Articolo metodologico

Progettazione e sviluppo guidati dalla struttura di nuovi inibitori della ciclofilina A e derivati del ganoderiolo-F: un approccio in-silico

DOI:

10.3791/67145

⸱

23 giugno 2026

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per la progettazione guidata dalla struttura dell'interazione di legame proteina-ligando tra Sanglifehrin A e Ciclofilina A/Ganoderiolo-F, essenziale per scoprire nuovi farmaci. La stabilità del complesso ligando-recettore è stata valutata tramite simulazione della dinamica molecolare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'asse ciclina Ds-CDKs (Ciclofilina A (Cyp /Ganoderiol F)) svolge un ruolo fondamentale nel cancro attraverso vari processi, come il controllo della proliferazione e l'inibizione delle cellule tumorali. I derivati del ganoderiolo F possono fungere da bersagli oncogenici per molteplici tipi di cancro. Questo studio ha dimostrato che la progettazione guidata dalla struttura e lo sviluppo di nuovi inibitori del Cyp A e derivati del Ganoderiol F possono essere impiegati per selezionare posizioni calcolate per aumentare l'efficacia negli inibitori chimici e la loro interazione con i recettori scelti. Per questo approccio, sono state utilizzate numerose applicazioni software per ottenere interazioni molecolari ottimali. In totale, sono state costruite 117 nuove molecole di ligando inibitori della ciclofilina utilizzando il software Chemsketch. I file PDB convertiti dei nuovi liganti inibitori Cyp A furono preparati per l'introduzione nel recettore enzimatico Sanglifehrin A. Le interazioni di aggancio ligando-proteina sono state eseguite utilizzando il software AutoDock 4.2.6 per rivelare le migliori interazioni geometriche. Le conferme di attracco sono state effettuate utilizzando il software PyMOL 2.5. Infine, sono stati rilevati legami a idrogeno utilizzando i software Chimera e Maestro. Il complesso selezionato con aggancio al recettore di ligando è stato sottoposto a simulazione della dinamica molecolare. Il processo di simulazione MD ha dimostrato la stabilità del complesso e ha indicato che il ligando scelto può essere utilizzato come inibitore farmacologico per le cellule tumorali. Nei risultati, gli amminoacidi attivi nel sito di legame sono stati identificati come Arginina 55 in movimento di 1,53Å, Asparagina (Asn), Glicina (Gly), Treonina (Thr), Lisina (Lys), Isoleucina (Iso), Istidina (Hid), Fenilalanina (Phe) e Cisteina (Cys) con il maggior numero di liganti di leganti idrogeno 45 idrossimangiferonico. Questo si collegava al recettore 1nmk nella coordinate della griglia X 38,86, Y di 10,987 e Z di 40,734. La valutazione del complesso recettore-ligando 1nmk nella simulazione della dinamica molecolare (MD) nel campo di forza CHARMM 36 della versione di Gromac ha gradi ottimali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ciclofilina A è un forte inibitore del Cyp A umano. La ciclofilina è un inibitore robusto che non compromette il sistema immunitario, possiede migliori qualità farmacologiche e riduce l'inibizione del trasporto. La prognosi negativa è stata collegata alla sovraespressione di ciclofiline, una famiglia di proteine con attività di peptidil-prolil isomerasi1. Sono stati segnalati che le ciclofiline sono sovraespresse in numerosi tumori, incluso il carcinoma epatocellulare. Nel carcinoma epatocellulare (HCC), le ciclofile sono fondamentali sia per la resistenza ai farmaci oncologici sia per laproliferazione 2. L'inibizione acquisisce informazioni essenziali per identificare nuovi immunosoppressori basati su derivati della chinossalina, utilizzando l'aggancio molecolare a livello atomico e la simulazione MD per determinare il sito di legame preciso di DC838 a CypA 3.

