Screening di frammenti covalenti mediante il saggio di tethering quantitativo irreversibile

Summary

Il saggio di tethering irreversibile quantitativo (qIT) è un metodo basato sulla fluorescenza per identificare frammenti covalenti che interagiscono selettivamente con una proteina bersaglio. Qui, viene delineato un protocollo dettagliato per descrivere il test qIT, con risultati di esempio inclusi.

Abstract

I composti che formano legami covalenti con specifiche proteine bersaglio offrono una serie di vantaggi come sonde chimiche e agenti terapeutici. Più comunemente, piccole molecole elettrofile leggermente reattive sono impiegate per formare legami covalenti con catene laterali di cisteina selezionate in proteine specifiche. Gli approcci elettrofili per la scoperta di ligandi, in base ai quali una libreria di piccole molecole elettrofile vengono sottoposte a screening rispetto a un bersaglio proteico, sono diventati popolari in quanto evitano la necessità di un'installazione a valle di una testata elettrofila. Tale screening è complicato, tuttavia, poiché i ligandi elettrofili possono mostrare un'ampia gamma di diversi tassi di reazione spontanea con le cisteine. Il tethering quantitativo-irreversibile (qIT) offre un metodo basato sulla fluorescenza per l'identificazione e lo sviluppo dei colpi che normalizza i dati per queste differenze nella reattività intrinseca dei composti. Le velocità di reazione dei singoli composti con una proteina bersaglio sono determinate e confrontate con la reattività dei composti con il tripeptide glutatione non strutturato (che è un proxy per la reazione spontanea dei composti), consentendo l'identificazione dei composti che reagiscono preferenzialmente con la proteina di interesse. Questa metodologia è stata applicata con successo per identificare frammenti covalenti selettivi contro diversi bersagli farmacologici, tra cui la proteasi principale di SARS-CoV-2, la chinasi ciclina-dipendente 2 e RAP27A. Qui, dimostriamo l'applicazione di qIT a una proteina bersaglio per generare un set di dati quantitativi e robusti, consentendo la prioritizzazione dei ligandi di successo per lo sviluppo futuro.

Introduction

I ligandi covalenti mirati alla cisteina (molecole che esercitano un effetto biologico reagendo con un residuo di cisteina selezionato su una proteina specifica) sono diventati sempre più popolari come strumenti chimici e terapeutici negli ultimi decenni¹. Questi sono tipicamente costituiti da un elettrofilo leggermente reattivo (come un'acrilammide, cloroacetammide o vinilsolfone) aggiunto a una porzione di ligando con un'elevata affinità per un bersaglio proteico². Idealmente, l'interazione ligando-proteina procede attraverso un meccanismo in due fasi che coinvolge il legame iniziale del ligando non covalente, seguito dalla formazione di un legame covalente irreversibile tra la cisteina bersaglio e l'elettrofilo³.

Diversi ligandi covalenti mirati precoci, tra cui l'inibitore della tirosin-chinasi di Bruton Ibrutinib, sono stati sviluppati fornendo un ligando reversibile precedentemente identificato con un manico elettrofilo⁴. Tuttavia, questo approccio non ha sempre successo e altri tentativi hanno riscontrato che l'installazione di elettrofili richiede un'ottimizzazione significativa⁵. Invece, gli approcci elettrofili, in particolare utilizzando frammenti elettrofili, sono diventati più popolari negli ultimi anni. Questi tipicamente comportano l'incubazione di una libreria di elettrofili con una proteina e quindi la selezione di composti con una maggiore velocità di reazione verso una cisteina, che si presume sia indotta da interazioni produttive non covalenti tra il ligando e la tasca di legame⁶. In particolare, questi metodi sono stati applicati con successo durante lo sviluppo dell'inibitore di KRAS (G12C) Sotorasib¹.

Lo screening electrophile-first pone diverse sfide uniche rispetto allo screening tradizionale di ligandi non covalenti, principalmente a causa dell'elevata variabilità della reattività all'interno e tra le classi di testate⁷. La maggior parte degli elettrofili reattivi alla cisteina, nel tempo, reagirà con tutti i residui di cisteina esposti al solvente, indipendentemente da qualsiasi interazione selettiva per la proteina bersaglio. L'occupazione del ligando, quindi, aumenterà nel tempo per quasi tutti gli elettrofili e, senza controllare la reattività, la selezione dei colpi sarà spesso orientata verso frammenti più reattivi che coinvolgono un bersaglio più rapidamente⁸.

