Articolo metodologico

Standardizzazione di un nuovo software semiautomatico per la misurazione della crescita dei neuriti

DOI:

10.3791/67163

⸱

9 agosto 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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I saggi di crescita dei neuriti forniscono un valore quantitativo sui processi neuronali rigenerativi. Il vantaggio di questo software semiautomatico è che segmenta separatamente i corpi cellulari e i neuriti creando una maschera e misura vari parametri come la lunghezza dei neuriti, il numero di punti di diramazione, l'area del cluster cellula-corpo e il numero di cluster di cellule.

Abstract

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Efficaci tecniche di imaging dal vivo sono fondamentali per valutare la morfologia neuronale al fine di misurare la crescita dei neuriti in tempo reale. La corretta misurazione della crescita dei neuriti è stata una sfida di lunga data nel corso degli anni nel campo della ricerca neuroscientifica. Questo parametro funge da pietra miliare in numerose configurazioni sperimentali in vitro , che vanno dalle colture dissociate e dalle colture organotipiche alle linee cellulari. Quantificando la lunghezza del neurite, è possibile determinare se un trattamento specifico ha funzionato o se la rigenerazione assonale è migliorata in diversi gruppi sperimentali. In questo studio, l'obiettivo è dimostrare la robustezza e l'accuratezza del software di analisi della crescita neuritica Incucyte Neurotrack. Questo software semi-automatico è disponibile in un sistema di microscopia time-lapse che offre diversi vantaggi rispetto alle metodologie comunemente utilizzate nella quantificazione della lunghezza del neurite nelle immagini a contrasto di fase. L'algoritmo maschera e quantifica diversi parametri in ogni immagine e restituisce metriche delle cellule neuronali, tra cui la lunghezza dei neuriti, i punti di diramazione, i cluster cellula-corpo e le aree del cluster cellula-corpo. In primo luogo, abbiamo convalidato la robustezza e l'accuratezza del software correlando i suoi valori con quelli del manuale NeuronJ, un plug-in delle Fiji. In secondo luogo, abbiamo utilizzato l'algoritmo che è in grado di lavorare sia su immagini a contrasto di fase che su immagini di immunocitochimica. Utilizzando specifici marcatori neuronali, abbiamo convalidato la fattibilità dell'analisi della crescita dei neuriti basata sulla fluorescenza su colture di neuroni sensoriali in vitro . Inoltre, questo software è in grado di misurare la lunghezza dei neuriti in varie condizioni di semina, che vanno dalle singole cellule alle reti neuronali complesse. In conclusione, il software fornisce una piattaforma innovativa ed efficace in termini di tempo per i saggi di crescita dei neuriti, aprendo la strada a quantificazioni più rapide e affidabili.

Introduzione

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Nei nervi sciatici è possibile misurare la rigenerazione assonale1. Inoltre, studi in vitro hanno dimostrato la fattibilità del monitoraggio della crescita assonale 2,3 per comprenderne le varie fasi, dalla germinazione assonale alla degenerazione assonale, sia nei neuroni sani che in quelli danneggiati. Tracciando questi processi, è possibile misurare parametri come la polarità assonale, l'iniziazione, la stabilità e la ramificazione. L'ultimo parametro è cruciale per comprendere la percezione del dolore neuropatico 4,5,6. Allo stesso modo, la degenerazione assonale può essere monitorata in vivo7 o in vitro 8,9. Durante la crescita dei neuriti, le reti citoscheletriche di actina e microtubuli si stabilizzano o cambiano in base alle esigenze della cellula10. Il citoscheletro di actina si riorganizza per consentire la formazione del cono di crescita assonale e i microtubuli si riallineano in fasci per stabilizzare il neurite11 in crescita. Al fine di studiare la crescita neuritica dei neuroni centrali e periferici in vitro, vengono quantificati tre parametri comuni: lunghezza assonale totale, distanza massima e punti di ramificazione. Questi parametri sono utilizzati per studiare la risposta neuronale di crescita al trattamento (ad esempio, neurotrofine, composti, inibitori, acido retinoico, siRNA, shRNA) o in animali geneticamente modificati 12,13,14. Per valutare se i neuroni hanno neuriti più allungati e/o più ramificati, questi tre parametri ci permettono di valutare la morfologia di un neurone. La misurazione della lunghezza dei neuriti è il parametro di maggiore interesse in diverse configurazioni sperimentali in vitro. Dai gangli delle radici dorsali vengono eseguiti principalmente due tipi di colture: coltura dissociata in vitro o coltura organotipica di espianti interi di DRG. In entrambi i casi, la lunghezza del neurite è un parametro d'oro per valutare l'esito dell'esperimento. In una linea cellulare simile a motoneuroni (NSC-34), la crescita assonale e la ramificazione sono misurate dopo la differenziazione indotta dall'acido retinoico15,16. Infatti, misurando la crescita dei neuriti, è possibile determinare se un trattamento specifico ha funzionato17, il tasso di crescita18 o la capacità di rigenerazione dopo una procedura di lesione19.

Come valutare correttamente la crescita dei neuriti ha posto un numero significativo di sfide nel corso degli anni nel campo della ricerca. Tuttavia, non esiste una standardizzazione delle misurazioni della lunghezza dei neuriti. Alcuni dei metodi più utilizzati per le colture cellulari in vitro sono, ad esempio, il plug-in manuale NeuronJ su Fiji18,20 o MetaMorph21,23 e il semi-automatico Neurolucida23,24. Oltre alle metodologie manuali, esistono anche metodi automatici, come il plug-in NeuriteTracer su Fiji25, il software HCA Vision26,27 o WIS-NeuroMath 2,28. Altre metodologie meno accurate si basano sulla misurazione della dimensione complessiva dei neuroni. Questi metodi includono la misurazione della distanza del vettore dal corpo cellulare alla punta dell'assonepiù lungo 29 o l'analisi di Sholl30. Tuttavia, questi metodi di misurazione sono adatti per colture a densità molto bassa o singoli neuroni. Inoltre, tutte queste metodologie sono utilizzate principalmente su neuroni colorati o neuroni che esprimono fluorofori geneticamente codificati (es. GFP, Venus, mCherry). Il tipo di neurone e la densità della coltura cellulare influenzano profondamente la scelta della metodologia di misurazione. Ad esempio, segmentare manualmente i neuroni con morfologie molto intricate e complicate, come i neuroni DRG, può facilmente diventare un compito impossibile. Se i neuroni contorti sono già una sfida da segmentare, le reti neurali sono completamente fuori dalla portata degli approcci manuali a causa della loro organizzazione altamente complessa.

