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Articolo metodologico

Quantificazione della respirazione mitocondriale in cellule intere di lievito

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DOI:

10.3791/67186

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8 novembre 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

In questo articolo

Sommario

La respirazione mitocondriale nelle cellule intere di lievito è un prezioso indicatore della bioenergetica cellulare. Qui, presentiamo un protocollo per quantificare questo fenotipo applicabile a diverse specie di lievito.

Abstract

Il metabolismo è principalmente coordinato dalla disponibilità di energia cellulare e dalle condizioni ambientali. I saggi per conoscere come le cellule adattano il metabolismo energetico alle diverse condizioni nutrizionali e ambientali forniscono informazioni preziose per chiarire i meccanismi molecolari. La fosforilazione ossidativa è la fonte primaria di ATP nella maggior parte delle cellule e l'attività della respirazione mitocondriale è una componente chiave della fosforilazione ossidativa, mantenendo il potenziale di membrana mitocondriale per la sintesi di ATP. La respirazione mitocondriale è spesso studiata in mitocondri isolati che mancano del contesto cellulare. Qui, presentiamo un metodo per quantificare la respirazione mitocondriale in cellule intatte dal lievito. Questo metodo si applica a qualsiasi specie di lievito, sebbene sia stato generalmente utilizzato per le cellule di Saccharomyces cerevisiae. In primo luogo, viene testata la crescita del lievito in condizioni specifiche. Quindi, le cellule vengono lavate e risospese in acqua deionizzata con un rapporto 1:1 (p/v). Le cellule vengono quindi poste in una camera ossimetrica con agitazione costante e un elettrodo di Clark viene utilizzato per quantificare il consumo di ossigeno. Alcune molecole vengono inserite in sequenza nella camera e selezionate in base a questo effetto sulla catena di trasporto degli elettroni o sulla sintesi dell'ATP. L'inibitore dell'ATPasi oligomicina viene prima aggiunto per misurare la respirazione accoppiata alla sintesi di ATP. Successivamente, viene utilizzato un disaccoppiatore per misurare la capacità respiratoria massima. Infine, viene aggiunto un mix di inibitori della catena di trasporto degli elettroni per scartare il consumo di ossigeno non correlato alla respirazione mitocondriale. I dati vengono analizzati utilizzando una regressione lineare per ottenere la pendenza, che rappresenta il tasso di consumo di ossigeno. Il vantaggio di questo metodo è che è specifico per la respirazione mitocondriale del lievito, mantenendo il contesto cellulare. È essenziale sottolineare che gli inibitori utilizzati nella quantificazione della respirazione mitocondriale potrebbero variare tra le specie di lievito.

Introduzione

I mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nella bioenergetica cellulare poiché sono la principale fonte di ATP per la maggior parte delle cellule, e diverse vie convergono e dipendono dall'attività delle vie mitocondriali1. La fosforilazione ossidativa è necessaria per la sintesi dell'ATP che combina il trasporto di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni per ridurre l'ossigeno e l'attività F1F 0-ATPasi, sintetizzando l'ATP utilizzando il potenziale di membrana mitocondriale prodotto a causa del flusso di elettroni2. Pertanto, la respirazione mitocondriale fa parte della fosforilazione ossidativa3.

La catena di respirazione mitocondriale comprende quattro complessi o, in alcuni casi, carenti del complesso di lievito I (ad esempio, Saccharomyces cerevisiae), tre complessi e tre proteine deidrogenasi4. I complessi respiratori sono localizzati nella membrana mitocondriale interna; alcuni lieviti presentano la catena canonica di trasporto degli elettroni con il complesso I (NADH deidrogenasi) o tre NADH deidrogenasi, ubichinone (Co Q), complesso II (ubichinone ossidoreduttasi succinato), complesso III (ubichinone citocromo ossidoreduttasi), citocromo c (Cyt c) e complesso IV (citocromo c ossidasi)5,6. Il trasporto di elettroni attraverso i complessi consente il pompaggio di protoni dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana, formando un potenziale di membrana mitocondriale7. I protoni situati nello spazio intermembrana vengono pompati al contrario, verso la matrice mitocondriale da F1F0 -ATPasi per sintetizzare una molecola di ATP ogni quattro protoni pompati8.

