Articolo metodologico

Un modello murino di cicatrici ipertrofiche simili a quelle umane guidate dalla meccanotrasduzione

DOI:

10.3791/67156

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29 novembre 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo spiegherà come stabilire un modello murino di cicatrici ipertrofiche che aumenta la segnalazione di meccanotrasduzione per simulare cicatrici simili a quelle umane. Questo metodo prevede l'aumento della tensione meccanica attraverso un'incisione di guarigione in un topo e l'utilizzo di un dispositivo specializzato per creare un tessuto cicatriziale riproducibile ed eccessivo per analisi istologiche e bioinformatiche dettagliate.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cicatrizzazione ipertrofica (HTS) è un processo anomalo di guarigione delle ferite che provoca un'eccessiva formazione di tessuto cicatriziale. Nell'ultimo decennio, abbiamo dimostrato che la meccanotrasduzione, la conversione di stimoli meccanici in risposte cellulari, guida l'eccessiva guarigione delle cicatrici fibrotiche. Un modello murino per valutare le cicatrici ipertrofiche simili a quelle umane sarebbe uno strumento essenziale per esaminare varie terapie e la loro capacità di ridurre le cicatrici e migliorare la guarigione. In particolare, il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di ferita murina che aumenta lo sforzo meccanico per promuovere HTS simile a quella umana. Questo protocollo utilizza dispositivi di carico biomeccanico, realizzati con espansori palatali modificati da 13 mm, i cui bracci sono posizionati su entrambi i lati dell'incisione e distratti in modo incrementale per applicare una tensione continua sul letto della ferita durante la guarigione. Nel corso di quasi due decenni di utilizzo, questo modello è stato notevolmente migliorato per migliorare l'efficacia e la riproducibilità. Utilizzando il modello HTS murino, è possibile indurre cicatrici fibrotiche dermiche significative ad essere istologicamente paragonabili alle cicatrici ipertrofiche umane. Questo modello murino fornisce un ambiente per lo sviluppo di farmaci biologici coinvolti nel trattamento dell'HTS e delle condizioni correlate alla meccanotrasduzione, come la risposta da corpo estraneo.

Introduzione

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La guarigione delle ferite, il processo mediante il quale il corpo tenta di riparare il tessuto danneggiato e ricostruire la barriera cutanea, può portare a una guarigione atipica se i suoi processi di emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento sono irregolari1. La cicatrizzazione ipertrofica (HTS) è un esempio di guarigione irregolare delle ferite, caratterizzata da un'eccessiva deposizione di matrice extracellulare e tessuto connettivo nel sito della lesione con conseguente formazione di un'area di tessuto cicatriziale allargata 1,2,3. Le aree del corpo che subiscono ripetute stimolazioni meccaniche di stiramento, come intorno alle articolazioni o sul viso, sono più inclini a sviluppare HTS e fibrosi 4,5,6,7,8,9,10. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'allungamento meccanico attraverso un letto di ferita promuove la formazione di HTS attraverso l'attivazione di vie di meccanotrasduzione, la conversione di stimoli meccanici in risposte cellulari 9,11.

L'HTS non solo coinvolge processi biologici complessi, ma comporta anche notevoli sfide sociali, mediche ed economiche per le persone colpite. Gli individui colpiti possono lottare con l'autostima e la depressione, specialmente quando le cicatrici si trovano in aree visibili come il viso e le mani 1,9,10,12. Articoli di revisione scientifica indicano che la prevalenza di HTS varia tra il 32% e il 72% negli Stati Uniti10,13. La gravità di questi problemi estetici, soprattutto nei casi di gravi ustioni nella regione facciale, è sottolineata dal numero crescente di casi di trapianto facciale completo per migliorare l'aspetto10. Queste cicatrici possono anche causare menomazioni funzionali limitando il movimento 6,14 e spesso è necessario un intervento chirurgico per asportare le cicatrici e ripristinare la mobilità10. Il costo del trattamento HTS può essere sostanziale, comprese le spese per chirurgia, trattamenti, terapia fisica o persino assistenza a lungo termine 1,10. Solo negli Stati Uniti, il costo annuale del trattamento dell'HTS supera i 4 miliardi di dollari10.

Considerando la pervasività dell'HTS e le misure estreme adottate per affrontare le sue complicanze, le terapie convenzionali (ad esempio, l'escissione chirurgica, le iniezioni di corticosteroidi e la terapia laser) rimangono altamente variabili 1,2,15,16,17. Sebbene questi trattamenti possano offrire sollievo in alcuni casi, possono essere insufficienti a causa della natura complessa della patologia cicatriziale. Fattori come le differenze genetiche tra gli individui e una comprensione incompleta dei meccanismi che guidano l'HTS fanno sì che le strategie terapeutiche rimangano clinicamente insoddisfacenti 18,19,20. Il futuro della terapia HTS sembra risiedere in nuovi approcci innovativi che mirano ai driver meccanicistici cellulari dell'HTS, come la meccanotrasduzione11,21, che abbiamo ampiamente dimostrato di guidare l'eccessiva guarigione delle cicatrici fibrotiche 5,6,7,8,11,21,22,23,24,25. In particolare, avevamo precedentemente sviluppato un modello murino che aumenta lo sforzo meccanico della ferita per promuovere HTS9 simile a quello umano. Tuttavia, dopo quasi due decenni di utilizzo, il modello è stato notevolmente avanzato per migliorare l'efficacia e la riproducibilità. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di utilizzare al meglio un modello murino HTS aggiornato e ottimizzato per esplorare le popolazioni cellulari e i fattori alla base dell'eccessiva cicatrizzazione. L'obiettivo generale di questo metodo è fornire ai ricercatori un protocollo progettato per produrre cicatrici ipertrofiche simili a quelle umane nei topi.

