Articolo metodologico

Preparazione di una libreria di cDNA ultrasensibile per il sequenziamento di nuova generazione di microRNA da piccole vescicole extracellulari

DOI:

10.3791/67154

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13 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

In questo articolo

Sommario

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Le vescicole extracellulari (EV) contengono microRNA specifici per le cellule che regolano le cellule riceventi, la cui identificazione può far luce sulla loro funzione e sul loro ruolo come biomarcatori. Il nostro protocollo ottimizzato di preparazione della libreria cDNA introduce codici a barre unici che consentono il multiplexing dei campioni e l'elaborazione avanzata di vescicole extracellulari a basso input, utilizzando codici a barre a doppio indice accoppiati per la compatibilità con i sequenziatori Illumina.

Abstract

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Studi recenti dimostrano che le piccole vescicole extracellulari (sEV), che si trovano in tutti i biofluidi, svolgono un ruolo critico nella comunicazione intercellulare canalizzando proteine, DNA e RNA. I microRNA (miRNA) impacchettati nelle sEV sono emersi come regolatori critici nelle cellule riceventi. Poiché le sEV secrete da cellule normali e malate trasportano diversi carichi di miRNA, recenti studi di profilazione sEV-miRNA suggeriscono che potrebbero aiutare a identificare nuovi biomarcatori circolanti. Tuttavia, le sEV cellule/specifiche per malattia che circolano in diversi biofluidi, una volta isolate, forniscono basse quantità di miRNA, che sono generalmente difficili da quantificare utilizzando le metodologie spettrometriche convenzionali. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) di piccoli RNA non codificanti, che consente l'amplificazione di sequenze di miRNA clonate, offre una preziosa opportunità per valutare i carichi di miRNA delle sEV. Sfortunatamente, le procedure commerciali di preparazione delle librerie di cDNA spesso richiedono input di RNA ben al di sopra delle quantità non quantificabili disponibili dalle sEV isolate.

Pertanto, considerando la robustezza e le capacità di multiplexing della nostra attuale procedura di preparazione della libreria di cDNA (cioè, inizialmente ottimizzata per l'analisi di RNA a basso input, altamente degradato e fissato in formalina (paraffina (FFPE)), abbiamo cercato di valutare la sua applicabilità per l'analisi dei miRNA sEV. È importante sottolineare che, tenendo conto dei recenti miglioramenti tecnici del clustering dei chip di sequenziamento, abbiamo cercato di adattare il nostro approccio di codifica a barre delle trascrizioni all'interno di un flusso di lavoro di preparazione della libreria di cDNA compatibile con l'indice accoppiato e doppio per migliorare le nostre capacità di sequenziamento e multiplexing. Utilizzando l'RNA estratto da 8,4 × 109 sEV in 16 repliche e da quantità decrescenti di sEV da 1010 sEV a un minimo di 2,5 × 107 sEV, abbiamo valutato la riproducibilità e la sensibilità di questa metodologia. I dati dimostrano che i codici a barre del DNA adenilato 16 3' consentono il rilevamento altamente riproducibile e sensibile dei profili di miRNA sEV attraverso le ripetizioni utilizzando un minimo di 3,15 pg di piccoli RNA non codificanti totali o 1,35 pg di miRNA.

Introduzione

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Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono particelle di origine cellulare di dimensioni nanometriche (~30-200 nm di diametro) avvolte da una membrana a doppio strato fosfolipidico, che viene ereditata dalla loro cellula di origine e che protegge in modo robusto i loro carichi molecolari 1,2. È ben noto che praticamente tutte le cellule producono e rilasciano sEV nel compartimento intercellulare, che a sua volta può essere rilevato nella maggior parte dei biofluidi (ad esempio, sangue, urina, saliva, ecc)2,3,4. Studi recenti hanno dimostrato che i carichi molecolari stabilmente incapsulati (cioè DNA, RNA, proteine, lipidi, ecc.) 5,6,7 di sEV, una volta in contatto o consegnati alle cellule riceventi mediano la comunicazione intercellulare8. Gli attuali sforzi di ricerca si sono concentrati sul miglioramento dell'isolamento di sEV specifiche per le cellule da diversi biofluidi, per identificare e monitorare con precisione questi carichi molecolari 9,10. Considerando che le sEV contengono piccoli RNA non codificanti e in particolare microRNA (miRNA), che mantengono la loro funzione regolatoria al momento della consegna cellulare, molti studi si sono concentrati sulla valutazione dell'utilità dei miRNA come biomarcatori in grado di rivelare la condizione della loro cellula di origine 11,12,13.

I microRNA (miRNA) rappresentano un'ampia classe (~2.000 noti nell'uomo) di piccoli RNA non codificanti con dimensioni comprese tra 19 e 25 nucleotidi (nt), che si legano a siti complementari imperfetti nelle regioni 3' non tradotte dei loro bersagli di mRNA e ne dirigono la degradazione e/o la repressione post-trascrizionale14,15. Funzionalmente, è stato descritto che i miRNA controllano molti processi biologici e la deregolazione della loro espressione è stata associata ad alterazioni nei processi molecolari, biochimici e fisiologici che contribuiscono all'inizio e allo sviluppo di malattie, incluso il cancro 16,17,18. È importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato che le cellule malate, e in particolare le cellule tumorali, non solo esprimono in modo differenziale i miRNA rispetto alle cellule normali18, ma che anche il loro impacchettamento nelle sEV differisce19,20.

