Method Article

Integrazione della flessibilità e della dinamica della struttura della proteina bersaglio nella scoperta di farmaci computazionali utilizzando l'analisi di docking basata su ensemble

DOI:

10.3791/67174

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I metodi computazionali sono promettenti per accelerare la scoperta di farmaci, ma spesso trascurano la natura dinamica delle strutture proteiche. In questo articolo, discutiamo dell'analisi di docking basata su ensemble per incorporare indirettamente la flessibilità delle proteine, migliorando potenzialmente l'accuratezza e l'affidabilità degli sforzi di scoperta farmacologica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il processo di scoperta di farmaci è un'operazione rigorosa, dispendiosa in termini di tempo e costosa. L'approccio computazionale nella scoperta di farmaci consente ai ricercatori di dare priorità ai composti più promettenti per ulteriori test, il che ridurrebbe notevolmente le risorse necessarie, portando a un aumento dell'efficienza complessiva nelle pipeline di scoperta farmacologica. La scoperta di farmaci basata sulla struttura è un approccio comune che richiede le informazioni strutturali della proteina bersaglio in un formato tridimensionale. Tuttavia, l'attuale limite della maggior parte delle strategie di scoperta di farmaci assistite da computer è la loro incapacità di introdurre la flessibilità e la dinamica della struttura della proteina bersaglio durante la simulazione di docking ligando-proteina. Mentre sia il docking indotto che il docking basato sull'ensemble mirano ad affrontare la flessibilità delle proteine nella procedura di docking, quest'ultimo può fornire una visione più completa del comportamento dinamico delle proteine incorporando più conformazioni durante la simulazione. In questo rapporto, dimostriamo e discutiamo l'applicazione di una tecnica chiamata analisi di docking basata su ensemble che introduce indirettamente la flessibilità e la dinamica della struttura della proteina bersaglio nel processo di docking molecolare. La proteina e il ligando selezionati per gli studi di docking basati su ensemble erano rispettivamente il lisozima e la flovokawaina B (FB). In precedenza è stato segnalato che FB ha attività di legame con il lisozima. È stata eseguita una simulazione di dinamica molecolare (MD) sul lisozima in presenza di acqua e sono state esaminate l'energia totale, la deviazione quadratica media (RMSD) e la fluttuazione quadratica media (RMSF). Il clustering delle conformazioni è stato generato sulla base di diversi valori di cutoff di clustering ed è stato scelto per un'ulteriore analisi di docking con FB. Il cluster n. 2 fornisce l'energia di legame più bassa a -29,37 kJ/mol. Sono state generate immagini di docking molecolare per anticipare la presenza di forze di legame. Incorporando le dinamiche strutturali della proteina, l'approccio di docking basato sull'ensemble può catturare meglio la gamma di possibili scenari di legame, portando a previsioni più affidabili dei risultati di legame.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nella scoperta computazionale di farmaci (CDD), le tecniche di informatica, chimica, biologia e fisica sono integrate per esplorare un vasto spazio chimico, prevedere le interazioni farmaco-bersaglio e ottimizzare i farmaci candidati con maggiore efficienza e costi inferiori rispetto ai soli metodi sperimentali tradizionali. Si tratta di un approccio potente che sfrutta metodi computazionali e algoritmi per accelerare la scoperta e l'ottimizzazione di nuovi composti terapeutici 1,2,3. Il CDD ha rivoluzionato la scoperta di farmaci. Tuttavia, ci sono limitazioni associate alla dinamica della struttura tridimensionale delle proteine (3D) che possono influenzare l'accuratezza e l'affidabilità delle previsioni computazionali4. Le strutture proteiche 3D fungono da modelli in CDD per la progettazione o ottimizzano i farmaci candidati in base alle interazioni proteina-farmaco bersaglio. Mentre i modelli di cristallografia a raggi X delle strutture proteiche forniscono preziose informazioni strutturali sulle proteine, è essenziale riconoscere la natura dinamica delle strutture proteiche e i limiti dei modelli statici 5,6,7. Inoltre, i recenti progressi nella microscopia crioelettronica (cryo-EM) e le previsioni computazionali come AlphaFold hanno notevolmente ampliato la disponibilità di dati strutturali nel catturare l'intero spettro della flessibilità e della dinamica delle proteine 8,9,10,11,12.