Inoltre, i metodi di screening electrophile-first utilizzano spesso la spettrometria di massa per rilevare la formazione di addotti proteina-ligando, che è limitata nel rendimento⁹. È necessario un campionamento regolare della reazione per un periodo di tempo prolungato (da ore a giorni) per caratterizzare correttamente la cinetica di reazione per una libreria di composti con diversa elettrofilia¹⁰. Uno screening di 300 frammenti campionati in 10 punti temporali richiederà, quindi, l'esecuzione di 3000 spettri di massa, superando la produttività della maggior parte dei sistemi di spettrometria di massa proteica. Sono quindi auspicabili metodi a più alto rendimento per monitorare la formazione di addotti proteina-ligando.

L'approccio qui descritto, il saggio di tethering irreversibile quantitato (qIT), è un metodo di screening elettrofilo che controlla la reattività intrinseca e utilizza una semplice lettura della fluorescenza⁷. Le proteine, o glutatione (un tripeptide non strutturato, contenente tiolo utilizzato come controllo della reattività intrinseca) vengono incubate con una libreria di frammenti elettrofili e prelevati campioni regolari per l'estinzione in una soluzione di CPM (7-dietilammino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metilcumarina, un agente di quantificazione tiolica fluorogenica). La formazione di addotti tra la cisteina e il frammento elettrofilo riduce la quantità di tiolo disponibile per la reazione con CPM, riducendo la fluorescenza risultante al quenching. La fluorescenza CPM agisce quindi come proxy per il tiolo non reagito, consentendo di determinare la cinetica della reazione del tiolo con ciascun frammento elettrofilo. I frammenti elettrofili con una reattività proteica significativamente migliorata rispetto al glutatione vengono selezionati come risultati e classificati in ordine di priorità per un ulteriore sviluppo (Figura 1).

Figura 1: Schema di qIT. Una panoramica schematica del test qIT. (creato utilizzando BioRender). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La selezione dei colpi utilizzando i valori REF controlla la reattività intrinseca e garantisce che i frammenti vengano selezionati come risultati solo se formano interazioni produttive non covalenti con un bersaglio proteico. La semplice lettura della fluorescenza significa anche che il test qIT è altamente scalabile e non richiede metodi di monitoraggio delle reazioni basati sulla spettrometria di massa.

In questo articolo viene delineata una procedura completa per il test qIT, con risultati di esempio inclusi per illustrare le prestazioni del test e la selezione dei risultati.

Protocol

1. Costruzione di librerie di frammenti

1. Progetta una libreria di frammenti elettrofili e sintetizzali o acquistali. Le librerie di frammenti elettrofili sono tipicamente costituite da elettrofili leggermente reattivi (come acrilammidi, cloroacetammidi e vinilsulfamidici) aggiunti a una vasta gamma di scaffold chimici. Le librerie di frammenti elettrofili sono ampiamente disponibili presso i fornitori commerciali e maggiori dettagli sulla loro progettazione e costruzione sono esaminati altrove ^5,11.
2. Sciogliere ogni composto in DMSO a una concentrazione di 50 mM, quindi erogare un composto diverso in ciascun pozzetto delle colonne da 3 a 22 di una piastra serbatoio da 384 pozzetti, denominata piastra della libreria di frammenti.
   1. Erogare DMSO in ciascun pozzetto delle colonne 1, 2, 23 e 24 per i controlli positivi e negativi. La disposizione delle piastre può essere variata a seconda del numero di composti da vagliare (Figura 2). Il volume aggiunto alla piastra della libreria dipenderà dal numero di schermate da eseguire, considerando che sono necessari circa 1,8 μl da ciascun pozzetto per ogni schermata qIT. Preparare questa piastra per libreria di frammenti in anticipo e conservarla a 4 °C.

