Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper

Summary

Il sistema oculare Drosophila è uno strumento utile per studiare vari processi biologici, in particolare le malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, la quantificazione manuale dei fenotipi dell'occhio ruvido può essere distorta e inaffidabile. Qui descriviamo un metodo con cui ilastik e Flynotyper vengono utilizzati per quantificare il fenotipo dell'occhio in modo imparziale.

Abstract

L'occhio composto di Drosophila melanogaster è una schiera ben strutturata e completa di circa 800 ommatidi, che presentano un andamento simmetrico ed esagonale. Questa regolarità e facilità di osservazione rendono il sistema oculare di Drosophila un potente strumento per modellare varie malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, i modi per quantificare i fenotipi anormali, come la classificazione manuale dei punteggi di gravità degli occhi, hanno dei limiti, specialmente quando si classificano le alterazioni deboli nella morfologia dell'occhio. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati approcci computazionali come Flynotyper. L'uso di una luce anulare consente di ottenere immagini di migliore qualità che accedono all'integrità dei singoli ommatidi. Tuttavia, queste immagini non possono essere analizzate direttamente da Flynotyper a causa delle ombre sugli ommatidi introdotte dalla luce anulare. Qui, descriviamo un modo imparziale per quantificare i fenotipi dell'occhio ruvido osservati nei modelli di malattia di Drosophila combinando due software, ilastik e Flynotyper. Pre-elaborando le immagini con ilastik, è possibile ottenere una quantificazione di successo del fenotipo dell'occhio ruvido con Flynotyper.

Introduction

Il genoma di Drosophila melanogaster contiene ~75% di ortologhi genici umani correlati alla malattia. Inoltre, durante lo sviluppo dell'occhio di Drosophila, vengono espressi circa due terzi dei geni nel genoma, rendendo l'occhio di Drosophila un sistema genetico eccezionale per studiare varie funzioni molecolari e cellulari, lo sviluppo e i modelli di malattia ^1,2. Pertanto, il sistema oculare di Drosophila è un utile strumento sperimentale per studiare vari processi biologici.

L'occhio composto di Drosophila è una serie ben strutturata e completa di ~800 ommatidi che mostrano un modello simmetrico ed esagonale³. La regolarità di questo modello esagonale può essere utilizzata per stimare l'effetto dell'introduzione di mutazioni e cambiamenti nell'espressione genica nella morfologia dell'occhio⁴. Studi precedenti che richiedono la valutazione della morfologia oculare si sono basati in gran parte sulla classificazione manuale della gravità dei fenotipi oculari rilevati ad occhio nudo. Per classificare i fenotipi oculari, le immagini della morfologia esterna dell'occhio vengono scattate con uno stereomicroscopio ^5,6. Il fenotipo oculare di ciascun gruppo viene valutato suddividendo l'occhio esterno in quattro aree e calcolando la proporzione di degenerazione in ciascuna area ^5,6. Quindi, i valori vengono utilizzati per calcolare le medie che vengono confrontate con i valori ottenuti dai moscerini di controllo⁷. Il punteggio si basa sull'entità della fusione, sulla perdita di ommatidi e sull'organizzazione delle setole ^7,8. Le foto dell'occhio di mosca scattate con uno stereomicroscopio vengono acquisite da un ricercatore e l'analisi del fenotipo oculare viene eseguita da un altro ricercatore con set di tripla convalida ^7,8.

Quando si tratta di classificare deboli alterazioni nella morfologia dell'occhio ad occhio nudo, ci sono limitazioni⁴. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati approcci computazionali come FLEYE e Flynotyper ^1,9. Flynotyper è un nuovo metodo computazionale per stimare quantitativamente i cambiamenti morfologici nel sistema oculare di Drosophila¹. Rileva automaticamente l'occhio di Drosophila e il singolo ommatidio, calcolando i punteggi fenotipici (P-Score) in base all'irregolaritàdell'occhio¹. Un P-Score più alto indica che l'occhio della mosca è più degenerato. Questo software è stato utilizzato con successo per quantificare l'anomalia degli occhi di Drosophila ¹⁰. Sebbene Flynotyper garantisca un processo automatizzato, non può ancora essere applicato con successo ad alcune immagini oculari acquisite con vari metodi di microscopia ottica.

