negativo del 99,66%, che è la percentuale di tempo in cui il modello prevede con precisione l'assenza di strabismo rispetto allo strabismo annotato manualmente. Questi mostrano la proporzione di valori negativi e positivi che sono stati etichettati correttamente. Abbiamo anche trovato un tasso di veri positivi del 98,1% e un tasso di veri negativi del 99,46%, che rappresentano la previsione accurata del modello di valori positivi e negativi rispetto a tutti i valori positivi e negativi, rispettivamente. Il nostro coefficiente di correlazione di Matthews, o MCC, era del 93,8%, indicando il coefficiente di correlazione tra i valori osservati e previsti.

Una volta che siamo stati sicuri che il nostro modello tracciasse in modo affidabile lo strabismo, abbiamo confrontato questo metodo DLC con un metodo di monitoraggio dello strabismo precedentemente pubblicato utilizzando un set di dati preclinici sull'emicrania¹⁴. Ci riferiremo a quest'altro metodo come "modello di strabismo ad area (ASM)" perché è stato sviluppato utilizzando l'area dell'occhio aperto come variabile continua di misurazione dello strabismo¹⁴. Il modello di strabismo dell'area utilizza un software di rilevamento facciale addestrato combinato con uno script MATLAB personalizzato per analizzare l'area media dei pixel dell'occhio, escludendo i fotogrammi con un tasso di errore di tracciamento del >15%¹⁴. Una delle principali limitazioni è che l'"ASM" non è open source e, quindi, non è ampiamente accessibile. I DLC consentono una maggiore ottimizzazione e adattabilità senza richiedere un acquisto significativo di software e hardware.

Abbiamo utilizzato un set di dati di 10 topi CD1 femmine e 10 maschi. Sperimentalmente, tutti gli animali sono stati acclimatati in delicate restrizioni per 30 minuti per un totale di 3 giorni prima dell'inizio delle registrazioni. Ogni animale è stato registrato per 5 minuti di basale e poi 5 minuti per le registrazioni del trattamento. Durante le sessioni di trattamento, gli animali sono stati trattati con PBS (veicolo) o 0,1 mg/kg di CGRP (trattamento) per via intraperitoneale per indurre uno stato simile all'emicrania. I dati sono stati raccolti in una stanza ben illuminata utilizzando telecamere dotate di luce infrarossa per illuminare il viso, garantendo un rilevamento accurato dei punti di riferimento. La telecamera a infrarossi includeva un obiettivo Kowa LM35JC 2/3" 35 mm F1.6 con diaframma manuale C-Mount con una distanza focale di 254 mm e un'apertura opportunamente regolata. Dopo aver raccolto i dati, abbiamo utilizzato l'ASM e il DLC per analizzare i dati. Poiché il punteggio manuale è stato convenzionalmente utilizzato sul campo per quantificare la smorfia facciale, con lo strabismo che è una componente della smorfia facciale¹⁴, abbiamo anche confrontato i nostri dati con i dati valutati manualmente.