Figura 2: Layout della targa. Una panoramica del layout della piastra a 384 pozzetti del saggio qIT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Configurazione del saggio (Figura 3)

1. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione proteica ricombinante (proteina bersaglio in qualsiasi tampone), tampone per saggio qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), tampone di quench per saggio qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7,5)) e soluzioni madre composte (frammento elettrofilo (50 mM) in DMSO).
   NOTA: Nel tampone di reazione viene utilizzato un pH di 8 per accelerare la reazione tra il residuo di cisteina bersaglio e i frammenti, consentendo di misurare la velocità di reazione anche per frammenti estremamente lievemente reattivi. Un pH leggermente inferiore di 7,5 viene utilizzato nel tampone di estinzione poiché il legame tioetere formato tra la maleimmide del CPM e il tiolo della cisteina è soggetto a idrolisi a pH più basici (ad esempio, lavori precedenti hanno scoperto che i coniugati cisteina-maleimmide sono molto più stabili a pH 7,3 rispetto a pH 8¹²).
2. Rimuovere le soluzioni madre di frammenti di DMSO dal deposito e lasciarle a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore per consentire lo scongelamento delle scorte composte.
3. Degassare il tampone di dosaggio qIT facendo gorgogliare con gas argon per circa 30 minuti.
4. Scambiare accuratamente la soluzione proteica target nel tampone del saggio qIT degassato. Fondamentalmente, gli agenti riducenti come DTT e TCEP devono essere accuratamente rimossi a concentrazioni < 100 nM poiché interferiscono con la quantificazione dei tioli. Questo passaggio può essere eseguito tramite una serie ripetitiva di scambi di buffer, come descritto di seguito.
   1. Diluire la soluzione proteica in eccesso rispetto al tampone del saggio qIT degassato in un'unità filtrante a rotazione, concentrare mediante centrifugazione (4000 x g, 4 °C, 15 min) e ripetere. Tipicamente, sono necessari 4 cicli di diluizioni di 1 su 15 per rimuovere sufficientemente DTT (1 mM) da 1 mL di soluzione madre proteica ricombinante, sebbene questo passaggio possa essere regolato a seconda della concentrazione dell'agente riducente nella soluzione proteica ricombinante originale.
      NOTA: In alternativa, la dialisi della soluzione proteica target contro un grande eccesso di tampone del saggio qIT degassato può ottenere lo stesso risultato.
5. Diluire la soluzione proteica target (prodotta nella fase 2.1) a una concentrazione proteica di 15 μM in tampone qIT degassato. Sono necessari circa 9 mL di soluzione proteica target per riempire una piastra da 384 pozzetti con un volume morto sufficiente.
6. Preparare una sospensione all'1,5% (v/v) di TCEP-agarosio in tampone di saggio qIT degassato. Sono necessari circa 9 mL di sospensione di TCEP-agarosio per piastra di screening.
7. Erogare 20 μL di soluzione di TCEP-agarosio in ogni pozzetto di due piastre da 384 pozzetti.
8. Preparare un stock di glutatione da 15 μM in tampone di saggio qIT degassato. Questo deve essere preparato immediatamente prima della placcatura poiché il glutatione si ossida rapidamente in soluzione senza agente riducente.
9. Erogare 20 μl di tampone per saggio qIT nelle colonne 1 e 2 di entrambe le piastre da 384 pozzetti.
10. Erogare 20 μl di proteina da 15 μM o soluzione di glutatione (in conformità con la piastra prevista) nelle colonne 3-24 della piastra a 384 pozzetti. Questi sono chiamati piastra di reazione proteica e piastra di reazione del glutatione. Lasciare ridurre a RT per 1 ora.
11. Erogare 58,2 μl di tampone per saggio qIT degassato in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti, quindi trasferire 1,8 μl da ciascun pozzetto corrispondente della piastra della libreria di frammenti per creare una piastra di diluizione composta, in cui ogni composto viene diluito a una concentrazione di 1,5 mM nel tampone del saggio qIT più il 3% di DMSO.
    NOTA: Questa fase è facilitata da una stazione di pipettaggio 384, che consente di trasferire le scorte di composti per ogni pozzetto in un'unica operazione.
12. Dopo 1 ora di incubazione di proteine e glutatione con TCEP-agarosio, trasferire 20 μl di soluzione composta da ciascun pozzetto della piastra di diluizione del composto nelle piastre di reazione delle proteine e del glutatione per iniziare il saggio. Anche questo passaggio è facilitato da una stazione di pipettaggio 384. Le fasi del saggio sono riassunte nella Figura 3.
    NOTA: La concentrazione del frammento può essere variata secondo necessità e, se lo si desidera, i saggi qIT possono essere ripetuti per i risultati a concentrazioni più basse, per confermare che l'affinità proteica non è un artefatto dell'alta concentrazione di frammenti. La concentrazione relativamente alta del frammento viene utilizzata per elevare il k_pro e il k_GSH per garantire che siano determinabili tassi accurati per i composti leggermente reattivi (che possono mostrare t_1/2 (GSH) > 24 ore nelle condizioni di analisi). Inoltre, sebbene una concentrazione di frammenti di 500 μM sia elevata, nello screening dei frammenti sono state utilizzate concentrazioni da μM a basse di mM, ad esempio¹³.
13. Avvia un timer: il test è iniziato e i quench devono essere eseguiti a intervalli regolari in conformità con la sezione seguente.