Protocollo

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Per tutti gli esperimenti è stata ottenuta l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università dell'Arizona (numero di controllo: 2021-0828). Questo protocollo utilizza topi maschi C57BL/6J di 15 settimane, sebbene possa essere applicato ad altre età e ceppi 9,26.

1. Creazione del dispositivo di carico biomeccanico HTS

NOTA: La modifica degli espansori palatali nel dispositivo HTS può avvenire in qualsiasi momento prima dell'esperimento.

  1. Prendi l'espansore palatale non modificato e presentalo al nucleo makerspace o al nucleo di fabbricazione con le specifiche secondo la Figura 1A, B.
    NOTA: Se non è disponibile alcun makerspace o core di fabbricazione, continuare con i passaggi seguenti.
  2. Utilizzare uno strumento di piegatura del filo Mini Universal Bender (MUB) per modificare l'espansore palatale in modo che sia conforme alle specifiche della Figura 1A, B.
  3. Posizionare il dispositivo su una superficie come mostrato nella Figura 1A1.
  4. Piegare i bracci di 90° verso l'alto per la parte superiore dei bracci e di 90° verso il basso per i bracci inferiori quando il dispositivo è piatto con il MUB, come mostrato nella Figura 1A2. Vedere la Figura 1A3 per l'aspetto del dispositivo quando è appoggiato su una superficie in cui le braccia sono ora perfettamente parallele al corpo del dispositivo.
  5. Piegare ciascun braccio all'indietro nella pagina di 90° lungo l'asse della linea tratteggiata come mostrato nella Figura 1A4. Vedere la Figura 1A5 per il dispositivo dopo la piegatura.

2. Depilazione e incisione iniziale al giorno 0 postoperatorio (POD 0)

NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciatore ad ago). Preparare i punti di sutura sterilizzati 5-0 per l'uso e tenere a portata di mano un pennarello chirurgico.

  1. Pulire l'area di lavoro con spray all'etanolo al 70%.
  2. Posizionare un termoforo a 35 °C sul tavolo di preparazione preoperatoria. Fissare con del nastro adesivo un tampone assorbente sul termoforo. Posizionare un altro tampone assorbente sopra il tampone precedente (per raccogliere i peli rasati). Fissare il cono (o i coni) per anestesia sul tampone assorbente.
    NOTA: [Opzionale] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.
  3. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia con isoflurano all'1-3% e flusso di ossigeno di 2 L/min fino a quando i topi respirano tranquillamente (2-3 min).
  4. Inserire il naso di ciascun topo nell'apertura del cono, consentendo l'inalazione di un'anestesia composta dall'1-3% di isoflurano con 2 L/min di ossigeno. Confermare un'anestesia adeguata dalla mancanza di reazione a un pizzicamento del dito del piede. Applicare un unguento lubrificante oftalmico sugli occhi del topo.
  5. Utilizzare un rasoio elettrico per radere i peli sul dorso nell'area come mostrato nella Figura 1C.
  6. Applicare la pasta depilatoria con un dito guantato o un batuffolo di cotone sulla pelle, coprendo la zona rasata. Dopo 45 s, rimuovere la pasta con una garza e poi un tampone imbevuto di alcol. Pulisci il dorso con un altro tampone imbevuto di alcol per rimuovere la pasta depilatoria, lasciando dietro di sé una macchia glabra (Figura 1C).
    NOTA: È fondamentale utilizzare una quantità moderata di pasta, rimuovere prontamente la pasta e pulire il mouse dopo la rimozione della pasta per evitare ustioni cutanee dovute alla pasta depilatoria. La pelle murina è sottile, il che la rende suscettibile a rapide ustioni chimiche che possono avere effetti dannosi sia sulla salute del topo che sulla qualità sperimentale.
  7. Segnare il mouse per l'identificazione.
  8. Dopo aver rimosso i peli, rimetti il mouse nella gabbia per evitare un'eccessiva esposizione all'isoflurano. Monitorare il mouse.
  9. Rimuovere il tampone assorbente superiore coperto di peli per avere una superficie di lavoro prechirurgica pulita.
  10. Allestire un'area di lavoro chirurgica separata. Posizionare un termoforo a 35 °C sul tavolo operatorio. Fissare con del nastro adesivo un tampone assorbente sul termoforo. Fissare il cono (o i coni) per anestesia sul tampone assorbente.
  11. Posizionare un topo nella camera di induzione dell'anestesia con isoflurano al 2-4% e flusso di ossigeno di 2 L/min fino a quando il topo respira tranquillamente (2-3 min).
  12. Estrarre il mouse dalla camera di induzione e posizionarlo sulla superficie operativa. Inserire il naso di ciascun topo nell'apertura del cono, consentendo l'inalazione di un'anestesia composta dall'1-3% di isoflurano con 2 L/min di ossigeno. Confermare un'anestesia adeguata dalla mancanza di reazione a un pizzicamento del dito del piede. Applicare un unguento lubrificante oftalmico sugli occhi del topo.
  13. Iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato nella spalla per via sottocutanea utilizzando un ago da 21 G per il trattamento del dolore post-chirurgico.
  14. Disinfettare il dorso del topo con tre cicli alternati di scrub a base di iodio/clorexidina e tampone imbevuto di alcol. Con il pennarello chirurgico e un righello, segnare una linea di 2 cm sulla linea mediana dorsale dove verrà praticata l'incisione a tutto spessore, come mostrato nella Figura 1D.
  15. Utilizzare un bisturi o delle forbici da dissezione (preferenza chirurgica) per praticare l'incisione della linea mediana dorsale a tutto spessore attraverso l'area contrassegnata.
    NOTA: Fare attenzione a non tagliare il tessuto sottostante (ad es. muscolo), come mostrato nella Figura 1D.
  16. Utilizzando suture 5-0 in un semplice schema interrotto, chiudere l'incisione dividendo in due la ferita come mostrato nella Figura 1D. Utilizzare almeno 5 punti di sutura equidistanti.
  17. Tagliare una garza Telfa in un pezzo di 3 cm x 1 cm. Posizionarlo al centro di una medicazione adesiva in schiuma e posizionare la medicazione adesiva sul dorso del topo in modo che la garza copra l'incisione come mostrato nella Figura 1D. Posizionare una medicazione tagliata a metà sull'addome e avvolgerla circonferenzialmente fino a quando non incontra la medicazione dorsale.
  18. Al termine della medicazione, posizionare il topo in una gabbia sterile separata e monitorarlo fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestetico.
  19. Ripetere la procedura con tutti i topi, indipendentemente dal gruppo sperimentale. Lascia che l'incisione guarisca nei prossimi 4 giorni prima del passaggio successivo.

