Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Summary

Qui, descriviamo la procedura per analizzare la progressione della replicazione attraverso ripetizioni patogene e inclini alla struttura utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale.

Abstract

La gel-elettroforesi bidimensionale neutra/neutra (2DGE) è emersa come tecnica di riferimento per analizzare la replicazione del DNA attraverso impedimenti naturali. Questo protocollo descrive come analizzare la progressione della forcella di replicazione attraverso ripetizioni di DNA espandibili e soggette a struttura all'interno dell'episoma basato sul virus delle scimmie 40 (SV40) nelle cellule umane. In breve, dopo la trasfezione del plasmide nelle cellule umane, gli intermedi di replicazione vengono isolati mediante il protocollo Hirt modificato e trattati con l'enzima di restrizione DpnI per rimuovere il DNA non replicato. Gli intermedi vengono quindi digeriti da appropriati enzimi di restrizione per collocare la ripetizione di interesse all'interno della metà distale di origine di un frammento di DNA lungo 3-5 kb. Gli intermedi di replicazione sono separati in due dimensioni perpendicolari, prima per dimensione e poi per forma. Dopo l'ibridazione Southern blot, questo approccio consente ai ricercatori di osservare lo stallo della forcella in varie ripetizioni di formazione della struttura sulla metà discendente dell'arco Y di replicazione. Inoltre, questo posizionamento del sito di stallo consente la visualizzazione di vari risultati dello stallo della forcella mediato dalla ripetizione, come l'inversione della forcella, l'avvento di una forcella convergente e il riavvio della forcella ricombinatrice.

Introduction

Le brevi ripetizioni tandem (STR) sono piccole sequenze ripetitive di DNA che costituiscono circa il 3% del genoma umano¹. Gli STR svolgono un ruolo importante nella regolazione genica²; tuttavia, la loro composizione ripetitiva li rende inclini alla formazione di strutture secondarie del DNA non canoniche e alla conseguente instabilità genetica ^3,4. Dalle eliche sinistrorse alle forcine/cruciformi, alle eliche a tre e quattro filamenti, queste strutture alternative del DNA causano sfide intrinseche per il replosoma. Un prerequisito naturale per la formazione della struttura secondaria è lo svolgimento del DNA, che è un prerequisito per la replicazione del DNA. Ciò rappresenta un enigma unico per il funzionamento del genoma poiché molte di queste strutture possono formarsi durante la replicazione, ostacolando la progressione del reposoma e, infine, causando lo stallo della forcella^di replicazione ^5,6,7 o, nei casi più gravi, il collasso della forcella e la rottura del DNA ^8,9. È stato dimostrato che sia il riavvio delle forcelle in stallo che le vie di riparazione del DNA portano a instabilità ripetuta, come espansioni ripetute^10,11 e riarrangiamenti genomici complessi (CGR)^12,13. Questi eventi possono portare allo sviluppo di circa 60 malattie umane note come disturbi dell'espansione ripetuta, tra cui la sindrome dell'X fragile, la malattia di Huntington, l'atassia di Friedreich e altre^14,15, nonché malattie CGR, come la sindrome di Emmanuel¹⁶. Pertanto, per comprendere meglio i meccanismi della malattia umana guidata dall'instabilità delle ripetizioni, è imperativo studiare i dettagli della progressione della forcella di replicazione attraverso tali ripetizioni.

Una tecnica per studiare la progressione della replicazione è emersa a metà degli anni '80, quando Brewer e Fangman hanno cercato di fornire prove dirette che l'inizio della replicazione in Saccharomyces cerevisiae avviene a livello di elementi di sequenza di replicazione autonoma (comunemente noti come ARS)¹⁷. In tal modo, hanno separato le strutture degli intermedi di replicazione del lievito nell'agarosio, adattando un metodo precedente di Bell e Byers noto come elettroforesi su gel neutro/neutro bidimensionale (2DGE)¹⁸. Questa tecnica ha sfruttato il fatto che il DNA non lineare viaggia in modo diverso nel gel di agarosio rispetto al suo equivalente lineare della stessa massa. Più specificamente, in 2DGE, il DNA isolato viene separato in due dimensioni perpendicolari, prima principalmente per dimensione e poi principalmente per forma, per creare una mappa completa della replicazione in una particolare regione di interesse. Nel loro articolo originale, Brewer e Fangman hanno dimostrato che questo è un arco composto da strutture a "Y semplici" o forcelle di replicazione che collegano il DNA non replicato alle loro controparti replicate. Descrivono inoltre altri intermedi osservati come "bolle" e "doppia Y", che rappresentano rispettivamente le origini di replicazione e le forcelle convergenti.