Figura 3: riepilogo del saggio qIT. Un riassunto che illustra le fasi chiave dell'impostazione del pozzetto di reazione del saggio qIT. (creato utilizzando BioRender). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Tempra CPM

NOTA: I quench CPM vengono eseguiti per quantificare la quantità di tiolo non reagito rimanente nelle piastre di reazione delle proteine e del glutatione. Questi dovrebbero essere eseguiti in punti temporali discreti (ad esempio, vengono generalmente utilizzati i seguenti punti temporali: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 e 1440 min) per consentire il monitoraggio della cinetica di reazione.

1. Preparare le soluzioni stock CPM (500 μM) in DMSO, dispensarle in aliquote da 111,2 μL in provette per microcentrifuga e conservarle a -20 °C. Queste scorte CPM possono essere preparate in anticipo e sarà necessaria 1 aliquota per ogni punto di tempra.
2. Preparare la soluzione di quench CPM (1,4 μM) scongelando una soluzione stock CPM congelata (500 μM) e aggiungendola a 40 mL di tampone di quench qIT.
3. Erogare 27 μL di soluzione di quench CPM in ciascun pozzetto di due piastre da 384 pozzetti: due sono necessarie per estinguere sia la proteina che le piastre di reazione del glutatione. Queste sono chiamate piastre CPM-Quench, prepararle un massimo di 30 minuti prima dell'uso.
4. Centrifugare la piastra di reazione proteica a 200 x g per 3 minuti per assicurarsi che l'agarosio TCEP sia pellettato.
5. In momenti predeterminati, trasferire 3 μl di campione da ogni pozzetto della piastra di reazione proteica a una piastra di quench CPM preriempita. Anche questo passaggio è semplificato utilizzando una stazione di pipettaggio 384.
6. Miscelare la piastra di tempra CPM aspirando ed erogando 3 x 25 μl. È importante rimuovere il campione dalla parte superiore del pozzetto per evitare di aspirare il TCEP-agarosio sul fondo, che interferirà con la tempra CPM.
7. Ripetere i passaggi 3.4-3.6 con la piastra di reazione al glutatione.
8. Incubare le piastre di tempra CPM (preparate in 3.4-3.6) a temperatura ambiente per 1 ora.
9. Misurare l'intensità di fluorescenza della piastra di quench CPM (eccitazione a 384 nm ed emissione a 470 nm).

