Articolo metodologico

Istituzione di un nuovo sistema di perfusione polmonare ex vivo per polmoni di ratto dopo la morte circolatoria

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DOI:

10.3791/67168

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18 ottobre 2024

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1China-Japan Friendship Institute of Clinical Medicine, 2Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, 3Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo è sviluppare un nuovo modello di perfusione polmonare ex vivo (EVLP) nei ratti in grado di sostenere una funzione polmonare costante per 4 ore durante l'EVLP e fornire all'industria specifiche di implementazione che offriranno un metodo robusto per applicare l'EVLP ai modelli di roditori.

Abstract

La crescente scarsità di polmoni di donatori per il trapianto ha stimolato un notevole interesse per l'utilizzo di organi prelevati da donatori dopo la morte cardiaca (DCD). Tuttavia, rimane una sfida critica nel massimizzare il numero di polmoni vitali che soddisfano criteri rigorosi per l'uso clinico. La perfusione polmonare ex vivo (EVLP) emerge come una tecnologia promettente per valutare e potenzialmente migliorare la funzione dei polmoni donati. Questo articolo descrive lo sviluppo di una piattaforma sperimentale per piccoli animali, economica e riproducibile, progettata specificamente per la ricerca EVLP. Questa piattaforma offre un alto grado di personalizzazione, consentendo ai ricercatori di personalizzare i parametri sperimentali per affrontare specifiche domande di ricerca nel campo dell'EVLP. Il team ha stabilito un modello di ratto per simulare la DCD e ha implementato un approccio di conservazione in due fasi. I polmoni sono stati sottoposti a conservazione a freddo statico utilizzando una soluzione di perfusato a 4 °C per 4 ore, seguita da EVLP normotermica per altre 4 ore. I ricercatori hanno valutato vari parametri della funzione polmonare, tra cui la resistenza vascolare polmonare, la compliance dinamica polmonare, le misurazioni dei gas nel sangue del perfusato e la morte cellulare apoptotica nei tessuti polmonari. Lo studio dimostra che l'EVLP potrebbe migliorare significativamente le prestazioni funzionali dei polmoni DCD rispetto alla semplice conservazione a freddo a 4 °C, suggerendo che l'EVLP ha il potenziale per mitigare il danno da ischemia-riperfusione e migliorare la funzione del trapianto dopo la morte circolatoria, aumentando così il pool di polmoni trapiantabili.

Introduzione

Il trapianto di polmone (LTx) rimane l'unico trattamento definitivo per i pazienti con malattia polmonare allo stadio terminale. Il successo del trapianto di polmone dipende dalla disponibilità di polmoni di donatori di alta qualità con una funzione adeguata. Tuttavia, a livello globale è emersa una crescente lista d'attesa per i trapianti di polmone a causa di una grave carenza di polmoni da donatore1. Molti pazienti in lista d'attesa sperimentano un declino della salute o addirittura la morte durante l'attesa di un polmone donatore compatibile entro un lasso di tempo ragionevole2. Pertanto, è fondamentale ampliare il pool di potenziali innesti per soddisfare le esigenze dei pazienti in lista d'attesa per il trapianto. Donazione dopo morte cardiocircolatoria (DCD)1,3 e la perfusione polmonare ex vivo (EVLP)4,5 sono due strategie promettenti per aumentare il numero di polmoni disponibili per il trapianto. Attualmente, la donazione dopo la morte cerebrale (DBD)6 è la fonte primaria di trapianti di polmone. Tuttavia, a causa dell'attuale carenza di innesti, la DCD sta guadagnando terreno. Questo cambiamento è guidato dai limiti degli innesti DBD, in cui i cambiamenti nel flusso sanguigno, nella ventilazione meccanica, nell'infezione e nell'aspirazione possono compromettere la qualità dell'innesto. La qualità dell'innesto influisce direttamente sugli esiti dei pazienti e sulla sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto. Il processo di perfusione polmonare ex vivo (EVLP) ha effettivamente aumentato il numero di trapianti polmonari disponibili rivalutando gli innesti polmonari da donatori dopo la morte cardiaca (DCD), ottenendo risultati simili sia a breve che a lungo termine7,8. L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un sistema di perfusione polmonare extracorporea in ratti con polmoni ciclicamente morti e valutare accuratamente i donatori di DCD. Per ridurre la probabilità di disfunzione primaria del trapianto (PGD), il danno per i donatori di DCD9 può essere ridotto al minimo utilizzando la diagnostica molecolare10 e impiegando trattamenti mirati specializzati.