Il 2DGE può essere utilizzato per studiare le popolazioni relative di intermedi di replicazione del DNA in un dato momento. Pertanto, se una popolazione di intermedi è più prevalente di un'altra, ciò sarebbe evidente alla visualizzazione. Ciò rende 2DGE uno strumento particolarmente utile per studiare la progressione della replicazione attraverso sequenze impegnative, come le ripetizioni di formazione della struttura. Ad esempio, se la regione analizzata contiene una sequenza in grado di indurre lo stallo della forcella di replicazione, questo si presenterebbe come un rigonfiamento sull'arco (Figura 1A), indicando un accumulo di forcelle di replicazione in quel locus. Questo può essere visto con la replicazione di entrambe le sequenze di ripetizioni formanti forcine nel lievito 19,20,21 e ripetute triplex nelle cellule umane 22,23,24. Oltre allo stalling, il 2DGE può essere utilizzato per osservare strutture di DNA che non sono conformi allo standard di Ys semplice formato durante la replicazione, come nel caso degli intermedi ricombinanti²⁵. Questi intermedi hanno una struttura a forma di X più pesante e ramificata e, quindi, viaggiano più lentamente sia nella prima che nella seconda dimensione rispetto alle forche di replica standard. Risultati simili possono essere osservati anche per quanto riguarda l'inversione della forcella di replicazione 20,24,26. In risposta a un forte stress di replicazione, è stato dimostrato che le cellule eucariotiche utilizzano l'inversione della forcella di replicazione per salvare le forcelle in stallo. Queste forcelle invertite hanno un peso molecolare simile a quelle delle forcelle in stallo; tuttavia, la loro struttura a zampa di pollo si traduce in una mobilità elettroforetica più lenta nella seconda dimensione rispetto ai loro complementi a forma di Y, con conseguente estensione verso l'alto e verso l'esterno dall'arco.

Figura 1: Analisi dell'elettroforesi su gel 2D della replicazione del DNA. (A) Schema di un tipico 2DGE che raffigura la replicazione attraverso una ripetizione di formazione della struttura in grado di indurre lo stallo della forcella. Le dimensioni e la struttura intermedie influenzeranno la mobilità elettroforetica. (B) Esempio di arco Y con bracci ascendenti e discendenti rispettivamente etichettati. Abbreviazione: 2DGE = Elettroforesi su gel bidimensionale neutro/neutro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Naturalmente, uno degli aspetti più importanti di 2DGE riguarda la qualità e la quantità degli intermedi di replicazione. Tuttavia, la risoluzione dell'analisi 2DGE della replicazione attraverso loci endogeni in cellule di mammifero è insufficiente per una singola sequenza bersaglio di copia all'interno del genoma umano diploide 6 × 10⁹ bp, sebbene sia stata fatta per geni multi-copia, come il locus²⁷ DHFR fortemente amplificato o l'RNA ribosomiale²⁸. La replicazione basata su SV40 è un mezzo efficiente e ben caratterizzato per studiare la replicazione nelle cellule eucariotiche²⁹. Fornisce un modello affidabile di replicazione eucariotica che utilizza la maggior parte del meccanismo di replicazione dell'ospite per replicare il genoma virale, che viene parcellizzato in nucleosomi dopo l'infezione^30,31. Due eccezioni degne di nota del replosoma dei mammiferi sono che l'antigene T (Tag), invece del complesso CMG ospite, funge da DNA elicasi replicativa, e la DNA polimerasi delta sintetizza sia i filamenti di DNA principali che quelli ritardati³². Abbiamo sfruttato questo sistema posizionando tratti patogeni di ripetizioni di formazione della struttura a valle di un'origine di replicazione SV40 all'interno di un plasmide che è stato originariamente creato nel laboratorio Massimo Lopes²². È importante sottolineare che questo plasmide contiene anche il gene che codifica per Tag stesso, determinando così la sua replicazione costitutiva ed estremamente potente dopo la trasfezione in una varietà di cellule umane in coltura. Questa caratteristica dà origine ad una grande quantità di prodotti, ideali per l'analisi 2DGE degli intermedi formati durante e in risposta alla replicazione di ripetizioni patogene nelle cellule umane. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per visualizzare la replicazione delle ripetizioni che formano la struttura all'interno dell'episoma umano basato su SV40 utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale.