Sulla base di precedenti risultati secondo cui l'iniezione periferica di CGRP induce una risposta strabica nei topi, ci aspettavamo di osservare differenze significative nella risposta strabica tra il veicolo e il trattamento CGRP ^6,14. Abbiamo confrontato i metodi ASM, manuali e DLC e abbiamo scoperto che il nostro modello ha rilevato in modo robusto un fenotipo strabico, così come i metodi manuali e ASM (Figura 5). È importante notare che il modello ASM è stato utilizzato per valutare il dolore e lo strabismo indotti da CGRP. In quello studio, Rea et al. hanno confrontato la risposta allo strabismo dopo CGRP con la risposta allo strabismo dopo l'iniezione di formalina della zampa posteriore come un test di induzione del dolore "più tradizionale"¹⁴. Inoltre, è ben documentato che il CGRP induce ipersensibilità al tatto nei topi attraverso l'uso di von Frey ^3,17. Coerentemente con il campo, abbiamo normalizzato lo strabismo medio durante la sessione di trattamento a un basale pretrattamento di 5 minuti per ciascun animale e abbiamo confrontato PBS (n = 10) rispetto agli animali trattati con CGRP (n = 11). Le analisi statistiche dei gruppi trattati con PBS rispetto a CGRP sono le seguenti. Abbiamo scoperto che gli animali trattati con CGRP mostravano una diminuzione dell'area media dei pixel utilizzando il metodo di tracciamento dello strabismo dell'area (p = 0,012, Figura 5A) e mostravano una diminuzione della distanza euclidea quando valutavano manualmente (p = 0,0007, Figura 5B) e utilizzando il nostro modello DLC (p = 0,007, Figura 5C). Quando abbiamo confrontato ciascun metodo nel tempo in un singolo animale rappresentativo, è stato osservato lo stesso modello (Figura 5). Questo animale ha mostrato un fenotipo strabico molto chiaro in risposta al trattamento con CGRP ma non alla PBS. Tutti i modelli sono stati in grado di rilevare queste differenze, ma i dati sono stati rappresentati più chiaramente nel nostro modello DLC (Figura 5). Metriche precise e accurate sono particolarmente importanti quando i dati devono essere analizzati a risoluzioni più fini in cui la media non è indicativa della lettura comportamentale completa (ad esempio, l'attività cerebrale). Il metodo DLC per rilevare lo strabismo nei topi ci consente di raccogliere dati su una scala temporale di millisecondi e di bloccarli nel tempo su misure di attività cerebrale (ad esempio, potenziali di campo locali), che si verifica su una scala temporale di millisecondi. Possiamo quindi utilizzare questa tecnica per costruire un profilo più robusto di uno stato cerebrale indicativo di dolore spontaneo nel contesto dell'emicrania e di altri disturbi cerebrali complessi.

