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Articolo metodologico

Produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

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⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 settembre 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il seguente protocollo presenta un metodo di estrusione basato sul taglio per la fabbricazione di idrogel di collagene con fibrille modellate su scala nanometrica, che può essere applicato a un'ampia gamma di applicazioni di ingegneria tissutale.

Abstract

I biomateriali rigenerativi sono progettati per facilitare le interazioni cellula-materiale per guidare la riparazione di tessuti e organi danneggiati. Questi materiali sono progettati per emulare le proprietà biofisiche dei tessuti nativi, fornendo una guida fenotipica e morfologica cellulare che contribuisce al ripristino della nicchia dei tessuti rigenerativi. Il collagene, una proteina prevalente della matrice extracellulare, è un componente comune di questi biomateriali rigenerativi grazie alla sua biocompatibilità e ad altre proprietà favorevoli. L'attuale studio descrive un metodo nuovo e semplice per la fabbricazione di collagene nanofibrillare ingegnerizzato con patterning diretto delle fibrille. Attraverso la manipolazione dello sforzo di taglio, della temperatura e del pH, la fibrillogenesi e l'allineamento del collagene sono controllati con precisione senza richiedere attrezzature specializzate. Questo approccio consente la creazione di biomateriali di collagene nanofibrillare che imitano la struttura nativa di tessuti che presentano caratteristiche anisotrope o isotrope. La flessibilità del patterning delle nanofibrille di collagene non solo facilita lo studio del patterning su scala nanometrica sul comportamento cellulare, ma offre anche diverse possibilità per applicazioni di ingegneria tissutale modellata.

Introduzione

L'obiettivo della medicina rigenerativa è migliorare la rigenerazione e la guarigione dei tessuti attraverso l'applicazione di terapie ingegnerizzate. Un approccio prevede la fabbricazione di costrutti di biomateriali che emulano da vicino la composizione e la struttura dei tessuti nativi. Nella progettazione di questi costrutti, una considerazione fondamentale è la matrice extracellulare (ECM) nativa sottostante, che fornisce indicazioni didattiche per la proliferazione, la migrazione e la differenziazione cellulare, guidando in ultima analisi la rigenerazione tissutale 1,2. La ECM nativa è costituita prevalentemente da collagenefibrillare 3,4. In tessuti altamente organizzati come il muscolo scheletrico e il tendine, queste ECM mostrano un pattern allineato, che è la chiave per supportare la trasmissione della forza attraverso il tessuto e la funzione motoria 5,6.

L'utilità del collagene come biomateriale per applicazioni di ingegneria tissutale va oltre la sua ampia prevalenza nei tessuti nativi, poiché mostra anche una buona biocompatibilità, biodegradabilità e affinità cellulare 7,8,9. I recenti progressi nello sviluppo di biomateriali a base di collagene si sono concentrati sul perfezionamento delle proprietà biofisiche per guidare meglio i segnali meccanici e biochimici che sono essenziali per la rigenerazione di tessuti specifici. La creazione di biomateriali di collagene con una struttura fibrillare in vitro è relativamente semplice, poiché le molecole di collagene solubili in acido sono in grado di autoassemblarsi in nanofibrille se esposte a temperature calde e pH neutro10,11. Tuttavia, senza una manipolazione guidata, queste fibrille si formeranno in reti casuali, rendendole inadatte per applicazioni di ingegneria tissutale anisotropa. Le tecniche in grado di produrre fibrille allineate includono l'elettrofilatura e la filatura a umido, insieme ad altre tecniche di estrusione in soluzione12,13, liofilizzazione14, fabbricazione elettrochimica o magnetica15,16, deposizione a flusso di taglio17, cristallizzazione indotta dal flusso18, estrusione di gel19, allineamento indotto da deformazione20 e allineamento guidato dalla forza attraverso la manipolazione del fluido flusso 21,22. Tuttavia, molti di questi metodi non sono altamente compatibili con il collagene, producono allineamento su microscala ma non su scala nanometrica, richiedono ulteriori passaggi di post-elaborazione per indurre allineamento e stabilità o richiedono attrezzature e reagenti altamente specializzati, rendendo difficile la loro adozione diffusa.