Mentre diversi studi si concentrano sullo stabilire i processi molecolari e le vie che dirigono l'impacchettamento delle sEV nelle cellule normali e malate 19,21,22, gli studi sui biomarcatori sono attualmente focalizzati sull'identificazione di piccole firme di RNA e/o miRNA non codificanti distinguibili che vengono impacchettate e secrete da specifiche cellule malate/tumorali tramite sEV. L'isolamento mirato di sEV specifiche per cellule malate da diversi biofluidi umani e la valutazione dei loro carichi molecolari multi-omici possono quindi consentire lo sviluppo di saggi diagnostici e prognostici per il rilevamento non invasivo di diverse malattie e tumori umani 23,24,25,26. Sebbene i sEV-miRNA siano i trascritti non codificanti più studiati, altre piccole specie di RNA non codificanti (ad esempio, isoforme di miRNA (isomiR), piwiRNA, frammenti di RNA di trasferimento (tRF), rRNA, RNA orfani non codificanti (oncRNA)...) sono in fase di valutazione per la loro potenziale utilità come biomarcatori sEV circolanti, con particolare attenzione alla rilevazione di diversi tumori 27,28,29,30,31,32.

Vantaggiosamente, l'analisi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) di piccoli trascritti di RNA non codificanti (inclusi i miRNA), dopo la loro preparazione di librerie di codici a barre e cDNA, è ideale per l'esplorazione di piccole specie di RNA non codificanti note e/o sconosciute contenute nelle sEV circolanti, che possono essere associate a malattie27. Infatti, sEV small-RNA NGS fornisce un approccio ad alto rendimento per la scoperta di piccoli trascritti di RNA non codificanti specifici per cellula che altrimenti rimarrebbero sconosciuti, se valutati globalmente con tecnologie specifiche per il bersaglio (ad esempio, PCR multiplex, microarray, pannelli personalizzati, ecc.) 32,33,34. Considerando che abbiamo precedentemente ottimizzato un protocollo di preparazione di una libreria di cDNA ultrasensibile e altamente riproducibile, che abbiamo sviluppato per l'analisi di RNA inclusi in paraffina (FFPE)35,36 altamente degradati e a bassa concentrazione fissati in formalina, abbiamo cercato di adattarlo per l'analisi di piccoli RNA e miRNA non codificanti incapsulati all'interno di sEV 37,38,39,40.

Con l'interruzione dello strumento Illumina HiSeq2500, che ci ha fornito anni di analisi di alta qualità di miRNA a doppio indice single-end di carichi sEV37,40, abbiamo cercato di esplorare la riproducibilità e la sensibilità del nostro protocollo quando adattato a strumenti di sequenziamento aggiornati che utilizzano la chimica a doppio indice ora paired-end. Con l'intento di mantenere le capacità di multiplexing del protocollo originale, abbiamo mantenuto i 16 codici a barre esistenti per la preparazione di trascritti di cDNA a piccoli RNA prima di integrarli all'interno della chimica a doppio indice paired-end. Utilizzando solo una coppia di codici a barre i5 e i7, consentiamo la preparazione di una solida libreria di cDNA basata su laboratorio in cui l'elaborazione e l'analisi simultanea di un massimo di 16 singoli campioni migliorano la riproducibilità analitica dell'RNA sEV a basso input. Pertanto, presentiamo i processi biochimici, i codici a barre aggiornati, la PCR e i primer dei marcatori dimensionali e le fasi di isolamento necessarie per generare librerie di cDNA altamente riproducibili utilizzando quantità ultra-basse di miRNA isolati da sEV plasmatiche umane.

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Protocollo

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1. Tutti i reagenti e gli oligonucleotidi sono preparati come segue:

NOTA: Tutti i nucleotidi utilizzati in questo protocollo sono descritti in dettaglio nella Figura 1 e nel File supplementare 1 alle concentrazioni utilizzate per l'implementazione di questo protocollo. Vedere il file supplementare 2 per le sequenze di base.

  1. Preparare una soluzione madre di cocktail calibratore, che verrà utilizzata in ogni singola legatura come controllo per le diverse reazioni enzimatiche:
    1. Risospendere l'oligonucleotide Carrier (0,5 μM) (File supplementare 1) con acqua priva di RNasi.
    2. Combinare i 10 calibratori (10 μL ciascuno, File supplementare 1) in un'unica provetta da 1,5 mL per ottenere una riserva di 100 μM, diluirla utilizzando l'oligonucleotide vettore per ottenere la soluzione da 0,0052 nM e conservare a -20 °C.
  2. Risospendere ciascuno dei 17 adattatori adenilati 3' unici (16 sperimentali e 1 adattatore con codice a barre di prova) (Figura 1A) con acqua priva di nucleasi a una concentrazione di 50 μM.
    NOTA: Ogni adattatore viene aliquotato in singole provette contenenti 2,5 μl per la conservazione a -80 °C per un massimo di 2 anni, per evitare cicli di gelo-scongelamento delle scorte più grandi.
  3. Risospendere i diversi oligonucleotidi di RNA sperimentali, tra cui il supporto di estrazione dell'RNA (File supplementare 1), il supporto di legatura dell'RNA 3' (File supplementare 1), il test di legatura dell'RNA (File supplementare 1) e la legatura 3' (File supplementare 1; adattatore 19 nt-3' e adattatore 24 nt-3') e legatura 5' (File supplementare 1; adattatore 5'adapter-19 nt-3' e 5'adapter-24 nt-3'adapter), a 250 ng/μL.
  4. Diluire l'adattatore da 5' purificato con HPLC a 100 μM con acqua priva di nucleasi (Figura 1A).
  5. Risospendere l'RT e i primer RT/PCR della prima PCR 5' e 3' a 100 μM con acqua priva di nucleasi (Figura 1B).
  6. Risospendere gli oligonucleotidi i7 e i5 della PCR 5' e 3' a 100 μM con acqua priva di nucleasi (Figura 1B).
    NOTA: Aliquotare ciascun primer di DNA per un massimo di 10 esperimenti e conservarlo a -80 °C.
  7. Preparare il colorante caricante in gel di poliacrilammide (PAA), miscelare e aliquotare 1 mL in provette e conservare a -80 °C.
    1. Preparare una soluzione di 0,5 M Na2H2 EDTA aggiungendo 18,6 g di Na2H2 EDTA a 50 mL di acqua priva di nucleasi. Aggiungere lentamente i pellet di NaOH alla soluzione preparata di Na2H2 EDTA per raggiungere un pH di 8,0. Portare il volume fino a 100 mL utilizzando ddH2O per ottenere una soluzione madre 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0)
    2. Pesare 15 mg di Blu di Bromofenolo in una provetta da 15 mL, risospendere la polvere in 600 μL di acqua priva di nucleasi, aggiungere 14,25 mL di formammide deionizzata. Infine, aggiungere 150 μl di una soluzione 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0. Aliquotare la soluzione finale di PAA in provette da 1 mL e conservare a -80 °C.
    3. Preparare il colorante di caricamento in gel di agarosio 5x.
      1. Pesare e sciogliere 1,86 g di Na2H 2-EDTA in 50 mL di acqua priva di RNasi e regolare il pH a 8,0 aggiungendo pellet di NaOH. Aggiungere acqua priva di RNasi a 100 mL per ottenere una soluzione di 50 mM di Na2H2 EDTA.
      2. A 5 ml di 50 mM Na2H2 EDTA, aggiungere 20 mg di blu di bromofenolo, 20 mg di xilene cianolo FF e 2 g di Ficoll tipo-400. Agitare la provetta contenente i tre coloranti da miscelare e aggiungere altri 5 mL di 50 mM Na2H2 EDTA. Aliquotare singole provette da 1 mL di 5 coloranti di caricamento in gel di agarosio e conservare a -80°C.