Protocol

NOTA: Il plasmide progettato per la nostra analisi 2DGE delineata in cellule di mammifero dovrebbe contenere un'origine di replicazione SV40 diversi kb a monte delle ripetizioni inclini alla struttura (Figura 2). La sintesi leading e lagging dovrebbe essere tenuta a mente quando si sceglie quale orientamento rispetto all'origine le ripetizioni dovrebbero essere clonate nel plasmide.

Figura 2: Digestione di plasmidi contenenti ripetizioni per l'analisi 2DGE. Le ripetizioni soggette a struttura sono rappresentate diversi kb a valle della forcella di replicazione che si muove a destra. La digestione con le taglierine uniche 1 e 2 posizionerà la sequenza ripetuta sul braccio discendente dell'arco Y, data la sequenza oltre il punto di metà del frammento digerito. Abbreviazione: 2DGE = Elettroforesi su gel bidimensionale neutro/neutro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Trasfezione plasmidica in cellule di mammifero

1. Seminare 600.000 cellule HEK293T in una piastra di coltura tissutale di 10 cm prima della trasfezione. Lasciare che le celle si riprendano a 37 °C durante la notte.
   NOTA: Molte linee cellulari possono essere utilizzate per questo esperimento, anche se si raccomandano celle contenenti il tag SV40 per ottenere risultati ottimali. ATTENZIONE: HEK293T cellule sono considerate BSL-2 e tutto il lavoro di coltura deve essere eseguito in una cabina di biosicurezza utilizzando un'appropriata tecnica asettica e DPI adeguati.
2. Quando le cellule raggiungono il 60% di confluenza, trasfettare 8 μg di DNA plasmidico contenente ripetizioni nelle cellule seminate utilizzando reagenti di trasfezione appropriati in conformità con il protocollo del produttore.
3. Se in questo momento non sono isolanti intermedi, aspirare il vecchio terreno e sostituirlo con 10 ml di terreno fresco dopo 24 ore.
4. Iniziare a raccogliere le cellule 24-48 ore dopo la trasfezione.
   1. Aspirare il terreno e lavare accuratamente con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Staccare e raccogliere le cellule utilizzando 0,5 mL di tripsina e centrifugare a 340 × g per 4 minuti.
   2. Aspirare il surnatante e lavare i pellet cellulari con PBS. Centrifugare nuovamente a 340 × g per 4 minuti e aspirare il surnatante.
      NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa congelando i pellet di celle a -80 °C. Abbiamo trovato la migliore risoluzione isolando gli intermedi di replicazione 48 h dopo la trasfezione; Tuttavia, 24 ore ha prodotto risultati validi.

2. Isolamento degli intermedi di replicazione

1. Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone di lisi Hirt modificato [10 mM di tris-HCl (pH 7,5), 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)] in provette coniche da 50 mL e iniziare la lisi cellulare.
   1. Aggiungere il dodecil solfato di sodio (SDS) a una concentrazione finale dello 0,6% (circa 650 μL di SDS al 2%) e la proteinasi K a una concentrazione finale di 100 μg/mL (circa 10 μL di proteinasi K da 20 mg/mL) per rimuovere le nucleasi.
   2. Miscelare delicatamente pipettando fino a ottenere un composto omogeneo e incubare la miscela a 37 °C per almeno 90 minuti.
2. Aumentare la concentrazione di NaCl a 1 M (circa 540 μL di NaCl 5 M) e mescolare delicatamente fino a ottenere un composto omogeneo. Incubare per una notte (18-24 ore) a 4 °C per consentire la precipitazione di detriti cellulari, RNA e proteine mediante salatura.
   NOTA: La miscela sarà molto viscosa, quindi fai attenzione e sii paziente mentre mescoli bene.
3. Il giorno seguente, separa il DNA dai detriti cellulari, dall'RNA e dalle proteine.
   1. Centrifugare la miscela a 29.500 × g per 45 minuti a 4 °C.
   2. Trasferire il surnatante contenente DNA, aggiungere un volume di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico 25:24:1 (v/v) e mescolare brevemente fino a ottenere un composto omogeneo.
      ATTENZIONE: Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico è un materiale pericoloso e deve essere maneggiato con DPI appropriati in una cappa chimica.
   3. Centrifugare nuovamente a 15.000 × g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo conico.
4. Precipitare e lavare il DNA isolato.
   1. Aggiungere un volume di isopropanolo puro e incubare a temperatura ambiente per almeno 5 minuti. Centrifugare il DNA a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
   2. Decantare il surnatante e lavare il pellet con etanolo freddo al 70% per rimuovere il sale in eccesso.
   3. Centrifugare nuovamente a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C, asciugare all'aria e risospendere delicatamente il pellet nel tampone Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
      NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere congelati a -20 °C; tuttavia, il ciclo di congelamento/disgelo dovrebbe essere evitato in quanto ciò può ridurre la qualità degli intermedi di replicazione del DNA.