Il presente studio presenta un metodo basato sul taglio per la fabbricazione di collagene nanofibrillare, con pattern di fibrille allineate o orientate in modo casuale, senza la necessità di attrezzature specializzate come pompe a siringa o elettrospinner. Questa tecnica sfrutta la dipendenza dal pH della fibrillogenesi del collagene. L'applicazione della forza di taglio al collagene monomerico acido all'interno di un tampone neutralizzante promuove la fibrillogenesi allineata lungo la direzione del taglio. Allo stesso modo, il collagene può essere indotto a subire fibrillogenesi in assenza di taglio, che produce fibrille con schemi casuali. Le strisce di collagene 3D risultanti, composte da collagene nanofibrillare allineato o modellato in modo casuale, possono servire come strumenti per studiare gli effetti del patterning su scala nanometrica sul comportamento cellulare. Inoltre, offrono diverse possibilità per applicazioni di ingegneria tissutale sia anisotropa che isotropa 23,24,25,26,27. Il pattern può essere personalizzato per adattarsi alla struttura del tessuto nativo di interesse. Le strisce di collagene possono anche essere combinate in fasci di varie dimensioni per fungere da terapia ingegnerizzata trapiantata in diverse dimensioni e forme di lesioni.

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Protocollo

1. Preparazione del collagene dializzato ( Figura 1)

  1. Tagliare il tubo di dialisi a una lunghezza di circa 3 pollici. Utilizzare tubi con le seguenti specifiche: larghezza piatta di 32 mm, diametro gonfiato di 20 mm e dimensione dei pori di 4,8 nm.
  2. Reidratare il tubo per dialisi in acqua ultrapura.
  3. Agganciare un'estremità del tubo con una clip per tubo di dialisi.
  4. Trasferire 5-6 mL di collagene di coda di ratto di tipo I (concentrazione: 9-10 mg/mL in acido acetico 0,02 N) nel tubo utilizzando una siringa da 10 mL dotata di un ago da 18 G. Agganciare l'altra estremità del tubo per chiuderla.
  5. Posizionare uno strato spesso 0,5-1 cm di scaglie di glicole polietilenico (PEG) sul fondo di un piatto di vetro, quindi posizionare il tubo di dialisi riempito di collagene sopra lo strato PEG.
    NOTA: Un piatto di vetro da 13 pollici x 9 pollici x 2 pollici può in genere ospitare una fila di 4-5 provette riempite di collagene. Le dimensioni del piatto possono essere regolate in base al volume di collagene necessario.
  6. Aggiungere altri fiocchi di PEG fino a coprire completamente il tubo e mettere la teglia in frigorifero a 4 °C.
  7. Ogni 10-15 minuti, rimuovere i fiocchi di PEG bagnati dalla superficie del tubo di dialisi e ricoprire il tubo con un nuovo strato di PEG asciutto. Rimettere la pirofila in frigorifero a 4 °C.
  8. Ripetere il passaggio 1.7 altre due volte e, dopo 30-35 minuti, risciacquare i fiocchi di PEG bagnati con acqua di rubinetto.
  9. Sciacquare nuovamente il tubo con acqua ultrapura e asciugarlo tamponando con un fazzoletto.
  10. Sganciare un'estremità del tubo e trasferire il collagene dializzato (concentrazione finale: ~30 mg/mL) in provette per microcentrifuga. Centrifugare brevemente le bolle d'aria nel collagene utilizzando una mini-centrifuga (2.000 x g, ≤30 s, temperatura ambiente [RT]) e conservare a 4° C per un uso successivo.
  11. Un giorno prima dell'uso, caricare il collagene nelle siringhe.
    1. Utilizzando un ago calibro 16, aspirare ~1 ml di collagene dializzato in una siringa da 1 ml.
      NOTA: Il collagene è una sostanza viscosa. Potrebbe essere necessario precaricare la testa dell'ago con collagene prima di prelevare altro collagene. Rimuovere la testa dell'ago ed espellere grandi sacche d'aria se necessario
    2. Rimuovere l'ago e avvolgere la testa della siringa con il parafilm.
    3. Conservare la siringa riempita di collagene in posizione verticale a 4°C per una notte per consentire la fuoriuscita di piccole bolle d'aria.

2. Preparazione delle scaglie di vetro ( Figura 1)

ATTENZIONE: Utilizzare una protezione per gli occhi per questa parte del protocollo.

NOTA: Per gli esperimenti di coltura cellulare vengono utilizzati vetrini in vetro idrofobico con rivestimento speciale. Le guide devono essere maneggiate dai bordi per evitare la rimozione del rivestimento superficiale. Eseguire la procedura di taglio del vetro su una superficie di taglio idonea.