Da un lato, la segmentazione manuale è molto precisa perché viene eseguita dall'occhio e dall'intelligenza umana; D'altra parte, è davvero dispendioso in termini di tempo. L'elevato dispendio di tempo richiesto dai metodi manuali è lo svantaggio principale. Per questo motivo, solo pochi neuroni vengono acquisiti per l'analisi, rendendola meno accurata e costosa in termini di tempo. Gli approcci automatici o semiautomatici, invece, riducono parzialmente il dispendio di tempo. Tuttavia, presentano anche alcuni svantaggi. I metodi automatici devono essere addestrati per funzionare correttamente e, se il software non è abbastanza interattivo con l'utente, la segmentazione può essere errata.

Oltre alla misurazione della crescita dei neuriti, anche il numero di punti di ramificazione è un'informazione preziosa. Con la segmentazione manuale, il numero di punti di diramazione può essere calcolato, mentre ciò non è possibile con una distanza vettoriale. Con i metodi automatici, il numero di punti di diramazione viene solitamente fornito, mentre con l'analisi Sholl deve essere calcolato con una formula matematica.

In questo articolo sui metodi, miriamo a descrivere la funzionalità e l'efficacia di questo software semiautomatico nella misurazione della lunghezza assonale totale e di altri parametri. La macchina consente l'acquisizione automatica di immagini in punti temporali definiti o per condurre studi a lungo termine (giorni, settimane, mesi), preservando un ambiente fisiologico per le cellule vive. La misurazione della crescita dei neuriti utilizzando l'imaging time-lapse a contrasto di fase ha il vantaggio di consentire il monitoraggio continuo della cinetica e della crescita dei neuriti. Inoltre, è anche possibile monitorare la morte cellulare attraverso l'aggiunta nei terreni di coloranti specifici che hanno come bersaglio le cellule morte 31,32,33. Sebbene il software sia stato rilasciato nel 2012, siamo i primi a standardizzare questa metodologia in modo riproducibile e imparziale per la quantificazione accurata della crescita dei neuriti. Tuttavia, è importante notare che il software non è incluso con l'acquisto della macchina. Nonostante questa spesa aggiuntiva, il suo utilizzo offre vantaggi significativi nella misurazione della lunghezza assonale totale e di altri parametri, contribuendo così alla ricerca nel campo delle neuroscienze.

Protocollo

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1. Scansione del recipiente sulla macchina

NOTA: Il rilevamento viene eseguito dalla fotocamera Basler Ace 1920-155 μm integrata.

  1. Aprire il programma facendo clic su Connetti al dispositivo e selezionando Pianifica - Acquisire. Quindi fare clic sul segno + .
  2. Specifica se l'imbarcazione verrà scansionata ripetutamente o solo 1 volta scegliendo rispettivamente l'opzione Scansiona su programma o Scansiona una volta ora.
  3. Seleziona Nuovo per creare una nuova imbarcazione da scansionare. Se non viene aggiunta una nuova imbarcazione, creare una nuova scansione utilizzando una delle opzioni descritte di seguito.
    1. Selezionare Copia corrente per creare un nuovo serbatoio copiando un serbatoio dall'abaco corrente. Selezionare Copia precedente per creare un nuovo recipiente copiando un recipiente scansionato in precedenza.
    2. Selezionare Aggiungi scansione per ripristinare un'imbarcazione precedentemente scansionata per ulteriori scansioni.
  4. Selezionare il tipo di scansione in base al test e all'applicazione. Per l'analisi, selezionare Standard.
  5. Specificare le impostazioni di scansione. Scegliete una delle opzioni Cellula per cellula, Nessuna, Cellula per cellula aderente o Cellula per cellula non aderente, e specificate i canali dell'immagine a seconda delle molecole fluorescenti utilizzate. Selezionare l'opzione Nessuno per le colture di neuroni sensoriali adulti ed embrionali. Per le linee cellulari, selezionare le opzioni Nessuno o Aderente cella per cella .
  6. Selezionare l'obiettivo del microscopio (4x, 10x, 20x). Acquisire con l'ingrandimento più elevato (20x) nelle colture primarie, mentre nelle linee cellulari è sufficiente 10x.
  7. Seleziona il tipo di imbarcazione da scansionare tra le opzioni fornite. Indicare la posizione dell'imbarcazione nel cassetto selezionandone la posizione sulla mappa virtuale del cassetto.
  8. Specificare il modello di scansione per l'acquisizione dell'immagine selezionando i pozzetti da scansionare. Selezionare il numero desiderato di immagini per pozzetto. Apparirà una stima della durata della scansione.
  9. Fornisci informazioni sulla nave digitando il nome e specifica la mappa della targa facendo clic sul segno + .
  10. Fare clic su Avanti. Scegliere il tipo di analisi e fare clic su Avanti. Apparirà una schermata di riepilogo delle opzioni selezionate. Se corretto, fai clic su Scansiona ora e la scansione inizierà.

2. Configurazione per l'analisi delle immagini a contrasto di fase

NOTA: L'analisi Neurotrack può essere eseguita solo su immagini precedentemente acquisite dalla macchina.