Le simulazioni di dinamica molecolare (MD) simulano il movimento e le interazioni di atomi e molecole nel tempo, fornendo informazioni sul comportamento dinamico e sulla flessibilità della struttura 3D delle proteine13,14. Le simulazioni MD vengono utilizzate per generare strutture 3D di proteine che rappresentano vari stati conformazionali, che fungono da input per l'analisi di docking basata su ensemble. Attraverso il campionamento di diverse conformazioni proteiche, l'analisi di docking basata su ensemble tiene conto della flessibilità e della dinamica intrinseche dei bersagli biologici, consentendo un'esplorazione più completa delle modalità e delle interazioni di legame del ligando3.

Comprendere la flessibilità delle proteine è essenziale, in quanto influenza il modo in cui i farmaci esercitano i loro effetti biologici, determina la posizione e l'orientamento dei siti di legame e influenza la cinetica di legame, il metabolismo e il trasporto15,16. L'acquisizione di questa natura dinamica può migliorare significativamente l'accuratezza e l'affidabilità delle previsioni di attracco. Nel 1994, Kearsley et al. hanno introdotto una tecnica di docking flessibile, una struttura che modella la flessibilità sia dei ligandi che delle proteine. Questo approccio consente alla conformazione della proteina di adattarsi durante l'aggancio, migliorando le previsioni delle interazioni ligando-recettore tenendo conto della flessibilità strutturale17. Allo stesso modo, nel 1999, Carlson et al. hanno riferito sull'ensemble docking, che applica la modellazione farmacoforica flessibile a modelli statici e dinamici dell'integrasi HIV-1, evidenziando ulteriormente l'importanza di tenere conto della dinamica delle proteine negli studi di docking18. Inoltre, Cavasotto et al. hanno anche riportato il miglioramento dell'accuratezza del docking del ligando incorporando la flessibilità del recettore nel processo di docking utilizzando l'analisi in modalità normale19. Più recentemente, le tecniche basate sull'ensemble 20,21,22,23,24,25,26,27 hanno ampliato la scoperta di farmaci identificando potenziali nuovi siti di legame del ligando e fornendo stime più accurate dell'energia libera di legame ligando-recettore. Questi progressi sono stati applicati a bersagli come il DNA20 quadruplex-duplex, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare 165 (VEGF-165)21, l'enzima bersaglio SARS-CoV-222, gli enzimi23 del citocromo P450 del fegato umano e le proteine antitumorali24.

È stato documentato che la flavokawaina B (FB), classificata come flavonoide, presenta varie proprietà farmacologiche 28,29,30. Sulla base di analisi sperimentali e computazionali, è stato riportato che FB forma un complesso stabile con il lisozima (LYZ)31, una proteina ampiamente riconosciuta per la sua attività antimicrobica ed è stata anche identificata come trasportatore di ligandi 32,33,34. In questo rapporto, analizziamo ulteriormente la natura dell'interazione di FB con LYZ utilizzando l'analisi di docking basata su ensemble per incorporare l'impatto della flessibilità proteica nella formazione del complesso FB-LYZ. L'obiettivo di questo metodo è fornire ai ricercatori un processo ripetibile e passo-passo per l'analisi del docking basata su ensemble. Inoltre, è consigliabile che i ricercatori selezionino le strutture proteiche dall'organismo bersaglio per la ricerca.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione della struttura del ligando Flavokawain B