Le misurazioni della respirazione mitocondriale forniscono preziose informazioni sull'integrità mitocondriale, sulla bioenergetica cellulare e sulla capacità respiratoria mitocondriale9. La funzione della respirazione mitocondriale può essere analizzata in vitro o in situ utilizzando diverse tecniche. Tuttavia, l'analisi della respirazione mitocondriale in cellule intatte potrebbe presentare una serie di vantaggi poiché comprende l'intero metabolismo cellulare, poiché le interazioni delle cellule con il loro ambiente e il metabolismo intracellulare sono considerate quando si impiegano cellule intere10. Inoltre, l'utilizzo di cellule intatte consente una facile valutazione di varie condizioni sperimentali e rileva cambiamenti minimi che non potrebbero essere osservati nei mitocondri isolati10,11. Un altro vantaggio della quantificazione della respirazione mitocondriale nelle cellule intatte è che gli effetti della proliferazione e della localizzazione mitocondriale vengono mantenuti12.

La respirazione dei mitocondri nei mammiferi in cellule intatte è stata descritta in grande dettaglio12, lasciando da parte lo studio di altri organismi eucarioti, come i lieviti. Qui, proponiamo una tecnica per quantificare la respirazione mitocondriale adattata al lievito dai protocolli dei mammiferi. Pertanto, in questa tecnica sono stati utilizzati i concetti della quantificazione della respirazione mitocondriale nei mammiferi. Ad esempio, questa tecnica è suddivisa in varie fasi come il protocollo dei mammiferi: 1) respirazione basale (substrato dipendente), 2) respirazione legata all'ATP (attraverso l'inibizione dell'ATP sintasi), 3) massima capacità respiratoria (impiegando un disaccoppiatore che consente la permeabilità dei protoni attraverso la membrana mitocondriale interna), 4) inibizione della respirazione mitocondriale (utilizzando un mix di inibitori della catena respiratoria per scartare il consumo di ossigeno per altre fonti diverse da respirazione mitocondriale)11,13. Pertanto, questo articolo mira a presentare un protocollo per quantificare la respirazione mitocondriale nel lievito.

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Protocollo

1. Terreni di coltura e preparazione dell'inoculo

  1. Preparare 100 ml di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD) aggiungendo 1 g di estratto di lievito, 2 g di peptone di caseina e 2 g di glucosio in 95 ml di acqua distillata. Distribuire 3 mL in provette di vetro da 10 mL, sterilizzare a 121 °C e 1,5 psi per 15 min.
    NOTA: Il fluido può essere conservato a 4 - 8 °C per un massimo di 1 mese.
  2. Inoculare una provetta di vetro da 10 mL contenente 3 mL di terreno YPD con 250 μL di cellule di lievito conservate in glicerolo a -20 °C. Incubare per una notte con agitazione costante a 200 giri/min e 30 °C.
    NOTA: La temperatura di incubazione potrebbe variare in alcune specie di lievito (ad esempio, Kluyveromyces marxianus ha una temperatura di crescita ottimale di 37 °C).
  3. Riempire una piastra di Petri (60 x 15 mm2) con agar sterile YPD al 2% (aggiungere 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone di caseina, 20 g di glucosio e 20 g di agar batteriologico a 950 ml di acqua distillata) e striare la piastra di Petri con le cellule di lievito coltivate nella provetta di vetro da 10 ml utilizzando un circuito sterile. Incubare la capsula di Petri a 30 °C fino alla comparsa di colonie isolate.
  4. Preparare un pre-inoculo inoculando una provetta di vetro sterile da 10 ml contenente 3 ml di terreno YPD al 2% di glucosio con due o tre colonie isolate di lievito dalla capsula di Petri. Incubare per una notte agitando costantemente a 30 °C.