Inoltre, ricerche in vivo hanno mostrato che la ciclofilina DC838 previene la proliferazione delle cellule della milza indotta dalla concanavalina. Diversi studi hanno riportato una serie di inibitori della ciclofilina macrociclici sintetizzati sulla base di Sanglifehrin A (SFA), una sostanzanaturale 4. L'ottimizzazione iniziale del composto ha rivelato che il gruppo idrossile del residuo di tirosina m5, gli stereocentri in C14 e C15 e il tripeptide acido valine5m5tirosina5piperazico nel nucleo di Sanglifehrin erano fattori essenziali che influenzavano la potenzadel composto 5. L'unità diene C185C21 della SFA potrebbe essere sostituita con un gruppo stirile per creare composti potenti che mostrano una modalità di legame innovativa, in cui la parte dello stirene interagisce con l'Arginina (Arg)55-6 del Cyp A tramite un'interazione di impilamento. Gli inibitori della ciclofilina non immunosoppressivi sono efficaci nel trattamento del virus dell'epatite C. La ciclosporinaA1, l'alisporivir e la maggior parte delle altre ciclosporine sono forti inibitori di MRP2, MDR1, OATP1B1 e altri trasportatori fondamentalidi farmaci 7,8.

D'altra parte, il Ganoderiol F purificato da Ganoderma leucocontextum rallenta la progressione del ciclo cellulare inibendo le cicline CDK4/CDK6 9, e le chinasi dipendenti da ciclina (CDK) sono fondamentali nel controllo del ciclo cellulare dei mammiferi. La ciclina D-CDK4/CDK6 e la ciclina E-CDK2 sono attori chiave nel controllo della progressione del ciclo cellulare da parte del Ganoderiol F. Pertanto, il Ganoderiol F potrebbe essere utilizzato come potenziale inibitore CDK4/CDK6 nel trattamento del cancro alseno 10,11. L'FA inibisce la fase G1 del ciclo cellulare, che impedisce la crescita dei macrofagi dipendenti da M-CSF senza compromettere la vitalitàcellulare 12. L'immunosoppressore inibisce la proliferazione disattivando l'attività di CDK2. Nel contesto del cancro, il ruolo della Ciclina D-CDK4/6, insieme ad altre Cicline e CDK, è ben consolidato. Il cancro è caratterizzato da una deregolazione anomala della via ciclina-CDK. In particolare, quando la cellula è pronta a iniziare la sintesi del DNA, CDK4 media il passaggio attraverso la fase G1 in combinazione con le cicline di tipo D. Questo processo è crucialmente collegato allo sviluppo e alla progressione delcancro 9.

Il sito attivo di Cyp A è caratterizzato dall'arginina catalitica invariante (Arg55) e da una miscela altamente conservata di residui idrofobi, aromatici e polari, come Arg55, Glutamina (Gln), Glicina (Gly) e Treonina (Thr)1,13,14. Il sito attivo della famiglia delle ciclofile è composto anche da alanina (Ala) e asparagina (Asn)1. Nel frattempo, il sito attivo della SFA è costituito dagli amminoacidi Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala e Asn, che formano una tasca idrofoba che racchiude la parte degli acidi piperazina della SFA. A differenza del Cyp A non ligato, il collegamento tra il macrociclo e la spin bike di SFA costringe Trp121 a riallineare le sue catenelaterali 16.