  1. Selezionare l'imbarcazione scansionata da analizzare. Seleziona Avvia analisi. Selezionare Crea nuova definizione di analisi.
  2. Seleziona Neurotrack. Seleziona Canali immagine. Selezionare un set rappresentativo di immagini su cui eseguire l'analisi. Seleziona tutte le immagini per ogni pozzetto per addestrare l'algoritmo.
  3. Perfezionate le impostazioni di Definizione analisi regolando i seguenti parametri.
    NOTA: Per impostazione predefinita, i neuriti sono segmentati in magenta, mentre i corpi cellulari in giallo. E' possibile modificare i colori a piacere.
    1. Per la segmentazione del cluster cellula-corpo, regolare quanto segue come descritto di seguito.
      1. Modalità di segmentazione: la segmentazione delle immagini viene eseguita per distinguere i corpi cellulari dallo sfondo e dai neuriti. Scegli tra Luminosità e Texture. Per le colture primarie e le linee cellulari, selezionare la modalità Luminosità.
      2. Regolazione della segmentazione: utilizza il cursore per regolare la sensibilità della segmentazione verso più sfondo o più celle. Varia da 0 (Sfondo) a 2 (Celle). Aumenta o diminuisce le dimensioni della maschera gialla. Sposta il cursore verso 0 (Sfondo) in modo che la dimensione della maschera gialla si riduca gradualmente lasciando spazio per la maschera magenta. Il contrario si verifica se il cursore viene spostato verso 2 (Celle).
    2. Per la pulizia, regolare quanto segue come descritto di seguito.
      1. Riempimento foro (μm2): Regolare questa opzione per rimuovere qualsiasi foro nella maschera del corpo della cella più piccolo dell'area specificata dall'utente.
      2. Regola le dimensioni (pixel): aumenta (se positivo) o riduce (se negativo) la maschera gialla del numero di pixel specificato. Varia da -10 a +10. Regolare questa opzione per aggiungere o rimuovere la segmentazione gialla sugli oggetti ad alto contrasto, come le cellule morte e i detriti cellulari.
      3. Larghezza minima della cella (μm): scegliere un valore per definire la dimensione alla quale i corpi cellulari saranno considerati neuriti.
    3. Per i filtri cluster cellula-corpo, regolare quanto segue come descritto di seguito.
      1. Area (μm2): Impostare un valore minimo e massimo dell'area del corpo cellulare. I valori superiori e inferiori ai valori impostati non saranno considerati come corpi cellulari.
    4. Per i parametri neuriti, regolare quanto segue come descritto di seguito.
      1. Filtraggio: Riduce il mascheramento delle imperfezioni dei piccoli vasi e dei detriti. Scegli tra le opzioni Nessuna, Migliore e Migliore. Scegli Nessuno solo per colture e recipienti molto puliti. Scegli Migliore per un'elaborazione più rapida a scapito della perdita del rilevamento di neuriti molto fini. Può essere sufficiente per cellule con neuriti spessi o ad alto contrasto; Inoltre, può essere utile per i vasi con molte imperfezioni o detriti. Scegli Migliore per un tempo di elaborazione più lungo, ma è l'impostazione del filtro più sensibile per garantire il rilevamento di neuriti molto fini.
      2. Sensibilità neurite: Utilizzare per regolare la sensibilità di rilevamento. Aumenta la sensibilità per rilevare i neuriti più fini. Il valore è compreso tra 0,25 (Meno) e 0,75 (Più).
        NOTA: Aumenta o diminuisce la sensibilità del software per riconoscere i neuriti. Se il cursore viene spostato verso 0,25 (Meno), il software sarà più rigoroso nel riconoscimento dei neuriti. Invece, se il cursore viene spostato verso 0,75 (Più), il software sarà meno rigoroso in questo rilevamento e, quindi, più imperfezioni (ad esempio, detriti cellulari, sporco) saranno considerate neuriti.
      3. Larghezza neurite (μm): usalo per regolare il rilevamento in base alle dimensioni dei neuroni. Può essere 1, 2 o 4. Aumentandolo, i neuriti più sottili non saranno considerati. Impostalo su 1 per le colture primarie di neuroni sensoriali adulti e su 2 per le linee cellulari e le colture di neuroni sensoriali embrionali.
  4. Fare clic su Anteprima corrente per visualizzare l'immagine segmentata. Per ogni immagine verranno fornite le seguenti misure: lunghezza della neurite (mm/mm2), punti di ramificazione della neurite (per mm2), cluster di cellule e corpi (per mm2) e area del cluster di cellule e corpi (mm2 / mm2).
  5. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 per tutte le immagini selezionate. Fare clic su Avanti.
  6. Selezionare il tempo di scansione e il pozzetto da analizzare. Assegnare un Nome Definizione e, se necessario, Note di Analisi. Fare clic su Avanti > Fine.

3. Configurazione per l'analisi delle immagini di immunocitochimica (ICC)

  1. Seguire gli stessi passaggi illustrati da 2.1 a 2.4. Seleziona i canali immagine per neuriti e nuclei. Selezionare il Set di immagini; selezionare Tutte le immagini per ogni pozzetto per addestrare l'algoritmo.
  2. Perfezionate le impostazioni di Definizione analisi regolando i seguenti parametri come descritto di seguito.
    NOTA: Per impostazione predefinita, i neuriti sono segmentati in blu, mentre i corpi cellulari sono viola. Tuttavia, i colori possono essere modificati a piacere.
    1. Segmentazione del cluster cellula-corpo: utilizzare questa opzione per segmentare l'immagine in oggetti di interesse. Stimare la luminosità dello sfondo in corrispondenza di ogni pixel dell'immagine. Dopo aver trovato lo sfondo, eseguire una delle seguenti opzioni.
      1. Nessuna sottrazione dello sfondo: utilizzare questa opzione per segmentare senza alterare l'immagine originale. Scegli tra Soglia adattiva o fissa. Adattivo: lo sfondo viene utilizzato per trovare gli oggetti ma non sottratto esplicitamente; con questa opzione è possibile impostare la Regolazione della Soglia (GCU). Soglia fissa: nell'immagine originale vengono rilevati oggetti più luminosi di questa soglia; con questa opzione è possibile impostare la Soglia (GCU).
      2. Sottrazione sfondo: utilizza questa opzione per sottrarre lo sfondo dall'immagine utilizzando una trasformazione Top-Hat, quindi applica una soglia. Con questa opzione, impostare Raggio e Soglia. Raggio: viene utilizzato un disco di questo raggio; Il disco deve essere abbastanza grande da non adattarsi completamente all'interno di alcun oggetto nell'immagine. Soglia: gli oggetti più luminosi di questa soglia vengono rilevati nell'immagine sottratta dallo sfondo.
    2. Pulizia: utilizzare la seguente opzione per eseguire questa operazione.
      1. Riempimento foro (μm2): utilizzare questa opzione per rimuovere eventuali fori nella maschera del corpo cellulare che sono più piccoli dell'area specificata.
      2. Regola dimensione (pixel): utilizzare questa opzione per aumentare (se positivo) o ridurre (se negativo) la maschera viola del numero di pixel specificato. L'intervallo è compreso tra -10 e +10. Aggiunge o rimuove il viola su oggetti ad alto contrasto come cellule morte e detriti cellulari.
      3. Larghezza minima delle celle (μm): utilizzare questa opzione per definire la dimensione alla quale i corpi cellulari saranno considerati neuriti.
    3. Filtri cluster cellule-corpi: utilizzare l'opzione seguente per applicare i filtri.
      1. Area (μm2): Impostare un valore minimo e massimo dell'area del corpo cellulare. I valori superiori e inferiori ai valori impostati non saranno considerati come corpi cellulari.
    4. Parametri neuriti: utilizzare la seguente opzione per impostarli.
      1. Sensibilità grossolana alla neurite: utilizzare questa opzione per regolare la luminosità dei neuriti. La sensibilità dovrebbe essere aumentata se l'intensità della fluorescenza dei neuriti è bassa. Il valore è compreso tra 0 (meno) e 10 (più). Aumenta o diminuisce la sensibilità del software per riconoscere i neuriti meno luminosi. I valori ottimali vanno da 7 a 10; Si noti che se è impostato a 10, è molto probabile che anche lo sfondo venga considerato nella misurazione dei neuriti.
      2. Sensibilità fine neurite: utilizzare questa opzione per regolare la sensibilità di rilevamento. La sensibilità dovrebbe essere aumentata per rilevare neuriti più fini. Il valore è compreso tra 0,25 (Meno) e 0,75 (Più). Aumenta o diminuisce la sensibilità del software per riconoscere i neuriti fini e meno luminosi. Se il cursore viene spostato verso 0,25 (Meno), il software non considererà i neuriti deboli. Invece, se il cursore viene spostato verso 0.75 (Più) il software rileverà anche neuriti molto deboli (quasi di fondo).
      3. Larghezza della neurite (μm): utilizzare questa opzione per regolare il rilevamento in base alle dimensioni dei neuroni. Può essere 1, 2 o 4. Aumentandolo, i neuriti più sottili non saranno considerati. Impostalo su 1 per le colture primarie di neuroni sensoriali adulti, su 2 per le linee cellulari e le colture di neuroni sensoriali embrionali.