  1. Apri il sito web di PubChem. Cerca Flavokawain B. Selezionare Scarica e selezionare Salva per struttura 2D SDF come SDF Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL.
  2. Apri il software Avogadro. Sposta il file SDF nello spazio vuoto del software. Fare clic su Sì.
    NOTA: Il software Avogadro costruirà automaticamente una geometria tridimensionale (3D).
  3. Nella scheda, fare clic sull'icona, come illustrato nella Figura 1. Nella scheda del menu a sinistra, modificare il campo di forza in MMFF9435,36. Regola i passaggi per aggiornamento a 15. Imposta l'algoritmo su Discesa più ripida e fai clic su Avvia.
    NOTA: Non spostare alcun atomo mentre la rotazione è in corso. Al termine, fare clic su Stop. MMFF94 è adatto per un'ampia gamma di ligandi a piccole molecole (sia neutri che carichi) ed è ampiamente utilizzato per la minimizzazione dell'energia e la modellazione molecolare37. Il metodo di discesa più ripida viene scelto per la minimizzazione iniziale dell'energia perché è semplice, efficiente dal punto di vista computazionale ed efficace per rimuovere grandi deformazioni strutturali e raggiungere uno stato di minimizzazione di base 38,39,40.
  4. Nella scheda del menu, vai su File e fai clic su Salva con nome. Quando viene visualizzata una cartella Salva molecola con nome , scrivere il nome del file come ligand.pdb e fare clic su Salva.

2. Preparazione della struttura della proteina del lisozima

  1. Apri il sito web della banca dati delle proteine RCSB. Cerca lisozima, codice: 1LYZ. Fare clic su Scarica file e selezionare Formato PDB. Salvare con nome 1lyz.pdb.
  2. Apri il software Chimera. Nella scheda, fare clic su File e apri. Nella cartella selezionare il file 1lyz.pdb .
    NOTA: Una struttura 3D del lisozima sarà costruita utilizzando un software.
  3. Nella scheda, fare clic su Seleziona > residuo > HOH. Quindi fare clic su Azioni > Atom/Legami > Elimina. Fare clic su Seleziona e Cancella selezione.
    NOTA: Questo rimuoverà l'acqua dalla proteina.
  4. Nella scheda, fare clic su Seleziona > catena > A. Quindi fare clic su Strumenti > Modifica struttura > AddH. Verrà visualizzata una casella dei parametri che lo lascerà come predefinito. Fare clic su OK. Fare clic su Seleziona (Select ) e su Cancella selezione (Figura 2).
    NOTA: Questo aggiungerà idrogeno alla proteina. Il residuo di istidina viene anche protonato per creare un sistema neutro. Il software può eseguire calcoli pKa integrando PROPKA41,42.
  5. Nella scheda, quindi fare clic su Strumenti, Modifica struttura e Aggiungi carica. Uscirà una casella dei parametri; selezionare Gasteiger. Fare clic su OK. NOTA: Questo aggiungerà cariche parziali alla proteina.
  6. Per salvare il file, nella scheda fare clic su File > Salva PDB. Salva come protein.pdb.
    NOTA: In questo studio, la struttura del lisozima è stata scelta per confrontarla con il risultato31 precedentemente riportato. Si consiglia ai lettori di selezionare attentamente le strutture proteiche dell'organismo bersaglio di loro interesse.

3. Simulazione MD del lisozima in acqua

NOTA: I computer personalizzati per la simulazione di dinamica molecolare (MD) utilizzati in questo studio sono Intel CORE i7 11th Gen per CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 per GPU e memoria DDR4 da 128 GB. Il sistema operativo è Ubuntu 22.04.4 LTS. La simulazione MD utilizza il software GROMACS. Il supporto GPU è CUDA.