3. Preparazione del campione ed elettroforesi su gel bidimensionale

1. Digerire gli intermedi isolati della replicazione plasmidica.
   1. Aggiungere 100 unità degli enzimi di restrizione appropriati al campione per digerire il DNA plasmidico, posizionando in particolare la sequenza contenente la ripetizione sulla metà distale di origine del frammento lineare (Figura 2). Inoltre, aggiungere DpnI per tagliare il DNA metilato, rimuovendo così il DNA plasmidico che non è stato completamente replicato nelle cellule umane in coltura.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, gli enzimi di restrizione dovrebbero essere taglierine uniche che producono un frammento di 3-5 kb che posiziona la sequenza incline alla struttura sul braccio discendente dell'arco Y.
   2. Incubare i campioni a 37 °C per 6-10 ore per consentire la completa digestione del plasmide.
   3. Far precipitare il DNA con 2,5 volumi di etanolo puro freddo e incubare a -20 °C per una notte, oppure aggiungere un volume di isopropanolo e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   4. Centrifugare i campioni digeriti e precipitati a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
   5. Decantare il surnatante e lavare il campione con etanolo freddo al 70%. Centrifugare nuovamente a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
   6. Decantare il surnatante, asciugare all'aria per 10 minuti e risospendere i campioni in 15 μl di tampone TE.
2. Preparare il gel di agarosio di prima dimensione allo 0,4-0,5% in 1x Tris-borato-EDTA (TBE) (89 mM di tris base, 89 mM di acido borico, 2 mM di EDTA). Lasciare solidificare la soluzione per almeno 1 ora.
3. Iniziare a caricare i campioni nella prima dimensione.
   1. Caricare la scala entro i primi 3 cm rispetto al bordo più a sinistra del gel. Quindi, caricare l'intero campione preparato, assicurandosi di 3 cm tra ogni coppia.
   2. Far scorrere il gel in 1x TBE per 19-24 ore a 0,85 V/cm per separare gli intermedi rispetto alle loro dimensioni. Assicurarsi che la camera sia coperta per proteggere i campioni dalla luce, che potrebbe causare danni al DNA.
4. Il giorno seguente, rimuovere il gel dal tampone e stimare la posizione del frammento lineare digerito utilizzando un righello.
   1. Asportare i primi 3 cm di gel contenente la scala e colorare il segmento di gel in 1x TBE contenente 0,3 μg/mL di bromuro di etidio per 10-15 minuti. Visualizzare la scala utilizzando un sistema di documentazione su gel.
   2. Aggiungere 1,3 cm alla posizione stimata, ottenendo il valore a. Quindi, sottrai 7,5 cm dal valore a, ottenendo il valore b. Allineare il righello contro il gel di prima dimensione e tagliare orizzontalmente in corrispondenza dei valori a e b. Quindi, tagliare verticalmente lo spazio di 3 cm riservato a ciascun campione. Fare riferimento alla Figura 3 per uno schema visivo.
   3. In un nuovo vassoio di colata, ruotare i segmenti in senso orario e posizionarli nella posizione dei pozzetti del campione (Figura 3).
5. Preparare il gel di agarosio di seconda dimensione a una concentrazione dell'1-1,3% in 1x TBE a 0,3 μg/mL di bromuro di etidio.
   1. Dopo il raffreddamento a circa 55 °C, versare il gel di seconda dimensione sui segmenti di prima dimensione ruotati e lasciarlo solidificare per almeno 1 ora.
   2. Trasferire la seconda dimensione in una camera con 1x TBE a 0,3 μg/mL di bromuro di etidio e lasciare che il gel si equilibri per almeno 30 minuti.
   3. Far scorrere il gel, sempre coperto, per 9-10 ore a 4,23 V/cm a 4 °C per separare gli intermedi rispetto alla loro forma.