Figura 1: Panoramica della procedura per la generazione di una rete addestrata con DLC. Schema generale del processo mediante il quale le caratteristiche oculari di un animale vengono tracciate e quindi analizzate utilizzando l'apprendimento automatico. Abbreviazione: DLC = DeepLabCut. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio di tracciamento automatico dello strabismo in un mouse CD1 rappresentativo. (A) Esempio di un fotogramma che mostra lo strabismo di tracciamento DLC (punti colorati) sul contorno dell'occhio durante il giorno del trattamento quando il mouse non strizza gli occhi. (B) Esempio di un fotogramma che mostra il rilevamento automatico dello strabismo il giorno del trattamento, utilizzando il nostro modello DLC. La distanza euclidea è stata misurata utilizzando la distanza media tra B e C, i punti blu, sulla parte superiore e inferiore dell'occhio. Le serie di punti blu nella parte superiore e inferiore dell'occhio vengono utilizzate per tracciare la distanza euclidea. Gli altri punti (verde, giallo, arancione, viola) sono punti di riferimento di inquadratura utilizzati sia per aiutare il modello a stimare i punti di distanza euclidei sia per filtrare il posizionamento non ottimale della testa dopo la raccolta dei dati. Abbreviazione: DLC = DeepLabCut. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Giustificazione del numero di frame utilizzati per addestrare il modello. (A) L'analisi dell'errore quadratico medio indica la distanza media tra i valori previsti e quelli osservati per i set di dati di prova e di treno. Il set di dati di training rappresenta i frame campionati durante il training del modello, mentre il set di dati di test rappresenta i frame non di training utilizzati per convalidare la capacità del modello di identificare immagini simili ma diverse. Abbiamo utilizzato cinque set di dati di addestramento e test e abbiamo scoperto che i valori RMSE si stabilizzavano di circa 300 fotogrammi per il gruppo di test. (B) La probabilità che un dato punto sia etichettato correttamente (media + SEM). Ciò ha dimostrato che 400 frame etichettati manualmente erano l'ideale perché i set di dati grezzi avevano una media superiore a 0,95 di probabilità, pur avendo un punteggio RMSE più vicino a quello dei dati di addestramento. Ciò significa che il modello è stato in grado di approssimare da vicino i punti su cui era stato addestrato, riportando anche la maggior parte dei fotogrammi con un'alta probabilità. Abbreviazione: RMSE = errore quadratico medio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Matrice di confusione per le misure di strabismo DLC. Abbiamo campionato 300 secondi da otto video (cinque CGRP e tre PBS) e abbiamo confrontato quei punti con un punteggio binario sì o no etichettato manualmente per strabismo. Abbiamo quantificato i valori previsti come quelli identificati dal DLC e i valori effettivi come quelli valutati manualmente da un essere umano. Abbiamo quindi confrontato questo con i dati con punteggio manuale per vedere con quale frequenza squint è stato identificato correttamente rispetto a quel binario con punteggio manuale sì o no di squint. Abbreviazioni: DLC = DeepLabCut; CGRP = peptide correlato al gene della calcitonina; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; TP = veri positivi; FP = falsi positivi; FN = falsi negativi; TN = veri negativi; PPV = valore predittivo positivo; VAN = valore predittivo negativo; TPR = tasso di vero positivo; TNR = tasso negativo vero; MCC = coefficiente di correlazione di Matthew. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Fenotipo dello strabismo in tre diversi modelli per il rilevamento dello strabismo. Le prime due righe contengono lo stesso animale rappresentativo con ciascuna condizione (PBS o CGRP) in tre diversi modelli per il rilevamento dello strabismo. La riga inferiore riflette le medie di tutti gli animali. (A) C'è stata una diminuzione dell'area media dei pixel (area media complessiva dei pixel/linea di base) nei topi trattati con CGRP rispetto a quelli trattati con PBS (t(18) = 2,805, p = 0,012) dopo aver elaborato tutti i dati utilizzando il modello di strabismo dell'area precedentemente pubblicato e convalidato¹⁴. (B) C'è stata una risposta simile nei dati con punteggio manuale (t(18) = 4,064, p = 0,0007). (C) I topi trattati con CGRP hanno mostrato una riduzione della distanza media da palpebra a palpebra (distanza euclidea di trattamento/distanza euclidea pretrattamento, basale) rispetto ai topi trattati con PBS (t(18) = 3,040, p = 0,007 quando si utilizza DLC per elaborare tutti i dati. N = 20 (10 femmine, 10 maschi). Le barre di errore indicano la media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo approfondito facilmente accessibile per l'utilizzo di strumenti basati sull'apprendimento automatico in grado di differenziare lo strabismo con un'accuratezza quasi umana, mantenendo la stessa (o migliore) risoluzione temporale degli approcci precedenti. In primo luogo, rende la valutazione dello strabismo automatizzato più facilmente disponibile a un pubblico più ampio. Il nostro nuovo metodo per la valutazione dello strabismo automatizzato presenta diversi miglioramenti rispetto ai modelli precedenti. In primo luogo, fornisce una metrica più robusta rispetto all'ASM utilizzando meno punti che contribuiscono effettivamente alla quantificazione dello strabismo. Ciò riduce la probabilità di falsi positivi e negativi facendo in modo che l'analisi si basi su un minor numero di punti quando genera i valori che denotano strabismo. In altre parole, il modello DLC rende ogni punto intorno all'occhio necessario ma non sufficiente per l'inclusione di un punto temporale. Questo ci permette di filtrare i dati non ottimali utilizzando lo stesso numero di punti dell'ASM senza dover fare affidamento sulla maggiore variabilità che deriva dall'affidarsi a così tanti punti costituenti. Inoltre, abbiamo ridotto il potenziale errore umano progettando modelli che non si basano completamente sull'accuratezza di individui addestrati.