2. Condizioni di crescita e disegno dell'esperimento

  1. Inoculare un pallone di Erlenmeyer da 500 ml contenente 100 ml di terreno sintetico completo sterile (terreno SC; 0,18 g di base azotata di lievito senza amminoacidi, 0,5 g di solfato di ammonio, 0,2 g di fosfato dipotassico, 1 g di integratori sintetici di drop-out di lievito e glucosio secondo il disegno sperimentale, in 98,02 ml di acqua distillata) con coltura di lievito a ODiniziale 600 ~ 0,1, ovvero circa 3 ml del pre-inoculo notturno (OD600 ~ 3). Impostare la condizione ambientale o integrare con la provocazione chimica da testare nella respirazione mitocondriale (ad esempio, aggiungendo 100 μM di resveratrolo). Preparare un controllo del veicolo in un pallone separato per la sfida chimica. Testare almeno tre repliche biologiche.
    NOTA: Si raccomanda di utilizzare un terreno minimo per scartare il rumore nutrimentale nel saggio, e il terreno minimo proposto a questo punto viene utilizzato per S. cerevisiae e potrebbe differire per altre specie di lievito. Infine, la concentrazione di glucosio integrata nei terreni di coltura è fondamentale per evitare la repressione del glucosio o l'effetto Crabtree che inibisce la respirazione mitocondriale; concentrazioni inferiori allo 0,5% (p/v) hanno dato buone risposte nella respirazione mitocondriale accompagnate da alti tassi di crescita in S. cerevisiae. Nei lieviti Crabtree-negativi, alte concentrazioni di glucosio non hanno influenzato la respirazione mitocondriale (ad esempio, K. marxianus).
  2. Pesare una provetta conica vuota da 50 mL e utilizzarla per raccogliere le cellule nella fase di log intermedio (OD600 ~ 0,5) mediante centrifugazione a 4000 x g per 5 min.
    NOTA: La fase mid-log è consigliata per testare la respirazione mitocondriale poiché è la fase di crescita in cui il metabolismo energetico è più attivo.
  3. Scartare il surnatante e lavare il pellet 3 volte con 25 ml di acqua deionizzata. Pesare il tubo conico con le celle a pellet (peso umido) e sottrarre il peso del tubo conico per ottenere il peso umido cellulare.
  4. Risospendere il pellet in 2 mL di acqua deionizzata.
  5. Registrare la concentrazione cellulare dividendo il peso umido per 2 per ottenere mg di cellule/mL. Questo valore è essenziale per determinare la quantità di volume che deve essere aggiunta per avere 50 mg di cellule per il test.