3. Posizionamento del dispositivo di carico biomeccanico HTS (POD 4)

NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave i dispositivi HTS e diversi set di strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciaago, cucitrice cutanea, graffette cutanee). Preparare le suture sterilizzate 5-0 per l'uso. [Facoltativo] Se è disponibile un estrattore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.

  1. Preparare l'area dell'intervento chirurgico come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2.
  2. Anestetizzare il topo e fornire analgesia seguendo i passaggi 2.11-2.13.
  3. Utilizzare la pinza o il cacciatore dell'ago per separare la medicazione dall'addome del topo lavorando l'utensile da un lato all'altro contro il lato ventrale. Lasciando lo strumento tra l'impacco e la pelle per sollevare la medicazione dalla pelle, usa le forbici per tagliare la medicazione.
    NOTA: Fare attenzione a non tagliare la pelle del topo, strappare la medicazione o disturbare l'incisione di guarigione.
  4. Pulisci il dorso con un tampone imbevuto di alcol. Esaminare l'incisione per verificare la presenza di deiscenza della ferita o segni di infezione.
  5. Assicurarsi che il dispositivo HTS non sia esteso/espanso e sia nella sua forma più ridotta, come mostrato nella Figura 1B. Rivestire leggermente le braccia del dispositivo con colla medica.
  6. Con una mano, rendi leggermente tesa la pelle del dorso del topo in direzione trasversale. Con l'altra mano, posizionare il dispositivo HTS sul dorso del mouse in modo che l'incisione sia equidistante da ciascun braccio del dispositivo HTS, centrando così il dispositivo sull'incisione. Assicurarsi che la pelle tra le braccia del dispositivo HTS sia uniformemente tesa. Tenere il dispositivo in posizione fino a quando la colla non si è asciugata (~30 s), come mostrato nella Figura 2A.
    NOTA: Mantenere la pelle uniformemente tesa è importante per garantire che la stessa quantità di tensione venga applicata all'incisione con il dispositivo. Lasciare intatte le suture durante questo processo perché il processo di posizionamento del dispositivo aggiunge tensione meccanica alla pelle, che può riaprire l'incisione di guarigione. Le suture rimangono in posizione fino al primo giorno di stretching per garantire che la ferita rimanga chiusa.
  7. Fissare quattro punti di sutura attorno a ciascun braccio e attraverso la pelle come mostrato nella Figura 2B. Durante la sutura, assicurarsi che l'ago esca dalla pelle verso l'incisione.
    NOTA: L'inserimento dell'ago dal lato dell'incisione del dispositivo a volte può strappare l'incisione a causa della forza necessaria per perforare la pelle.
  8. Ora posiziona tre graffette cutanee attorno alle braccia e attraverso la pelle, fissando il dispositivo HTS alla pelle come mostrato nella Figura 2B.
  9. Benda il topo seguendo i passaggi 2.17 e 2.18.
  10. Ripetere la procedura con tutti i topi, indipendentemente dal gruppo sperimentale.
    NOTA: Tutti i topi ricevono la stessa preparazione; Tuttavia, sono assegnati in modo casuale in ciascun gruppo sperimentale (ad esempio, controllo, stretching) per garantire una distribuzione imparziale dei topi nel disegno sperimentale. In particolare, sia i topi di controllo che quelli elastici avranno il dispositivo attaccato al loro dorso. I dispositivi dei mouse di controllo rimarranno intatti, mentre i mouse stretch subiranno i passaggi successivi.