Il 1nmk è selezionato come codice PDB specifico di Sanglifehrin A, come menzionato in studiprecedenti 17. La SFA, una sostanza naturale immunosoppressiva, è stata scoperta per la prima volta in Streptomyces sp. A92-3081 5,18. La SFA mostra grandi affinità per il Cyp A e ha una struttura distinta rispetto a CsA, utilizzando un metodo unico per sopprimere il sistema immunitario. La complessa struttura molecolare della SFA comprende un macrociclo a 22 membri con un ancoraggio di nove carboni nella posizione 23, che termina in una parte spiro-biciclica altamente sostituita. Studi in vitro con fibroblasti polmonari umani fibrotici e campioni di pazienti con fibrosi polmonare idiopatica hanno dimostrato che la SFA aumenta la produzione di ciclofilina B e inibisce la secrezione di collagene di tipoI 19,20. In totale, sono state utilizzate 20 diverse sanglifehrin per isolare la SFA (C16). La sua affinità per le ciclofiline è circa 60 volte superiore rispetto a quella degli altri membri del gruppo SFA in un esperimento di legame competitivo senzacellule 15. Ad esempio, la SFA riduce significativamente la quantità di IL-12p70 bioattiva, la principale fonte di IL-12 rilasciata dalle cellule dendritiche, inibendo così l'attività delle cellule dendritiche. Questo studio suggerisce che la SFA sia un nuovo farmaco immunosoppressore potente1.

In questo protocollo, nuove strutture di ligando per Ganoderiol F/Cyp A venivano generate utilizzando metodi in silico con il software Chemsketch e poi convertite in file PDB utilizzando software compatibile. La concezione del legame proteina-ligando è una questione significativa nel processo di scoperta e progettazione di farmaci21,22. Le interazioni ligando-recettore erano collegate tramite il software AutoDock 4.2.6. I sistemi di docking computazionali generano tipicamente diverse configurazioni potenziali di complesso proteina-ligando. Uno o pochi candidati con il legame energetico più basso al recettore 1nmk possono essere selezionati per la fase successiva della progettazione del farmaco per garantire prove efficaci in silico. Il software Chimera è stato utilizzato per identificare il ligando ottimale di legame all'idrogeno. Infine, sono state effettuate simulazioni di dinamica molecolare (MD) sul complesso ligando-recettore per misurarne la stabilità. Questo metodo è descritto nel protocollo qui sotto.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generazione in silico di liganti e preparazioni di liganti nel software ChemSketch

NOTA: Questo software sarà utilizzato per disegnare la struttura di un ligando/molecola, cioè per l'editing molecolare.

  1. Disegna il ligando/struttura come indicato nel processo di disegno seguito dal software, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 1).
  2. Premi f9 per pulire la struttura dopo aver disegnato l'intera struttura.
  3. Clicca su File e poi Salva come. (Naviga fino alla cartella, ad esempio, la molecola 1 sarà salvata nella cartella 1, e così via).
  4. Cambia il tipo Salva come in mdl molfiles, poi clicca su Salva (non è necessario specificare un nome file; usa il nome predefinito fornito dal software, ad esempio noname).
    NOTA: Un file verrà creato nella cartella, e ogni file avrà il formato mdl di un ligando di struttura 2D.
  5. Ripeti i passaggi sopra per tutte le molecole.

2. Conversione del formato file (software Open Babel)

NOTA: Il software converte i formati file. Qui, il file .mol verrà convertito in formato .pdb, come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 2).