  1. Scarica tutti i documenti necessari da questo link: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (GROMACS Tutorial, Lysozyme in Water)43.
    NOTA: I documenti necessari sono em.mdp, ions.mdp, md.mdp, npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff e protein.pdb (dal passaggio 2.5). Per la configurazione del sistema, em.mdp serve per la minimizzazione dell'energia e ions.mdp serve per aggiungere ioni e neutralizzare il sistema. Per l'equilibrio, nvt.mdp è per l'equilibrio della temperatura, mentre npt.mdp è per l'equilibrio della pressione. Per la produzione, md.mdp è per la simulazione. Charmm36 ff sta per topologia.
  2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo spazio vuoto nella cartella (la directory di lavoro) e fare clic su Apri terminale. Digita gmx per aprire il software GROMACS. NOTA: GROMACS non dispone di un'interfaccia utente grafica; È tutto dal comando scritto sul terminale.
  3. Per la generazione della topologia proteica, digitare gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh. Viene fornito un elenco di campi di forza e il tipo 1 per il campo di forza CHARMM all-atom44, seguito dal tipo 1 per TIP3P per il modello dell'acqua.
    NOTA: È disponibile anche la versione aggiornata, CHARMM36, scaricabile dal http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml45.
  4. Definisci una casella cubica per coprire l'intera struttura proteica. Digita gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic. NOTA: La proteina viene posizionata ad almeno 1 nm dal bordo della scatola. Assicurati che le dimensioni della scatola dell'acqua siano sufficientemente grandi per proteine, solventi e ioni. Inoltre, la scatola dell'acqua dovrebbe essere adeguata per evitare interazioni tra le immagini periodiche della proteina. La distanza minima raccomandata tra la proteina e il bordo della scatola è di almeno 1,0-1,5 nm.
  5. Per la configurazione del solvente46, digitare gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
  6. Aggiungi ioni come sodio e/o cloruro digitando gmx solvato -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
    NOTA: Gli ioni sodio e/o cloruro sono/vengono utilizzati per neutralizzare il sistema.
  7. Neutralizza il sistema digitando gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral. Selezionare 13 per il gruppo SOL.
    NOTA: Per il lisozima, 8 molecole di soluto sono state sostituite con ioni cloruro (Figura 3).
  8. Nel file CHARMM 36, cercare la cartella ions.itp . L'abbreviazione di ione cloruro è CLA.
  9. Aprire topol.top file, aggiungere CLA e il numero 8 come mostrato nella Figura 4.
  10. Aprire il file solv_ions.gro e scambiare tutti i CL in CLA.
    NOTA: Assicurati che i file solv_ions.gro e topol.top abbiano la stessa abbreviazione dei rispettivi ioni, altrimenti verrà visualizzato un avviso. La ridenominazione del nome dello ione è conforme alla versione del file CHARMM 36 ff. Poiché l'abbreviazione di cloruro è già CL, non è necessario rinominare gli ioni nella versione precedente. Tuttavia, controlla sempre l'abbreviazione degli ioni.
  11. Rilassa la struttura proteica riducendo al minimo l'energia della discesa più ripida con il numero massimo di 50.000 passi. Per questo, digita gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr seguito da gmx mdrun -v -deffnm em.
    NOTA: Il solvente e gli ioni sono equilibrati attorno alla proteina in due fasi: (i) il numero di particelle (N), il volume del sistema (V) e la temperatura (T) sono costanti (NVT) e (ii) il numero di particelle (N), la pressione del sistema (P) e la temperatura (T) sono costanti (NPT). L'accoppiamento di temperatura (fase NVT) è impostato a 300 K in base a un termostato Berendsen modificato, mentre l'accoppiamento a pressione (fase NPT) è impostato a 1 bar in base a Parrinello-Rahman. Le interazioni elettrostatiche a lungo raggio e la ricerca del vicino più vicino vengono calcolate automaticamente utilizzando rispettivamente il metodo di Ewald (PME) a maglia di particelle e l'algoritmo Verlet.
  12. Per l'equilibrio di NVT, digitare gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr seguito da gmx mdrun -v -deffnm nvt.
    NOTA: Il tempo impiegato per l'equilibratura della temperatura è di circa 5 minuti, a seconda della CPU e della GPU. Per l'equilibrio del sistema, il tempo di simulazione è di 100 ps.
  13. Per l'equilibrio di NPT, digitare gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr seguito da gmx mdrun -v -deffnm npt.
    NOTA: Il tempo impiegato per l'equilibratura della pressione è di circa 5 minuti, a seconda della CPU e della GPU. Per l'equilibrio del sistema, il tempo di simulazione è di 100 ps.
  14. Fare in modo che il sistema esegua le esecuzioni di equilibramento per 1 ns seguite dall'esecuzione di produzione utilizzando la funzione mdrun con una durata di 100 ns. Apri il file md.mdp. A n passi, passare a 50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. Per la produzione di dinamica molecolare, digitare gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr seguito da gmx mdrun -v -deffnm md.
    NOTA: Il tempo per questo è di circa ~2 giorni. I frame di traiettoria generati dalla simulazione MD vengono acquisiti a intervalli di 10 ps e utilizzati per l'analisi di clustering basata sulla deviazione quadratica media (RMSD) della radice.