Figura 3: Escissione di intermedi di prima dimensione prima della separazione di seconda dimensione. Dopo la visualizzazione della scala, è possibile stimare la mobilità dei frammenti non replicati. (I) Questo valore può quindi essere utilizzato per determinare i siti di taglio appropriati (a e b) per asportarlo e le sue controparti replicate (II). La sezione del gel deve quindi essere ruotata e posta nella posizione dei pozzetti per la separazione di seconda dimensione. Abbreviazione: CW = senso orario. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Southern blotting e ibridazione con sonda radiomarcata

1. Rimuovere il gel di seconda dimensione dalla camera e depurinare i frammenti di DNA per 10 minuti in una soluzione di HCl 0,24 M con un leggero oscillamento. Sciacquare il gel con acqua deionizzata e immergerlo in NaOH 0,4 M per 10-15 minuti.
   ATTENZIONE: HCl e NaOH sono corrosivi e devono essere maneggiati con DPI appropriati in una cappa chimica.
2. Iniziare ad assemblare il Southern blot per facilitare il trasferimento degli intermedi separati dal gel alla membrana. Fare riferimento alla Figura 4 per uno schema completo.
   1. Riempire un contenitore di dimensioni sufficienti con 1 L di NaOH 0,4 M.
   2. Allineare una lunga lastra di vetro sul contenitore e piegare (per tutta la lunghezza) due lunghi fogli di carta per cromatografia perpendicolari sulla lastra di vetro, estendendosi nel contenitore di NaOH.
   3. Bagnare la parte superiore della carta con NaOH e rimuovere con cura eventuali bolle d'aria sotto la sua superficie.
   4. Immergere tre fogli di carta per cromatografia con NaOH e posizionarli sopra la carta piegata, rimuovendo nuovamente eventuali bolle.
   5. Capovolgere il gel di seconda dimensione e trasferirlo sulle carte.
   6. Inumidire una membrana di nylon caricata positivamente (dimensione dei pori di 0,45 μm) con acqua deionizzata e posizionarla sopra il gel.
   7. Infine, aggiungere altri tre fogli di carta, bagnati con acqua deionizzata, sopra la membrana.
   8. Coprire il NaOH esposto nel contenitore inferiore con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Posiziona una pila di tovaglioli o tovaglioli di carta sopra la macchia, assicurandoti che sia alta 0,3-0,5 m. Posizionare un peso sulla parte superiore, comprimendo l'intera macchia per facilitare l'azione capillare stretta. Attendere almeno 2 giorni affinché il DNA si trasferisca sulla membrana.
      NOTA: La lunghezza e la larghezza della carta e della membrana per cromatografia dipendono dalle dimensioni del gel di agarosio utilizzato per la seconda dimensione. Per un trasferimento più efficiente, utilizzare carta e membrana delle stesse dimensioni del gel.
3. Dopo il trasferimento, reticolare il DNA alla membrana utilizzando un reticolante UV a 120 μJ/cm² per 1 minuto.
   NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui posizionando la membrana in un foglio protettivo ermetico, asciutto e pulito a temperatura ambiente.
4. Lavare la membrana 2 volte per 5 minuti con 2 citrato di sodio salino (tampone SSC) (0,3 M NaCl, 0,03 M citrato di sodio).
5. Preibridare la membrana con 0,18 mL/^cm2 di tampone di ibridazione di Church & Gilbert [1 mM EDTA, 1% albumina sierica bovina (BSA), 0,5 M di fosfato di sodio, 7% SDS] a 65 °C, ruotandola in un incubatore di ibridazione per almeno 2 ore.
   NOTA: La membrana può preibridarsi per diversi giorni.
6. Preparare la sonda radiomarcata utilizzando ^α-32P dATP o dCTP e un kit di marcatura del DNA in conformità con il protocollo del produttore.
   ATTENZIONE: I dNTP radiomarcati sono pericolosi e durante la manipolazione è necessario indossare DPI adeguati. Tutto il lavoro radioattivo dovrebbe essere eseguito dietro una schermatura e le persone addestrate dovrebbero essere monitorate per l'assorbimento delle radiazioni utilizzando dosimetri.
   1. Progettare un frammento di DNA lineare da 400-900 bp complementare alla sequenza digerita con restrizione (Figura 2) e amplificare il frammento utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR).
      NOTA: Si consiglia di avere un frammento PCR stock di 50-100 ng/μL
   2. Combinare 100 ng del frammento PCR complementare con DNA Pol I, tampone del frammento di Klenow (3' 5' exo-) e oligo decanucleotidici casuali.
   3. Denaturare il frammento a 100 °C per 10 min.
   4. Aggiungere al campione 5 unità di DNA Pol I, frammento di Klenow (3' 5' exo-), 50 μCi di ^α-32P dNTP e 30-50 μmol di miscela di dNTP carente di tipo dNTP radiomarcato.
   5. Incubare a 37 °C per 10 minuti per consentire la polimerizzazione e l'incorporazione di dNTP radiomarcato.
   6. Aggiungere 30-50 μmol di tipo dNTP precedentemente assente al campione e incubare a 37 °C per 10 minuti.
   7. Purificare il frammento radiomarcato utilizzando una colonna di centrifuga a 3.000 × g per 2 minuti.
7. Aggiungere una sonda radiomarcata a 50 mL di tampone di ibridazione e incubare con la membrana per una notte a 65 °C rotante in un incubatore di ibridazione.
8. Il giorno successivo, rimuovere la sonda e lavare la membrana 2 volte con il tampone di lavaggio 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) a 42 °C e 2 volte con il tampone di lavaggio 2 (2x SSC, 0,1% SDS) a 65 °C.
   NOTA: Tutti i lavaggi devono essere eseguiti con rotazioni rapide per 15 minuti nell'incubatrice.
9. Asciugare la membrana per 10 minuti e metterla in un foglio protettivo sottile e trasparente. Conservare la membrana sigillata in una cassetta controllata e resistente alle radiazioni con uno schermo sensibile ai fosfori. Lasciare che la membrana sia esposta allo schermo per 1-10 giorni.
10. Visualizzare i risultati utilizzando un imager biomolecolare impostato sull'imaging al fosforo. Lavare e riesporre se necessario.