2. Preparazione dei campioni di EV RNA

  1. Dopo l'isolamento delle sEV, valutare la loro morfologia utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM; Figura 2), concentrazione mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA; Figura 3) e distribuzione delle proteine di superficie utilizzando il nanoimaging a super-risoluzione (Figura 4) o una tecnologia di quantificazione sEV equivalente.
  2. Aliquotare un numero equivalente di sEV in provette diverse, aggiungere RNasi-A (12,5 μg/mL) e incubare a 37 °C per 1 ora.
  3. Avviare l'estrazione di piccoli RNA non codificanti, inclusi i miRNA, dalle sEV utilizzando il kit di estrazione di piccoli RNA e avviare l'isolamento della fase dell'RNA.
  4. Separare la fase acquosa inferiore del tampone di lisi dell'RNA, aggiungerlo a una nuova provetta, quindi aggiungere 4 ng di oligonucleotide trasportatore di RNA (File supplementare 1) a ciascun campione di RNA, prima di eseguire l'isolamento della colonna seguendo le istruzioni del produttore.
  5. Sottovuoto, in velocità, ogni singolo campione di RNA a 9,5 μL per avviare il protocollo di preparazione della libreria di cDNA.

3. Impostare le legature dell'adattatore con codice a barre da 3' con 16 campioni di RNA e 1 campione di prova

  1. Identificare 16 singoli campioni di sEV-RNA, aliquotarli in 9,5 μL di acqua priva di nucleasi in provette da microcentrifuga siliconate da 1,5 mL e metterli sul ghiaccio almeno 10 minuti prima di iniziare gli esperimenti.
  2. Preparare il tampone RNA ligasi 10x (senza ATP) fresco prima dell'esperimento.
    1. In una provetta siliconata da 1,5 mL, combinare 343 μL di acqua bidistillata priva di nucleasi (ddH2O), 500 μL di 1 M Tris pH 7,5, 100 μL di 1 M MgCl2, 50 μL di 20 mg/mL di albumina sierica bovina e 7 μL di 14 M 2-mercaptoetanolo.
    2. Mescolare la soluzione agitando la provetta, centrifugare per 2 s a 2.000 × g a temperatura ambiente (RT) su una centrifuga da tavolo, quindi mettere in ghiaccio.
      NOTA: Tutti i passaggi che descrivono una "centrifuga per 2 s" sono tutti eseguiti con una microcentrifuga a RT con una velocità non superiore a 2.000 × g.
  3. Scongelare il cocktail calibratore da 0,0052 nM posizionando la provetta sul ghiaccio per 10 minuti.
  4. Preparare la Ligation Master Mix per 18 reazioni in una provetta siliconata da 1,5 mL combinando 40 μL di tampone RNA ligasi 10x, 10 μL di cocktail calibratore 0,0052 nM e 40 μL di ddH2O privo di nucleasi.
  5. Muovi e gira la provetta da 1,5 ml e mettila sul ghiaccio.
  6. Aggiungere 4,5 μl di Ligation Master Mix a ciascuno dei 16 campioni di RNA sEV aliquotati singolarmente e la reazione di ligazione del test contenente 100 ng di oligonucleotide del test di ligazione dell'RNA (File supplementare 1) precedentemente aliquotato e a 9,5 μL di volume. Muovi per mescolare e far girare i tubi prima di rimetterli sul ghiaccio.
  7. Trasferire i 16 campioni e testare la reazione in un blocco termico per 1 minuto a 90 °C e trasferire nuovamente nel ghiaccio.
  8. Trasferire singolarmente 4 μl di PEG al 50% in ciascuna provetta, mescolare e centrifugare le provette prima di rimetterle sul ghiaccio.
  9. Scongelare aliquote da 2,5 μL da ciascuno dei 17 adattatori con codice a barre da 3' (16 sperimentali (da #1 a #16) e adattatore di prova (#17)) e metterli sul ghiaccio per scongelare.
  10. Trasferire 1 μL di ciascuno dei 17 adattatori ai corrispondenti 16 campioni contenenti sEV-RNA e un campione di prova, con Ligation Master Mix (cioè 4,5 μL) e PEG al 50% (cioè 4 μL).
    NOTA: Tutte le soluzioni e le reazioni vengono miscelate muovendo le provette e facendole girare, piuttosto che pipettare le soluzioni su e giù, per evitare la perdita di materiale.
  11. Preparare l'enzima di legatura K227Q troncato dell'RNA Ligasi 2 diluito aggiungendo 10 μL dell'enzima con 10 μL di ddH2O privo di nucleasi in una nuova provetta siliconata da 1,5 mL.
  12. Trasferire 1 μL dell'enzima di ligazione K227Q troncato dell'RNA T4 Ligasi 2 diluito in ciascuna delle 17 provette (16 campioni di RNA sperimentale e 1 campione di RNA di prova). Non pipettare su e giù, non cambiare i puntali tra una provetta e l'altra, tenere le provette sul ghiaccio, mescolare, centrifugare e posizionare le provette sul ghiaccio.
  13. Posizionare le legature sul ghiaccio fresco in un supporto per tubo in un secchiello per il ghiaccio nella cella frigorifera, durante la notte per un massimo di 18 ore.