Qualitativamente, preferiamo una sorgente luminosa ad anello rispetto a una sorgente luminosa a punto singolo, in quanto offre una rappresentazione più accurata di ciascun ommatidio. Tuttavia, quando si utilizza la luce anulare, si genera un'ombra a forma di anello nella parte superiore di ciascun ommatidio a causa della forma emisferica dell'ommatidio. Questa ombra a forma di anello inibisce il rilevamento accurato dell'ommatidia da parte di Flynotyper, portando a un calcolo errato dei P-Score.

Per superare questi problemi, abbiamo implementato ilastik, uno strumento basato sull'apprendimento automatico per varie analisi, per classificare gli ommatidi nelle immagini dell'occhio di mosca¹¹. Abbiamo quindi inserito le immagini generate da ilastik in Flynotyper per calcolare i P-Score. Questo ci permette di quantificare i difetti morfologici dell'occhio di Drosophila in modo imparziale¹.

Protocol

1. Preparazione alla quantificazione

1. Scarica e installa ilastik¹¹, ImageJ e il plug-in ImageJ Flynotyper¹. Vedere la Tabella dei materiali per i collegamenti ai siti Web all'installazione. Scarica i pacchetti appropriati in base al sistema operativo del computer (Mac, Windows, Linux, ecc.). Seguire le istruzioni di installazione esattamente come indicato.
   NOTA: È indispensabile seguire le indicazioni esattamente come indicato nei link forniti. Il computer utilizzato necessita di un sistema operativo a 64 bit; In caso contrario, non ci sono altre specifiche richieste. Vedere la Tabella dei materiali per le specifiche del computer del sistema utilizzato per questo protocollo.
2. Usare un'immagine standard per eseguire il training del modello di Machine Learning. Scatta un'immagine di un occhio di mosca sano utilizzando un microscopio ottico con una luce anulare (come w1118 x GMR-GAL4), utilizzando il centro dell'occhio come punto focale. Analizza maschi e femmine separatamente; Pertanto, acquisisci un'immagine standard per maschi e femmine.
   NOTA: Le impostazioni variano notevolmente a seconda del microscopio e della fotocamera. Vedere il secondo paragrafo della discussione per informazioni più generali sulla preparazione della mosca e sull'acquisizione delle immagini.
3. Scatta immagini degli occhi di mosca sperimentali utilizzando le stesse impostazioni utilizzate per l'acquisizione di immagini standard.
   NOTA: Un buon orientamento è fondamentale per una quantificazione accurata. Vedere la Figura 4 come esempio per un corretto orientamento.

