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Articolo metodologico

Modello di coma ischemico cerebrale indotto da occlusione a quattro vasi modificata

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DOI:

10.3791/67161

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5 luglio 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, 2School of Medicine, Foshan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il processo per indurre un modello di coma ischemico cerebrale utilizzando un metodo di occlusione a quattro vasi modificato.

Abstract

Il coma causato dall'ischemia cerebrale è la complicanza più grave dell'ischemia cerebrale. L'occlusione a quattro vasi può stabilire un modello di coma ischemico cerebrale per la ricerca sulla malattia e lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, il metodo di occlusione a quattro vasi comunemente usato prevede principalmente l'inserimento di una penna per elettrocoagulazione nel forame pterigoideo bilaterale della prima vertebra cervicale dietro il collo per elettrocoagulare le arterie vertebrali. Questo processo comporta il rischio di elettrocoagulazione incompleta, sanguinamento e danni al tronco encefalico e al midollo spinale. Ventiquattro ore dopo l'intervento chirurgico, i ratti rianestetizzati vengono sottoposti a legatura dell'arteria carotidea davanti al collo. Due interventi chirurgici espongono i ratti a un rischio più elevato di infezione e aumentano il periodo sperimentale. In questo studio, durante una singola procedura chirurgica, è stata utilizzata un'incisione cervicale anteriore per localizzare il sito chiave in cui l'arteria vertebrale penetra nella prima vertebra cervicale. Le arterie vertebrali bilaterali sono state elettrocauterizzate in condizioni visive, mentre le arterie carotidi comuni bilaterali sono state separate per posizionare i nodi sciolti. Quando gli arti dei ratti hanno iniziato a contrarsi, le arterie carotidi comuni bilaterali sono state rapidamente legate per indurre il coma ischemico. Questo metodo può evitare il rischio di infezione causato da due operazioni chirurgiche ed è facile da eseguire con un alto tasso di successo, fornendo un utile riferimento per i professionisti interessati.

Introduzione

La lesione cerebrale ischemica è la lesione cerebrale più comune nella pratica clinica, rappresentando circa il 75% dei casi di malattia cerebrovascolare. L'ischemia può portare a gravi lesioni cerebrali secondarie e malattie 1,2 e il coma è il sintomo più grave causato da una lesione cerebrale ipossica ischemica. È anche il percorso finale per molte condizioni critiche3. Il coma è una malattia critica e grave nella pratica clinica che è difficile da gestire4. Più a lungo dura il coma, maggiore è il potenziale pericolo. Il risveglio tempestivo è l'obiettivo principale per prevenire il deterioramento e la progressione della condizione. Sebbene l'iniezione di naloxone abbia un'ampia gamma di applicazioni cliniche nel promuovere la veglia, ha ancora alcuni effetti collaterali5. Pertanto, lo sviluppo di farmaci sicuri ed efficaci che promuovono la veglia è un problema urgente che deve essere affrontato. La creazione di un modello di coma ischemico cerebrale semplice e facile da usare è essenziale per chiarire la patogenesi del coma ischemico e per lo sviluppo di farmaci 6,7,8.

Lo scopo di questo studio è quello di introdurre un modello di induzione del coma ischemico globale attraverso l'elettrocoagulazione delle arterie vertebrali bilaterali (VA) e la legatura temporanea delle arterie carotidi comuni bilaterali (CCA), che è semplice e facile da usare per i principianti. Il protocollo precedente prevedeva l'esposizione del forame pterigoideo bilaterale della prima vertebra cervicale posteriore durante la prima operazione e la combustione elettrica del forame pterigoideo per bloccare i VA bilaterali. Una seconda operazione è stata eseguita 24 ore dopo per indurre il coma ischemico totale mediante legatura dei CCA bilaterali 9,10,11,12. Tuttavia, a causa dell'invisibilità, esiste il rischio di elettrocoagulazione incompleta, sanguinamento, lesioni del tronco encefalico e del midollo spinale, nonché un periodo sperimentale prolungato. Pertanto, è necessario affrontare questi problemi.