4. Tratto iniziale del dispositivo di caricamento biomeccanico HTS (POD 5)

NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciaago) prima dell'intervento chirurgico. [Facoltativo] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.

  1. Assegna casualmente ogni mouse tramite marchio auricolare al gruppo desiderato. Per i topi di controllo, è sufficiente rimuovere i punti di sutura sull'incisione e cambiare le medicazioni delle ferite (passaggi 1-6 e poi 8-9). Se lo si desidera, rimuovere il dispositivo al momento dello stretching e scattare una foto con un attrezzo di misurazione per la scala per tenere traccia della dimensione della cicatrice.
  2. Preparare l'area chirurgica, anestetizzare il topo e rimuovere la medicazione eseguendo i passaggi 3.1-3.4.
    NOTA: Fare attenzione a non strappare la medicazione o disturbare l'incisione di guarigione. Se un braccio del dispositivo HTS si è staccato dalla pelle, incollare leggermente in posizione e aggiungere una graffetta cutanea o una sutura a seconda delle dimensioni del distacco.
  3. Rimuovere i punti di sutura dalla ferita con le forbici da dissezione o con un altro metodo a scelta.
  4. Inserire la chiave del dispositivo HTS nel dispositivo e ruotare per espandere il dispositivo fino a quando la pelle non è tesa ma non a rischio di lacerazione, come mostrato nella Figura 2C.
    NOTA: Questa distrazione iniziale può richiedere circa 4-8 giri completi del tasto poiché la pelle potrebbe essere allentata tra i bracci del dispositivo.
  5. Benda il mouse eseguendo i passaggi 2.17 e 2.18.

5. Successivo allungamento del dispositivo di carico biomeccanico HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciaago) prima dell'intervento chirurgico. [Facoltativo] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.

  1. Per i topi di controllo, è sufficiente cambiare le medicazioni delle ferite (passaggi 1-5 e poi passaggi 13-14). Se lo si desidera, rimuovere il dispositivo al momento dello stretching e scattare una foto della cicatrice con un attrezzo di misurazione per la scala per tenere traccia delle dimensioni della cicatrice.
  2. Preparare l'area chirurgica, anestetizzare il topo e rimuovere la medicazione seguendo i passaggi 3.1-3.4.
    NOTA: Se un braccio di un dispositivo HTS si è staccato dalla pelle, incollarlo in posizione e aggiungere una graffetta cutanea o una sutura a seconda delle dimensioni del distacco.
  3. Inserire la chiave del dispositivo HTS nel dispositivo e ruotare per espandere il dispositivo fino a quando la pelle non è tesa ma non a rischio di lacerazione.
    NOTA: Questa operazione può richiedere circa 4 giri o ~2 mm di distrazione totale. Se il dispositivo ha raggiunto l'estensione massima e non può essere esteso ulteriormente, eseguire i passaggi 5.4-5.7 per rimuovere e ricollegare un nuovo dispositivo. In caso contrario, bendare il mouse eseguendo i passaggi 2.17 e 2.18.
  4. Se il dispositivo ha raggiunto la massima estensione, rimuovere il dispositivo dal dorso del mouse rimuovendo le graffette con un dispositivo di rimozione delle graffette o con le forbici facendo leva sui rebbi delle graffette per aprirle. Quindi, rimuovere i punti di sutura e rimuovere con cautela il dispositivo.
  5. Pulisci il dispositivo con un bisturi, tamponi imbevuti di alcol e tovaglioli di carta. Immergere il dispositivo in etanolo al 70% per ~20 minuti per facilitare la pulizia. Quindi, usa la chiave per contrarre il dispositivo nella sua forma più sottile.
  6. Ricollegare il dispositivo HTS seguendo i passaggi 3.5-3.8.
  7. Benda il topo seguendo i passaggi 2.17 e 2.18.

6. Prelievo del tessuto HTS (POD 19)

NOTA: Il prelievo del tessuto può avvenire in qualsiasi momento del processo. Abbiamo raccolto il tessuto dopo soli 4 giorni di allungamento per esaminare i primi punti temporali; tuttavia, il tessuto viene raccolto in modo più coerente al POD 19 (2 settimane dopo l'inizio del ceppo). Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson) prima dell'intervento chirurgico. Per ottenere foto della cicatrice nel tempo, il dispositivo può essere rimosso prima di ogni fase di allungamento per scattare una foto della cicatrice prima di riapplicare il dispositivo e ricominciare lo sforzo meccanico. [Facoltativo] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione. L'aspiratore di fumi da banco può essere spento quando il gas isoflurano non viene più utilizzato.