4. Isolamento PAGE dei piccoli RNA legati con adattatore 3'

  1. Posizionare le 17 provette su un blocco termico a 90 °C per 1 minuto per disattivare l'RNA Ligasi T4 2 e metterle su ghiaccio per 2 minuti per raffreddare.
  2. Combinare 1 μL di GlycoBlue e 26 μL di NaCl 5 M privo di nucleasi in una provetta nuova e trasferire 1,2 μL di questa soluzione di precipitazione in ciascuna delle 17 provette.
  3. Aggiungere 63 μl di etanolo al 100% a ciascuna delle 17 provette, chiudere, scorrere e girare verso il basso per 2 s prima di rimetterle sul ghiaccio.
  4. Combina il contenuto delle 16 provette per RNA sEV in un'unica provetta siliconata da 1,5 mL, mantenendo separata la provetta per la legatura dell'RNA in esame.
  5. Capovolgere la provetta contenente i campioni combinati 3 volte per mescolare, centrifugare brevemente per 2 s e mettere in ghiaccio per 60 minuti per precipitare.
  6. Preparare un gel grande (16 x 20 cm2) di poliacrilammide al 15% (PAGE) come segue:
    1. Siliconizzare (cioè utilizzando una soluzione a base di silicone) e fondere le lastre di vetro corte e lunghe insieme a distanziatori da 0,1 cm.
    2. Preparare la miscela di gel PAGE al 15% combinando 9 ml di diluente per sistema, 18 ml di concentrato per sistema, 3 ml di tampone per sistema, 240 μl di APS (9%) e 12 μl di TEMED in una provetta conica da 50 mL.
    3. Trasferire rapidamente la soluzione tra le piastre di vetro utilizzando una pipetta da 30 mL. Prima che il gel polimerizzi, aggiungere un pettine a 14 pozzetti (0,1 cm di spessore) e posizionare il gel in posizione verticale per 30 minuti a RT.
  7. Recuperare la provetta con i campioni di RNA combinati dal ghiaccio e centrifugarla a 16.000 × g per 60 minuti a 4 °C.
  8. Nel frattempo, terminare l'impostazione del 15% PAGE rimuovendo delicatamente il pettine, pulendo i pozzetti con H2O privo di nucleasi con un flacone a spruzzo sopra un lavandino, prima di asciugare e impostare il 15% PAGE sull'apparato in gel, dove sia il serbatoio superiore che quello inferiore sono riempiti con una soluzione 0,5x Tris-Borate EDTA (TBE), prima di una pre-corsa di 30 minuti a 450 V.
  9. Rimuovere la provetta dalla centrifuga (passaggio 4.6) e asciugare accuratamente il pellet di RNA utilizzando una pipetta Pasteur con un puntale non filtrante da 10 μl all'estremità collegato a un sistema di vuoto, senza disturbare il pellet.
  10. Risospendere il pellet di RNA contenente le 16 legature di RNA precipitate in 20 μL di ddH2O privo di nucleasi e aggiungere 20 μL di soluzione di caricamento su gel PAA. Agitare la provetta per mescolare, centrifugare per 2 s e mettere sul ghiaccio.
  11. Sostituire 0,5x TBE di apparecchio in gel con un nuovo 0,5x TBE.
  12. Impostare una provetta con una scala di dimensioni dell'RNA da 20 bp, due provette con ciascuno dei due marcatori di dimensioni del DNA corti di legatura 3' (File supplementare 1) e una provetta contenente l'oligonucleotide del test di ligazione dell'RNA (cioè legata con l'adattatore con codice a barre #17).
  13. A ciascuna delle provette (ad es. scala, oligo di DNA corti di legatura 3' e test di legatura dell'RNA), aggiungere 20 μL di soluzione di caricamento su gel PAA.
  14. Impostare la provetta per campioni di RNA da 16 leganti e 1 provetta per legatura dell'RNA a 90 °C per 1 minuto e rimetterla in ghiaccio.
  15. Sostituire il tampone TBE 0,5x sia dal serbatoio inferiore che da quello superiore (cioè, aggiungere il tampone al di sotto del livello del pozzetto in modo che non vi sia contaminazione incrociata tra i pozzetti durante il caricamento) e caricare la scala sulle estremità del gel, la legatura del test dell'RNA, i due marcatori corti della dimensione del DNA su entrambi i lati del pozzetto contenenti le 16 legature combinate di RNA con codice a barre da 3' (vedere la Figura 5).
  16. Far funzionare il gel al 15% di PAGE con tutti i campioni per 90 minuti a 450 V (~35 mA) in condizioni di raffreddamento (cioè con ventole che soffiano aria sulle lastre di vetro).
  17. Rimuovere il 15% di PAGE dal vetro e spruzzarlo leggermente con la soluzione di SYBR Gold (10 μL di SYBR Gold in 25 mL di 0,5x TBE) e lasciarlo riposare inclinato per 5 minuti al buio.
  18. Posizionare il gel su un transilluminatore a luce blu (Figura 5) e allineare sia l'adattatore 19 nt-3' che entrambi gli oligonucleotidi di DNA corti del marcatore di dimensioni dell'adattatore 24 nt-3' con un righello e asportare l'area del gel contenente i costrutti di miRNA legati (la Figura 6 mostra la legatura 3' e il costrutto risultante). Separatamente, asportare la banda superiore della legatura del test dell'RNA, che verrà utilizzata anche per una legatura del test 5' il giorno successivo.
  19. Posizionare i due pezzi di gel asportati separati (cioè per 16 campioni di RNA e per la legatura del test) in diverse provette rompigel da 0,5 mL inserite in provette siliconate da 1,5 mL, centrifugare a 16.000 × g per 3 minuti a RT e quindi risospendere i due pezzi di gel frammentati con 300 μL di soluzione di NaCl da 400 mM, chiudere le provette, e sigillarli con parafilm.
  20. Posizionare i tubi su un agitatore con agitazione a 1.100 giri/min a 4 °C, durante la notte (16-17 h).