2. Utilizzo di ilastik per rilevare gli ommatidi dalle immagini dell'occhio di mosca

1. Prima di iniziare l'analisi, assicurarsi che tutti i gruppi sperimentali, indipendentemente dalla condizione sperimentale, si trovino nella stessa cartella di file per semplificare i processi successivi. Assicurati che i file siano denominati in modo appropriato per identificare i gruppi sperimentali e distinguere tra maschi e femmine.
   NOTA: Si consiglia di stampare il protocollo e di utilizzare il computer per ingrandire le figure, poiché questo protocollo è più facilmente seguibile visivamente.
2. Apri il software.
   NOTA: Si consiglia di non tenere aperte altre applicazioni durante l'esecuzione del software; In caso contrario, il computer potrebbe funzionare molto lentamente, in particolare nei sistemi più vecchi o meno robusti.
3. Clicca su Crea nuovo progetto | Altri flussi di lavoro, scegliere Conteggio densità celle e selezionare una posizione in cui salvare il file di progetto (Figura 1A).
4. Fare clic su 1. Dati di input | Aggiungi nuovo | Aggiungi immagini separate. Scegliere l'immagine standard (Figura 1B).
5. Fare clic su 2. Selezione delle funzioni e selezionare le funzioni da utilizzare. Selezionare le funzioni mostrate nella Figura 1C; Scegli più valori Sigma per aumentare la sensibilità (ad esempio, 10, 15, 20, ecc.).
   NOTA: Se vengono selezionate troppe caselle, il programma potrebbe funzionare per molto tempo.
6. Fare clic su 3. Conteggio e impostare il valore sigma in primo piano su 5.00. Contrassegnare 50 o più ommatidium individuali utilizzando lo strumento Primo piano sull'immagine standard.
   NOTA: cinquanta marcature sono in genere adeguate per l'analisi; tuttavia, più ommatidi sono marcati, più accurati saranno i risultati (Figura 1D).
7. Fare clic su 3. Conteggio e utilizzare lo strumento Sfondo per contrassegnare l'esterno degli ommatidi (Figura 1E). Disegna linee verdi a forma di reticolo attorno agli ommatidi.
   NOTA: Simile a più segni sugli ommatidi, più linee verdi vengono tracciate, più accurati saranno i risultati.
8. Fare clic su 4. Esportazione della densità | Scegliere Esporta impostazioni immagine per configurare le impostazioni dell'immagine (Figura 1F). Fare clic su Informazioni file di output | selezionare Formato e tif per ulteriori analisi in Flynotyper.
9. Fare clic su 5. Elaborazione batch | Selezionare File di dati grezzi e selezionare tutte le foto sperimentali di mosche da analizzare (Figura 1G). L'elenco delle immagini importate da analizzare è visualizzato in Seleziona file di dati grezzi (Figura 1H). Fai clic su Elabora tutti i file nella parte inferiore dei 5. Sezione Elaborazione batch .
   NOTA: Come promemoria, le analisi maschili e femminili devono essere eseguite separatamente. A seconda del computer utilizzato, questo passaggio può richiedere 10 minuti o più, soprattutto se sono presenti molte immagini importate.
10. Al termine del software, controllare la stessa cartella di file contenente le immagini sperimentali dell'occhio di mosca; ci saranno immagini nere denominate "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).

3. Utilizzo di ImageJ per preparare le foto per Flynotyper

1. Apri il file .tif generato da ilastik (le caselle nere) in ImageJ.
   NOTA: Ogni file .tif generato da ilastik deve essere gestito separatamente.
2. Usa lo strumento Selezione rettangolo per creare un rettangolo attorno solo all'occhio. Dopo aver disegnato il rettangolo, ritagliare l'area scegliendo Ctrl + X o Ctrl + C (Figura 2A). Attendi che appaia una casella nera a forma di contorno del rettangolo.
   NOTA: Il sistema operativo del computer determinerà se utilizzare 'Ctrl + X' o 'Ctrl + C'. Di solito, "Ctrl + X" è per Windows e "Ctrl + C" è usato per Mac.
3. Apri l'occhio di mosca ora tagliato usando ImageJ; clicca su File | Nuovo | Appunti interni (Figura 2B).
4. Salva l'occhio di mosca tagliato come JPEG facendo clic su File | Salva con nome | Jpeg. Le immagini tagliate si trovano ora nella stessa cartella di file delle immagini sperimentali originali.
   NOTA: Per semplificare il passaggio successivo, si consiglia di creare una nuova cartella di file chiamata "taglia" e inserire tutte le immagini tagliate in quella cartella.

4. Utilizzo di Flynotyper per calcolare i punteggi fenotipici

1. Apri Flynotyper come plug-in ImageJ facendo clic su Plug-in | Flynotyper.
2. Seleziona Aggiungi genotipi e apri la cartella contenente le immagini dell'occhio di mosca tagliata (cartella dei file tagliati). Il nome della cartella apparirà in Genotipi (Figura 2C).
3. Selezionare le caselle Microscopio ottico e Verticalmente, ma regolare di conseguenza se necessario. Selezionare le caselle Stabilità e Distanza dal centro sotto Rango ommatidi di: (Figura 2C).
4. Per il numero di ommatidi classificati considerati, input 200.
   NOTA: In generale, 200 è un buon numero, ma regolate di conseguenza in base alle preferenze.
5. Fare clic su Esegui e attendere che vengano visualizzati i risultati dell'analisi (Figura 2D).
   NOTA: Questo passaggio può richiedere 5 minuti o più (o meno) a seconda della potenza di elaborazione del computer utilizzato.
6. Copia e incolla il file di esempio e il P-Score nel software statistico per ulteriori analisi.