4. Analisi di clustering basata su RMSD

  1. Dopo la simulazione MD, continuare con l'analisi dei comandi. La proteina si diffonderà attraverso la cellula unitaria e potrebbe apparire "rotta" o "saltare" dall'altra parte della scatola. Digita gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -il tuo compatto. Tipo 1 per centrare la proteina e 0 per l'output del sistema. Digita vmd em.gro per visualizzare la proteina.
  2. Per l'analisi dell'energia totale, digitare gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg e continuare a digitare 14 per l'energia totale.
    NOTA: Il monitoraggio dell'energia totale è fondamentale per garantire l'affidabilità e la correttezza delle simulazioni MD47,48.
  3. Per l'analisi RMSD, digitare gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns. Continuare a digitare 3 per il C-alfa dell'adattamento dei minimi quadrati e 3 per il C-alfa del calcolo RMSD (Figura 5).
  4. Per l'analisi RMSF, digitare gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res. Continuare con il tipo 1 per le proteine.
  5. Per utilizzare la grazia, digitare questo comando xmgrace totalenergy.xvg. Regolare gli assi facendo doppio clic sulla linea della casella del grafico. Apparirà una casella Grace: Axes . Fare clic su Accetta.
  6. Nel menu delle schede, fare clic su File e Print_setup. A Grace: Apparirà la configurazione del dispositivo . Cambia il dispositivo da PostScript a JPEG. Fare clic su Accetta. Ora fai clic su Stampa nel menu file. Salva con totalenergy.jpg.
  7. Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6 per xmgrace rmsd.xvg e xmgrace rmsfxvg.
  8. Per l'analisi dei cluster, digitare gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0. Continuare con il tipo 1 (gruppo proteico) per calcolare l'adattamento dei minimi quadrati e l'RMSD e il tipo 1 (gruppo proteico) per l'output del sistema.
    NOTA: Regolare il valore di cutoff in base al risultato del clustering. Il comando -cl rappresenta gli output della media per ogni cluster.
  9. Aprire cluster-size.xvg.
    1. In base alle informazioni fornite, aumentare il valore di cutoff RMSD se il numero di cluster è basso o diminuire il valore di cutoff RMSD se il numero di cluster è alto.
  10. Ripetere il passaggio 4.8 con valori di cutoff diversi.
    NOTA: Raggruppamento con valori di cutoff diversi fino a quando non è stato determinato un valore di cutoff RMSD ottimale in base ai seguenti criteri: (1) Il numero totale di cluster dovrebbe essere limitato a meno di 30. (2) È preferibile ridurre al minimo la presenza di cluster con un solo membro. (3) È auspicabile che oltre il 90% della traiettoria sia rappresentato in meno di 10 cluster.
  11. Apri il software Chimera e cerca cluster.pdb.
    NOTA: cluster.pdb contiene una media per ogni gruppo di cluster.
  12. Fare clic su Regali e pubblicazione 1 (silhouette, nastro arrotondato).
  13. Quindi, vai su File > Salva immagine > Salva.
  14. Fare clic su Seleziona > catena > (senza ID) > cluster.pdb . Fare clic su Seleziona (Select ) > Inverti (tutti i modelli). Fare clic su Azioni > Atomi/Legami > eliminare.
    NOTA: Questa operazione rimuoverà tutti i cluster di gruppi ad eccezione del cluster 1.
  15. Quindi, vai su File > salva PDB > salva. Salvare come cluster1.pdb.
  16. Ripetere i passaggi da 4.11 a 4.15 per cluster diversi. Salvare come cluster2.pdb, cluster3.pdb e cluster4.pdb.
    NOTA: Poiché il numero totale dei primi 4 cluster è superiore al 90% delle traiettorie totali, ogni rappresentante dei primi 4 cluster viene estratto e sottoposto ad analisi di docking molecolare utilizzando Chimera (vedi Figura 6).