3. Saggio del consumo di ossigeno (Polarography)

  1. Utilizzare un elettrodo di ossigeno di tipo Clark collegato a un monitor YSI5300A e a un computer per l'acquisizione dei dati.
    1. Porre 5 mL di acido morfo-etanolo solfonico regolato a pH 6 con trietanolammina (tampone MES-TEA; 10 mM) e 50 mg di cellule (peso umido) nella camera polarografica. Posizionare delicatamente l'elettrodo, facendo attenzione che non ci siano bolle.
    2. Accendere il monitor YSI5300A, il computer per l'acquisizione dei dati e la camera per l'agitazione. Impostare il monitor YSI5300A selezionando la manopola di impostazione del canale 1 in AIR. Regolare il canale 1 al 100% con la manopola di calibrazione del canale 1 e stabilizzare il segnale per 5 minuti al 100%.
    3. Inizia a registrare i dati nel computer e a misurare il tempo utilizzando un cronometro.
      NOTA: Il monitor YSI5300A non dispone di un computer o di un programma di acquisizione dati; Questo può essere implementato esternamente dall'utente.
    4. Utilizzare la canalizzazione laterale dell'elettrodo nella camera dell'ossimetro per aggiungere in sequenza il substrato ossidabile, l'oligomicina, il disaccoppiatore e la miscela di inibitori della catena respiratoria.
  2. Aggiungere il substrato ossidabile (glucosio, glicerolo, L-lattato o un'altra fonte di carbonio secondo il disegno sperimentale) a una concentrazione finale di 10 mM con una siringa per cromatografia. Tenere la camera sempre chiusa e con costante agitazione. Registrare il consumo percentuale di aria per 2-3 minuti per determinare la respirazione basale.
    NOTA: Il glucosio, il glicerolo e l'L-lattato vengono utilizzati per analizzare la catena di trasporto degli elettroni in diversi siti della catena respiratoria: il metabolismo del glucosio riduce il NAD+ per formare NADH e viene utilizzato per analizzare l'intera catena respiratoria; il glicerolo trasferisce elettroni all'ubichinone e viene utilizzato per valutare la catena respiratoria dell'ubichinone; infine l'L-lattato cede i suoi elettroni al citocromo c e viene impiegato per determinare l'effetto del citocromo c14. Questi substrati possono variare a seconda della capacità enzimatica delle specie di lievito.
  3. Aggiungere oligomicina per ottenere una concentrazione finale di 0,01 mM nella camera dell'ossimetro utilizzando una siringa per cromatografia per valutare la respirazione legata all'ATP e registrare il consumo percentuale di aria per 2-3 minuti.
  4. Integrare il disaccoppiatore, 3-clorofenilidrazone cianuro di carbonile (CCCP) per ottenere una concentrazione finale di 0,015 mM nella camera dell'ossimetro con una siringa per cromatografia per determinare la capacità respiratoria massima e registrare il consumo percentuale di aria per 2-3 minuti.
  5. Utilizzare una siringa per cromatografia per aggiungere gli inibitori della catena di trasporto degli elettroni: prima, 2-thenoiltrifluoroacetone (TTFA) e poi, antimicina A (AA) a concentrazioni finali di 1 mM e 1 mg/mL, rispettivamente. Misurare ogni inibitore per 2-3 minuti.
    NOTA: Gli inibitori della catena di trasporto degli elettroni potrebbero differire tra le specie di lievito; Questo aspetto deve essere considerato in questa fase.
  6. Esamina ogni fonte di carbonio in modo indipendente (ad esempio, glucosio, glicerolo o L-lattato). Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.5 per ciascuna fonte di carbonio. Lavare la camera 3 volte con etanolo al 70% e 3 volte con acqua deionizzata dopo ogni utilizzo.