Results

In uno studio precedente, abbiamo utilizzato questo protocollo per determinare i modificatori genetici della proteina VCP mutante legata alla sclerosi laterale amiotrofica con demenza frontotemporale (ALS-FTD)¹². Inoltre, questo metodo è stato utilizzato anche in un altro articolo per valutare la tossicità dell CHCHD10 ALS-FTD mediata da^S59L, anche quando si utilizza un vecchio stereomicroscopio¹³. Per convalidare ulteriormente questi risultati, abbiamo utilizzato ilastik e Flynotyper nella stessa mutazione della malattia ALS-FTD di Baek et ^al.13; Tuttavia, un personale di laboratorio non addestrato ha eseguito l'esperimento e ha ottenuto risultati simili. Pertanto, la combinazione di ilastik e Flynotyper è un metodo robusto per valutare in modo imparziale la degenerazione della Drosophila ommatidia.

Preferiamo l'uso di una luce anulare perché consente migliori valutazioni qualitative (Figura 3). Tuttavia, l'uso di una luce anulare provoca un'ombra che Flynotyper non può analizzare direttamente. Per ovviare a questo problema, abbiamo pre-elaborato le immagini in ilastik prima di quantificare i P-Score con Flynotyper. Nel complesso, i punteggi P dell'occhio di mosca non degenerato (GMR-GAL4) erano significativamente più bassi rispetto a un occhio moderatamente degenerato (2x_S81L) e a un occhio gravemente degenerato (3x_S81L) (Figura 4A, B e Tabella 1). Questo è il risultato atteso, poiché P-Score più alti generati da Flynotyper indicano un occhio più degenerato¹. Quando ilastik non è stato utilizzato, c'erano differenze trascurabili nei punteggi P tra un occhio non degenerato e un occhio moderatamente degenerato (Figura 4C e Tabella 1). Ciò suggerisce che Flynotyper fatica a identificare con precisione i modelli di ommatidi in condizioni di luce anulare senza utilizzare ilastik. Questo perché Flynotyper è progettato per utilizzare immagini scattate con una luce a doppio punto che viene convertita in scala di grigi con regolazioni aggiuntive per identificare il centro dell'ommatidiale¹. Ilastik replica questo processo incorporando un punto al centro di ogni ommatidio, consentendo la quantificazione all'interno di Flynotyper.

Figura 1: Esempio di flusso di lavoro ilastik. (A) Creazione di un nuovo progetto in ilastik. (B) Scelta dell'immagine standard. (C) Selezione dei valori sigma in Selezione funzionalità. (D) Marcatura del primo piano degli ommatidi per la sensibilità. (E) Contrassegnare lo sfondo degli ommatidi per la sensibilità. (F) Selezione della modalità di esportazione dei file elaborati da parte del software. (G) Scegliere quali immagini sperimentali dell'occhio di mosca analizzare. (H) Mostrare quali immagini sperimentali dell'occhio di mosca saranno analizzate. (I) Prodotto finito dopo l'esecuzione del software. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio di flusso di lavoro di Flynotyper. (A) Selezione solo dell'occhio della mosca per ulteriori analisi. (B) Apertura dell'immagine dell'occhio tagliato in una nuova finestra. (C) Selezione delle immagini tagliate da analizzare e dei parametri da controllare per l'analisi. (D) Risultati di esempio. I punteggi fenotipici sono presentati all'estrema destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini qualitative degli occhi di Drosophila . Lo stesso occhio di mosca preso con una luce anulare (a sinistra) e preso con una luce a doppio punto (a destra) in condizioni non degenerate (in alto) e degenerate (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Utilizzo di ilastik prima di Flynotyper per una quantificazione accurata del fenotipo dell'occhio ruvido in Drosophila. (A) Immagini rappresentative dell'occhio di Drosophila di un occhio non degenerato (GMR-GAL4), di un occhio moderatamente degenerato (2x_S81L) e di un occhio gravemente degenerato (3x_S81L). (B) Risultati della quantificazione da Flynotyper dopo l'uso di ilastik. I valori P di un test t di permutazione a due lati sono stati calcolati per facilitare l'interpretazione dei risultati (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Risultati di quantificazione da Flynotyper senza l'uso di ilastik. I valori P di un test t di permutazione a due facce sono stati calcolati per facilitare l'interpretazione dei risultati (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 per ogni gruppo. I punti dati sono jitter o impilati sull'asse x per una maggiore chiarezza visiva. La linea orizzontale continua rappresenta la media. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
Con ilastik	Senza ilastik	Con ilastik	Senza ilastik	Con ilastik	Senza ilastik
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Tabella 1: Punteggi P quando si utilizza Flynotyper con ilastik e quando si utilizza Flynotyper da solo.