EVLP è una tecnica che replica l'ambiente naturale dei polmoni al di fuori del corpo, mantenendo una temperatura fisiologica normale. Consente il monitoraggio e la valutazione continui dei polmoni11,12, estende il tempo di conservazione dei trapianti13 e utilizza la perfusione esterna, la ventilazione e i farmaci per migliorare la qualità dei polmoni marginali, rendendoli adatti al trapianto14. Il primo uso riuscito di polmoni da donatore marginale per il trapianto di polmone utilizzando EVLP è stato riportato da Steen et al. nel 200715. Da allora, l'uso della tecnologia EVLP è stato gradualmente integrato nella pratica clinica16,17. Il team di Toronto ha successivamente adattato l'approccio EVLP utilizzando la ventilazione a basso volume corrente e basse portate in combinazione con la strategia di protezione polmonare ideale di una pompa centrifuga; Ciò ha comportato una perfusione costante per una durata di 12 ore 18.

EVLP offre diversi vantaggi, tra cui la riduzione del rischio di fallimento del trapianto primario, la riduzione al minimo dell'edema polmonare, la mitigazione dell'infiammazione correlata alla morte cerebrale, la preparazione del sistema immunitario del ricevente per il trapianto e la prevenzione di infezioni polmonari, aspirazione, embolia polmonare e lesioni da ischemia-riperfusione14,19,20. Sebbene l'EVLP offra vantaggi significativi, sono necessari metodi migliorati per migliorare la qualità dell'innesto.

Attualmente, non c'è consenso sulle impostazioni specifiche per la perfusione e la ventilazione nella piattaforma EVLP per ratti. Ohsumi et al.21 hanno ideato un nuovo modello per studiare come i polmoni dei donatori sottoposti a lunghi periodi di ischemia fredda (CIT) potrebbero mantenere la loro funzione polmonare durante il processo di perfusione polmonare ex vivo (EVLP) e dopo essere stati trapiantati. A livello internazionale, ci sono stati diversi sforzi per creare modelli di perfusione polmonare ex vivo (EVLP) di ratto22,23,24,25,26,27 al fine di ottenere una perfusione più affidabile e precisa. Pertanto, è essenziale sviluppare un sistema EVLP per piccoli animali economico, altamente riproducibile e strettamente controllato per facilitare ulteriori ricerche in questo settore. I sistemi EVLP esistenti per piccoli animali sono spesso costosi e hanno una flessibilità limitata in termini di modifica delle condizioni operative per le diverse esigenze di ricerca. Questo documento propone un progetto di sistema EVLP conveniente e adattabile. Inoltre, fornisce una spiegazione dettagliata delle fasi tecniche e chirurgiche necessarie per la sua attuazione. Abbiamo impiegato un modello che utilizzava ratti deceduti in arresto circolatorio per dimostrare che l'EVLP migliora la qualità dei polmoni DCD, aumentando così il pool di donatori polmonari vitali per il trapianto. Il nostro obiettivo è quello di condividere la nostra esperienza di successo per aiutare altri ricercatori a stabilire una piattaforma EVLP prontamente disponibile per piccoli animali dopo la morte cardiocircolatoria.

Protocollo

Gli animali da esperimento erano ratti maschi SD del peso di 250-400 g. I ratti sono stati alloggiati in condizioni sperimentali standard a 18-22 °C con un ciclo controllato di luce-buio di 12 ore e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua. Il Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto di ricerca clinica dell'Ospedale dell'amicizia Cina-Giappone ha approvato gli esperimenti sugli animali e li ha condotti in conformità con le linee guida. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia generale. La Figura 1 presenta un diagramma schematico e un'immagine reale del sistema EVLP come riferimento. La marca e il modello specifici di tutti gli strumenti e le attrezzature utilizzate sono dettagliati nella Tabella dei materiali

1. Costruzione dell'apparato

NOTA: la plastica stampata in 3D sembra essere una scelta promettente per l'apparato. Tuttavia, in base alla nostra limitata esperienza, è difficile regolare la forza mentre si legano i nodi con materiali plastici; Una forza insufficiente potrebbe causare lo scivolamento del tubo e una forza eccessiva può bloccare il tubo di plastica. I tubi rigidi in metallo evitano questi problemi e sono relativamente resistenti, quindi vengono utilizzati qui.