  1. Preparare l'area chirurgica, anestetizzare il topo e rimuovere la medicazione seguendo i passaggi 3.1-3.4.
  2. Sacrificare il topo attraverso la lussazione cervicale.
    NOTA: Fare attenzione a non tirare la pelle e strappare il dorso del topo.
  3. Utilizzare forbici da dissezione o un dispositivo di rimozione delle graffette per rimuovere le graffette della pelle. Taglia i punti di sutura. Rimuovere delicatamente il dispositivo HTS, facendo attenzione a non strappare la pelle.
  4. Usando un bisturi o delle forbici, taglia la pelle che circonda la cicatrice HTS. Conservare la pelle per l'analisi istologica nel modo desiderato.
    NOTA: Se la pelle deve essere utilizzata per l'analisi trascrittomica o proteica (ad es. qPCR, western blot, analisi a singola cellula), assicurarsi di asportare solo il tessuto cicatriziale HTS per ridurre al minimo la quantità di tessuto sano circostante. Ciò garantirà che l'analisi catturi solo il tessuto cicatriziale.
  5. Raschiare i dispositivi HTS con un bisturi. Posizionare i dispositivi in un becher con etanolo al 70% per ammorbidire eventuali residui di adesivo o tessuto.
    NOTA: Dopo l'immersione in etanolo al 70%, i dispositivi potrebbero richiedere un'ulteriore pulizia, raschiatura e pulizia prima dell'autoclavaggio.

7. Misurazione della larghezza media della cicatrice

NOTA: Questa operazione è stata eseguita con il software di analisi delle immagini ImageJ e le informazioni sono state registrate su un foglio di calcolo.

  1. Aprire le immagini in ImageJ. Traccia i bordi della cicatrice con lo strumento poligono . Fare clic su analizza | misura per misurare quest'area.
    NOTA: La cicatrice può essere identificata dal suo scolorimento e dalla mancanza di follicoli piliferi.
  2. Misura la lunghezza della cicatrice da un'estremità all'altra usando lo strumento segmento . Fare clic su analizza | misura per misurare questa lunghezza.
  3. Misura la lunghezza di 1 cm o qualsiasi altra unità di lunghezza standardizzata nell'immagine, utilizzando lo strumento segmento . Fare clic su analizza | misura per misurare questa lunghezza.
  4. Usando il foglio di calcolo, prendi l'area della cicatrice (in pixel; px) e dividila per la lunghezza della cicatrice (px lunghezza). Questo risultato fornisce la larghezza media della cicatrice in pixel.
  5. Dividi il risultato per l'unità di lunghezza standard misurata (px lunghezza). Il risultato sarà la larghezza media della cicatrice nell'unità dell'unità di lunghezza standard (ad esempio, cm) utilizzata per l'esperimento.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per dimostrare chiaramente l'uso efficace del protocollo HTS e identificare i risultati "positivi" di successo, è stato stabilito il modello come mostrato nella Figura 3A. Nello studio rappresentativo, c'erano due gruppi: No Stretch Control (n = 6) e Mechanical Stretch HTS group (n = 6) in cui livelli di sforzo meccanico simili a quelli umani sono stati indotti attraverso l'incisione per generare un HTS, come mostrato nella Figura 3B, C. Nell'ambito del piano sperimentale riportato nella Figura 3A-C, è stata scattata una fotografia grossolana della cicatrice ai POD 5, 9, 15 e 19. Le cicatrici sono state tracciate con ImageJ e analizzate per la larghezza media delle cicatrici nei diversi punti temporali (Figura 3D). Le larghezze medie delle cicatrici sono state rappresentate graficamente in funzione del tempo e tra i gruppi nella Figura 3E. Dopo l'applicazione della deformazione meccanica al POD 5, dove le cicatrici non erano significativamente diverse tra lo Stretch e il Control, il Stretch Group ha mostrato cicatrici significativamente più larghe rispetto al Control, raggiungendo una larghezza di picco di 0,99 mm al POD 9 (p = 0,045). Questa larghezza della cicatrice significativamente maggiore rispetto al controllo è continuata a POD 15 (p = 0,043) e 19 (p = 0,045). Si consiglia di scattare fotografie grossolane solo nei giorni in cui il dispositivo HTS deve essere rimosso (ad esempio, il dispositivo HTS ha raggiunto la massima espansione e deve essere riattaccato o durante l'espianto) poiché il dispositivo blocca la corretta fotografia della cicatrice. In questo protocollo, le immagini e le analisi della larghezza della cicatrice in più punti temporali forniscono una visione più chiara della progressione della ferita del modello per il lettore.