4. Analisi dei dati e selezione dei risultati

1. Per ogni quench, calcolare Z' come misura della qualità del saggio. Qualsiasi quench CPM con Z' < 0,5 dovrebbe essere ignorato.
   Z' = 1 - ((3σ_{controllo positivo} + 3σ_{controllo negativo}) / (μ_{controllo positivo} - μ_{controllo negativo}))
   Dove σ = deviazione standard dell'intensità della fluorescenza e μ = media dell'intensità della fluorescenza
2. Calcolare i valori medi di fluorescenza per i pozzetti di controllo negativo e positivo (colonne 1 e 2 e 23 e 24, rispettivamente).
3. Normalizzare bene ogni reazione ai valori medi di fluorescenza dei controlli positivi e negativi:
   % modificata = 100 x (fluorescenza a pozzetti composti - fluorescenza a controllo negativo) / (fluorescenza a controllo positivo - fluorescenza a controllo negativo)
4. Tracciare separatamente la % di modifica rispetto al tempo per ciascun composto che reagisce con il glutatione e con la proteina bersaglio.
5. Adattare i dati normalizzati % modificati in funzione del tempo a un modello di decadimento esponenziale monofase sia per la reazione con la proteina che con il glutatione utilizzando l'equazione:
   % Modificato = ae ^{- kt + c}
   Dove a = l'intervallo dei valori % modificati, k = velocità di reazione, t = tempo, c = il valore % modificato al tempo infinito. L'adattamento della curva e la determinazione dei parametri possono essere eseguiti utilizzando software commerciali (come Graphpad).
6. Utilizzare la velocità con cui i frammenti reagiscono con la proteina (k_pro) e il glutatione (k_GSH) per calcolare il valore del fattore di miglioramento della velocità (REF) per ciascun frammento:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Utilizzare i valori REF per selezionare i frammenti di hit. Ciò può essere eseguito impostando una soglia REF (ad esempio, REF > 3), un tasso di successo arbitrario (ad esempio, il 2% superiore) o selezionando frammenti con deviazioni standard REF 3 maggiori della media geometrica.

Results

Il test qIT viene utilizzato qui per identificare i frammenti covalenti di una singola proteina di cisteina senza nome. MgCl₂ (10 mM) è stato aggiunto ai tamponi di reazione poiché è noto che la proteina bersaglio si lega agli ioni Mg²⁺ . Lo screening è stato eseguito in triplice copia ed è stata determinata la velocità con cui ciascun frammento ha reagito sia con la proteina bersaglio (k_pro) che con il glutatione (k_GSH). I valori di Z' erano superiori a 0,5 per tutte le piastre di quench e in media 0,75 per le quench proteiche e 0,79 per le quench con glutatione, indicando eccellenti prestazioni di analisi. I valori REF sono stati quindi calcolati per ogni frammento e sono stati selezionati i risultati in cui REF > 3.

I risultati rappresentativi (Figura 4) forniscono un esempio di selezione dei risultati utilizzando il test qIT. Il composto 1 ha reagito a una velocità 6,0 volte maggiore con il residuo di cisteina sulla proteina bersaglio rispetto al glutatione e, utilizzando un criterio di REF > 3, è stato selezionato come hit (Figura 4B). Questa accelerazione della velocità indica la presenza di un effetto templante, per cui le interazioni non covalenti si posizionano 1 nell'orientamento corretto per la cisteina sulla proteina bersaglio per reagire con la testata del cloroacetammide. Al contrario, 2 è un esempio di frammento non colpito poiché la reazione tra 2 e il residuo di cisteina bersaglio non è accelerata rispetto alla reazione tra 2 e glutatione. La mancanza di accelerazione della velocità indica che non ci sono interazioni produttive non covalenti che posizionano 2 nell'orientamento corretto per reagire con il residuo di cisteina bersaglio.

Figura 4: Risultati rappresentativi. I risultati mostrano il monitoraggio della reazione delle proteine e del glutatione mediante qIT per (A) un'elevata reattività intrinseca, un possibile frammento di hit falso positivo e (B) un frammento di hit. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il test qIT fornisce una piattaforma efficace e conveniente per lo screening di frammenti elettrofili reattivi alla cisteina rispetto a una proteina bersaglio. Tuttavia, ci sono considerazioni critiche che possono ostacolare le prestazioni dei saggi se non adeguatamente considerate. In particolare, le proteine bersaglio devono includere solo una singola cisteina esposta in superficie per essere adatte allo screening qIT, poiché altri residui di cisteina reagiscono con il CPM e interferiscono con le misure di fluorescenza. In casi precedenti in cui le proteine bersaglio contengono più cisteine esposte in superficie (come per la proteasi principale SARS-CoV-2, la piccola GTPasi RAP27A e la chinasi ciclina-dipendente 2), i costrutti di screening con residui interferenti rimossi sono stati precedentemente utilizzati con successo. Tuttavia, l'efficacia di questa strategia varierà a seconda della proteina 10,14,15.