  1. Collegare il modulo al tubo di plastica e utilizzare un supporto con telaio in ferro e una piattaforma di sollevamento regolabile per posizionare tutte le parti all'altezza appropriata. Aggiungere 150 ml di perfusione nel serbatoio di stoccaggio del liquido, aprire la pompa peristaltica e impostare la portata a 20 ml/min per fare in modo che la perfusione riempia il tubo.
  2. 1.2Macinare un solco circolare per l'intubazione endotracheale. Preparare una miscela di gas contenente l'8% di O2, il 6% di CO2 e l'86% di N2 come gas ipossico. Passa il gas ipossico nella perfusione attraverso il polmone a membrana artificiale. Ventilare con ossigeno puro per 5 minuti prima della misurazione dei gas nel sangue.
  3. Realizzare l'arteria polmonare e le cannule atriali con tubi cavi in acciaio inossidabile 304 che sono curvi per adattarsi all'anatomia dei ratti (Figura 2A). Macinare un solco circolare per l'intubazione dell'arteria. Praticare un foro all'estremità distale della parete della cannula atriale e lucidare la scanalatura anulare sulla parete esterna (Figura 2C). Posizionare un dispositivo di scarico prima del tubo nel tubo di perfusione dell'arteria polmonare.
  4. Collegare una valvola a tre vie al sistema di circolazione esterna del bagnomaria e regolare la temperatura del serbatoio, del compartimento dell'organo e del perfusato dell'arteria polmonare. Ridurre al minimo la lunghezza del tubo di collegamento non a bagno d'acqua e controllare l'errore di temperatura in tutti i punti del dispositivo nell'intervallo ± 0,2 °C. La temperatura desiderata per il disegno dello studio è di 37 °C.
  5. Riempire la linea di monitoraggio della pressione con soluzione fisiologica e regolare il dispositivo di monitoraggio della pressione alla stessa altezza del polmone del donatore. Aprire la valvola per collegare la linea di monitoraggio della pressione con l'arteria polmonare e la linea di perfusione venosa, avviare il raccoglitore di dati e impostare lo zero. Monitora la pressione di perfusione arteriosa e la pressione di ritorno venosa in tempo reale.

2. Anestetizzazione dei ratti

  1. Indossare dispositivi di protezione individuale: maschere chirurgiche, guanti e tute monouso prima di maneggiare ratti e tessuti per ratti.
  2. Pesa i ratti e registra i loro pesi. Riempi una siringa con 1000 U/kg di eparina e iniettala nella vena caudale con un ago.
  3. Mettere i ratti in una camera di induzione chiusa e anestetizzarli con gas isoflurano al 3%. Bloccare le dita dei topi; Se non c'è risposta, indica che i ratti hanno raggiunto la profondità di anestesia desiderata. In caso contrario, continuare ad aumentare il tempo di anestesia. Applicare un unguento oftalmico sterile per prevenire la secchezza oculare.
  4. Preparare più suture (3-0 o 4-0). Trasferisci i ratti sul tavolo operatorio, posizionali in posizione supina, fissali con punti di sutura e disinfettali con spray alcolico.