L'analisi del tessuto HTS può essere eseguita in diversi modi, come la colorazione IHC per i marcatori fibrotici, la colorazione H&E e Trichrome per esaminare le aree cicatriziali istologiche, la colorazione rosso picrosirius per valutare l'architettura del collagene delle cicatrici e altri metodi per l'analisi delle ferite, tutti utilizzati storicamente dal laboratorio6, 8,21,24,25,27,28 (Figura 4). La Figura 4 mostra le caratteristiche istologiche del tessuto HTS, come il tessuto cicatriziale rialzato (Figura 4A), la perdita delle strutture annessiali e dei follicoli piliferi (Figura 4B), l'allineamento delle fibre di collagene nella direzione del carico meccanico (Figura 4C) e le spirali di collagene (Figura 4F). La Figura 4 mostra anche la colorazione immunoistochimica della densità dei mastociti e della vascolarizzazione dell'HTS murino e la confronta con il tessuto HTS umano (Figura 4D, E, G, H). Inoltre, l'analisi della cicatrice HTS può essere eseguita con l'analisi di singole cellule se il tessuto viene raccolto, preparato e portato in un nucleo bioinformatico immediatamente dopo l'escissione.

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Figura 1: Preparazione del dispositivo HTS e del dorso del topo. (A) Processo di modifica di un espansore palatale di 13 mm per creare il dispositivo HTS, (1) che mostra la struttura iniziale dell'espansore, (2) flessione dei bracci di 90° verso l'alto per la parte superiore dei bracci e verso il basso per i bracci inferiori quando il dispositivo è piatto, (3) risultato della flessione iniziale, dove i bracci sono ora perfettamente paralleli con il corpo del dispositivo, (4) piegatura dei bracci per formare il dispositivo finale con misurazioni; I bracci devono essere piegati di 90° nella pagina come si vede nel (5) dispositivo finale. (B) Il dispositivo HTS completamente assemblato da varie angolazioni, sia non esteso che esteso. (C) Passaggi sequenziali per la preparazione del dorso del topo: (1) stato iniziale con il pelo, (2) dopo la rasatura e (3) dopo l'applicazione della pasta depilatoria. (D) Procedura per la creazione dell'incisione dorsale: (1) contrassegnare il sito di incisione con una linea guida di 2 cm, (2) praticare l'incisione, (3) suturare la ferita, (4) applicare la garza Telfa e (5) fissarla con una medicazione adesiva. (E) Fotografia grossolana dell'(1) incisione e (2) dopo la sutura dell'incisione chiusa. Abbreviazione: HTS = cicatrici ipertrofiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Posizionamento e allungamento del dispositivo HTS. (A) Illustrazione del corretto posizionamento del dispositivo HTS sul dorso del topo, garantendo il corretto allineamento con il sito di incisione. L'immagine a sinistra mostra il posizionamento del dispositivo visto da una posizione posteriore. L'immagine a destra mostra il posizionamento del dispositivo visto lateralmente. (B) Illustrazione dell'attacco del dispositivo HTS: (1) posizionamento iniziale, (2) posizione delle suture, (3) posizione delle graffette cutanee. (C) Dimostrazione dell'allungamento del dispositivo HTS con la chiave del dispositivo HTS etichettata: (1) configurazione iniziale, (2) applicazione della tensione, (3) lo stato espanso finale progettato per applicare una deformazione meccanica costante attraverso l'incisione di guarigione per promuovere la formazione di cicatrici ipertrofiche, 2 mm di espansione applicati. (D) Fotografia grossolana dell'applicazione della tensione al dispositivo HTS, con la chiave del dispositivo HTS etichettata. (E) Fotografia grossolana del topo completamente bendato. Abbreviazione: HTS = cicatrici ipertrofiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Applicazione della deformazione meccanica per sviluppare cicatrici. (A) Cronologia della procedura sperimentale dalla creazione dell'incisione (POD 0) all'applicazione della deformazione meccanica (POD 4) e attraverso il periodo di stretching (da POD 5 a POD 19), culminante nell'espiantazione di tessuto (POD 19). (B) Illustrazione dei due gruppi: gruppi No Stretch Control e Mechanical Stretch HTS. (C) Schema in sezione trasversale che descrive la differenza nella risposta tissutale tra i gruppi No Stretch Control e Stretch HTS. (D) Immagini macroscopiche rappresentative delle cicatrici dei gruppi No Stretch Control e Stretch HTS nei giorni post-operatori (POD 5, 9, 15 e 19), con le cicatrici ipertrofiche tracciate in una linea tratteggiata gialla. (E) Analisi quantitativa della larghezza media della cicatrice nel tempo, dimostrando differenze significative nello sviluppo della cicatrice tra i gruppi No Stretch e Stretch, con barre di errore che rappresentano la deviazione standard. Le differenze significative sono contrassegnate da asterischi (*). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA). Valori di *p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Abbreviazioni: HTS = cicatrici ipertrofiche; POD = giorno postoperatorio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Istologia della cicatrice. Questa istologia della cicatrice murina è stata raccolta dopo 2 settimane di stress meccanico nel nostro lavoro precedentemente pubblicato9,26. (A) L'immagine più grande mostra l'imaging istologico H&E della sezione trasversale della cicatrice, mentre l'immagine in basso a destra è l'imaging istologico tricromatico della sezione trasversale della cicatrice, che mostra come viene sollevata la regione cicatriziale. (B) L'immagine più grande mostra l'imaging istologico H&E della sezione trasversale della cicatrice, mentre quello in basso a destra è l'imaging istologico tricromo della sezione trasversale della cicatrice, che mostra come la regione cicatriziale dimostri una perdita di strutture annessiali e follicoli piliferi. (C) L'immagine più grande mostra l'imaging rosso picrosirio della sezione trasversale della cicatrice, mentre quella in basso a destra è l'imaging istologico tricromatico della sezione trasversale della cicatrice, che mostra le fibre di collagene allineate nella direzione del carico meccanico. (D) L'immagine più grande mostra l'imaging dell'immunoistochimica del CD117 nel tessuto HTS murino, mentre l'immagine in basso a destra mostra l'imaging dell'immunoistochimica del CD117 nel tessuto umano, dimostrando la densità dei mastociti paragonabile al tessuto HTS umano. (E) L'immagine più grande mostra l'imaging dell'immunoistochimica CD31 della vascolarizzazione nel tessuto HTS murino, mentre l'immagine in basso a destra è l'imaging dell'immunoistochimica CD117 nel tessuto umano, dimostrando la densità dei mastociti paragonabile al tessuto HTS umano. (F) Le spirali di collagene, osservate nelle cicatrici ipertrofiche umane mature nell'immagine in basso a destra, si vedono anche nelle cicatrici murine caricate dopo 24 settimane nella regione cerchiata nell'imaging H&E murino. (G) Immagini macroscopiche rappresentative delle cicatrici di un gruppo di controllo (Incisione + No Stretch), di un gruppo di controllo Stretch (No Incision + Stretch) e di un gruppo Stretch HTS. (H) Mostra l'immunoistochimica confrontando il gruppo di controllo (Incisione + No Stretch) e il gruppo Stretch HTS. Utilizzando una co-colorazione per i marcatori fibrotici pEPF, aSMA e YAP con DAPI, si verifica un aumento dei marcatori fibrotici nel gruppo HTS. A-F sono stati adattati da Aarabi, S. et al.9. G,H sono stati adattati da Mascharak, S. et al. Ristampato con il permesso di FASEB26. Abbreviazioni: HTS = cicatrici ipertrofiche; H&E = ematossilina ed eosina; pEPF = fibroblasto engrailed-positivo; aSMA = actina del muscolo liscio alfa; YAP = proteina associata a Yes; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il modello murino HTS è un metodo economico e altamente riproducibile per indurre HTS tramite meccanotrasduzione e sviluppare potenziali terapie. Sebbene esista una curva di apprendimento iniziale per utilizzare efficacemente il modello, il protocollo può, con la pratica, essere eseguito da qualsiasi ricercatore senza formazione chirurgica. L'utilizzo di questo modello consente ai ricercatori di comprendere meglio la formazione di HTS e il ruolo della meccanotrasduzione nella guarigione delle ferite, il che può portare a miglioramenti tangibili nella cura delle ferite dei pazienti. La dimostrazione video che accompagna questo protocollo ridurrà idealmente la curva di apprendimento per i ricercatori e faciliterà l'implementazione fluida di questo modello negli studi futuri. Tuttavia, ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo che potrebbero beneficiare di ulteriori spiegazioni per migliorare la chiarezza per gli utenti.