Figura S1 supplementare: Montatura a testa volante configurata per l'acquisizione dell'immagine. Questo è un esempio di come impostare l'acquisizione di immagini utilizzando più fogli di carta. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi metodo che garantisca il corretto orientamento della testa e dell'occhio della mosca. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Risultati quantitativi di ilastik e Flynotyper quando si utilizza un valore sigma di 2,5 nella selezione delle funzionalità. L'utilizzo di un valore sigma diverso da 5.0 nella selezione delle funzioni in ilastik può comportare una quantificazione imprecisa. In particolare, un valore sigma di 2,5 comporta una perdita di sensibilità. I valori P di un t-test di permutazione a due facce sono stati calcolati per facilitare l'interpretazione dei risultati (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 per ogni gruppo. I punti dati sono jitter o impilati sull'asse x per una maggiore chiarezza visiva. La linea orizzontale continua rappresenta la media. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Perdita di sensibilità e P-Score imprecisi a causa di chiazze necrotiche. Le frecce bianche indicano segmenti di macchie necrotiche. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Punteggi P quando si utilizza un valore sigma di 2,5 nella selezione delle funzioni. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Gli ommatidi di Drosophila costituiscono un sistema utile per lo studio di varie funzioni biologiche e malattie genetiche. La regolarità degli ommatidi è una buona misura per esaminare l'effetto delle mutazioni genetiche⁴. Anche se esistono diversi metodi per calcolare la regolarità ommatidiale, come la classificazione manuale, questi metodi possono essere fortemente distorti. Per superare questo approccio distorto, sono stati sviluppati strumenti semiautomatici ^1,11.

Per una quantificazione oculare accurata, la preparazione e l'impostazione della mosca devono essere ottimizzate. Anche se comprendiamo che ogni laboratorio avrà la sua configurazione, stiamo fornendo la seguente configurazione nel nostro laboratorio per dare ai lettori un'idea su come preparare le mosche per l'acquisizione delle immagini. Le mosche vengono congelate e conservate a -80 °C. Abbiamo utilizzato un campione di 3 perché, nella nostra esperienza, quando GMR-GAL4 è combinato con la mutazione S81L, c'è pochissima variazione tra la popolazione. Tuttavia, tieni presente che la dimensione del campione deve essere regolata per eseguire il test di significatività dell'ipotesi nulla. Per montare le mosche per l'acquisizione dell'immagine, la testa della mosca poggia su un foglio di carta molto piccolo che funge da cuscino in modo che il centro dell'occhio sia all'incirca il piano focale (Figura supplementare S1). Il nostro laboratorio utilizza un microscopio Z-stack e una fotocamera (vedi Tabella dei materiali) in quanto produce immagini complessivamente più chiare, consentendo la migliore visualizzazione dell'intero occhio poiché l'occhio di mosca è a forma di cupola. Tuttavia, la funzione Z-stack non è un requisito per questo protocollo, poiché abbiamo utilizzato con successo questo metodo con uno stereomicroscopio più vecchio senza la funzione Z-stack¹³. La ghiera della luce anulare per la luminosità è ruotata non più di 1/4 verso l'alto per evitare la sovraesposizione. Lo spessore totale dei nostri campioni varia tra 300 e 450 micron.