3. Approvvigionamento di polmone da donatore

  1. Posizionare la testa del ratto nella maschera per anestesia e mantenere l'anestesia erogando aria contenente l'1,5% di isoflurano. Bloccare le dita dei topi; Se non c'è risposta, indica che i ratti hanno raggiunto la profondità di anestesia desiderata.
  2. Praticare un'incisione longitudinale di 2-3 cm con forbici chirurgiche per roditori lungo la linea mediana del collo davanti alla trachea, tagliare la pelle, sezionare il tessuto muscolare davanti alla trachea ed esporre completamente la trachea.
  3. Libera lo spazio dietro la trachea, passa una sutura 3-0 attraverso di essa e fai un nodo sciolto per un uso successivo. Praticare un'incisione a forma di V di 0,5 cm con le forbici chirurgiche per roditori sopra il nodo nella trachea, inserire un tubo tracheale (14G) nella trachea, stringere il nodo di sutura e fissare il tubo tracheale (Figura 3A).
  4. Collegare il tubo tracheale al ventilatore, accenderlo e iniziare la ventilazione dei polmoni.
  5. Monitorare e registrare frequentemente i segni vitali per garantire l'anestesia e i cambiamenti dei segni vitali fino alla conferma della morte.
  6. Avviare le manovre di reclutamento polmonare, riavviare la ventilazione meccanica in modalità a pressione controllata e ventilare per 5 minuti. Utilizzare i seguenti parametri: PEEP 3 cmH2O, inspiratorio: rapporto espiratorio (I:E) 1:2, frequenza respiratoria 40 respiri/min e FiO2 0,5.
  7. Bloccare la trachea e lasciare che i polmoni subiscano 1 ora di tempo ischemico caldo (WIT). Dopo il periodo di WIT, estrarre i polmoni come descritto di seguito e dividerli casualmente in tre gruppi: (1) prelievo diretto dei polmoni, (2) conservazione statica a freddo (CS) di 4 ore e (3) valutazione EVLP di 4 ore.
  8. Per il prelievo diretto di polmone, campionare i polmoni del donatore ottenuti senza alcun trattamento per vari test. Per 4 ore di conservazione statica a freddo (CS), conservare i polmoni del donatore in conservazione statica a freddo in frigorifero a 4 °C per 4 ore e quindi campionare per la rilevazione. Valutazione EVLP di 4 ore. Per una valutazione EVLP di 4 ore, seguire il passaggio 5.
  9. Regolare il tavolo operatorio in una posizione inclinata di 45° con la testa alta e i piedi in basso.
  10. Rimuovere i peli con un rasoio per capelli dal centro del torace e dell'addome del topo, disinfettarli con iodio 3 volte e drappeggiarli con un asciugamano chirurgico.
  11. Praticare un'incisione longitudinale di 6-7 cm lungo la linea mediana dell'addome con le forbici chirurgiche per roditori, tagliare la pelle, aprire la parete addominale fino alla cavità addominale ed esporre gli organi addominali. Usa un batuffolo di cotone per spingere delicatamente l'intestino sul lato destro della cavità addominale per esporre la vena cava inferiore dietro di loro.
  12. Utilizzando una siringa, iniettare una soluzione di 1000 U/kg di eparina nella vena cava inferiore. Attendere 5 minuti per garantire un'adeguata eparinizzazione del sangue. L'eparina previene la formazione di microtrombi nell'arteria polmonare.
  13. Taglia la vena cava inferiore del topo con le forbici, dissanguandola. Avviare la ventilazione meccanica dei polmoni con le impostazioni iniziali del ventilatore a un volume corrente di 3 ml/kg, pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 2 cmH2O, frequenza respiratoria di 60 respiri/min e un rapporto I:E di 1:2.
  14. Usa una pinza per sollevare il processo xifoideo; fai un'incisione longitudinale lungo lo sterno dal basso verso l'alto. Usa un divaricatore per costole per esporre la cavità toracica. Rimuovere il tessuto del timo per esporre il cuore e i principali vasi sanguigni sottostanti.
    NOTA: I polmoni di ratto sono fragili; Evitare di toccarli o gli organi addominali con strumenti metallici. Per una migliore visibilità, spingere delicatamente i polmoni da parte con un batuffolo di cotone.
  15. Libera l'aorta del ratto e lo spazio dietro l'arteria polmonare, passa una sutura 3-0 attraverso di essa e fai un nodo sciolto per un uso successivo.
  16. Praticare un'incisione a forma di V di 2-3 mm sulla superficie anteriore del tratto di efflusso del ventricolo destro, inserire una cannula dell'arteria polmonare nell'arteria polmonare attraverso l'incisione e stringere la sutura pre-legata per fissare la cannula (Figura 3B).
  17. Tagliare la punta del cuore di ratto, inserire una pinza emostatica nel ventricolo sinistro, interrompere le valvole tra il ventricolo sinistro e l'atrio sinistro e assicurarsi che il tratto di efflusso atriale sinistro sia libero.
  18. Collegare la cannula dell'arteria polmonare al circuito di perfusione e lavare il sangue residuo a una velocità di 0,6-1 mL/min utilizzando 15 mL di soluzione a basso contenuto di potassio. Sciacquare fino a quando i polmoni diventano bianchi o fino a quando il liquido di perfusione che esce dal ventricolo sinistro diventa bianco.
  19. Posizionare una sutura dietro il cuore e circondare il ventricolo; inserire la cannula del ventricolo sinistro attraverso l'incisione nel ventricolo sinistro; e stringere la sutura pre-legata per fissare la cannula (Figura 3C).
  20. Tagliare la trachea sopra il tubo tracheale, sollevare la trachea e usare le forbici per separare il tessuto connettivo dietro la trachea verso il basso fino al livello del diaframma.
  21. Tagliare la vena cava inferiore e l'arteria polmonare principale sopra il diaframma; rimuovere il cuore e i polmoni (Figura 3D).
  22. Per mantenere i polmoni gonfiati, bloccare immediatamente il terzo inferiore della trachea alla fine dell'inalazione, raccogliere il cuore e i polmoni e metterli in una soluzione a basso contenuto di potassio per la conservazione.
  23. Posizionare il cuore e i polmoni nella posizione designata del circuito EVLP e collegare la cannula del ventricolo sinistro al circuito di perfusione (Figura 4A).

4. Inizializzazione del sistema di perfusione polmonare ex vivo

  1. Assemblare il circuito EVLP: collegare il tubo, l'ossigenatore, il serbatoio, la pompa peristaltica e la camera dell'organo.
  2. Riempire il circuito EVLP con 120 ml di soluzione di riparazione della perfusione polmonare contenente 1000 unità di eparina sodica, 50 mg di cefoperazone e 50 mg di metilprednisolone prima della perfusione. Eliminare eventuali bolle d'aria nel tubo in modo da utilizzare il dispositivo di scarico alla fine della perfusione dell'arteria polmonare.
  3. Impostare il bagnomaria a temperatura ambiente e iniziare a far circolare acqua calda per riscaldare l'intero circuito EVLP.
  4. Aprire il programma di acquisizione dati del computer e collegare il sensore di pressione dell'arteria polmonare, il sensore di peso polmonare, il sensore di velocità della pompa e il sensore di temperatura al circuito EVLP e al registratore.
  5. Riempire il tubo di monitoraggio della pressione sanguigna con soluzione fisiologica, regolare l'altezza del tavolo in modo che corrisponda all'altezza del polmone in dotazione, collegare il tubo di monitoraggio della pressione all'arteria polmonare e al tubo di perfusione venosa, aprire la valvola, avviare il raccoglitore di dati e azzerare il sistema.
  6. Aprire la valvola del gas ipossico, far passare il gas ipossico attraverso il polmone a membrana per 10 minuti fino a quando la soluzione di perfusione raggiunge uno stato ipossico stabile, chiudere la valvola del gas e mettere in pausa la pompa peristaltica, in attesa dell'arrivo del polmone del donatore per la perfusione polmonare ex vivo.
  7. Preparare il tavolo operatorio e gli strumenti chirurgici vicino alla piattaforma EVLP per piccoli animali e pre-sterilizzarli con la sterilizzazione a vapore ad alta pressione.