  1. Sul lato sinistro, nel formato input, seleziona mol--mdl mol format dal menu a tendina. Analogamente, sul lato destro, nel formato di output, seleziona pdb--protein data bank format.
  2. Sotto il formato di input (sul lato sinistro), clicca su ... (il pulsante di navigazione).
  3. Naviga nella cartella (ad esempio, cartella 1), clicca sul file Chemsketch appena disegnato e aprilo .
  4. Nel formato di output, clicca su ....
  5. Si aprirà una finestra predefinita. Digita 1.pdb qui per nominare il file. Per la struttura 1, digita 1.pdb e clicca su Salva. Ripeti questo passaggio per la molecola/struttura 2, tipificando 2.pdb , e così via.
  6. Infine, dal centro dell'interfaccia software, clicca su Converti. Questo convertirà le coordinate dal formato mol mdl al formato PDB.
    NOTA: Ora, un altro file verrà aggiunto alla cartella. Ogni file avrà 1 file pdb di ligando che verrà utilizzato nei passaggi successivi.
  7. Clicca con il tasto destro sul file appena creato, seleziona Apri con e poi scegli Notepad.
  8. Ripeti gli stessi passaggi per tutte le molecole.
    NOTA: AutoDock 4.2.6 apparirà sul desktop dopo l'installazione degli strumenti MGL 1.5.7.
  9. Prepara il file di input 1nmk.pdb come descritto di seguito.
  10. Nel file 1nmk.pdb, rimuovere tutti i liganti esterni visitando il sito web pdb.org e selezionando la struttura 1nmk. Cerca i liganti sotto il titolo della piccola molecola sulla struttura 1nmk, come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 3).
  11. Trova il ligando chiamato SFM, come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 4), e apri il file 1nmk. Scarica il file PDB 1nmk dal sito web del PDB. Individua il residuo di terminazione (TER.), come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 5).
  12. Eliminare i residui dei liganti esterni (SFM) nella struttura a 1nmk, partendo dal residuo dopo TER e terminando prima del residuo elencato prima della fine. Salva il file PDB 1nmk modificato sul sistema.
    NOTA: Il file PDB 1nmk sarà pronto e la preparazione del file del sito delle coordinate attive del recettore sarà nella Tabella 1.
  13. Apri il file 1nmk e trova Arg al numero di amminoacido 55.
  14. Trova le coordinate x, y e z, come mostrato nel Supplementare File 1 (Screenshot 6).

3. Preparazione dei parametri di attracco utilizzando il software AutoDock 4.2.6.

  1. Apri il software AutoDock 4.2.6 tools dal desktop.
  2. Seleziona AutoDock 4.2.6 4.0 per la preparazione del recettore 1nmk, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 7).
  3. Apri il menu File , seleziona Leggi Molecole, naviga nella cartella, seleziona 1nmk e premi Aperto.
  4. Premi Modifica, scegli Idrogeno e clicca su Aggiungi. Seleziona solo Polare e premi OK. (File supplementare 1, Screenshot 8).
  5. Premi Modifica, scegli Charges, poi seleziona Kollman Charges.
  6. Premi Modifica, scegli Atomi, poi seleziona Assegna tipo ad4 (scegli uno qualsiasi di essi).
  7. Apri il menu File , scegli Salva e digita pdbqt. Si aprirà una finestra. Sfoglia la cartella 1, digita il nome file 1nmk.pdbqt e clicca su Salva.
  8. Seleziona da Atom, poi aggiungi come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 9). Seleziona le caselle per i nodi di ordinamento, salva le coordinate di trasformazione, scrivi tutti i record e poi clicca OK.
  9. Apri Ligando, seleziona input, e poi Aperti. Naviga nella cartella 1, cambia il tipo di file in tutti i file, seleziona 1.pdb e clicca su Open. Apparirà una piccola finestra che fornirà informazioni sul ligando selezionato, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 10).
  10. Apri il ligando, poi l'albero di torsione, e infine rileva la radice, come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 11).
  11. Apri il ligando, poi l'output, e poi salva come pdbqt. Naviga nella cartella 1, digita il nome file 1. pdbqt e clicca su Salva, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 12).
    NOTA: Tutti i file pdbqt con ligando saranno preparati.
  12. Apri la griglia, seleziona Macromolecola, scegli 1nmk e poi seleziona Molecola. Apparirà un avvertimento; clicca OK, come mostrato nel Supplementare File 1 (Screenshot 13). Naviga nella cartella 1, digita il nome file 1nmk.pdbqt, clicca su Salva e, quando si apre una finestra di sostituzione, clicca su Sì, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 14).
  13. Apri la griglia e poi imposta i tipi di mappa, scegli Ligando, clicca su 1 e seleziona Ligando, come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 15).
  14. Prepara il file dei siti di coordinate attive del recettore GPF come mostrato nella Tabella 1.
    NOTA: Il file GPF rappresenta il sito coordinato attivo del recettore (Tabella 1).
  15. Clicca su Griglia, poi vai su Scatola della Griglia, scegli Centro, scegli un atomo e inserisci la casella Griglia Centrale (Supplementare File 1, Screenshot 16).
    1. Scegli File, poi Chiudi, salvando le impostazioni attuali.
    2. Scegli Griglia, poi Output e salva come GPF. Vai nella cartella 1 e digita il nome del file 1nmk.gpf.
    3. Scegli Docking > Macromolecola > imposta il nome file rigido, naviga fino alla cartella 1 e clicca su 1nmk.pdbqt, poi apri, come mostrato nel File supplementare 1 (Screenshot 17).
    4. Scegli Docking, trova 1 e seleziona Ligando (File Supplementare 1, Screenshot 18). Si aprirà una finestra con parametri predefiniti. Accettare i parametri predefiniti, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 19).
    5. Poi scegli Docking, vai a Parametri di ricerca, seleziona Algoritmo Genetico, che apre una finestra con parametri predefiniti, e poi scegli Accetta, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 20).
    6. Scegli Docking, poi Output, Lamarckian GA, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 21).
    7. Vai nella cartella 1, digita il nome del file " 1nmk.dpf" e clicca su Salva, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 22).
      NOTA: Chiudi la finestra software di AutoDock 4.2.6, riaprila e ripeti il processo per la molecola successiva. Inoltre, il 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf e 1nmk.dpf saranno pronti per la fase del processo di attracco.