In questo studio, abbiamo dimostrato che l'analisi degli occhi di mosca con ilastik e Flynotyper genera risultati di quantificazione degli ommatidi imparziali e affidabili. Abbiamo analizzato i pattern di Drosophila ommatidia utilizzando ilastik, uno strumento di analisi delle bioimmagini basato sull'apprendimento automatico, per marcare gli ommatidi, e poi Flynotyper, un metodo computazionale utilizzato per misurare la regolarità degli ommatidi ^1,11. Preferiamo utilizzare una luce anulare per ottenere immagini per una migliore valutazione qualitativa. Tuttavia, questo approccio non consente a Flynotyper di produrre risultati quantitativi utilizzando queste immagini. Pertanto, ilastik è implementato per pre-elaborare queste immagini e queste immagini elaborate sono state utilizzate con successo con Flynotyper per produrre risultati quantitativi. Quando le immagini non sono state pre-elaborate con ilastik prima di Flynotyper, i punteggi P complessivi erano simili tra occhi non degenerativi e degenerativi. Ciò evidenzia l'importanza di utilizzare ilastik per primo quando si implementa una luce anulare per ottenere risultati quantitativi.

Ci sono alcune limitazioni nei nostri metodi. Le impostazioni in ilastik possono variare notevolmente e possono portare a dati non significativi. Ad esempio, abbiamo eseguito un'altra serie di analisi utilizzando le stesse immagini, ma abbiamo regolato il valore sigma in primo piano in ilastik a 2,5 invece di 5. Ciò ha comportato una perdita di sensibilità nei fenotipi moderatamente degenerativi (Figura S2 e Tabella S1). Un'altra limitazione è la perdita di sensibilità agli occhi con troppa degenerazione. Rispetto ad un occhio 3x_S81L, un occhio con chiazze necrotiche è qualitativamente molto più degenerato. Tuttavia, il P-Score medio per 3x_S81L occhi era 60,2, mentre il P-score medio per gli occhi con chiazze necrotiche era 60,9. Pertanto, anche gli occhi con troppa degenerazione, come le chiazze necrotiche, possono causare perdita di sensibilità (Figura supplementare S3).

Un passaggio critico di questo protocollo è la selezione di un'immagine standard appropriata, che viene utilizzata per addestrare ilastik. Un'immagine standard non degenerata con un contrasto distinto tra gli ommatidi e le cellule pigmentate circostanti, come gli occhi rossi o arancioni, risulterà in una quantificazione più accurata in Flynotyper. Un altro passaggio critico è la selezione delle funzioni in ilastik, in cui la sensibilità, rappresentata da valori sigma, viene selezionata per mettere a punto il software di apprendimento automatico (Figura 1D). La selezione di un numero insufficiente di caratteristiche può ridurre la sensibilità dell'ilastik, portando a una marcatura imprecisa degli ommatidi. La selezione di troppe funzioni aumenterà il tempo e la potenza di elaborazione necessari per generare risultati, riducendo l'efficienza della procedura. In alternativa, se c'è una notevole degenerazione qualitativa dell'occhio, ma i risultati dell'analisi non sono statisticamente significativi, aumentare il valore sigma delle caratteristiche selezionate sarebbe una potenziale soluzione. Tuttavia, le selezioni di funzionalità fornite in questo protocollo producono regolarmente risultati accurati. Seguire i passaggi critici scritti aiuterà a mitigare i problemi più comuni e la risoluzione dei problemi in futuro.

In sintesi, questo metodo fornisce immagini qualitative migliori, fornendo al contempo una quantificazione imparziale e affidabile del sistema oculare di Drosophila . Di conseguenza, questo metodo potrebbe migliorare l'utilità della degenerazione oculare come potente strumento per modellare le malattie degenerative in futuro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Specifiche del			Ryzen 5, 16 GB di RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Scarica il software qui: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Software open source. Non utilizzare Flynotyper 2.0. Al momento della pubblicazione, la versione 2.0 era abbastanza nuova e questo protocollo è ottimizzato per la versione originale di Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Scarica il software qui: https://www.ilastik.org/download.html	Software open source. Scarica la versione 1.4.0.post1 in Regular Builds corrispondenti al sistema operativo del tuo computer.
ImageJ		Scarica il software qui: https://imagej.net/ij/download.html	Software open source. Sono state utilizzate le versioni 1.53 e 1.54. 1.54 è la versione aggiornata ed è il download predefinito.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	Sistema e software utilizzati per l'acquisizione z-stack.
Microscopio Leica Z16 APO con fotocamera DMC2900	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Nel testo viene indicato come microscopio Z-stack e fotocamera. Questo prodotto è ora archiviato.