Progredendo cronologicamente dall'inizio del protocollo, il primo passo chiave è la chiusura dell'incisione chirurgica al giorno postoperatorio 0 (POD 0). È imperativo che l'incisione sia completamente chiusa con gli strati cutanei in perfetta apposizione29. Questo per garantire che l'incisione guarisca correttamente e non si apra una volta posizionato il dispositivo e indotta la tensione attraverso la ferita. Se la ferita si apre (deiscenza), l'animale non deve essere utilizzato per ulteriori esperimenti.

Quando si posiziona il dispositivo HTS sul POD 4, è fondamentale garantire la stessa quantità di tensione sul dorso del mouse. Con il corretto posizionamento del dispositivo, la tensione esercitata sarà uniforme lungo l'intera incisione, mitigando il rischio di applicazione di forza variabile che potrebbe portare a risultati sperimentali non ottimali (cicatrici non uniformi). Se il dispositivo è collegato in modo errato, parti dell'incisione non riceveranno allo stesso modo la media di 2 mm di distrazione a giorni alterni per indurre HTS. L'espansione del dispositivo dovrebbe eliminare il gioco della pelle e renderla tesa. Allo stesso tempo, è necessario prestare attenzione per evitare un'estensione eccessiva del dispositivo, che potrebbe causare la deidratazione della ferita. Se i dispositivi vengono utilizzati per diversi cicli di esperimenti, l'ingranaggio rotante in cui è posizionato il tasto per espandere e contrarre il dispositivo può allentarsi. In questo caso, è necessario creare un nuovo dispositivo e scartare il vecchio dispositivo.

Quando il ceppo viene iniziato al POD 5, deve iniziare a essere somministrata qualsiasi terapia destinata alla prevenzione delle cicatrici. Terapie come gli unguenti topici vengono solitamente somministrate a giorni alterni quando il ceppo inizia a diffondersi sul sito di incisione. Gli idrogel sono posizionati in modo simile sopra il sito di incisione. Le terapie sistemiche possono essere iniettate nel flusso sanguigno attraverso la vena caudale o per via retro-orbitale.