Qui, presentiamo un metodo migliorato per modellare il coma ischemico. La procedura principale prevede l'esecuzione di un'incisione mediana del collo anteriore, l'esecuzione della resezione elettrica dei VA bilaterali in condizioni visive e la legatura breve dei CCA bilaterali durante un'unica operazione per bloccare l'afflusso di sangue all'intero cervello, causando una rapida inibizione dell'elettroencefalogramma (EEG) e portando al coma. Questo metodo induce anche un breve coma continuo dopo la riperfusione. Questa procedura è facile da eseguire, adatta ai principianti e riduce il rischio di infezione da trauma secondario negli animali, accorciando così il periodo sperimentale.

Il protocollo è adatto per lo studio del coma ischemico globale causato da arresto cardiaco. È ideale anche per lo studio della demenza ischemica, principalmente perché l'area cerebrale dell'ippocampo è estremamente sensibile all'ischemia; Pertanto, l'ischemia cerebrale transitoria può portare a danni o addirittura alla perdita dei neuroni dell'ippocampo13, con conseguente disfunzione cognitiva. Pertanto, il protocollo può fornire un riferimento per i professionisti che studiano l'ischemia cerebrale, il coma ischemico e la demenza ischemica.

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Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato condotto in conformità con i requisiti del Comitato per l'uso e l'uso degli animali da laboratorio e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Foshan (numero di registrazione: 2023-643656). Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague Dawley (SD) (200 g ± 20 g, di età compresa tra 6 e 8 settimane). Tutti i dati della ricerca sugli animali sono stati redatti in conformità con le linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Impianto di elettrodi EEG

  1. Iniettare 0,05 mg/kg di atropina per via sottocutanea 15 minuti prima dell'anestesia per prevenire l'ostruzione respiratoria e l'asfissia causate dalle secrezioni. Somministrare un'iniezione intramuscolare di 20 mg/kg di zoletil e 5 mg/kg di xilazina per anestetizzare i ratti14. Usa una pinzetta per bloccare le dita dei piedi del ratto per confermare l'anestesia profonda.
  2. Rimuovi i peli dalla testa del topo con un rasoio per capelli. Fissa la testa del ratto su un dispositivo stereotassico cerebrale utilizzando barre auricolari non penetranti. Utilizzare batuffoli di cotone sterili per applicare etanolo e iodio povidone tre volte sul sito chirurgico per disinfettare la pelle.
  3. Taglia la pelle della testa del topo lungo la sutura decapitata con una lama chirurgica. Rimuovere il muscolo che copre il cranio ed esporre completamente il cranio. Utilizzare tamponi di cotone sterili per fermare l'emorragia durante tutto il processo.
  4. Asciugare la superficie del cranio con una pallina per il lavaggio delle orecchie per aiutare il cemento dentale ad aderire saldamente al cranio. Contrassegnare la posizione di installazione dell'unghia del cranio (diametro 1,2 mm, lunghezza 3 mm) con un pennarello nero (Figura 1, passaggio 1). Le posizioni specifiche sono il punto della fontanella anteriore e altri quattro siti.
  5. Utilizzare l'ago di una siringa da 10 ml per ruotare e perforare quattro aree in sequenza. Inserire quattro unghie del cranio nel cranio in sequenza, assicurando il contatto con la corteccia cerebrale (Figura 1, passaggi 2-3).
    NOTA: Utilizzare tamponi di cotone sterili per assorbire il sangue in caso di sanguinamento per prevenire la ruggine delle unghie ossee.
  6. Avvolgere il filo d'argento dell'elettrodo EEG attorno all'unghia del cranio. Incorporare l'elettrodo elettromiografico nel muscolo e fissarlo con una sutura 6-0.
  7. Mescolare la resina della base della protesi con la polvere per protesi autofissante e fissare l'elettrodo al cranio. Usa una palla per il lavaggio delle orecchie per soffiare aria sulla superficie del cemento dentale per accelerare l'indurimento.
  8. Iniettare 10.000 unità di penicillina per prevenire l'infezione. Alloggia ogni ratto in una gabbia separata per evitare lacerazioni reciproche e danni agli elettrodi. Iniettato per via sottocutanea 0,2 mg/kg di meloxicam per tre giorni consecutivi per alleviare il dolore postoperatorio. Attendere 3 giorni per il recupero delle ferite di ratto e la fissazione dell'elettrodo (Figura 1, passaggio 4).