4. Esportazione dei dati

  1. Aprite l'analisi. Fare clic su Metriche del grafico.
  2. Seleziona la metrica, i punti temporali e i pozzetti di interesse.
  3. Selezionare l'opzione di raggruppamento tra Tutto, Nessuno, Colonne, Righe e Repliche mappa targa.
  4. Clicca su Esporta dati e seleziona la cartella di destinazione e, se necessario, altre opzioni. Verrà creato un file .txt.
    NOTA: La macchina fornirà un unico valore medio della metrica scelta per ogni pozzo. Durante l'analisi è necessaria l'annotazione manuale per recuperare i valori di una singola immagine.

5. Esportazione delle immagini

  1. Apri il recipiente. Fare clic su Esporta immagini e filmati.
  2. Seleziona il tipo di esportazione per le immagini.
    1. Selezionare Come visualizzato per esportare le immagini visualizzate. Fare clic su Avanti e selezionare le immagini di interesse per l'esportazione . Fare clic su Avanti.
      1. Seleziona il tipo di sequenza tra un singolo filmato o una serie di immagini e i punti temporali di interesse. Fare clic su Avanti.
      2. Regolare le opzioni di esportazione in base alle esigenze e fare clic su Avanti. Imposta la cartella di output, il formato del file e il nome del file, quindi fai clic su Esporta.
    2. Selezionate Come memorizzato per esportare le immagini in formato raw. Seleziona il tipo di immagine.
      1. Seleziona i punti temporali e i pozzetti di interesse. Fare clic su Avanti. Imposta la cartella di output, il formato del file e il nome del file, quindi fai clic su Esporta.
  3. Esportazione delle immagini con le maschere di segmentazione
    1. Aprite l'analisi. Fare clic sull'icona dei livelli dell'immagine. Selezionare le maschere dei canali desiderati (neurite di fase e cluster cellula-corpo di fase). Seguire il passaggio 5.2.

Risultati

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L'algoritmo di misurazione della crescita dei neuriti è in grado di rilevare i neuriti sia nelle reti neurali che nei singoli neuroni. Genera una maschera gialla che segmenta gli oggetti con un contrasto elevato, come corpi cellulari, detriti cellulari, cellule morte, espianti di tessuti e ombre. Inoltre, una maschera magenta appare su neuriti di vari spessori. I valori della lunghezza dei neuriti sono espressi in mm/mm2, a indicare che la lunghezza assonale è stata divisa per l'area dell'immagine, che è 0,282739 mm2 ed è costante per ogni condizione di scansione. Pertanto, per ottenere valori puri di lunghezza dei neuriti in mm, i numeri forniti dal software devono essere moltiplicati per l'area dell'immagine.

Metodo semiautomatico e manuale
Il software utilizzato è una metodologia semi-automatica per misurare la lunghezza assonale totale. Per valutare l'accuratezza del software, abbiamo condotto misurazioni sugli stessi neuroni utilizzando il metodo manuale anche con il plug-in NeuronJ. Come illustrato nella Figura 1, la maschera di segmentazione sui neuroni è molto simile tra i due metodi (Figura 1A).

Inoltre, abbiamo condotto analisi statistiche sui valori ottenuti per esaminarne la correlazione. L'analisi di correlazione di Spearman ha prodotto un alto coefficiente r di 0,8526, fornendo quindi una forte evidenza dell'accuratezza e della precisione dell'algoritmo (Figura 1B). La misurazione automatica richiede elevati standard di qualità della coltura in base alla sua pulizia, densità e purezza. I risultati ottenuti con la segmentazione semi-automatica sono riproducibili e non influenzati dal giudizio individuale. La riproducibilità imparziale è un problema per le metodologie manuali.

A volte, possono verificarsi errori di segmentazione semiautomatica a causa di diverse cause. Nelle immagini a contrasto di fase, lo sporco nella coltura potrebbe essere rilevato come neurite dalla segmentazione semiautomatica. Inoltre, la presenza di diversi tipi di cellule può disturbare il processo di segmentazione. Tali problemi non si verificano con la segmentazione manuale perché viene eseguita da occhi umani. Tuttavia, se tali problemi si presentano, possono essere superati utilizzando le immagini di immunocitochimica come controllo.

Segmentazione dei neuriti
Per le colture primarie di neuroni DRG adulti, il punto di partenza ottimale per un'analisi di fase affidabile è avere i neuroni uniformemente placcati nel pozzetto e nella coltura pulita. Se si verificano errori durante la semina e le cellule si concentrano in un punto, come illustrato nella Figura 2A-B, i valori saranno più una stima che un riflesso ravvicinato della realtà. In tali situazioni, la maschera gialla coprirà la maggior parte dei neuriti tra le cellule (Figura 2A-B), con conseguente perdita di lunghezza dei neuriti. Inoltre, il software sarà significativamente influenzato nel riconoscimento dei neuriti, ed è molto probabile che una maschera magenta appaia su oggetti che non sono neuriti (Figura 2D). In un'immagine ottimale, dovrebbero esserci fino a 15 neuroni con un ingrandimento di 20x.

Quando i neuroni sono correttamente piastrati e la coltura è pulita, come illustrato nella Figura 3A-B, è consigliabile regolare il cursore di segmentazione verso lo sfondo (0,5 - 0,7; Figura 3C). Questo aiuta a ridurre la componente gialla che apparirà sugli oggetti ad alto contrasto nell'immagine, come i punti di ramificazione che dovrebbero essere in magenta. Inoltre, se i neuriti sono audaci, una sensibilità dei neuriti compresa tra 0,4 e 0,5 dovrebbe essere sufficiente per coprire la maggior parte di essi (Figura 3C-D).

Un'altra situazione comune che può verificarsi è una coltura sporca con molti detriti cellulari e cellule morte, come mostrato nella Figura 4A-B. In tali condizioni, ci sono molti oggetti ad alto contrasto. Pertanto, è consigliabile aumentare la dimensione della maschera gialla regolando il cursore di segmentazione verso la cella o aumentando il parametro di regolazione della dimensione (+1, +2 e così via; Figura 4C). Tuttavia, sarebbe anche utile diminuire leggermente la sensibilità dei neuriti per evitare che il software identifichi erroneamente come neuriti oggetti che non sono neuriti in quanto tali. (Figura 4C-D).