Si consiglia di radersi e/o applicare leggermente la pasta depilatoria sul dorso del topo intorno alla cicatrice sul POD 19 o prima di fotografare la cicatrice. Ciò migliora la visibilità e la successiva analisi delle dimensioni della cicatrice con ImageJ. Inoltre, quando si utilizza la pasta depilatoria, peccare per eccesso di meno pasta e tempi più brevi. La sovraesposizione del dorso del topo alla pasta può causare ustioni chimiche che possono interferire con il processo di guarigione della ferita. La pelle del topo è più sottile di quella umana ed è più soggetta a ustioni chimiche30.

Il modello murino HTS è intrinsecamente limitato poiché non utilizza la pelle umana e quindi non può ricapitolare completamente l'HTS umano. Tuttavia, presenta un numero significativo di vantaggi logistici rispetto ad altri modelli animali; eseguito correttamente, questo modello HTS del mouse è affidabile, economico e facile da eseguire. Biologicamente, l'HTS è indotto attraverso aumenti fisici della segnalazione meccanica. Altri modelli di HTS nei conigli inducono HTS sull'orecchio o sul dorso utilizzando lesioni termiche e chimiche 30,31,32. La pelle sul lato ventrale dell'orecchio di coniglio non coinvolge molte cellule diverse dalle cellule della pelle durante la guarigione, come i condrociti 1,30. Un altro metodo è un modello HTS di ustione su pelle suina33, ma può essere logisticamente impegnativo in termini di costi e gestione. Il modello suino è probabilmente il più simile nel ricapitolare l'HTS umano; Tuttavia, è un metodo costoso per raccogliere i risultati iniziali. Un ultimo modello di HTS sta xenotrapiantando la pelle umana di HTS asportata sui topi, ma questo potrebbe innescare una risposta immunitaria e non esplora la formazione di nuove cicatrici34.

I metodi di cui sopra per indurre l'HTS nei modelli animali non innescano adeguatamente la risposta di guarigione naturale del corpo nello stesso modo in cui si formano le cicatrici umane da HTS. Al contrario, il modello HTS murino basato sulla meccanotrasduzione impiega uno sforzo meccanico per avviare cicatrici ipertrofiche, rispecchiando da vicino l'HTS umano 1,9,21. Questo metodo si basa sul processo fisiologico della segnalazione di meccanotrasduzione per catturare la biomeccanica dei tessuti sottostanti e i fattori della popolazione cellulare alla base della fibrosi. Questo modello è ottimale per lo studio di bersagli biologici per inibire o addirittura indurre vie di meccanotrasduzione, portando potenzialmente alla scoperta di nuove terapie traslazionali.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi concorrenti o altri conflitti associati ai contenuti di questo articolo.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal Center for Dental, Oral, and Craniofacial Tissue and Organ Regeneration Interdisciplinary Translational Project Awards, sostenuto dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (U24 DE026914) (G.C.G) e dalla Plastic Surgery Foundation Translational Research Grant (837107) (K.C.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bicchiere di grifone PYREX da 100 mlMilipore SignmaCLS1000100
Mini trimmer AesculapAutoClip
Strumenti chirurgici di precisione12020-00
Tamponi di alcol isopropilico di marca BD FisherScientific13-680-63
Buprenorfina SR (0,5 mg/mL)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 femmine (6– 8 settimane)The Jackson Laboratory000664
garza sterile CovidienFisher Scientific2187
Covidien TelfaTM cuscinetti non aderentiFisher Scientific, Covidien1961
Righello chirurgico dentaleDoWell Dental ProductsS1070
Crema depilatoria (Lozione depilatoria Nair)Church& Dwight, CVS339823
Etanolo 70% soluzioneFisher Scientific64-17-5
ExcelMicrosoft CooperazioneMicrosoft.comprogramma software 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netprogramma software 
Sistema per anestesia per inalazioneVetEquip922130
Forbici per iride 4½ in. inossidabileMcKesson43-2-104
Isoflurano, USPDechra Prodotti veterinari17033-094-25
Kaka industriale MUB-1Kaka industriale 173207Necessario solo se non c'è spazio per i produttori o un'officina di fabbricazione disponibile.
Espansore Palatale Rapido Leone - 13 mmGreat Lakes Dental Technologies125-004La chiave necessaria per ampliare e collegare il dispositivo verrà fornita con questo prodotto nella confezione
Telo idrorepellente 75 x 90 cm con foro adesivo 6 x 9 cmOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Seta nera intrecciata Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Porta aghi 5 pollici con ganasce seghettateMcKesson43-2-842
Prism 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comprogramma software 
Unguento oftalmico PuralubeDechra, NDC17033-211-38
R studio DesktopRStudio PBCrstudio.comprogramma software 
Marcatore cutaneo chirurgicoMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191medicazione adesiva in schiuma 
Termoforo Thermo-peepK& H, Amazzonia
Pinze per tessuti 4¾ in. inox 1 x 2 dentiMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB
Exacta Sistema

Riferimenti

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