  1. Misurare e segnare le dimensioni desiderate del truciolo di vetro utilizzando un pennarello indelebile
    1. Se si creano impalcature a 8 strisce, segnare incrementi di circa 1 cm lungo il bordo lungo della diapositiva. Regolare le dimensioni secondo necessità in base alle dimensioni desiderate dell'impalcatura.
  2. Utilizzando un bordo dritto (cioè un bordo della piastra a 6 pozzetti), far scorrere il tagliavetro lungo la lunghezza della prima misurazione per incidere il vetro.
  3. Il vetrino si romperà da solo lungo la linea segnata o capovolgerà il vetrino su un tessuto (lato idrofobico rivolto verso il basso) e applicherà manualmente una pressione sulla regione segnata.
  4. Segnare il lato rivestito del vetrino idrofobico utilizzando un pennarello a etanolo.
  5. Sciacquare il truciolo di vetro in acqua ultrapura per rimuovere la polvere di vetro residua.
  6. Asciugare i trucioli di vetro utilizzando un ugello da banco per aria pressurizzata o impilandoli ad angolo nella cappa aspirante.
  7. Ripetere se necessario per il numero richiesto di fiches. Conserva le fiches su RT. Per ottenere i migliori risultati di coltura cellulare, utilizzare le patatine preparate entro 7 giorni.

3. Preparazione di soluzione salina tamponata con fosfato 10x (PBS)

  1. Riempi una bottiglia di vetro con 500 ml di acqua ultrapura.
  2. Aggiungere 10 compresse PBS al flacone.
    NOTA: Questo protocollo presuppone che il rapporto delle compresse per 1x PBS sia di 1 compressa per 500 ml. Regolare il numero di compresse secondo necessità se si utilizza una dimensione o una marca diversa.
  3. Aggiungere una barra di agitazione alla bottiglia e posizionarla su una piastra di agitazione fino a quando le compresse non si saranno sciolte.
  4. Il giorno della fabbricazione dell'idrogel, trasferire il volume necessario di 10x PBS in provette coniche da 50 mL.
  5. Posizionare le provette riempite di PBS in un bagno d'acqua a 37 °C per almeno 15 minuti prima della fabbricazione del collagene.

4. Fabbricazione di nanofibrille di collagene allineate (Figura 2)

  1. Togliete una siringa di collagene dal frigorifero e inserite un ago smussato da 22 G.
  2. Posizionare un vetrino nel coperchio di una piastra a 4 pozzetti.
  3. Coprire il vetrino con una quantità di PBS a 37 °C 10x riscaldata per immergerlo (30-50 mL).
  4. Tenendo la siringa a un angolo di circa 30-45°, estrudere manualmente sottili strisce di collagene sul chip di vetro utilizzando una velocità di ~340 mm/s e una velocità di flusso di ~3,2 mL/min.
    NOTA: Completare l'estrusione del collagene entro 30-60 s dall'aggiunta del PBS riscaldato per garantire che il PBS non si raffreddi eccessivamente.
  5. Attendere 1-2 minuti per consentire al collagene di completare la fibrillogenesi o fino a quando il collagene non assume un colore bianco opaco.
  6. Usa una pinza per tagliare le strisce di collagene a misura. Assicurati che le strisce siano abbastanza lunghe in modo che 3-5 mm possano essere piegate sotto entrambe le estremità del chip.
  7. Una alla volta, drappeggiare delicatamente le strisce di collagene nel senso della lunghezza (parallele alla regione incisa) su una scheggia di vetro preparata. Infila i bordi sotto il chip.
  8. Continuare a posizionare le strisce di collagene fino a raggiungere le dimensioni desiderate.
  9. Posizionare l'idrogel di collagene appena formato su due pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Ciò consente il flusso d'aria durante il processo di essiccazione e impedisce alle estremità della coda del collagene di aderire a superfici indesiderate.
  10. Lasciare asciugare gli idrogel sul piano di lavoro per 1-3 ore o fino a quando i cristalli di sale PBS coprono il 50%-90% della superficie dell'idrogel.
    NOTA: Il tempo di asciugatura varia a seconda delle dimensioni dell'idrogel e della presenza di liquido in eccesso.
  11. Immergere ogni idrogel in 1x PBS per circa 30-60 s o fino a quando i cristalli di sale non si sono sciolti.
  12. Tamponare delicatamente il PBS in eccesso con un fazzoletto.
  13. Riposizionare gli idrogel sulla piastra a pozzetti e lasciarli asciugare in una cappa aspirante per una notte.
  14. Conservare gli idrogel essiccati a RT per circa 1 settimana.