5. Perfusione polmonare ex vivo

  1. Riempire la trappola per bolle con una quantità sufficiente di soluzione di perfusione per evitare che le bolle entrino nei polmoni (causando embolia gassosa).
  2. Posizionare l'unità cardiopolmonare nella camera dell'organo, collegarla al dispositivo EVLP, accendere il ventilatore e la pompa peristaltica e avviare la perfusione EVLP (Figura 4B).
  3. Iniziare la perfusione al 20% della portata target; aumentare gradualmente la portata fino alla portata target entro 1 ora; calcolare la portata target come il 20% della gittata cardiaca (75 mL/min/250 g di peso del donatore).
  4. Impostare lo scambiatore di calore a 40 °C per mantenere una temperatura polmonare di 37,5 °C. Entro 20 minuti, la temperatura della soluzione di perfusione aumenta da 25°C a 37°C.
  5. Rimuovere il morsetto endotracheale 20 minuti dopo l'inizio della perfusione. Iniziare la ventilazione meccanica con una frequenza respiratoria (RR) di 60 bpm, una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 3 cmH2O e un volume corrente iniziale (VT) di 4 mL/kg, raggiungendo un volume corrente massimo di 6 mL/kg entro 10 minuti.
  6. Avviare il flusso di gas ipossico (8% CO2, 6% O2 e 86% N2) per mantenere la soluzione di perfusione PCO2 che entra nell'arteria polmonare tra 35 e 45 mmHg contemporaneamente durante la ventilazione.
  7. Monitorare costantemente la portata della soluzione di perfusione, la pressione arterovenosa, la pressione di picco delle vie aeree e i parametri di funzionalità polmonare durante la perfusione.

Risultati

È necessario valutare il numero di cellule apoptotiche rilevate mediante colorazione TUNEL, i livelli di marcatori infiammatori (rilevati nel perfusato utilizzando il kit saggio QAH-INF-1) e l'aspetto fisico generale (colorato con ematossilina ed eosina (H&E)) dei polmoni da donatore con cuore battente in tutti i gruppi, al fine di determinare quanto efficacemente l'EVLP abbia preservato i polmoni da donatore DCD. Tutti i polmoni da donatore DCD hanno subito 4 h di perfusione. La maggior parte dei polmoni ha mostrato una compliance stabile, con un graduale decremento osservato nel corso del periodo di 4 h (Figura 5B). Non sono state riscontrate differenze significative nei livelli di resistenza vascolare e di ossigenazione del graft polmonare tra i polmoni da donatore DCD (Figura 5A,C). I livelli di glucosio nel perfusato sono diminuiti nel tempo, senza differenze significative osservate tra ratti singoli (Figura 5D). I livelli di elettroliti nel perfusato sono rimasti simili tra i gruppi (Figura 5E-F).

La colorazione TUNEL è stata eseguita utilizzando la tecnica di etichettatura degli estremi frammentati del DNA mediante transferasi deossinucleotidilica terminali (TdT) con il kit per il rilevamento dell'apoptosi, seguendo le istruzioni del produttore per il rilevamento nucleare delle cellule apoptotiche. La colorazione TUNEL è stata impiegata per quantificare l'apoptosi (morte cellulare programmata) delle cellule epiteliali alveolari nei polmoni donatori da donatore in morte cerebrale (DCD) in diverse condizioni di conservazione. L'analisi in cieco del numero di cellule apoptotiche ha rivelato un numero significativamente maggiore di cellule positive nel gruppo donatore rispetto agli altri gruppi. Inoltre, il gruppo sottoposto a conservazione a freddo ha mostrato un numero maggiore di cellule positive rispetto ai polmoni donatori DCD perfusi con EVLP (Figura 6). Per la valutazione dei campioni istopatologici colorati con ematossilina ed eosina (H&E) sono state utilizzate cinque variabili indipendenti: 1) afflusso di cellule infiammatorie nello spazio alveolare, 2) ispessimento del setto alveolare, 3) emorragia intra ed extra-alveolare, 4) edema intra-alveolare e 5) formazione di membrane ialine. Ogni variabile è stata valutata su una scala da 0 a 4: 0 = assente, 1 = lieve, 2 = moderato, 3 = alto e 4 = severo. La somma dei punteggi ottenuti per ciascuna variabile ha generato il punteggio totale di danno polmonare. Il punteggio di lesione polmonare è significativamente più basso nel gruppo EVLP rispetto al gruppo con conservazione statica a freddo e al gruppo di controllo (Figura 7A). Un ispessimento della parete alveolare e un'emorragia alveolare sono osservabili nel gruppo sottoposto a conservazione statica a freddo per 4 h (Figura 7B). La struttura alveolare normale è mantenuta nel gruppo EVLP (Figura 7C).