5. Docking basato su ensemble

  1. Fare doppio clic sul software Autodock Tools .
    NOTA: Per l'attracco, questo studio ha utilizzato il software AutoDock e AutoDock tools 13,49,50,51.
  2. Inserire i file cluster1.pdb e ligand.pdb in una nuova cartella.
  3. Nel menu, fare clic su File > Preferenze > Imposta. Verrà visualizzata una finestra Imposta preferenze utente . Copia l'indirizzo della "nuova cartella" come testo. Incolla l'indirizzo nella directory di avvio nella casella Imposta preferenze utente . Fai clic su Imposta.
    NOTA: Questo è un passaggio importante se si utilizza il sistema operativo Windows.
  4. Fare clic sull'immagine blu della cartella. Verrà visualizzata una cartella della molecola letta . Selezionare cluster1.pdb.
    NOTA: Gli strumenti Autodock leggeranno la struttura molecolare della proteina.
  5. Fai clic su Modifica > addebiti > Aggiungi addebiti Kollman. Quindi fare clic su OK. Fare clic su Modifica > idrogeni > Unisci non polare.
    NOTA: Alla proteina vengono aggiunte cariche di Kollman.
  6. Fare clic su Griglia > macromolecole > scegliere. Verrà visualizzata la casella Scegli macromolecole . Selezionare cluster1 e fare clic su Seleziona molecole. Fare clic su OK. Apparirà un file di macromolecola AutoDock4 modificato . Salvare con nome cluster1.pdbqt.
  7. Svuotare l'area di lavoro facendo clic su Modifica > Elimina > Elimina tutte le molecole. Fai clic su Continua.
  8. Fare clic su Ligando > input > Apri.  Apparirà un file Ligand per la cartella Autodock4 . Scegliere Tutti i file, selezionare ligand.pdb e fare clic su Apri. Fare clic su OK.
    NOTA: Il legante di configurazione includerà l'incorporazione di cariche di Gasteiger e la fusione di idrogeno non polare.
  9. Fare clic su Ligando > Albero di torsione > Rileva radice.
  10. Fare clic su Ligando > Output > Salva come PDBQT. Apparirà una cartella Formatted Autotors Molecules . Salva come ligand.pdbqt.
  11. Svuotare l'area di lavoro facendo clic su Modifica > Elimina > Elimina tutte le molecole. Fai clic su Continua.
    NOTA: Seguire la stessa procedura descritta al punto 5.6.
  12. Fare clic su Griglia > macromolecole > Apri. Selezionare cluster1.pdbqt e fare clic su Apri. Fare clic su Sì. Fare clic su OK.
  13. Fare clic su Griglia > impostare i tipi di mappa > aprire il ligando. Selezionare ligand.pdbqt e fare clic su Apri.
    NOTA: Nell'area di lavoro sono presenti proteine e ligandi.
  14. Fare clic su Griglia e Casella griglia. Apparirà una finestra Opzioni griglia . In Numero di punti nella dimensione x, regolare il parametro su 120 e impostare Numero di punti nella dimensione y su 120, impostare Numero di punti nella dimensione z su 120. Impostare la spaziatura (angstrom) su 0,375. Lasciate i parametri della casella della griglia centrale come predefiniti. Fare clic su File e chiudere Salvataggio corrente.