A volte, i neuriti possono apparire molto sottili e pallidi, come mostrato nella Figura 5A-B, ponendo sfide al software per segmentarli accuratamente (Figura 5D). In questo caso, è consigliabile aumentare la sensibilità dei neuriti ad almeno 0,6 (Figura 5C). Tuttavia, tieni presente che maggiore è la sensibilità, maggiore è la probabilità che il software contrassegni in modo errato gli oggetti che non sono neuriti come tali (Figura 5D). È possibile adottare alcune precauzioni per evitare che la distorsione della sensibilità aumenti eccessivamente, ad esempio regolando il cursore di segmentazione verso le cellule. Tuttavia, se i neuriti sono troppo sottili per essere rilevati dal software, i valori di lunghezza dei neuriti saranno distorti a prescindere.

Nel caso delle immagini immunocitochimiche, il problema principale risiede nello sfondo. A parte le condizioni di semina per le quali si applicano le regole di cui sopra, la fonte primaria di distorsione è la fluorescenza stessa. Il software riconosce efficacemente i neuriti molto luminosi mentre i neuriti più sottili e meno intensi vengono lasciati indietro (Figura 6A-B). Per prevenire la perdita di lunghezza del neurite, la sensibilità fine del neurite può essere aumentata fino a 0,75 (Figura 6C). Tuttavia, è fortemente consigliabile ridurre la sensibilità grossolana dei neuriti ad almeno 8-9 per evitare un'eccessiva distorsione di rilevamento considerando i neuriti in background (Figura 6C-D). Se quest'ultimo non viene ridotto, tutto lo sfondo verrà segmentato, come illustrato nella Figura 7.

Un problema comune con l'acquisizione della fluorescenza è la dispersione della luce. Spesso, le immagini di immunocitochimica presentano torce elettriche nell'immagine, che influenzano significativamente la qualità e la precisione dell'analisi (Figura 8A-B). In una situazione del genere, non si può fare molto per migliorare l'analisi e i valori saranno più di una stima. La diffusione della luce interferisce con il riconoscimento dei neuriti in modo che vengano rilevati solo neuriti molto luminosi (Figura 8C-D). Un altro problema nelle immagini di immunocitochimica è la qualità della colorazione di per sé. Spesso, a causa di errori umani, gli assoni possono essere rotti (Figura 9A) e i corpi cellulari possono essere strappati via durante i lavaggi (Figura 9B). Questi errori rappresentano un problema critico in quanto i valori di lunghezza dei neuriti perdono precisione e accuratezza. Di conseguenza, l'interpretazione dei dati biologici viene alterata, portando a conclusioni errate.

Per le colture embrionali, la situazione è diversa. In questo tipo di coltura è predominante la presenza di cellule gliali. Di conseguenza, gli errori aumentano significativamente poiché il software rileva anche i rivestimenti delle cellule gliali (Figura 10A-B). Per ridurre al minimo questo problema, il cursore di segmentazione deve essere spostato verso le celle, in genere intorno a valori di 1,7-2 (Figura 10C-D). Questo approccio garantisce che la maggior parte delle cellule gliali siano coperte dalla maschera gialla e quindi non considerate nella misurazione della lunghezza dei neuriti. Un altro consiglio utile è quello di mantenere la larghezza del neurite a 2, poiché i neuroni embrionali in coltura mostrano tipicamente forme bipolari o unipolari con neuriti spessi (Figura 10C-D). Questa precauzione filtra la maggior parte dei rivestimenti delle cellule gliali che di solito sono molto sottili. Infine, fai attenzione a non aumentare troppo la sensibilità dei neuriti; In caso contrario, ciò che è stato filtrato dal parametro Larghezza neurite verrà nuovamente incluso nella misurazione della lunghezza neurite.

Nel caso di colture embrionali, dove la componente delle cellule gliali è predominante, l'immunocitochimica potrebbe essere l'opzione migliore. Colorando specificamente i neuroni, il problema della segmentazione della glia viene risolto poiché la glia non sarà colorata, rendendo l'analisi molto più semplice e accurata (Figura 11).

Infine, il software può essere sfruttato anche per valutare il programma di differenziamento di linee cellulari e/o iPSC per valutarne lo stato di crescita. Pertanto, l'applicazione di parametri e precauzioni simili può essere utilizzata per obiettivi diversi.

Per quanto riguarda il processo di differenziamento, la robustezza del software è stata dimostrata nella linea cellulare NSC-34 (linea cellulare ibrida costituita da cellule di neuroblastoma di topo e motoneuroni derivati dal midollo spinale di embrioni di topo) durante la maturazione in cellule simili a motoneuroni. Per quanto riguarda le colture primarie DRG, il punto di partenza ottimale per una buona analisi è la semina cellulare uniforme. Le cellule indifferenziate e differenziate, dopo il trattamento con acido retinoico, possono essere seguite utilizzando acquisizioni durante l'intero periodo di coltura o come mostrato in Figura 12, all'ultimo punto temporale.

Infatti, oltre alla lunghezza del neurite, l'algoritmo fornisce anche il parametro del punto di diramazione. Tuttavia, è importante notare che il parametro del punto di diramazione non rappresenta il numero esatto di punti di diramazione; Piuttosto, indica la densità di ramificazione nell'immagine espressa in mm/mm2. Questa misurazione è significativamente influenzata dai detriti nella coltura e dalla concentrazione di semina. Pertanto, la densità dei neuroni nell'immagine e la pulizia della coltura sono fattori cruciali per ottenere valori affidabili. Se la coltura presenta molti detriti cellulari, non filtrati dalla maschera gialla, questi saranno inclusi nella lunghezza del neurite e nella misurazione del punto di ramificazione.

Di conseguenza, si raccomanda di normalizzare questi valori per la conta cellulare, poiché il numero di neuroni nell'immagine influenza la lunghezza dei neuriti e le misurazioni dei punti di ramificazione.

Segmentazione dei corpi cellulari
Tra tutti i parametri forniti dal sistema, ci sono il cluster cellula-corpo e l'area del cluster cellula-corpo. Tuttavia, questi due parametri non sono affidabili da utilizzare come valori per il conteggio delle celle. Come illustrato nella Figura 4, il software segmenta gli oggetti ad alto contrasto nella maschera gialla, comprese le ombre causate dal movimento medio nel pozzetto. Inoltre, segmenta anche le cellule morte e i detriti cellulari (Figura 4). Per ottenere un conteggio affidabile delle cellule dei neuroni in crescita, è possibile utilizzare un metodo manuale, come lo strumento Cell Counter nelle Figi (Figura 13).