4. Cygwin-I (Processo di attracco)

NOTA: Per creare file GLG e DLG , esegui l'algoritmo. L'algoritmo (AutoGrid) gira in questo terminale Cygwin. In Cygwin, naviga fino alla cartella. Ad esempio, se la cartella 1 si trova sul disco C, dovrebbe contenere una cartella chiamata "progetto", seguita da un'altra cartella chiamata "molecoleche" e poi tutte le cartelle al suo interno. Segui questi passaggi.

  1. Apri il terminale Cygwin .
  2. Digita cd c:/ e premi Invio. Poi scrivi cd project e premi Invio.
  3. Tipifica le molecole cd e premi Invi, poi CD 1 e Invio. Ora la cartella 1 è nel terminale Cygwin.
  4. Digita ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & e premi Invio, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 23).
    NOTA: In "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &", -l è un minus l minuscolo.
  5. Digita coda -f 1nmk.glg e premi Invio, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 4).
  6. Se AutoGrid si completa con successo, chiudi questa finestra di Cygwin, apri una nuova finestra di Cygwin e ripeti il processo sopra per la molecola 2.
  7. Ripeti questo passaggio per tutte le molecole ed esegui l'algoritmo (AutoDock 4.2.6).
    NOTA: Per AutoDock 4.2.6, ripeti il processo di navigazione fino alla cartella e, quando la cartella è accessibile, digita e premi Invio per AutoDock 4.2.6.
  8. Digita ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & e premi Invio, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 24).
    NOTA: Nel passaggio sopra "-l" c'è una lettera minuscola "L" con segno negativo.
  9. Tipo coda -f 1nmk.dlg
    NOTA: Se l'AutoDock 4.2.6 si completa, chiudi la finestra Cygwin e ripeti il processo per la molecola 2.
  10. Segui questa procedura Cygwin per tutte le molecole.
  11. Dopo aver creato file DLG per le molecole, vai nella cartella 1 e apri il file DLG su WordPad. Premi Ctrl + F, digita e premi Invio tre volte per raggiungere la tabella RMSD, come mostrato nel Supplementare File 1 (Screenshot 25).
  12. Apri una finestra di Microsoft Excel o annota la pagina e crea tre colonne: No., Min. Binding Energy, e Run.
  13. Annota i dati secondo la tabella RMSD nel file di log. L'energia di legame si trova in cima alla tavola, insieme alla corsa in cui è stata osservata. Fallo per tutte le molecole.
    NOTA: La molecola con energia di legame più bassa è considerata migliore delle altre.
  14. Crea un altro foglio di calcolo con i dettagli (numero di serie, energia minima di legame e corsa) delle 20 molecole principali.
    NOTA: La seguente procedura sarà eseguita solo per le prime 20 molecole.