Impianto di circolazione extracorporea, ossigenazione mediante membrana, diagramma schematico, metodo sperimentale.
Figura 1: Diagramma e fotografia del circuito per la perfusione polmonare ex vivo (EVLP) in piccoli animali. Le lettere nel diagramma corrispondono a quelle nella fotografia per descrivere la funzione di ciascun componente. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Componenti del sistema di cromatografia; diagramma di connettori metallici, raccordi e parti di tubi.
Figura 2: Cannule su misura. (A) Cannula dell'arteria polmonare. (B) Cannula della trachea. (C) Cannula dell'atrio sinistro. (D) Un set di cannule per la perfusione polmonare ex vivo del ratto. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma della procedura chirurgica su roditore che mostra i passaggi della dissezione cardiovascolare e dell'esposizione degli organi.
Figura 3: Isolamento del polmone di ratto. (A) La cannula tracheale viene posizionata e fissata con un punto di sutura in seta. (B) L'arteria polmonare viene cannullata e legata con il punto di sutura in seta precedentemente posizionato. (C) La cannula nell'atrio sinistro viene fissata con un punto di sutura in seta. (D) Il tessuto connettivo viene dissezionato in modo ottuso per rimuovere il blocco cuore-polmoni. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Impostazione dell'esperimento di perfusione d'organo; A: collegamenti dei tubi, B: organo nella camera di conservazione per la ricerca.
Figura 4: Impianto per la perfusione polmonare del ratto. (A) Il blocco cuore-polmone viene inserito nel circuito di perfusione polmonare ex vivo. (B) Un polmone correttamente ventilato e perfuso collegato al circuito EVLP. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici dei parametri fisiologici nel tempo: PaO2/FiO2, CDyn, PVR, Glucosio, Sodio, Potassio.
Figura 5: Funzione polmonare durante il protocollo EVLP in ratto. (A-F) Analisi della funzione polmonare e dei gas ematici dei polmoni donatori sottoposti a EVLP dopo un periodo ischemico a caldo (WIT) di 1 h. (A) Indice di ossigenazione polmonare. (B) Compliance polmonare dinamica (Cdyn). (C) Resistenza vascolare polmonare (PVR). (D) Livello di glucosio nel perfusato 4 h dopo l'EVLP. (E) Livello di sodio nel perfusato 4 h dopo l'EVLP. (F) Livello di potassio nel perfusato 4 h dopo l'EVLP. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma del saggio TUNEL con colorazione DAPI, confronto tra condizioni DCD, DCD+COLD, DCD+EVLP.
Figura 6: Immagini rappresentative del saggio TUNEL in diversi casi. Cellule TUNEL-positive: fluorescenza verde indica cellule apoptotiche; DAPI: fluorescenza blu rappresenta il nucleo; Merge: tutte le cellule, comprese quelle che subiscono morte cellulare programmata (apoptosi); DCD indica il gruppo con prelievo polmonare diretto. DCD+COLD indica il gruppo sottoposto a 4 h di conservazione statica a freddo. DCD+EVLP indica il gruppo sottoposto a 4 h di perfusione polmonare ex vivo (EVLP). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre del punteggio di danno polmonare e analisi istologica dei tessuti polmonari, rappresentazione dei risultati sperimentali.
Figura 7: Punteggio di danno polmonare e reperti istologici. (A) Il punteggio di danno polmonare nel gruppo di controllo, SCS ed EVLP (*, p <0,05). (B) Sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) rappresentative di donatori sottoposti a conservazione statica a freddo (SCS). La freccia nera indica la rottura dell'epitelio capillare polmonare, mentre le frecce blu indicano l'ispessimento delle pareti alveolari. (C) Sezioni colorate con H&E rappresentative di donatori EVLP. La freccia rossa indica l'infiltrazione di cellule infiammatorie. (D) Sezioni colorate con H&E rappresentative di donatori sottoposti a prelievo diretto (controllo). Le frecce nere indicano rottura e sanguinamento dell'epitelio capillare polmonare. Le barre di errore indicano la deviazione standard; l'analisi di significatività è stata eseguita mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Questo studio introduce un design modulare ed economico per una piattaforma EVLP per piccoli animali e la convalida dell'efficacia di questa piattaforma in un modello di DCD su ratto. I risultati indicano che l'EVLP può migliorare significativamente la qualità dei polmoni da donatori deceduti, ampliando così il pool di potenziali donatori per il trapianto di polmone. La scarsità di polmoni da donatore per il trapianto rimane una sfida critica. Per affrontare questo problema, alcuni paesi hanno iniziato ad attuare programmi DCD28. Questo approccio offre una strategia preziosa per aumentare il numero di innesti di organi vitali. In particolare, diversi studi hanno dimostrato che i tassi di sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di fegato con organi DCD sono paragonabili a quelli con gli organi da DBD29,30. Tuttavia, l'utilizzo di polmoni da donatori di DCD rimane limitato a causa degli ingenti danni causati dall'ischemia prolungata31. La valutazione e l'utilizzo efficienti delle limitate risorse polmonari ottenute dai donatori di DCD hanno un immenso potenziale per alleviare la carenza di polmoni trapiantabili. L'EVLP è una tecnica promettente che può migliorare la qualità dei polmoni e prolungarne il tempo di conservazione prima del trapianto. Per convalidare l'efficacia dell'EVLP rispetto alla conservazione a freddo a 4 °C, abbiamo impiegato un modello di morte circolatoria nel ratto. Ipotizziamo che la nostra tecnica di perfusione possa mitigare il danno causato dal danno da ischemia-riperfusione e migliorare la funzione polmonare dopo la morte circolatoria. I nostri risultati sperimentali sono coerenti con i recenti risultati riportati da Wang et al.32 e Hasenauer et al.33.