5. Legatura dell'adattatore da 5'

  1. Trasferire due gel frammentati separati e le loro soluzioni (16 campioni con codice a barre da 3' (codici a barre da #1 a #16) e RNA di test con codice a barre da 3' (codice a barre #17)) su due provette filtranti separate da 5 μm, ciascuna impostata in provette siliconate da 1,5 mL, sigillarle con parafilm e centrifugare per 5 minuti a 2.300 × g a RT.
  2. Aggiungere 950 μl di etanolo al 100% a ciascuna soluzione filtrata, chiudere le provette, capovolgerle per mescolare, centrifugare per 2 s, sigillare le provette con parafilm e metterle in ghiaccio per 1 ora.
  3. Preparare al momento un brodo acquoso al 50% di DMSO combinando 1 mL di acqua priva di nucleasi con 1 mL di DMSO, avvolgere la provetta in un foglio di alluminio e conservare al buio presso RT.
  4. Preparare un gel al 15% di PAGE e pre-eseguirlo, seguendo i passaggi descritti nel paragrafo 4.6.
  5. Centrifugare le provette contenenti i 16 campioni di RNA legati 3' e la legatura dell'RNA di prova a 16.000 × g per 60 minuti a 4 °C per far precipitare gli RNA legati.
  6. Rimuovere con cautela il surnatante senza toccare i pellet di RNA e asciugare con l'aspirapolvere.
  7. Risospendere il pellet legato 3' di 16 campioni di RNA e testare l'RNA ciascuno in 8 μL di ddH2O privo di nucleasi senza pipettare su e giù. Muovere leggermente le provette per mescolare, centrifugare per 2 s (2.000 × g) a RT e mettere le provette sul ghiaccio.
  8. Preparare il tampone RNA ligasi 10x (con ATP) mescolando 500 μL di Tris 1 M (pH 7,5), 100 μL di 1 M MgCl2, 50 μL di BSA acetilato 20 mg/mL, 200 μL di ATP 10 mM, 7 μL di 2-mercaptoetanolo 14 M e 143 μL di acqua priva di RNasi in una provetta da 1,5 mL.
  9. Aggiungere 2 μL di tampone RNA ligasi 10x (cioè con ATP), 1 μL di adattatore 5' da 100 μM e 4 μL di DMSO acquoso al 50% a ciascuna provetta. Frullare per mescolare, centrifugare per 2 s a RT, quindi impostare la provetta a 90 °C per 1 minuto per denaturare l'RNA e rimetterla sul ghiaccio.
  10. Aggiungere 3 μl di DMSO al 50%, frullare per mescolare, centrifugare per pellettare, aggiungere 3 μl di RNA ligasi T4 a ciascuna provetta, agitare le provette, centrifugare per 2 s a RT e posizionare le provette sull'agitatore a 37 °C per 75 minuti.
    NOTA: Non pipettare su e giù.
  11. Preparare la scala di DNA da 20 nt e due provette separate contenenti gli oligonucleotidi di DNA lunghi del marcatore di dimensione della legatura 5' (File supplementare 1; adattatore 5'adapter-19 nt-3' e adattatore 5'adapter-24 nt-3') e aggiungere 20 μL di PAA a ciascuna delle provette.
  12. Una volta completata la legatura dell'adattatore 5', aggiungere 20 μL di PAA a ciascuna delle due legature (cioè 16 campioni di RNA e RNA di prova), mescolare muovendo, centrifugare verso il basso e impostare a 90 °C per 1 minuto, dopodiché riposizionare le provette sul ghiaccio.
  13. Svuotare i serbatoi superiore e inferiore dell'apparecchio in gel e aggiungere una soluzione fresca di TBE 0,5x al di sotto del livello dei pozzetti del serbatoio superiore.
  14. Caricare la scala all'estremità del gel, il campione di RNA del test legato 5', i due oligonucleotidi di DNA lunghi marcatori dimensionali (cioè adattatore 5'-19 nt-3' e adattatore 5'-24 nt-3') nei pozzetti che circondano il pozzetto dove verranno caricati i 16 campioni di RNA 5' legati (la Figura 6 mostra la legatura 5' e il costrutto risultante). Far funzionare il gel per 90 minuti a 450 volt.
  15. Una volta completata la corsa, rimuovere il gel dall'apparecchio e dal vetro e spruzzarlo con una soluzione di SYBR Gold (cioè 10 μL di SYBR Gold in 25 mL di 0,5x TBE) e lasciarlo riposare al buio per 5 minuti.
  16. Utilizzando l'adattatore 5'-19 nt-3' e entrambi i marcatori dimensionali dell'adattatore 5'--24 nt-3' come guide dimensionali, asportare direttamente la sezione del gel contenente i 16 campioni di RNA legati 5' (Figura 7).
    NOTA: La legatura dell'RNA del test viene valutata sul gel per dimostrare che la legatura dell'adattatore 5' consente uno spostamento di dimensioni equivalenti ai marcatori di dimensioni. La legatura dell'RNA del test non viene asportata dal gel; solo i 16 campioni di RNA combinati legati.
  17. Trasferire il pezzo di gel asportato contenente i 16 campioni di RNA legati in una provetta rompigel da 0,5 mL in una provetta da 1,5 mL, centrifugare a 16.000 × g per 3 minuti a RT, quindi aggiungere 300 μL di NaCl 300 mM e 1 μL di primer RT/PCR da 100 μM 3' (Figura 1B) ai pezzi di gel frantumati nella provetta.
  18. Sigillare la provetta con parafilm e posizionarla su un agitatore agitando a 1.100 giri/min a 4 °C, per una notte (17-18 h) in una cella frigorifera.