5. Cygwin-ii

  1. Apri il terminale Cygwin, digita cd c:/ e premi Invio.
  2. Tiptipizza cd project e premi Enter, tipizzazione molecole cd e premi Enter.
  3. Digita cd (numero di cartella della molecola superiore selezionata) e premi Invio.
    NOTA: Il numero dovrebbe corrispondere alla cartella nel terminale Cygwin.
  4. Tipare grep '^docked' 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt e premi Invio. A differenza di AutoGrid e AutoDock, non apparirà alcun messaggio di completamento riuscito per questo e premi Invio, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 26).
  5. Premi Invio e il file verrà creato.
  6. Tipizzazione -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb e premi Invio. Il file verrà creato, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 27).
  7. Chiudi la finestra del Cygwin.
    NOTA: Per visualizzare l'interazione tra liganti e recettori dopo l'attracco utilizzando il software PyMOL 2.5
    1. Apri il software PyMOL 2.5, poi apri il file, poi seleziona recettore.
    2. Apri il file, poi seleziona la configurazione del ligando scelta, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 28).
    3. In PyMOL 2.5, seleziona Nascondi Molecola e Nascondi Recettore. Nel menu Recettore , seleziona Mostra Superficie, come mostrato nella Figura 1A.
      NOTA: Per visualizzare il legame idrogeno nel complesso recettore ligando-1nmk, verrà utilizzato il software Chimera UCSF in 20 liganti con energia di legame più bassa.

6. Software UCSF Chimera per la visualizzazione del legame a idrogeno e l'analisi dei risultati

  1. Apri UCSF Chimera, poi seleziona File, poi Apri, e naviga su drive c:/, poi Project, Molecules), seleziona 1nmk.pdb e aprilo.
  2. Seleziona il drive dove si trovano le molecole, poi apri la proteina nel programma UCSF.
  3. Seleziona Residuo, poi scegli UNL Zoom.
  4. Seleziona Zona, poi premi OK, poi Azione, poi Etichetta, Residuo e Nome + Specificatore.
  5. Seleziona strumenti, poi scegli Analisi strutturale, e infine scegli Trova H-Bond, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 29).
  6. Apri la finestra predefinita e seleziona le caselle per i legami H di colore che non soddisfano criteri precisi, e trova solo i legami H selezionati.
  7. Seleziona Cancella Selezione per iniziare un nuovo sondaggio, poi Zooma e cerca le linee blu/arancioni, che rappresentano i legami H, come mostrato nella Figura 3.
  8. Controlla quante obbligazioni devono essere conteggiate.
    NOTA: Lo zoom dovrebbe mostrare le interazioni con i legami H con Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, isoleucina 15623, istidina 5424, fenilalanina (Phe)53, cisteina (Cys)52, Gly72, Asn71 e Hid70, e indicare se si trovano nel sito attivo della proteina, come mostrato nella Figura 3A - D.
  9. Nota il numero di legami H e il numero delle molecole.
  10. Metti il mouse sopra la linea che mostra il legame H, indicando le interazioni con Arg55 e Metionina, Gln, Gly e Thr.
  11. Premi il tasto Stampa schermo .
  12. Apri l'applicazione Paint , incolla la Figura Supplementare e salvala nella cartella nominata.
    NOTA: Per mostrare chiaramente i legami H e gli amminoacidi del sito attivo, la struttura 2D dei liganti e recettori scelti dovrebbe essere la seguente:

7. Preparazione del diagramma di interazione dei ligandi per la conferma dell'aggancio e la visualizzazione del legame H

  1. Apri il software AutoDock 4.2.6.
    1. Seleziona Analisi e apri Macromolecola, poi scegli 1nmk, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 30).
    2. Seleziona Analisi e apri Docking, poi scegli Apri, naviga al file dlg.pdb e selezionalo, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 31).
    3. Seleziona Analisi e apri Docking, poi scegli di scrivere il ligando di schermo virtuale AutoDock e salvalo come file PDB, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 32).
  2. Apri il software PyMOL 2.5 come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 33).
    1. Apri il file salvato dlg.pdb, poi apri il file 1nmk.pdb.
    2. Apri File, seleziona Esporta Molecola, poi Salva, come mostrato nel File Supplementare 1 (Screenshot 34).
    3. Apri il software Maestro, apri File, poi scegli Import Structure come mostrato in Supplementary File 1 (Screenshot 35).
    4. Importare il Diagramma di Interazione dei Ligandi, salvare la struttura 2D, come mostrato nel Fascicolo Supplementare 2.

8. Simulazione MD

NOTA: Per aprire GROMACS su Linux segui questi passaggi

  1. Scarica Ubuntu 20.04.6.
    1. Attiva l'applicazione Funzionalità di Windows sul PC. Poi scegli il sottosistema Windows per Linux e premi OK.
    2. Segui queste e premi Invio per installare GROMACS:
      1. Digita sudo apt-get update e premi Enter, poi sudo apt-get upgrade e premi Enter.
      2. Digita sudo apt-get install gcc e premi Enter, e digita sudo apt-get install cmake e premi Enter.
      3. Digita sudo apt-get install built-essential e premi Enter, poi sudo apt-get install liDevfftwtw3-d e premi Enter.
      4. Digita sudo apt-get install GROMACS e premi Enter, poi shift + Ctrl + T.
    3. Apri la cartella sul PC del personal computer e chiamala GROMACS, come mostrato nel Supplementary File 1 (Screenshot 36).
    4. Apri la cartella GROMACS e premi Shift + Ctrl + Tasto destro per entrare in Linux.
      NOTA: Le simulazioni utilizzavano il modello dell'acqua e la versione 4.0 di GROMACS, versione multicore Win64, che incorporava il campo di forza CHARMM 36. Il timestep è stato impostato a 2 fs, è stata scelta la distanza di taglio da 1,0 a 1,2 nm.

9. Creazione di topologia di ligando utilizzando moduli GROMACS pdb2gmx (File supplementare 1, Screenshot 37)

  1. Crea un file lig.gro, estrai il ligando dalla struttura proteica digitando grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb e premendo Invio, poi rinomina "UNL" in "LIG" nel file.
  2. Apri lig.pdb in PyMOL 2.5, rimuovi gli atomi indesiderati premendo seleziona gli atomi e premendo elimina l'atomo. Clicca su salva per salvare la versione pulita come lig_clean.pdb.
  3. Apri il file pulito in Avogadro per aggiungere idrogeno usando lo strumento Build e salvalo come lig.mol2. Modifica la parte superiore del file in un editor di testo per assicurarti che il nome del residuo sia impostato su LIG.
  4. Digita perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 e premi Invio.
  5. Genera la topologia del ligando usando CGenFF: carica lig_fix. mol2, elabora l'input e scarica lig_fix.pdb. Attiva l'ambiente Python ed esegui python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff e premi Invio.
    NOTA: Questo passaggio genererà quattro file ligando (lig.prm, lig.itp, lig.top e lig_ini.pdb).
  6. Genera il file ligand.gro , digita gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro e premi Invio.
  7. Separare la proteina salvando solo gli atomi non liganti in prot_clean.pdb e assicurarsi che gli atomi UNL siano elencati in cima al complesso combinato.