Figura 4: Assemblaggio di Southern blot. Schema completo di un tipico apparato utilizzato per il trasferimento Southern blot di intermedi dalla seconda dimensione su una membrana di nylon. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

In caso di successo, dopo la visualizzazione, si può osservare un arco acuto di forcelle di replicazione che si estendono verso l'alto e verso l'esterno dal massiccio punto 1n (Figura 5A). La dimensione di un frammento, o percentuale replicata, determina la mobilità del frammento nella prima dimensione. Man mano che gli intermedi sviluppano una struttura più articolata, inizieranno a viaggiare più lentamente nella seconda dimensione. Pertanto, se un intermedio ha viaggiato lentamente in entrambe le dimensioni, si può affermare che si tratta di una molecola altamente replicata con una significativa variazione giunzionale rispetto alle forcelle di replicazione convenzionali. Nel caso della sintesi a filamento ritardato della ripetizione (GAA)₁₀₀ , lo stallo della forcella è indicato da un punto definito scurito sull'arco (I), che rappresenta un accrescimento delle forcelle di replicazione all'incontro della ripetizione (Figura 5B), probabilmente dovuto alla formazione di triplex. Questo è accompagnato da intermedi più pesanti e ramificati (II e III) sopra il sito di stallo. Abbiamo descritto la natura di questi intermedi in modo più approfondito in Rastokina et al. 2023²⁴. In breve, questi rappresentano probabilmente una combinazione di forche che si invertono in risposta allo stallo (II), oltre all'avvento della forcella convergente (Figura 5B) (III).

Un'osservazione che può essere fatta sulla visualizzazione è un arco ampio e non ideale. Nel peggiore dei casi, questo può presentarsi come un completo raddoppio dell'arco. Tipicamente, questo rappresenta una scarsa separazione degli intermedi nella prima dimensione. Ciò può essere attribuito a diversi fattori, il più probabile dei quali è la contaminazione da sale o proteine nel campione intermedio di replicazione. Una purificazione fenolo:cloroformio dopo aver digerito gli intermedi, seguita da un lavaggio approfondito con etanolo al 70%, può ridurre al minimo questo rischio. Tuttavia, va notato che un'ulteriore esposizione al fenolo può aumentare la possibilità di denaturare gli intermedi, che possono presentarsi come un'intensità oscurata del DNA lineare sotto l'arco, che rappresenta intermedi di replicazione collassati (Figura 5C).