4. Trattamento dei dati

  1. Utilizzare le curve di consumo di ossigeno (tracciando la percentuale dell'aria rispetto al tempo) per calcolare le pendenze del substrato ossidabile (respirazione basale), dell'oligomicina (respirazione legata all'ATP), della CCCP (respirazione massimale), dell'AA e della TTFA (respirazione non mitocondriale); Figura 1). Calcola le pendenze individuali per ogni composto integrato utilizzando la regressione lineare come descritto di seguito.
    1. Creare un nuovo file di progetto nel software statistico. Scegliere XY nella sezione Crea. Selezionare l'opzione Inserisci o Importa dati in una nuova tabella nella sezione Tabella dati.
    2. Seleziona Numeri nella sottosezione X della sezione Opzioni. Fare clic su Inserisci 3 valori replicati in sottocolonne affiancate nella sottosezione Y nella sezione Opzioni.
      NOTA: Il formato della tabella ha una colonna X e diverse colonne Y, ciascuna con 3 sottocolonne denominate A: Y1 e A: Y2.
    3. Inserire i dati temporali in X colonne (ad esempio, 0, 2, 4, 6, 8 s o 0, 1, 2, 3 min). Scrivi la percentuale dell'aria nelle colonne Y.
    4. Crea un'idoneità alla regressione lineare. Fare clic su Analizza nella barra dei menu. Nell'opzione Analisi, selezionare Regressione lineare semplice su analisi XY e fare clic su OK.
    5. Ottenere il valore della pendenza dalle tabelle Risultati nei dati nella parte sinistra dello schermo.
  2. Scrivere i valori di pendenza in una scheda tecnica e sottrarre il valore di pendenza ottenuto dalla miscela di inibitori respiratori (AA e TTFA) dalle pendenze ottenute dal substrato ossidabile, oligomicina e CCCP per scartare il consumo di ossigeno da fonti diverse dalla respirazione mitocondriale.
  3. Moltiplicare i valori ottenuti per 237 μM di O2. Questo valore è considerato la solubilità di O2 in un mezzo mitocondriale tamponato bilanciato con aria (20,9% O2) a 25 °C; Questo valore varia in base alla temperatura, all'altitudine e al buffer impiegato.
  4. Convertire in minuto; i valori ottenuti sono μM di O2 per tempo, a seconda di come viene tracciato il tempo, per ottenere μM di O2/min.
  5. Dividi per 50, cioè i mg di cellule utilizzate; La cellula Mg può variare a seconda del disegno sperimentale. Infine, il consumo di ossigeno è espresso come μM di O2/mg di cellule x min

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Risultati

Questa tecnica di respirazione mitocondriale può essere utilizzata per specie di lievito diverse da S. cerevisiae, come Scheffersomyces stipitis15 e K. marxianus16. Tuttavia, a scopo rappresentativo, presentiamo solo i risultati di S. cerevisiae. È noto che S. cerevisiae presenta un metabolismo respiratorio predominante a basse concentrazioni di glucosio (inferiori a 0,8 mM)17,18

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Discussione

La fosforilazione della respirazione mitocondriale svolge un ruolo fondamentale in diverse vie che dipendono dal potenziale di membrana mitocondriale e mantengono i livelli di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Comprendere in che modo le condizioni ambientali e nutrizionali influiscono sulla respirazione mitocondriale dei lieviti serve come strumento per chiarire i meccanismi molecolari.

È essenziale considerare i seguenti passaggi critici per ottene...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) assegnato a LAMP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2- thenoiltrifluoroacetone (TTFA)MerckT27006Complesso inibitore II
3-clorofenilidrazone cianuro di carbonile (CCCP)MerckC2759Disaccoppiatore di respirazione mitocondriale   
Absolut ethanolMerck107017Per sciogliere la quercetina 
AgarMerckA1296YPD agar preparazione
Solfato di ammonio granulare (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC preparazione del brodo
Antimicina A (AA)MerckA8674Complesso inibitore III
aYSI5300A--------Monitor 
CentrifugaHermleZ 206 APer centrifugazione cellulare
Oxygen--------Electrode 
Computer--------Per l'acquisizione dei dati 
Fosfato dipotassico K2HPO4J.T. Baker3252-05SC preparazione del brodo
GlucosioMerck G7021YPD preparazione del brodo
GliceroloMerckG5516Substrato media integrazione 
Substratodi lattato MerckL1250media integrazione 
Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Inibizione dell'ATP sintasi mitocondriale
Agitatore orbitaleThermo FisherSHKE6000Incubazione dell'inoculo in tubi di vetro e pallone
Peptone da caseina, digestato enzimaticoMerck82303YPD preparazione del brodo
Quercetina Merck337951Per diminuire la respirazione mitocondriale
Uracillo MerckU0750SC preparazione del brodo
Estratto di lievitoMerckY1625YPD preparazione del brodo
Lievito base azotata senza aminoacidi e solfato di ammonioMerckY1251SC preparazione del brodo
Lievito Sintetico Drop-out integratori di terreni senza uracileMerckY1501SC preparazione del brodo

Riferimenti

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