5. Fabbricazione di nanofibrille di collagene casuali (Figura 3)

  1. Togliete una siringa di collagene dal frigorifero e inserite un ago smussato da 22 G.
  2. Estrudere il collagene a ~3,2 mL/min su una scheggia di vetro asciutta. Estrudere una quantità sufficiente di collagene per ottenere dimensioni simili agli idrogel di collagene allineati. Se necessario, prevenire l'accumulo di bolle d'aria.
  3. Estrudere altro collagene per avvolgere i bordi della scheggia di vetro. In questo modo si riduce al minimo il rischio di distacco accidentale.
  4. Usa una pinza per immergere il collagene estruso in una provetta da 50 ml di PBS 10x riscaldato.
  5. Attendere 45-60 s affinché il collagene completi la fibrillogenesi o fino a quando il collagene non assume un colore bianco opaco.
  6. Tamponare delicatamente il PBS in eccesso con un fazzoletto.
  7. Completare i passaggi 4.9-4.14 per risciacquare e asciugare gli idrogel

6. Sterilizzazione e reidratazione

NOTA: Completare tutti i seguenti passaggi in una cabina di biosicurezza

  1. Sterilizzare gli idrogel di collagene e la piastra a pozzetti circostante in etanolo al 70% per 15 minuti.
    1. Sollevare brevemente gli idrogel a metà della sterilizzazione utilizzando una pinza per assicurarsi che sia la parte inferiore del chip di vetro che l'idrogel siano a contatto con l'etanolo.
  2. Rimuovere l'etanolo e lasciare asciugare gli idrogel all'aria per 10 minuti.
  3. Lavare gli idrogel 3 volte in 1x PBS sterile, per 10 minuti ciascuno, per rimuovere l'etanolo residuo e reidratare gli idrogel. Gli idrogel sono ora pronti per l'uso (colture cellulari, ecc.). Gli idrogel possono essere lasciati brevemente nel PBS dopo l'ultima fase di lavaggio se non sono immediatamente pronti per l'uso.

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Risultati

Questo protocollo descrive una semplice tecnica di estrusione basata sul taglio per la fabbricazione di idrogel di collagene composti da nanofibrille allineate (Figura 2) o orientate in modo casuale (Figura 3). Il patterning delle nanofibrille si basa sul controllo preciso delle forze di taglio, che si ottiene attraverso la modulazione combinata della velocità della siringa e della velocità di estrusione del collagene. I valori ottimali per indurre l'allineament...

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Discussione

Le fasi critiche del protocollo possono essere distillate in tre parti principali: 1) fibrillogenesi del collagene, 2) montaggio dell'idrogel e 3) lavaggio. Il processo di fibrillogenesi del collagene avviene spontaneamente in condizioni neutralizzanti e si basa sull'autoassemblaggio di singole molecole di collagene in strutture fibrillari stabilizzate più grandi 10,11. Ciò si ottiene attraverso l'applicazione di un mezzo tampone...

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Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata in parte dai finanziamenti dell'Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, dell'Oregon Health & Science University Foundation e del Collins Medical Trust. K.M.H. è stato supportato dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1937961) e dall'Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) Fellowship (5TL1TR2371-8). K.H.N. è stato sostenuto da sovvenzioni del NIH/NHLBI (R00HL136701) e del NIH/NIAMS (R01AR080150).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagene I, alta concentrazione, coda di rattoCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U microscopioNikonTE-2000-U Microscopio invertito
Vetrini per microscopio extra spessiFisher Scientific22-267-005Funziona bene per la superficie di estrusione del collagene
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AMicroscopio elettronico a scansione
Set di strumenti per tagliavetro 2mm-20mm Stile matita Punta in metallo duro per alimentazione a olioAmazon/MOARMORB07Y1D243H Opzione per un tagliavetro
Hamilton Kel-F Hub Aghi a punta smussata (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Aghi per estrusione di collagene
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Vetrini idrofobici
PBS CompresseThermo Fisher Scientific18912014
Polietilenglicole 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Tubo per dialisi in cellulosa senza saldatura Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Clip per dialisiThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware TagliavetroSynthware31-501-927Opzione per un tagliavetro

Riferimenti

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