Nello scenario peggiore, la visualizzazione può comportare una completa assenza di intermedi di replicazione, evidenziata dalla mancanza di arco (Figura 5D). È improbabile che l'assenza di un arco sia attribuita a intermedi di replicazione denaturati, poiché non c'è una macchia scura sotto l'area prevista dell'arco. Data la presenza di un punto 1n (IV) particolarmente piccolo, la quantità complessiva di DNA presente in questo esempio raffigurato è minima e, pertanto, questo problema può essere causato da una sottoreplicazione del plasmide o da una scarsa trasfezione o isolamento generale del DNA.

Figura 5: Potenziali risultati dell'analisi 2DGE. (A) Analisi 2DGE riuscita della replicazione attraverso la ripetizione di formazione della struttura (GAA)₁₀₀ in cellule HEK293T. (I) si riferisce alle forche bloccate alla ripetizione, mentre (II) e (III) si riferiscono a intermedi più strutturati che sorgono in risposta allo stallo. Un'illustrazione del frammento di 2,7 kb è raffigurata sopra. (B) Intermedi rappresentativi che si verificano durante la replica della ripetizione (GAA)₁₀₀ . Utilizzando i knockdown dei siRNA dei geni di inversione della forcella di replicazione e di riavvio, sono stati stabiliti controlli genetici per identificare la natura di questi intermedi. (C) Rappresentazione di intermedi di replicazione non risolti che possono apparire se le forcelle vengono denaturate durante l'isolamento. (D) Un esperimento 2DGE fallito come dimostrato da una completa assenza di intermedi di replicazione. IV rappresenta frammenti lineari e non replicati del plasmide digerito. Abbreviazione: 2DGE = Elettroforesi su gel bidimensionale neutro/neutro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

2DGE fornisce un'immagine semiquantitativa e completa delle popolazioni relative di intermedi che si formano durante la replicazione di una particolare sequenza. Dato che le fragili strutture molecolari delle forcelle di replicazione devono essere mantenute durante questa procedura, è necessario prestare molta attenzione per prevenire il taglio fisico e la denaturazione chimica. Pertanto, si raccomanda vivamente di evitare qualsiasi trattamento alcalino durante l'isolamento del plasmide. Per evitare ciò, noi e altri abbiamo implementato una forma modificata dell'isolamento di Hirt del DNA, stabilita da Hirt nel 1967³³. Qui, il DNA viene separato da proteine, RNA e altri detriti cellulari trattando il lisato cellulare con 1 M di NaCl a 4 °C durante la notte. Sebbene questo metodo si sia dimostrato eccezionale per preservare la qualità degli intermedi di replicazione, non sembra separare completamente il DNA plasmidico dal DNA genomico. Questo deve essere tenuto presente quando si progetta la sequenza per il sondaggio radiomarcato, poiché la sonda progettata non dovrebbe avere un'elevata somiglianza di sequenza con il DNA genomico per evitare al meglio il legame fuori bersaglio. Inoltre, l'integrità degli intermedi di replicazione può essere notevolmente aumentata attraverso la reticolazione UV-psoralene. Qui, le cellule possono essere incubate con psoralene per diversi minuti al buio prima di essere irradiate con raggi UV a 366 nm³⁴, creando così legami covalenti tra le molecole di DNA. Oltre a rafforzare la coesione delle strutture intermedie, ciò può anche alleviare la preoccupazione che le strutture si formino durante l'isolamento piuttosto che in vivo.

Un aspetto che dovrebbe essere considerato quando si progetta questo esperimento è il posizionamento ripetuto sull'arco finale risolto. La prima metà dell'arco che si estende dal punto 1n è indicata come braccio ascendente, mentre la seconda metà è nota come braccio discendente (Figura 1B). Per osservare lo stallo della forcella di replicazione, dovrebbe essere sufficiente il posizionamento ripetuto su entrambi i bracci dell'arco. Tuttavia, per osservare intermedi più strutturati che sorgono in sequenze ripetute, come le giunzioni postreplicative, si consiglia di posizionare la sequenza ripetuta sul braccio discendente. Ciò è in gran parte dovuto alla mobilità elettroforetica più lenta di questi intermedi in entrambe le dimensioni, che può comportare una co-migrazione con semplici strutture Ys più avanti nella loro progressione se la sequenza contenente ripetizioni fosse posizionata sul braccio ascendente, ostacolando così qualsiasi analisi dettagliata. Per ottenere la migliore risoluzione, si consiglia di posizionare la sequenza di ripetizione tra il 60% e il 90% all'interno del frammento di interesse rispetto all'origine della replica.