6. Trascrizione inversa dei piccoli RNA non codificanti 5' e 3' legati con codice a barre e miRNA

  1. Pipettare la soluzione dalla provetta contenente il gel frantumato su una provetta filtrante da 5 μm inserita in una provetta siliconata da 1,5 mL priva di RNasi e centrifugare brevemente per consentire alla soluzione di passare attraverso il filtro.
  2. Aggiungere 950 μl di etanolo al 100% a questa soluzione filtrata, capovolgere la provetta per mescolare, centrifugare per 2 s e mettere in ghiaccio per 60 min.
  3. Far precipitare il pellet di RNA mediante centrifugazione della provetta a 16.000 × g a 4 °C per 1 ora.
  4. Recuperare la provetta, rimuovere con cura il surnatante senza toccare il pellet e asciugare il pellet sotto vuoto prima di rimetterlo in 5,6 μL di H2O privo di nucleasi.
  5. Impostare la reazione RT aggiungendo 3 μl di tampone 5x primo filamento, 4,2 μl di 10x dNTP (ciascuno a 2 mM) e 1,5 μl di ditiotreitolo (DTT) alla provetta. Scorri per mescolare e gira per 2 s.
  6. Impostare la reazione a 90 °C per 30 s esatti e quindi trasferire la provetta in un blocco a 50 °C per 2 minuti.
  7. Avviare la reazione RT aggiungendo 0,75 μL di enzima trascrittasi inversa nella soluzione, mescolare e impostare a 50 °C per 35 minuti.
  8. Trasferire la provetta a 95 °C per 1 minuto per denaturare l'enzima e i filamenti di cDNA/RNA, quindi aggiungere 95 μL di H2O privo di RNasi, agitare la provetta per mescolare e metterla in ghiaccio per 2 minuti. Questa provetta contiene cDNA generato dai 16 campioni di RNA, ciascuno con codice a barre separato in 3'.

7. Condurre il test PCR e l'amplificazione su larga scala

  1. Preparare un tampone PCR 10x fresco combinando 304 μL di H2O privo di nucleasi, 125 μL di 2 M KCl, 50 μL di 1 M Tris pH 8.0, 10 μL di 1 M MgCl2, 5 μL di Triton X-100 all'1% e 6 μL di 1 M 2-mercaptoetanolo in una provetta che può essere conservata con ghiaccio.
  2. Assemblare una reazione PCR pilota/di prova per il cDNA prodotto nella fase 6.8 (sopra) combinando 67 μL di H2O privo di nucleasi con 10 μL di tampone PCR 10x, 10 μL di 10x dNTP, 0,5 μL di primer PCR 5' 100 μM, 0,5 μL di primer PCR 3' 100 μM, 10 μL di cDNA Stock Library, e 2 μl di Taq polimerasi 50x in una provetta PCR fresca.
    NOTA: Prima di eseguire le amplificazioni PCR, configurare lo strumento stabilendo due diversi file come segue: Per File#1: 94 °C per 45 s, 50 °C per 85 s e 72 °C per 60 s per 12 cicli e 4 °C; e per File#2: 94 °C per 45 s, 50 °C per 85 s e 72 °C per 60 s per 2 cicli e 4 °C.
  3. Per la reazione PCR pilota/di prova, posizionare la provetta PCR contenente i 100 μL della reazione PCR nel termociclatore ed eseguire File#1.
  4. Una volta completato il File#1, aprire la provetta PCR e trasferire 12 μL della reazione in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 3 μL di colorante 5x per il caricamento del gel. Chiudere il tubo e scrivere "12 cicli" sul tappo.
  5. Prendi la provetta per PCR, inseriscila nel termociclatore e avvia il File#2.
  6. Una volta completato il File#2, trasferire 12 μL della reazione PCR in una provetta da 1,5 mL contenente 3 μL di colorante Loading in gel 5x e scrivere "14 cicli" sul tappo.
  7. Ripetere le amplificazioni PCR altre quattro volte consecutive (cioè due cicli di PCR ciascuna), trasferendo 12 μL di prodotto PCR alla fine di ogni amplificazione, e a sua volta ottenere quattro diverse provette, etichettate a 16, 18, 20 e 22 cicli.
  8. Caricare la scala da 20 nt e ciascuno dei prodotti amplificati con PCR su un agarosio al 2,5% e far scorrere il gel in TBE 0,5x per 30 minuti a 120 V.
  9. Identificare il ciclo di amplificazione PCR ottimale (Figura 8A), in base al rapporto e alla presenza di dimeri di primer (banda inferiore) e cDNA amplificato (banda superiore).
    NOTA Considerando che l'input totale di RNA con 16 campioni può essere inferiore a 1 ng, ci si aspetta che i dimeri di primer generino un prodotto più velocemente e in quantità maggiori rispetto al cDNA purificato. Pertanto, il ciclo di PCR adeguato viene generalmente selezionato tra 18 e 22 cicli. Nella Figura 8A, il ciclo PCR adeguato per questa libreria è 20. Nella Figura 8B, la dimensione del costrutto PCR è dettagliata.
  10. Una volta identificato il ciclo di amplificazione della PCR adeguato, impostare una PCR negativa (senza cDNA) e quattro reazioni PCR positive da 100 μL (cioè, ciascuna contenente 12 μL di cDNA).
    1. Per semplificare la preparazione delle reazioni PCR, impostare una PCR Master Mix (cioè per 4,5 reazioni) in una provetta da 1,5 mL combinando 292,5 μL di H2O privo di nucleasi, 45 μL di tampone PCR 10x, 45 μL di dNTP 10x, 3,25 μL di primer RT/PCR 3' (Figura 1B) e 2,25 μL di primer PCR 5' (Figura 1B). Capovolgere questo tubo per mescolare e girare per raccoglierlo sul fondo del tubo.
    2. Trasferire 86 μl della PCR Master Mix in ciascuna delle quattro provette PCR da 0,5 mL.
    3. Aggiungere 12 μl di libreria di cDNA (conservata su ghiaccio), quindi 2 μl di titanio polimerasi 50x in ciascuna delle 4 provette PCR e mescolare pipettando su e giù.
    4. Preparare la provetta di reazione PCR senza stampo aggiungendo 77 μL di H2O privo di nucleasi, 10 μL di tampone PCR 10x, 10 μL di dNTP 10x, 0,5 μL di primer PCR 5', 0,5 μL di primer PCR 3' e 2 μL di polimerasi Taq 50x a una provetta PCR separata e pipettando su e giù per miscelare.
    5. Impostare le provette PCR nel termociclatore utilizzando il ciclo PCR identificato al punto 7.9 e impostare un nuovo programma sul termociclatore per amplificare se necessario.
  11. Preparare un gel di agarosio al 2,5% con 0,5x TBE e bromuro di etidio e trasferire 12 μl da ciascuna provetta PCR in provette singole contenenti 3 μl di colorante caricante gel 5x.
  12. Preparare la scala da 20 nt combinando 3 μL di scala con 9 μL di H2O privo di nucleasi e 3 μL di colorante caricante su gel.
  13. Caricare il gel, farlo funzionare per 30 minuti a 120 V e verificare che l'amplificazione della PCR sia simile tra le quattro diverse reazioni e che il controllo senza stampo sia vuoto (Figura 8C).
  14. Combinare le quattro reazioni PCR tra due provette per microcentrifuga siliconate da 1,5 mL (cioè due provette contenenti ciascuna 90 μL di prodotto) e aggiungere 18 μL di NaCl 5 M e 800 μL di etanolo al 100% in ciascuna delle due provette.
    1. Capovolgere le provette per mescolare e conservarle a -20 °C per farle precipitare durante la notte.