Inoltre, poiché il test qIT misura la diminuzione del tiolo disponibile per reagire con il CPM nel tempo, qualsiasi fattore che riduca la percentuale di tioli disponibili, come l'ossidazione del tiolo o l'aggregazione proteica, può ostacolare le prestazioni del test. Il degasaggio del tampone e l'uso di un agente riducente immobilizzato (TCEP-agarosio) assicurano che l'ossidazione del tiolo sia lenta e che l'ossidazione residua debba essere mitigata normalizzando le misure di fluorescenza a quelle dei pozzetti di controllo positivo. Tuttavia, possono sorgere problemi quando una distribuzione non uniforme di TCEP-agarosio tra i pozzetti provoca un'ossidazione non uniforme dei tioli. La costanza della placcatura TCEP-agarosio è quindi essenziale per le prestazioni del saggio, che può essere difficile quando le particelle di TCEP-agarosio affondano nei serbatoi di pipettaggio.

Anche l'aggregazione proteica può essere un problema, poiché le condizioni del saggio (24 ore di incubazione a temperatura ambiente) sono relativamente difficili. Strategie di risoluzione dei problemi, come la fusione di proteine bersaglio in tag di solubilizzazione, l'alterazione dei tamponi di reazione o l'esecuzione del test a temperature più basse, possono ridurre l'aggregazione e risolvere i problemi di stabilità delle proteine. Alcuni frammenti possono anche indurre l'aggregazione proteica, che riduce nuovamente la proporzione di tiolo disponibile per reagire con il CPM e crea risultati falsi positivi. La validazione ortogonale dei colpi mediante spettrometria di massa a proteina intatta è un metodo efficace per rilevare questi casi, poiché i risultati falsi positivi creeranno una popolazione piccola o inesistente di specie marcate quando incubate con una proteina bersaglio.

Quando queste considerazioni sono controllate, il test qIT presenta alcuni chiari vantaggi rispetto ad altri metodi di screening dei frammenti covalenti. La selezione dei colpi mediante REF garantisce che i risultati vengano selezionati solo se formano interazioni produttive non covalenti con la proteina bersaglio. L'elettrofilia dei frammenti varia su ampi intervalli, sia tra diverse testate che all'interno delle classi di testate; Ad esempio, lavori precedenti hanno trovato diverse variazioni di centinaia di volte nel tasso di reattività del glutatione tra le acrilammidi¹⁰. Questa vasta gamma di elettrofilia può rendere difficile distinguere i frammenti con valori k _pro elevati a causa di un effetto di modellazione da quelli che sono semplicemente altamente reattivi, il che può portare a selezionare frammenti altamente reattivi come falsi positivi. Ad esempio, 2 ha reagito con il residuo di cisteina bersaglio più rapidamente di 1 e, senza considerare la reattività intrinseca, può essere selezionato come hit. Tuttavia, 2 non reagisce con il residuo di cisteina bersaglio a una velocità maggiore rispetto al glutatione, indicando che il maggiore k_pro di 2 rispetto a 1 è dovuto a una maggiore reattività intrinseca del frammento e non a un effetto templante.

Anche la semplice lettura della fluorescenza utilizzata dal saggio qIT per quantificare il tiolo rimanente è molto vantaggiosa. Altri metodi di screening dei frammenti covalenti utilizzano la spettrometria di massa delle proteine intatte per determinare la velocità con cui i frammenti reagiscono con una proteina bersaglio e LC-MS per determinare la velocità con cui il glutatione reagisce con i frammenti, entrambi i quali richiedono attrezzature specializzate e mancano di produttività ^8,16. La comoda lettura della fluorescenza rende il test qIT altamente scalabile e richiede solo apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili.

Combinate, queste innovazioni creano un metodo robusto e scalabile di screening dei frammenti covalenti, che elimina la necessità di apparecchiature per la spettrometria di massa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas argon	BOC	I1149
Corning Piastre per saggi a 384 pozzetti, flangia bassa, fondo piatto	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
TCEP-agarosio immobilizzato	Pierce	77712
Micro lettore di piastre	CLARIOstar
Guarnizioni per piastre PCR	BioRad	MSA5001
L-glutatione ridotto	Sigma-Aldrich	G4251
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7