    NOTA: La scatola della griglia copre l'intera proteina, il che significa che si tratta di un ancoraggio cieco.
  15. Fare clic su Griglia > Output > Salva GPF. Apparirà un file di output dei parametri della griglia . Nel nome del file, digita grid.gpf e fai clic su Salva.
  16. Fare clic su Esegui ed eseguire AutoGrid. Verrà visualizzata la casella Esegui griglia automatica . Nella scheda Nome file parametro , fare clic su Sfoglia. Apparirà un file di parametri Autogrid . Selezionare grid.gpf. Fare clic su Apri. Al percorso del programma > sfogliare. Apparirà un file autogrid4 . Cerca autogrid4.exe e fai clic su Apri > Avvia.
    NOTA: Assicurarsi che il nome della cartella non contenga spazi, in quanto ciò potrebbe causare un errore durante l'esecuzione. La cartella autogrid4.exe può essere installata da https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  17. Fare clic su Ancoraggio > macromolecole > impostare nomi file rigidi. Apparirà un file PDBQT Macromolecules . Selezionare cluster1.pdbqt e fare clic su Apri.
  18. Fare clic su Docking > ligand > scegliere. Viene visualizzata la casella Scegli ligandi . Selezionare il ligando e fare clic su Seleziona ligando. Apparirà una casella Parametro ligando AutoDpf4 . Fare clic su Accetta.
  19. Fare clic su Docking > Parametro di ricerca > Algoritmo genetico. Apparirà una casella Parametri dell'algoritmo genetico . Cambia il numero di esecuzioni GA a 100. Lasciate i parametri rimanenti come predefiniti. Fare clic su Accetta.
  20. Fare clic su Ancoraggio > Output > Lamarckian GA(4.2). Apparirà un file di output dei parametri di aggancio Autodock4.2 GALS . Per il nome del file, digitare docking.dpf e fare clic su Salva.
  21. Fare clic su Esegui > Esegui AutoDock. Verrà visualizzata la casella Esegui Autodock . In Nome file parametro, fare clic su Sfoglia. Viene visualizzato un file di parametri autodock4 . Selezionare docking.dpf. Fare clic su Apri. In Nome percorso programma , fare clic su Sfoglia. Verrà visualizzato un file autodock4 . Cerca autodock4.exe e fai clic su Apri. Fare clic su Avvia.
    NOTA: Assicurarsi che il nome della cartella non contenga spazi, in quanto ciò potrebbe causare un errore durante l'esecuzione. Il tempo impiegato è di ~30 minuti. La cartella autodock4.exe può essere installata utilizzando il link: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. Eliminare tutte le molecole come descritto nel passaggio 5.7.
  23. Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.22 per cluster2.pdb, cluster3.pdb e cluster4.pdb.
    NOTA: Tutti e 4 i gruppi di aggancio verranno utilizzati per l'analisi.