8. Purificazione della libreria amplificata PCR

  1. Centrifugare le due provette contenenti le reazioni PCR positive miste a 16.000 × g per 60 minuti a 4 °C.
  2. Dopo 60 minuti, rimuovere il surnatante, asciugare sotto vuoto i pellet di DNA e risospenderli in 19,5 μL di tampone 1x, quindi aggiungere 0,5 μL di enzima PmeI.
  3. Impostare i digestati PmeI a 37 °C per 2 ore per rimuovere qualsiasi marcatore delle dimensioni del DNA che correva nei pozzetti adiacenti (ad esempio, adattatore 19 nt-3', adattatore 24 nt-3') o potenziali contaminanti (ad esempio, vettore di estrazione dell'RNA, vettore di legatura dell'RNA post-3') (ad esempio, vedere i siti PmeI inclusi nei primer di RNA e DNA nel File supplementare 1)
  4. Eseguire i due digest in tre diversi pozzetti di un gel di agarosio al 2,5% utilizzando 0,5x TBE per evitare di accumulare un eccesso di dimeri di primer in un singolo pozzetto e creare uno striscio.
    1. Aggiungere 3 μl di colorante 5x per il caricamento di gel a ciascuno dei digestati, combinare i due digest e quindi caricare 16,5 μl in tre pozzetti adiacenti separati.
    2. Caricare la scala delle dimensioni del DNA da 20 nt ai pozzetti terminali del gel e far scorrere il gel per 90 minuti a 150 V (Figura 8D).
  5. Per purificare le librerie di DNA, asportare le bande PCR superiori dalle tre corsie adiacenti del gel e trasferirle in una provetta fresca da 1,5 mL.
  6. Purificare la libreria amplificata PCR utilizzando un kit di estrazione su gel, seguendo le istruzioni del produttore, e quantificare il prodotto a base di DNA purificato utilizzando un fluorimetro, seguendo le istruzioni del produttore.