Un riepilogo dei parametri di analisi suggeriti, ordinati per tipo di coltura, è fornito nella Tabella 1 per le immagini di fase e nella Tabella 2 per le immagini di immunocitochimica. Inoltre, nella Tabella 3 viene fornito un riepilogo dei parametri di analisi suggeriti per risolvere problemi specifici.

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Figura 1: Analisi di correlazione tra segmentazione manuale e semi-automatica dei neuriti. (A) A sinistra, un'immagine di fase rappresentativa di un neurone segmentato con il plug-in NeuronJ nelle Fiji. A destra, un'immagine di fase rappresentativa di un neurone è segmentata con il software semiautomatico. (B) Una semplice regressione lineare eseguita su 20 neuroni è stata analizzata con metodi sia manuali che semi-automatici. Coefficiente di correlazione di Spearman r = 0,8526, p**** < 0,0001. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Errore di seeding nella coltura di neuroni sensoriali adulti. (A) Immagine rappresentativa della fase dell'errore di seeding. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera gialla segmenta i corpi cellulari, la maschera magenta segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Pannello superiore: zoom sull'errore di segmentazione del corpo cellulare (maschera gialla) dovuto al raggruppamento dei corpi cellulari. Pannello inferiore: zoom sull'errore di segmentazione dei neuriti (maschera magenta) dovuto ai detriti cellulari. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Coltura ideale di neuroni sensoriali adulti per l'analisi della crescita dei neuriti. (A) Immagine rappresentativa della fase di una condizione di semina ideale per l'analisi della crescita dei neuriti. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera gialla segmenta i corpi cellulari, la maschera magenta segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Zoom sulla segmentazione del corpo cellulare (maschera gialla) e sulla segmentazione dei neuriti (maschera magenta). Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Elementi di disturbo nell'analisi della crescita dei neuriti nella coltura di neuroni sensoriali adulti. (A) Immagine di fase rappresentativa di detriti cellulari e ombre dovute a movimenti del mezzo. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera gialla segmenta i corpi cellulari, la maschera magenta segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Zoom sull'errore di segmentazione del corpo cellulare (maschera gialla) e della segmentazione dei neuriti (maschera magenta) dovuto ai detriti cellulari e alle ombre del mezzo in movimento. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Neuriti sottili nell'analisi della crescita dei neuriti in colture di neuroni sensoriali adulti. (A) Immagine rappresentativa di fase di neuroni caratterizzati da neuriti molto sottili. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera gialla segmenta i corpi cellulari, la maschera magenta segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Pannello superiore: zoom sulla perdita di lunghezza dei neuriti dovuta ai limiti di rilevamento della segmentazione dei neuriti (maschera magenta). Pannello inferiore: zoom sull'errore di segmentazione dei neuriti (maschera magenta) su oggetti estranei. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Luminosità dei neuriti nell'analisi della crescita dei neuriti in colture di neuroni sensoriali adulti. (A) Immagine immunocitochimica rappresentativa (marcatore neuronale Tuj1) di neuroni caratterizzati da neuriti molto luminosi e spessi. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera viola segmenta i corpi cellulari, la maschera blu segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Pannello superiore: zoom sull'errore di segmentazione del corpo cellulare (maschera viola) dovuto allo spessore dei neuriti. Pannello inferiore: zoom sulla perdita di lunghezza dei neuriti dovuta all'intensa luminosità di fluorescenza dei neuriti spessi. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Fluorescenza di fondo nell'analisi della crescita dei neuriti in colture di neuroni sensoriali adulti. (A) Immagine immunocitochimica rappresentativa (marcatore neuronale Tuj1) di un elevato rumore di fluorescenza di fondo. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera viola segmenta i corpi cellulari, la maschera blu segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Zoom sull'errore di segmentazione dei neuriti (maschera blu) dovuto all'interferenza della fluorescenza di fondo. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Diffusione della luce nell'analisi della crescita neuritica della coltura di neuroni sensoriali adulti. (A) Immagine immunocitochimica rappresentativa (marcatore neuronale Tuj1) della diffusione della luce. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera viola segmenta i corpi cellulari, la maschera blu segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Pannello superiore: zoom sulla perdita di lunghezza dei neuriti dovuta all'interferenza della diffusione della luce. Pannello inferiore: zoom sull'errore di segmentazione del corpo cellulare (maschera viola). Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Errori che influenzano la qualità della procedura di colorazione che interferiscono con l'analisi della crescita dei neuriti della coltura dei neuroni sensoriali adulti. (A) A sinistra, un'immagine rappresentativa di fase di neuroni sensoriali adulti. A destra, un'immagine immunocitochimica rappresentativa (marcatore neuronale Tuj1) di neuriti rotti a causa del lavaggio nella procedura di colorazione. (B) A sinistra, un'immagine rappresentativa della fase di neuroni sensoriali adulti. A destra, un'immagine immunocitochimica rappresentativa (marcatore neuronale Tuj1) della rimozione del corpo cellulare dovuta ai lavaggi della procedura di colorazione. Le immagini sono state acquisite 48 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Coltura di neuroni sensoriali embrionali ideali (E13.5) per l'analisi della crescita neuritica. (A) Immagine di fase rappresentativa di una condizione di semina ideale per l'analisi della crescita dei neuriti in coltura di neuroni sensoriali embrionali. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera gialla segmenta i corpi cellulari, la maschera magenta segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Zoom sulla segmentazione del corpo cellulare (maschera gialla) e sulla segmentazione dei neuriti (maschera magenta). Le immagini sono state acquisite 24 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Coltura di neuroni sensoriali embrionali (E13.5) ideali per l'analisi della crescita neuritica. (A) Immagine immunocitochimica rappresentativa (marcatore neuronale Tuj1) di una coltura di neuroni sensoriali embrionali ideale per l'analisi della crescita dei neuriti. (B) Immagine rappresentativa segmentata automaticamente. La maschera viola segmenta i corpi cellulari, la maschera blu segmenta i neuriti. (C) Parametri illustrativi di definizione dell'analisi della crescita dei neuriti. (D) Zoom sulla segmentazione del corpo cellulare (maschera viola) e sulla segmentazione dei neuriti (maschera blu). Le immagini sono state acquisite 24 ore dopo la semina. Ingrandimento 20x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 12: Le cellule NSC-34 differenziate hanno un aumento dei neuriti e della ramificazione rispetto ai controlli indifferenziati. Immagini rappresentative delle cellule NSC-34. Pannello superiore: cellule NSC-34 indifferenziate (controllo). Pannello inferiore: cellule NSC-34 differenziate dopo 96 ore di trattamento con acido retinoico. Sul lato sinistro di entrambi i pannelli, le immagini a contrasto di fase, mentre sul lato destro di entrambi i pannelli, le immagini segmentate automaticamente (soma in giallo, neuriti in magenta). Le immagini sono state acquisite 96 ore dopo la semina. Ingrandimento 10x. Barra graduata, 50 μm. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 13: Strumento Contatore celle nelle Figi. Conta cellulare manuale eseguita su un'immagine di fase di una condizione di semina ideale per l'analisi della crescita dei neuriti. Ingrandimento 20x. La figura è stata creata con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di culturaCultura DRG adulta (Fase)Coltura DRG embrionale (Fase)NSC-34 (Fase)
Ingrandimento20 volte20 volte10 volte
Modalità di segmentazioneLuminositàLuminositàLuminosità
Regolazione della segmentazione0.5 - 0.71.7 - 21
Regola le dimensioni (pixel)0, +1, +20, +10
FiltraggioMigliorMigliorMiglior
Sensibilità ai neuriti0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
Larghezza Neurite122