Durante l'elaborazione dei dati, abbiamo scoperto che il nostro metodo filtrava accuratamente i punti non ottimali e i punti anomali più grandi di quanto fosse possibile, data la dimensione massima dell'occhio del topo (sezione 10 del protocollo). Abbiamo utilizzato macro che controllavano se ciascuno dei 10 punti che circondano l'occhio individualmente avevano un valore di probabilità superiore a 0,92 e filtravano quelli al di sotto di tale valore. In futuro, questo può essere regolato per rendere i dati elaborati più o meno selettivi. Le macro hanno anche filtrato tutti i valori di distanza euclidea superiori a 200 pixel, poiché abbiamo scoperto che la massima distanza possibile tra la parte superiore e inferiore dell'occhio era di 150 pixel. Potrebbe essere necessario modificare questa impostazione a seconda della configurazione sperimentale. Se la fotocamera non è alla stessa distanza dall'occhio, il valore massimo potrebbe essere significativamente più o meno. Il punto di forza di queste macro è che ci hanno permesso di estrarre le misurazioni tra la parte superiore e inferiore dell'occhio in un modo che dipendeva dal modello che riportava una maggiore probabilità per tutti i punti costitutivi che circondano l'occhio.

Il DLC e l'ASM sono entrambi limitati in quanto si basano sul fatto che il mouse si trovi in una posizione fissa a una distanza predeterminata dalla telecamera per consentire una scala di ingrandimento coerente tra la linea di base e le condizioni di trattamento. Pertanto, il movimento dell'animale stesso, il posizionamento errato all'interno dell'apparato o un cambiamento nella procedura sperimentale comprometterebbero la capacità del modello di rilevare l'area totale dell'occhio. Il nostro modello migliora in qualche modo queste limitazioni utilizzando la distanza euclidea, cioè la distanza su e giù della lunghezza dell'occhio, che consente un migliore tracciamento nonostante le differenze negli angoli della telecamera, il movimento dell'animale e la variazione sperimentale tra le diverse sessioni senza richiedere ulteriori ricalibrazioni. Tuttavia, riconosciamo che i miglioramenti nella normalizzazione per tenere conto del movimento della testa potrebbero portare a un monitoraggio ancora migliore dello strabismo negli animali in movimento.

Un'altra limitazione del nostro metodo è che filtrava i punti in cui la distanza euclidea si avvicinava allo zero, denotando la chiusura dell'occhio. Nonostante il filtraggio di questi fattori significativi per lo strabismo, siamo stati comunque in grado di rilevare una risposta allo strabismo indotta da CGRP in modo più robusto rispetto ai metodi precedenti (p = 0,007). La rimozione di questo componente dello strabismo diventa particolarmente limitante quando si cerca di confrontarla con altri punti di interesse, come l'attività cerebrale. Pensiamo che trovare un significato rimuovendo quei punti dimostri la robustezza di questo metodo, ma riconosciamo che rimuovere questi componenti di strabismo non è l'ideale. Gli studi futuri che utilizzano questo metodo dovrebbero includere un numero maggiore di fotogrammi anomali per addestrare meglio i modelli a riconoscere lo strabismo quando si avvicina allo zero. Nel complesso, lo sviluppo di un metodo per tracciare in modo affidabile lo strabismo automatizzato può consentire studi volti ad associare importanti caratteristiche del comportamento naturale con il suo stato cerebrale, consentendo un'indagine approfondita dei profili di attività cerebrale come nel contesto dell'emicrania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CUDA toolkit 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
Computer Intel con Windows 11, 13a generazione
Modulo aggiuntivo LabFaceX 2D Eyelid Tracker per un mouse in roaming gratuito:	FaceX LLC	NA	Qualsiasi telecamera in grado di registrare l'occhio di un animale è sufficiente, ma questo è il nostro hardware di tracciamento oculare.
Driver GPU NVIDIA versione 450.80.02 o superiore
NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6	NVIDIA	[490-BHXV]	Qualsiasi GPU che soddisfi i requisiti minimi specificati per la versione del DLC, attualmente 8 GB, è sufficiente. Abbiamo usato NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9-3.11
TensorFlow versione 2.10