9. Amplificazione PCR finale per l'aggiunta di codici a barre compatibili con il sequenziatore

  1. Preparare una nuova miscela di tampone PCR 10x come quella descritta al punto 7.1.
  2. Impostare le reazioni PCR includendo un controllo negativo (senza ampliconi) e tre reazioni PCR utilizzando 0,75 ng del prodotto PCR purificato dalla prima amplificazione PCR in ciascuna delle tre provette come segue:
    1. Impostare tre reazioni PCR individuali mescolando 75 μL di ddH2O, 10 μL di tampone PCR 10x, 10 μL di 10x dNTP, 1 μL di primer PCR 2' 2( es. primer i503 (Figura 1B)), 1 μL di 2nd primer PCR 3' (es. primer i702 (Figura 1B)), 1 μL di prodotto PCR (es. 0,75 ng da 1° prodotto PCR purificato con gel) e 2 μL di Titanium Taq Polimerasi.
    2. Impostare il controllo PCR negativo (cioè senza stampo di DNA) mescolando 76 μL di ddH2O, 10 μL di tampone PCR 10x, 10 μL di 10x dNTP, 1 μL di 5' 2nd PCR primer (cioè primer i503 (Figura 1B)), 1 μL di 3' PCR 2 nd primer (cioè primer i702 (Figura 1B)), e 2 μL di Taq polimerasi.
    3. Impostare le quattro reazioni PCR (cioè un controllo negativo, tre positivi) su un termociclatore programmate come segue: 72 °C per 3 min, 95 °C per 30 s e 95 °C per 10 s, 55 °C per 30 s, 72 °C per 30 s per 9 cicli, quindi 72 °C per 5 min e un mantenimento finale a 10 °C.
  3. Una volta completati i cicli di PCR, prelevare 10 μl della miscela di reazione e aggiungere 3 μl di colorante di caricamento, quindi valutare i prodotti su un gel di agarosio al 2,5% come mostrato nella Figura 9A, insieme alla scala da 20 nt.
  4. Dopo aver convalidato le dimensioni del prodotto PCR (cioè la banda PCR superiore a 164 bp come mostrato nella Figura 9B e nella Figura 6 per le dimensioni e i dettagli sul costrutto finale) e la distribuzione della banda, combinare i prodotti PCR in due provette aggiungendo a ciascuna 135 μL di prodotto PCR (cioè 90 μL + 45 μL), 13,5 μL di NaCl 5 M, e 650 μl di etanolo al 100% e precipitare a -20 °C durante la notte.
  5. Il giorno successivo, centrifugare le due provette per PCR a 16.000 × g per 60 minuti a 4 °C.
  6. Asciugare ogni pellet, risospendere con 19,5 μL di tampone PmeI 1x e aggiungere 0,5 μL di PmeI per 2 ore a 37 °C su un agitatore per eliminare ulteriormente tutti i marcatori dimensionali che scorrevano nei pozzetti adiacenti (ad esempio, adattatore 19 nt-3', adattatore 24 nt-3') o vettori di RNA (ad esempio, vettore di estrazione dell'RNA, vettore di legatura post-3' dell'RNA).
  7. Mettere i prodotti digeriti in tre pozzetti di gel di agarosio al 2,5% e separarli a 150 V per 90 minuti.
  8. Asportare la banda superiore, che funziona a 164 bp (Figura 9C), e purificare il prodotto del DNA utilizzando un kit di isolamento del DNA e quantificare con un fluorimetro.
  9. Esegui il prodotto finale della PCR su un chip di DNA per convalidare le dimensioni, la concentrazione e la purezza della libreria prima delle diluizioni e dell'analisi utilizzando un sequenziatore.
  10. Trasferire il file di dati FASTQ alla pipeline RNAworld per il taglio dell'adattatore, il demultiplexing, l'allineamento al genoma umano, prima delle analisi dei miRNA, come descritto in precedenza41. In alternativa, utilizzando lo script presentato nel file supplementare 3, demultiplex le letture dal file FASTQ e ulteriori elaborazioni utilizzando una pipeline analitica a piccoli RNA a scelta.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come dettagliato nel protocollo di cui sopra, descriviamo l'elaborazione simultanea di un massimo di 16 singoli campioni di RNA di piccole vescicole extracellulari (sEV) (cioè per l'analisi di piccoli RNA non codificanti e miRNA), che vengono analizzati insieme all'interno di un'unica libreria, dopo essere stati sottoposti a 3' barcoding. Le sEV selezionate per le nostre analisi sono state isolate mediante ultracentrifugazione, come precedentemente descritto 37,40

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato un protocollo di preparazione di librerie di cDNA per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) riproducibile e sensibile di RNA non codificanti, inclusi i microRNA (miRNA) isolati in modo efficiente da piccole vescicole extracellulari (sEV). Considerando che una quantità limitata di piccoli RNA e miRNA non codificanti può essere recuperata da sEV isolate globalmente o selettivamente, abbiamo cercato di ottimizzare la nostra procedura di preparazione della libreria ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. è un fondatore non impiegato di EValuate Diagnostics, Inc con una piccola percentuale di capitale della società. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desideriamo ringraziare il laboratorio del Dr. Thomas Tuschl per il loro supporto e per aver fornito l'accesso alla tecnologia originale sviluppata nel loro laboratorio, oltre a garantirci l'accesso alla pipeline RNAworld.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1% Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTP AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoetanoloSigmaO3445I-100 
Scala da 20 nt Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL Albumina sierica bovinaSigmaB8894-5ML 
50x Taq in titanioLaboratori Clontech 
Persolfato di ammonioFisher Scientific7727-54-0
Transilluminatore a luce blu - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Sistema di elettroforesi verticale su gel con piastre di vetro e pettiniGIBCOV16
Dimetil solfossido (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuga 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Tubo filtrante con Filtro da 5 mmIST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand Provette per microcentrifuga siliconate a bassa ritenzione 1,5 mLFisher Scientific02-681-320
Provetta rompigel 0,5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Apparecchio per elettroforesi su gel 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT con vassoi e pettini in gelBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sequencer Illumina20047256
Jersey-Cote (soluzione a base di silicio)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 M AmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge centrifuga personale a doppio rotoreUSA scientific2641-0016
Modello V16 Apparecchio per elettroforesi su gel di poliacrilammide, occhiali, pettini e distanziatoriCiore Life Science21070010
OligonucleotidiIDTDefinito in fase d'ordine
Owl EasyCast B2 mini sistema di elettroforesi - con vassoi e pettini in gel Kit diThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Qiagen28704
Qubit FluorimetroThermofisher ScientificQ33238
Enzima di restrizione PmeI e 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Trascrittasi inversa - Superscript IIIThermoFisher12574026
Acqua priva di RNasi...AmbionAM9932
Agitatore - Eppendorf ThermomixerEppendorf5385000024
SeaKem LE agarosioLonza50002
Superscript III Tecnologie Invitrogen18080-044
SYBR GoldLifeS11494
Titanio Taq polimerasiTakara639208
T4 RNA ligasi 1 NEBM0204S
T4 RNA ligasi 2 troncato K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Themocycler con coperchio riscaldatoApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7,5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
sistema UltraPure Sequagel concentrato, diluente e tamponeNational DiagnosticsEC-833
639208 estrazione Kit di trascrizione inversa

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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