2. Modello di processo chirurgico di coma ischemico cerebrale

  1. Tre giorni dopo, anestetizzare nuovamente i ratti e metterli in posizione supina. Utilizzare batuffoli di cotone sterili per disinfettare il sito chirurgico attraverso tre applicazioni ripetute di iodio seguite da un risciacquo/salvietta imbevuta di alcol. Praticare un'incisione lunga circa 2-3 cm con un bisturi dal margine superiore dello sterno nel senso della lunghezza lungo la metà del collo (Figura 1, passaggio 5).
  2. Separare senza mezzi termini il tessuto sottocutaneo e il muscolo sternoioide, esponendo completamente la trachea e i muscoli del lungo collo su entrambi i lati della trachea15.
    NOTA: Evitare di stimolare la trachea durante l'intera procedura.
  3. Separare bruscamente i muscoli del lungo collo dal livello della ghiandola tiroidea verso il basso, esponendo la prima e la seconda vertebra cervicale. Espandere l'area del collo con un dilatatore di tessuto di ratto, esponendo completamente il sito chirurgico.
  4. Utilizzare una pinza fine per separare con cura i muscoli e i tessuti visibili nello spazio intervertebrale cervicale, esponendo la posizione caratteristica in cui l'arteria vertebrale entra nella prima vertebra cervicale. Si può osservare che l'arteria vertebrale passa attraverso la prima vertebra cervicale (Figura 1, passaggio 6).
    NOTA: Posizionare una siringa da 1 ml sotto il collo fornisce uno spazio di manipolazione chirurgica più chiaro.
  5. Preriscaldare la penna per elettrocoagulazione e inserirla nell'area per 3-5 secondi per assicurarsi che l'arteria vertebrale sia elettrocoagulata e recisa. Separare i muscoli e la fascia lungo il bordo interno del muscolo sternocleidomastoideo, esporre e liberare i CCA bilaterali e fare un nodo sciolto.
    NOTA: La penna per elettrocoagulazione deve essere preriscaldata; in caso contrario, non può coagulare rapidamente l'arteria vertebrale, portando a sanguinamento. Entrambe le arterie vertebrali sono elettrocoagulate e i nodi sciolti sono legati attorno ai CCA.
  6. Stringere rapidamente il primo nodo allentato per bloccare il flusso sanguigno nel CCA quando i ratti riprendono conoscenza e mostrano contrazioni degli arti, mentre il rilevatore EEG rileva segnali EEG ed EMG attivi. I ratti lottano per alcuni secondi e poi perdono gradualmente conoscenza (Figura 1, passaggio 7).
  7. Dopo aver rilasciato la fissazione, osservare che gli arti del ratto sono rigidi, il riflesso raddrizzante scompare, ma la respirazione viene mantenuta. A questo punto, l'elettromiogramma (EMG) presenta una linea retta e l'EEG viene rapidamente soppresso, indicando che il modello di ischemia cerebrale indotta da 4-VO ha avuto successo16.
    NOTA: La depressione respiratoria si verifica in alcuni ratti durante la legatura bilaterale del CCA. Una rapida stimolazione meccanica può ripristinare la respirazione spontanea in alcuni ratti.
  8. Secondo il "metodo16 della cravatta di controllo dell'ago", legare il CCA con un ago da siringa di 0,5 mm di diametro utilizzando un filo di nylon 6-0 a circa 1,5 cm di distanza dalla biforcazione di CCA, ICA ed ECA. Estrarre con cautela l'ago; questo secondo nodo causerà successivamente il restringimento dell'arteria carotide (Figura 1, passaggio 8).
    NOTA: La legatura utilizzata per la stenosi CCA deve essere realizzata in materiale di nylon, che è stabile. Il filo di nylon non è influenzato dal sangue e non si addensa; in caso contrario, può causare una stenosi estrema del CCA nei ratti e aumentare il tasso di mortalità.
  9. Dopo 30 minuti di ischemia, sciogliere il primo nodo e il CCA subirà la riperfusione, ma il secondo nodo provocherà una stenosi del CCA, inducendo un coma sostenuto (Figura 1, passaggio 9). Chiudere il tessuto sottocutaneo con suture monofilamento riassorbibili e la pelle con suture monofilamento non assorbibili.