Mantenere una temperatura costante in tutto il circuito di perfusione è fondamentale per un funzionamento ottimale dell'EVLP. Tuttavia, molti sistemi EVLP esistenti non dispongono di meccanismi di controllo della temperatura affidabili e adattabili. I singoli sistemi di scambio termico richiedono spesso regolazioni che alterano la temperatura in luoghi specifici. Questa fluttuazione della temperatura può influenzare la composizione del fluido di perfusione, interrompere le misurazioni dell'indice di ossigenazione e, in ultima analisi, compromettere l'accuratezza dei risultati sperimentali. Per superare questa difficoltà, è stato creato un sistema EVLP dotato di tre scambiatori di calore a bagno d'acqua separati che sono stati posizionati nel serbatoio, nelle zone di perfusione dell'arteria polmonare e nella camera dell'organo. Inoltre, il sistema utilizza tubazioni minime per ridurre al minimo la perdita di calore e garantire un controllo preciso della temperatura in un intervallo di 4-40 °C. Questa configurazione consente un controllo della temperatura estremamente accurato, con temperature misurate in ciascun segmento del circuito che non si discostano più di ± 0,2 °C dal set point. Il design soddisfa efficacemente i severi requisiti di controllo della temperatura per gli esperimenti EVLP.

I modelli animali di piccola taglia, a causa dei loro organi più piccoli, sono particolarmente suscettibili all'edema polmonare e all'atelettasia34. Queste complicanze ostacolano in modo significativo l'esecuzione di lunghi esperimenti di perfusione. Per affrontare questa sfida e garantire una protezione polmonare ottimale durante la perfusione, abbiamo adottato l'approccio di Toronto, l'attuale gold standard nella pratica clinica. Questo metodo prevede un aumento graduale sia della portata del perfusato che della ventilazione in un determinato periodo di tempo35. La perfusione è stata avviata al 10% della velocità di flusso target (20% della gittata cardiaca = 75 ml/min/250 g di peso del donatore) e gradualmente aumentata nell'arco di 1 ora. Allo stesso modo, la ventilazione è stata avviata a una velocità bassa (4 mL/kg) e il volume corrente è stato gradualmente aumentato fino a un massimo di 6 mL/kg in 10 minuti. La ricerca evidenzia anche i benefici dell'aggiunta di albumina sierica bovina (BSA) al perfusato. L'integrazione di BSA aumenta la pressione osmotica colloidale, riducendo così l'edema tissutale36. Nell'EVLP per piccoli animali, esistono due configurazioni primarie di perfusione basate sull'incannulamento atriale: ad anello chiuso e ad anello aperto. I sistemi a circuito chiuso mantengono una pressione bassa e costante all'interno degli atri, imitando le condizioni fisiologiche e facilitando misurazioni accurate dei gas nel sangue. Uno studio di Linacr et al. ha dimostrato che il mantenimento di una pressione atriale specifica durante la perfusione può migliorare la funzione polmonare e ridurre l'edema34. Tuttavia, possono verificarsi picchi di pressione se il muscolo atriale ostruisce il circuito. Inoltre, il fissaggio dell'atrio e la presenza di bolle d'aria possono compromettere i risultati sperimentali a causa di potenziali danni alle fibre miocardiche e letture di pressione incoerenti7. Per superare queste limitazioni e ottenere un'efficace perfusione a circuito chiuso, è stata realizzata una cannula atriale appositamente progettata. Questa cannula è dotata di un tutore sporgente sulla punta per prevenire l'ostruzione del muscolo atriale. Inoltre, le scanalature anulari lungo il corpo della cannula facilitano il posizionamento sicuro della legatura. Inoltre, il sistema incorpora trappole a bolle d'aria e tecniche di pre-perfusione per eliminare l'embolia gassosa e mantenere costante la pressione di perfusione.