Tabella 1: Riepilogo dei parametri di definizione dell'analisi suggeriti per colture di neuroni sensoriali adulti, colture di neuroni sensoriali embrionali (E13.5) e colture di NSC-34 in immagini a contrasto di fase.

Tipo di culturaCultura DRG adulta (ICC)Coltura DRG embrionale (ICC)
Ingrandimento20 volte20 volte
Modalità di segmentazioneLuminositàLuminosità
Regolazione della segmentazione0.5 - 0.71.7 - 2
Regola le dimensioni (pixel)0, +1, +20, +1
FiltraggioMigliorMiglior
Sensibilità grossolana alla neurite8 - 98 - 9
Sensibilità fine alla neuritefino a 0,750.5 - 0.75
Larghezza Neurite12

Tabella 2: Riepilogo dei parametri di definizione dell'analisi suggeriti per colture di neuroni sensoriali adulti, colture di neuroni sensoriali embrionali (E13.5) e colture di NSC-34 in immagini di immunocitochimica.

QUESTIONESUGGERIMENTI
Cultura sporcaRegolare il cursore di segmentazione verso le celle
Aumenta il parametro di regolazione della dimensione (+1,+2...)
Diminuire leggermente la sensibilità dei neuriti
Neuriti pallidi/sottiliAumentare la sensibilità ai neuriti (almeno 0,6)
Regola il cursore di segmentazione verso le celle.
Neuriti sottili nell'ICCAumenta la sensibilità dei neuriti fini (fino a 0,75)
Ridurre la sensibilità grossolana ai neuriti (almeno a 8-9)
Cellule glialiRegolare il cursore di segmentazione verso le celle (1.7-2)
Larghezza della neurite a 2

Tabella 3: Riepilogo dei parametri di definizione dell'analisi suggeriti per risolvere problemi specifici in diversi tipi di culture.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Misurare con precisione il modo in cui i neuroni crescono in condizioni sane, ferite e malate è un parametro critico in molte configurazioni sperimentali nel campo delle neuroscienze. Sia che si lavori con colture organotipiche di espianti di DRG interi o colture dissociate, misurare correttamente la crescita assonale è stata una sfida significativa negli ultimi 20 anni. Senza una quantificazione affidabile e accurata della crescita dei neuriti, è impossibile valutare se un trattamento specifico, come l'acido retinoico (per 4 giorni) per le cellule NSC-3434 o le neurotrofine (per 1-2 giorni) per i neuroni DRG embrionali 14,35, sia stato efficace. I neuroni in genere mostrano una crescita continua quando sono sani; Tuttavia, a seguito di una lesione, il tasso di crescita assonale aumenta del12,13. Il tempismo è fondamentale quando si misura la crescita assonale; Pertanto, prima di iniziare un esperimento, è essenziale condurre un test di prova per determinare il momento ottimale per fissare le cellule in base alla loro curva di plateau del tasso di crescita.

La scelta del metodo, manuale o automatico, segna uno spartiacque in termini di dispendio di tempo e precisione. Alcuni dei metodi manuali più comuni includono NeuronJ18,20 e Metamorph (Visitron)2,22,28. I metodi manuali richiedono agli utenti di tracciare manualmente i neuriti, il che richiede molto tempo e immagini di singole cellule. Con la segmentazione manuale dei neuriti, le reti neurali sono completamente fuori portata. Tipicamente, queste metodologie misurano solo l'assone più lungo o utilizzano la misurazione della distanza vettoriale, perdendo così informazioni importanti come il numero di punti di diramazione e la lunghezza assonale totale. Un certo miglioramento è fornito dall'analisi di Sholl30, che comunque è limitata alle condizioni di singola cellula. L'analisi di singole cellule presenta diverse sfide, a partire dalla semina delle cellule. I neuroni devono essere placcati a una concentrazione molto bassa, che potrebbe non essere la condizione di crescita più adatta per ogni tipo di cellula. Un altro problema deriva dall'acquisizione delle immagini. Di solito, il microscopio confocale viene utilizzato per l'imaging, che richiede utenti addestrati e neuroni fluorescenti e non è né efficiente in termini di tempo né di costi. Con il microscopio confocale si ottengono immagini ad alta risoluzione, ma pochissimi neuroni vengono ripresi da ogni esperimento. Ciò rappresenta un limite in quanto sono necessarie più repliche biologiche per raggiungere un numero adeguato di neuroni.

Alcune metodologie automatiche come NeuroMath 2,28 risolvono il problema della segmentazione dei neuriti, che richiede molto tempo, che viene eseguita in modo automatico.

Tuttavia, a causa dei limiti di tempo, questo modulo di misurazione della crescita neuritaria fornisce risultati più rapidi durante l'acquisizione di immagini presso la macchina di microscopia time-lapse. Quest'ultimo, insieme a questo software, migliora significativamente l'efficienza in termini di tempo e costi sia per gli studenti che per i ricercatori principali.

La macchina di acquisizione permette la creazione di una mappa abbastanza completa del pozzo, acquisendo un numero variabile di immagini in base al diametro del pozzo. Ciò rappresenta un vantaggio significativo in quanto più neuroni vengono visualizzati contemporaneamente. Tuttavia, raggiungere solo un ingrandimento 20x è sufficiente e adatto per analizzare le immagini con il software. La sua potenza si basa sulla sua capacità di addestrarsi su una serie di immagini ed eseguire una misurazione semi-automatica della lunghezza assonale totale. Inoltre, il software può funzionare sia su singoli neuroni che su reti neuronali. Il software è in grado di segmentare neuriti e corpi cellulari con due diverse maschere. Una maschera gialla segmenta tutti gli oggetti ad alto contrasto nell'immagine, come corpi cellulari, detriti cellulari e ombre. Una maschera magenta, invece, segmenta i neuriti. La precisione e l'accuratezza del software sono state dimostrate dalla segmentazione degli stessi neuroni sia con il software che con NeuronJ. Dal punto di vista dell'analisi statistica, i valori delle lunghezze dei neuriti sono ben correlati con un alto coefficiente di correlazione di Spearman.