L'attenzione ai dettagli deve essere utilizzata durante la fase di trasferimento del DNA e il successivo trattamento della membrana. È estremamente importante che il Southern blot sia assemblato in modo da facilitare un trasferimento uniforme e stretto del DNA alla membrana. Ciò significa che tutti i componenti del trasferimento sono privi di bolle d'aria e che l'apparecchio è uniforme su tutta la sua superficie. Per aiutare in questo, è standard capovolgere il gel di seconda dimensione prima di aggiungerlo al Southern blot. Si presume che la parte inferiore del gel sia più piatta della parte superiore; pertanto, capovolgendo il gel si garantisce il trasferimento più fluido possibile del DNA alla membrana.

Se nella risoluzione finale del blot è presente un forte fondo, ciò può essere indicativo del legame non specifico della sonda radiomarcata. Questo può essere alleviato in diversi modi. Innanzitutto, è necessario verificare che la sonda non contenga un'elevata somiglianza di sequenza con alcun DNA genomico. Questo può essere facilmente verificato utilizzando lo strumento di ricerca per l'allineamento locale di base dei nucleotidi (BLAST), che è prontamente disponibile attraverso il sito web NIH³⁵. In caso contrario, le sonde non specificamente legate possono essere rimosse attraverso ulteriori lavaggi rigorosi. Si consiglia di iniziare con due lavaggi aggiuntivi del tampone 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) a 42 °C a intervalli di 15 minuti ciascuno; Tuttavia, potrebbero essere necessari più lavaggi. Infine, anche la temperatura alla quale avviene l'ibridazione può essere alterata. Per la maggior parte delle sonde con un contenuto di G/C del 40-60%, 65 °C tende ad essere sufficiente, anche se questo non è un valore statico. Il legame efficiente della sonda dipende dalla sua temperatura di fusione e, pertanto, può richiedere modifiche alla temperatura di ibridazione.

Dato che 2DGE fornisce una panoramica delle popolazioni relative di intermedi di replicazione in un dato momento, uno dei suoi maggiori svantaggi è che non fornisce una forte misura dei tempi di progressione della replicazione. A tale scopo, si consiglia di utilizzare l'analisi di singole molecole come la pettinatura del DNA. Inoltre, mentre il 2DGE consente l'analisi degli intermedi di replicazione che sorgono in risposta allo stallo, è necessario stabilire controlli genetici per scoprire la loro esatta identità, il che può essere tempestivo. Sebbene costosa, la microscopia elettronica rimane superiore nell'identificare l'esatta struttura delle molecole di DNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T celle	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarosio	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
Schermi al fosforo per lo stoccaggio BAS Fisher	Scientific
Il tampone di ibridazione Church e Gibert	Scientific	50-103-5408
Marcatura del DNA DecaLabel kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, alto gluctosio, integratore GltaMAX, piruvato	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Sarà necessario acquistare anche enzimi di restrizione aggiuntivi
EDTA 0,5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
etanolo, 70%	Fisher Scientific
Siero fetale bovino	VWR	97068-085
Soluzione di acido cloridrico, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanolo	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME Reagente di trasfezione DNA e siRNA con tampone	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Provette per centrifuga ad alta velocità Nalgene Oak Ridge	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Soluzione salina tampone fosfato, pH 7,4			ThermoFisher Scientific
, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	10010024
proteinasi K	ThermoFisher Scientific	EO0491
proteinasi K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Carta per cromatografia in pura cellulosa	Fisher Scientific	05-714-4
Carta per cromatografia in pura cellulosa	Fisher Scientific	05-714-5
Righello	Fisher Scientific	09-016
Bisturi	Fisher Scientific	12-460-451
Sodio dodecil solfato	Millipore Sigma	436143-25G
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Centrifuga Superspeed	ThermoFisher Scientific	75006580
Sistema di elettroforesi orizzontale a sottocella	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Rotore a secchio oscillante	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7,5	Fisher Scientific	BP1757-500
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	ThermoFisher Scientific	25200056