Le piattaforme EVLP per piccoli animali sono favorite nella ricerca scientifica per i loro numerosi vantaggi: condizioni controllate degli animali, economicità, sistemazione di campioni di grandi dimensioni e basso consumo di liquidi di perfusione. Inoltre, l'utilizzo di un singolo ceppo animale di piccola taglia (ad esempio, ratti in questo studio, ma anche porcellini d'India e conigli 24,35,36) consente un controllo meticoloso sia della dieta che delle impostazioni sperimentali. La versatilità del sistema consente l'adattamento di tutte queste specie regolando i parametri respiratori e la velocità del flusso di perfusione. I video di accompagnamento descrivono in dettaglio il modello animale e le procedure EVLP, fornendo ai ricercatori una comprensione completa. Seguendo questi protocolli, i ricercatori possono migliorare il successo degli esperimenti, ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre l'uso complessivo degli animali.

Sebbene la ricerca abbia stabilito un sistema EVLP economico, modulare e facile da usare per piccoli animali che supera le opzioni commerciali in termini di stabilità, qualità della perfusione e regolabilità, sono necessarie ulteriori indagini per ottimizzare i protocolli EVLP, compresi i parametri di perfusione e ventilazione, e identificare i farmaci protettivi per i polmoni più efficaci. Questa tecnologia facile da usare ed efficiente ha permesso di eseguire test di successo su molti polmoni di donatori sfruttando l'infrastruttura. Gli attuali sforzi di ricerca si concentrano sul ripristino e la conservazione dei polmoni da donatori.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National National High-Level Hospital Clinical Research Funding e dal progetto Elite Medical Professionals del China-Japan Friendship Hospital (numeri di sovvenzione[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] e [ZRJY2021-GG07]).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3.0mm Tubo asettico medicoZhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, Cina3.0mmNella circolazione del sangue, piuttosto che dei vasi sanguigni
Albumina sierica bovinaSigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Shanghai, CinaBSAV-ROMigliorare la pressione osmotica colloidale del
trasduttore di pressione sanguigna intravascolare BP-100/102iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USABP-100/102Registrazioni della pressione vascolare polmonare nei ratti
CefazolinBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pechino, CinaPHR1291Infezione antibatterica
DeossigenatoreDongguan Kewei Medical Instrument, Guangdong, CinaNessuna specifica del modelloSostituire la funzione polmonare del ratto Scambio di gas nel sangue
F500 Macchina per anestesia generale per piccoli animaliBeijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Pechino, CinaF500Somministrare l'anestesia gassosa per la fornitura di anestesia
Miscela di gas (6% O2, 8% CO2, 86% N2)Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Pechino, CinaNessuna specifica del modelloMantenere l'equilibrio acido-base del sangue, simula la fisiologia vascolare polmonare
Scambiatore di caloreChanghong Precision Instrument Center, Shenzhen, CinaDHC-05-BControllo della temperatura nel circuito di perfusione
eparinaPechino psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pechino, CinaH0200000Anti-micro trombosi
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, CinaR510-22 R510-22Ratti anestetizzati
Camera di isolamentoFatta a mano di Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, CinaNessuna specifica del modelloConservazione dei polmoni di ratto
i-STAT 1 Analizzatore clinico portatileAbbott point of care, Inc, NJ, USA300GL'analisi dei gas ematici in perfusione
iWorx RA-834 RegistratoreiWorx Systems, Inc, New Hampshire, USARA-834Uscita del segnale di pressione dei vasi sanguigni polmonari
Pompa peristaltica multicanale LabMateZhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, CinaLabMate2Fornisce energia per il processo di circolazione della perfusione
PERFADEX PlusXVIVO Perfusion, Göteborg, SveziaNAIl polmone del donatore di ratto è stato sottoposto a prelavaggio; soluzione a basso contenuto di potassio
cannula polmonareIn acciaio inossidabile304 Acciaio inossidabile/SUS3042,0/2,5 mm
Cannula per vene polmonariIn acciaio inossidabile304 Acciaio inossidabile 304/SUS3044,0 mm
Kit di test QAH-INF-1Innopsys, Parcd'Activité s Activestre
R415 Ventilatore per piccoli animaliRWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, CinaR415La ventilazione del polmone di ratto
SerbatoioShanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, CinaCapacità 1 LStoccaggio di perfusione
SOLU-MEDROLPechino psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pechino, CinaM0639NA
Sensore di temperatura (TM-100)iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USATM-100Registra la temperatura di perfusione polmonare
di perfusione

Riferimenti

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