3. Recupero degli animali

  1. Posiziona i ratti su cuscinetti isolanti e inietta 10.000 unità di penicillina per prevenire l'infezione. Iniettare per via sottocutanea 0,2 mg/kg di meloxicam per tre giorni consecutivi per alleviare il dolore postoperatorio.
  2. Dopo 60 minuti di riperfusione, assicurati che i ratti si riprendano gradualmente.

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Risultati

A causa dell'infiammazione e di altre stimolazioni causate dall'impianto di elettrodi, l'EEG può essere instabile, quindi i ratti devono riprendersi per 3 giorni. I ratti con EEG ed EMG normali dopo 3 giorni potrebbero essere inclusi per la preparazione del modello di coma. Quando i ratti sono stati anestetizzati, l'attività EEG ed EMG è stata leggermente soppressa, ma è proceduta senza intoppi. Non vi è stato alcun cambiamento significativo nell'attività EEG ed EMG dopo l'elettrocoagulazione che ha bloccato i VA bilater...

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Discussione

L'occlusione a quattro vasi induce lesioni cerebrali ischemiche e ipossiche globali, che possono simulare coma acuto, arresto cardiaco, asfissia, shock, aritmia grave e altre condizioni cliniche critiche causate dall'ischemia cerebrale nella pratica clinica. Nel frattempo, l'occlusione a quattro vasi può portare a danni principalmente nell'ippocampo17,18, che è l'area funzionale primaria del cervello responsabile della memoria co...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82173781 e 82373835), dal progetto di ricerca post-dottorato (BKS212055), dal progetto di innovazione scientifica e tecnologica del Foshan Science and Technology Bureau (2320001007331), dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515010806), dai progetti chiave sul campo (produzione intelligente) delle università generali nella provincia del Guangdong (2020ZDZX2057) e dai progetti di ricerca scientifica (innovazione caratteristica) del generale Università nella provincia del Guangdong (2019KTSCX195).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Array di fotoelettrodi in microfibra a 16 canaliJiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd2605
4-0 Sutura chirurgicaNantong Holycon Medical Devices Co., Ltd.B-104
6-0 Sutura chirurgicaNingbo MEDICAL Needle Co., Ltd.JM1216-742417
Elettrodo EEGKedou Brain machine Technology Co., LTDKD-EEGEMG
Penna per elettrocoagulazioneCONPUVON Company465
Lunion Stage Sistema di stadiazione del sonno automaticoShanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.1336
Trapano per cranio portatile in miniaturaRayward Life Technology Co., Ltd87001
Penicillina sodicaChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
RATTI SDSPF ( Pechino ) Biotechnology Co., Ltd.180-220g
Chiodo del cranioGLOBALEBIO, LTD/
Strumento stereotassicoRayward Life Technology Co., Ltd68801
Zoletil 50Vic Trading (Shanghai) Co., LTDBN 88SHA

Riferimenti

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