6. Analisi di docking basata su ensemble

  1. Utilizzare il software AutoDock Tools per continuare l'analisi. Fare clic su Analizza > ancoraggio > Apri. Verrà visualizzato un file di registro di ancoraggio. Selezionare docking.dlg e fare clic su Apri. Quindi, fare clic su OK.
  2. Fare clic su Analizza > macromolecole > aprire.
  3. Fare clic su Analizza > conformazioni > Gioca, classificata in base all'energia. Apparirà una scatola del ligando.
  4. Nella nuova cartella, aprire la cartella docking.dlg utilizzando un blocco note. Ricerca di analisi cluster di conformazione. Dalle informazioni fornite, cerca la corsa di conformazione (indicata come Run), che ha l'energia di legame più bassa.
    NOTA: Poiché ci sono 100 conformazioni eseguite, solo una ha la più forte affinità di legame tra ligando e proteina. Il termine per l'energia di legame più bassa è definito come avente un'affinità di legame più forte 52,53,54.
  5. Dal passaggio 6.3 (scatola del ligando ), inserire la conformazione (dal passaggio 6.4) e premere Invio.
    NOTA: Il ligando si posizionerà di conseguenza all'interno della proteina.
  6. Nella casella del ligando , fare clic sul pulsante apri pannello per modificare l'opzione di riproduzione. Apparirà la casella Imposta opzione di riproduzione. Fare clic su Scrivi complesso. Apparirà un complesso di scrittura della cartella del recettore . Salvare come complex.pdb.
    NOTA: poiché sono presenti 4 gruppi di cluster, il file complex.pdb può essere denominato di conseguenza, ad esempio complex1.pdb per il gruppo di cluster 1.
  7. Apri il software Chimera e cerca complex.pdb (come nel passaggio 6.6).
  8. Fare clic su Preimpostazioni > Interattivo 1 (barre multifunzione) > Pubblicazione 1 (silhouette, barra multifunzione arrotondata).
  9. Quindi vai su File e fai clic su Salva immagine.
    NOTA: L'immagine salvata è la struttura a nastro del complesso FB-LYZ.
  10. Fare clic su Preimpostazioni > Interactive 3 (superficie idrofobica) > Pubblicazione 1 (silhouette, nastro arrotondato).
    NOTA: L'immagine salvata è la struttura a pallone del complesso FB-LYZ.
  11. Aprire il software Discovery Studio.
  12. Trascinare il file complex.pdb nello spazio vuoto del software.
  13. Fare clic sulla scheda Strumenti e selezionare Mostra diagramma 2D.
    NOTA: Il software genererà automaticamente la struttura 2D del complesso (Figura 7).
  14. Fare clic su File e Salva con nome. Scrivi il nome del file e fai clic su Salva.

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Results

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La struttura chimica e la rappresentazione strutturale 3D di FB dopo l'ottimizzazione sono mostrate nella Figura 8A. La Figura 8B mostra la struttura 3D del lisozima con codice pdb 1LYZ allo stato iniziale prima della simulazione MD. Al fine di studiare la dinamica e la flessibilità della struttura 3D del lisozima, è stata condotta una simulazione MD per 100 ns. L'energia totale della struttura proteica è rimasta stabile durante ...

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Discussion

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L'applicazione basata su ensemble nella scoperta di farmaci computazionali comporta l'utilizzo di numerosi insiemi conformazionali derivati da strutture cristalline, studi di risonanza magnetica nucleare (NMR) o simulazioni di dinamica molecolare26. Lo sfruttamento di più conformazioni computazionali consentirebbe all'analisi di incorporare la dinamica e la flessibilità della struttura di una proteina, portando al miglioramento dell'accuratezza e dell'affidabilità...

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione RMF dell'Universiti Malaya, progetto numero RMF1392-2021 dell'Universiti Malaya.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoDockThe Scripps Research Institute, Stati UnitiVersione 4.2.6
AutoDock ToolsThe Scripps Research Institute, Stati UnitiVersione 1.5.6
AvogadroGeoffrey R Hutchison, Dipartimento di Chimica, Università di Pittsburgh, Pittsburgh, USAVersione 1.95
Discovery StudioDassault Systè mes, Massachusetts, Stati UnitiVersione 2021
GROMACsUniversità di Groningen
Royal Institute of Technology
Università di Uppsala, Svezia		Versione 2023
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization, and Informatics
Università della California		Versione 1.16

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