10. Creazione di topologia proteica nei moduli pdb2gmx di GROMACS (File supplementare 1, Screenshot 38).

  1. Preparare la topologia proteica, tipo gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter e premere Enter .
  2. Crea il complesso di proteine e ligando dopo aver aggiunto il file lig.gro alla fine del file pro.gro . Poi digita gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic e premi Invio.
  3. Genera solvato usando il modello di carico puntuale specifico dell'acqua per mantenere l'equilibrio, tipa gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top e premi Invio.
  4. Crea file di ioni, digita gmx grompp -f ioni.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ioni.tpr e premi Invio. Tipa gmx genion -s ioni.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutro, e premi Invio, poi scegli il gruppo 15 per aggiungere ioni.
  5. Genera minimizzazione energetica em.gro.
  6. Digita gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr e premi Enter, e digita gmx mdrun -v -deffnm em e premi Enter.
    NOTA: Il sistema solvato sarà minimizzato energeticamente utilizzando un massimo di 50.000 passi con un criterio di convergenza delle forze di 1.000,0 kJ/mol/nm.
  7. Crea i file indice, digita gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, premi Invio.
  8. Digita gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 e premi Invio.
  9. Genera il file index.ndx , digita gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx e premi Invio.
  10. Genera il file NVT di equilibramento nvt.gro , digita gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr e premi Enter. Poi, digita gmx mdrun -deffnm nvt e premi Invio.
    NOTA: L'equilibrio del sistema è stato eseguito a una temperatura di 27,35 °C (300,5 K) per l'insieme del numero di atomi (N), volume (V) e temperatura (V) (NVT) del sistema per 100 ps.
  11. Aggiornare il file topologico topol.top includere la topologia dei liganti e i parametri per ottenere NPT.
  12. Generare l'equilibrio NPT.
  13. Crea l'equilibrio NPT di seconda fase, tipa gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr e premi Invio, poi digita gmx mdrun -deffnm npt e premi Invio.
    NOTA: NVT equilibrato si riferisce al numero di particelle, al volume e alla temperatura, mentre NPT equilibrato si riferisce alla stabilità per il numero di particelle, la pressione e la temperatura. I file NVT.mdp e NPT.mdp sono necessari per produrre i risultati della simulazione MD come segue.

11. Rilasciare i vincoli di posizione ed eseguire la simulazione della dinamica molecolare di produzione per raccogliere dati

  1. Tipare gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr e premi Invio. Poi, digita gmx mdrun -deffnm md_0_10 e premi Invio.
  2. Sottoponi il sistema a una simulazione MD di 1 ns per testare la stabilità del complesso.
    NOTA: La deviazione quadratica media della radice (RMSD) quantifica la deviazione strutturale media degli atomi rispetto a una struttura di riferimento, mentre la deviazione quadrata media della fluttuazione (FMSD) misura le fluttuazioni miche medie nel tempo attorno alle loro posizioni medie. I due valori sono necessari per finalizzare le esecuzioni di simulazione MD.
  3. Eseguire analisi strutturali, inclusi RMSD, FMSD, legami a H ed energia libera.
  4. Disegna i grafici di analisi usando qtgrace_v026_win7 software e il file md_0_10.gro per mostrare la scatola di traiettoria usando il software VMD.

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Risultati

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Come menzionato nell'introduzione, studi in vivo e in vitro dimostrano l'importanza degli inibitori della ciclofilina nel semplificare la struttura della Sanglifehrin, riducendo così la proliferazione della milza topina interferendo con il ciclocellulare 5 del muro. Inoltre, la ciclofilina A, insieme ai derivati del Ganoderiolo F, svolge ruoli vitali nel ripiegamento delle proteine, nelle risposte immunitarie e nella segnalazione cellulare attrav...

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Discussione

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Una nuova sostanza naturale immunosoppressiva chiamata SFA o recettore molecolare 1nmk è stata estratta da Streptomyces. L'analisi del docking molecolare è stata utilizzata per determinare le energie di legame dei liganti costruiti con la proteina bersaglio. I risultati hanno mostrato che, di tutti i liganti progettati, SFA differisce strutturalmente da CsA e mostra una notevole affinità per CypA 16. Il Cyp A, che possiede attività di isomerasi cis-trans ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Riferimenti

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