Dopo aver valutato l'affidabilità del metodo, si è passati all'analisi delle varie condizioni di prova. Per un'analisi ottimale sono necessari alcuni accorgimenti. In primo luogo, i neuroni devono essere seminati uniformemente nel pozzetto, evitando punti con un'alta concentrazione cellulare. Il raggruppamento dei neuroni fa sì che il software perda precisione nel rilevamento dei neuriti. Un'altra variabile che influenza l'accuratezza e la precisione dell'analisi è la pulizia della coltura. È preferibile una coltura pulita con pochi detriti cellulari e cellule morte. Tuttavia, il software è in grado di compensare tali problemi modulando la sensibilità dei neuriti e la maschera di segmentazione del corpo cellulare. Come accennato in precedenza, la maschera gialla segmenta oggetti ad alto contrasto, tra i quali ci sono anche ombre causate dal movimento del mezzo nel pozzo. Le ombre potrebbero coprire i neuriti, con conseguente perdita di lunghezza dei neuriti. Tuttavia, un problema di questo tipo può essere facilmente risolto consentendo al mezzo di stabilizzarsi prima dell'acquisizione dell'immagine.

L'algoritmo è in grado di eseguire la quantificazione della lunghezza dei neuriti sia su immagini a contrasto di fase che su immagini di immunocitochimica. Quando è coinvolta la fluorescenza, è necessario prendere altre precauzioni per ottenere un'analisi affidabile. In primo luogo, la qualità della colorazione influenza profondamente l'esito dell'analisi. Se i neuriti vengono rotti o segmentati e i corpi cellulari vengono strappati via durante i lavaggi, l'analisi perde forza e affidabilità. Inoltre, la fluorescenza stessa rappresenta un elemento potenzialmente disturbante per l'analisi. Poiché la messa a fuoco viene eseguita automaticamente dalla macchina, l'obiettivo mette a fuoco oggetti molto luminosi come artefatti, corpi cellulari o neuriti spessi. Di conseguenza, i neuriti più sottili e meno luminosi vengono lasciati indietro, rendendo difficile per l'utente misurare correttamente la lunghezza dei neuriti.

Di conseguenza, l'analisi delle immagini di fase potrebbe essere più fondata rispetto all'analisi delle immagini di immunocitochimica. Il software è in grado di lavorare su molte morfologie neuronali diverse, dalle più intricate ed elaborate a quelle più semplici, sia come singole cellule che in reti neuronali. Pertanto, è utilizzabile in molti campi di ricerca diversi, che vanno dalle colture primarie di neuroni provenienti dal sistema nervoso centrale o periferico di vari stadi di sviluppo ai neuroni e alle linee cellulari derivate da iPSC come NSC-34.

Nonostante il notevole potenziale del software, si possono notare alcune limitazioni. In primo luogo, la precisione della segmentazione del corpo cellulare è subottimale. Di conseguenza, parametri come l'ammasso di corpi cellulari e l'area dell'ammasso di corpi cellulari non possono essere utilizzati in modo affidabile per il conteggio delle cellule. In secondo luogo, oltre alle precauzioni necessarie per una segmentazione ottimale dei neuriti, gli assoni non sufficientemente spessi possono essere esclusi dalla misurazione della lunghezza dei neuriti, con conseguente perdita di dati.

Il parametro del punto di diramazione riscontra problemi relativi a entrambi i tipi di segmentazione. Ombre, cellule morte o detriti nella coltura che si localizzano sui punti di ramificazione li oscurano mentre vengono coperti dalla segmentazione del corpo cellulare. Inoltre, nel caso di neuriti sottili, l'affidabilità del parametro del punto di ramificazione è ancora una volta gravemente compromessa.

Inoltre, la messa a fuoco automatica durante l'acquisizione delle immagini a volte può essere non ottimale. L'ingrandimento massimo della macchina è limitato a 20x, che potrebbe essere inadeguato per osservare i dettagli più fini o la fluorescenza in strutture sottili come i neuriti. Inoltre, la macchina offre prestazioni ottimali con substrati plastici omogenei. Se nel pozzetto viene inserito un vetrino coprioggetti, la messa a fuoco sul vetro potrebbe non riuscire, risultando in immagini parzialmente sfocate. Tuttavia, questo software non si applica solo ai neuroni, ma anche a campi di ricerca completamente diversi, come la crescita dei funghi36.

Tutto sommato, riteniamo che questo modulo di misurazione della crescita dei neuriti sia uno strumento affidabile per misurare i neuriti in modo rapido, imparziale ed efficiente.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcun rapporto commerciale o finanziario che potesse potenzialmente creare un conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Alessandro Vercelli per i commenti critici e il supporto tecnico di Sartorius per l'aiuto. La nostra ricerca su questi temi è stata generosamente sostenuta dal Rita-Levi Montalcini Grant 2021 (MIUR, Italia). Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca progetto MIUR Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 al Dipartimento di Neuroscienze Rita Levi Montalcini. La ricerca di D.M.R. è stata condotta durante e con il supporto del corso di dottorato interuniversitario nazionale italiano in Sviluppo Sostenibile e Cambiamenti Climatici (link: www.phd-sdc.it).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi AMerck / Roche10103586001
Dispase II (proteasi neutra, grado II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco's modificato eagle's mediumMerck / SigmaD5796
Siero bovino fetaleMerck / SigmaF7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 w/ L-GlutamminaEurocloneECM0135L
Hanks' Balanced Salt SolutionEurocloneECM0507L
HBSS (10X), senza calcio, senza magnesio, senza fenoloThermoFisher Scientific14185045
Siero fetale bovino caratterizzato da HyClone (Stati Uniti)CytivaSH30071.03
Incucyte, software di analisi Neurotrack Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminin Proteina di topo, naturaleThermoFisher Scientific23017015
L-CisteinaMerck / SigmaC7352
Leibovitz's L-15 medium senza L-glutamminaEurocloneECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Terreno neurobasale [-] GlutamminaThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)CLU140
Papaina da lattice di papayaSigmaP4762
Penicillina-Streptomicina (5.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( Densità: 1,130 g/mL)Cytiva17089101
Soluzione di poli-D-lisina (1mg/mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Soluzione di poli-L-lisina (0-01%)SigmaP4832
Umano ricombinante NT-3PeproTech450-03
Acido retinoicoMerck / SigmaR2625
Soluzione di tripsina-EDTASigmaT3924
β-Tubulina III (Tuj1) anticorpoMerck / SigmaT8660

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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