Articolo metodologico

Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

DOI:

10.3791/67234

⸱

20 settembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per isolare esosomi derivati dalla milza di topo utilizzando una combinazione di digestione con collagenasi di tipo I e ultracentrifugazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esosomi (Exo) sono strutture a doppio strato lipidico secrete da varie cellule, comprese quelle di animali, piante e procarioti. Studi precedenti hanno rivelato che gli Exo derivati da umorali o surnatanti cellulari sono bersagli promettenti per nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici, sottolineando il loro ruolo significativo nella patogenesi della malattia. L'Exo di derivazione tissutale (Ti-Exo) ha attirato una crescente attenzione grazie alla sua capacità di riflettere accuratamente la specificità dei tessuti e il microambiente. I Ti-Exo, presenti nello spazio interstiziale, svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare e nella segnalazione tra organi. Nonostante il loro valore riconosciuto nel chiarire i meccanismi della malattia, l'isolamento di Ti-Exo rimane difficile a causa della complessità delle matrici tissutali e della variabilità dei metodi di estrazione. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo pratico per isolare gli esosomi dal tessuto della milza dei topi, fornendo una tecnica riproducibile per successive analisi di identificazione e studi funzionali. Abbiamo utilizzato la digestione della collagenasi di tipo I combinata con l'ultracentrifugazione differenziale per isolare l'Exo derivato dalla milza. Le caratteristiche dell'Exo isolato sono state determinate attraverso la microscopia elettronica, il citometro a nanoflusso e il western blot. L'Exo isolato derivato dalla milza ha mostrato la tipica morfologia delle vescicole a doppio strato lipidico, con dimensioni delle particelle che variano da 30 nm a 150 nm. Inoltre, il profilo di espressione dei marcatori esosomiali ha confermato la presenza e la purezza degli esosomi. Nel complesso, abbiamo stabilito con successo un protocollo pratico per isolare l'Exo derivato dalla milza nei topi.

Introduzione

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Gli esosomi (Exo) sono un sottogruppo di vescicole extracellulari (EV), di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm, che incapsulano una vasta gamma di biomolecole, tra cui proteine, acidi nucleici e lipidi1. Queste biomolecole derivano dalle cellule parentali e vengono rilasciate nello spazio extracellulare. Gli exosessuali facilitano lo scambio di informazioni biomolecolari tra le cellule e il microambiente circostante, svolgendo ruoli sia nel sistema procariotico che in quello eucariotico2. Le caratteristiche degli esosomi, come il contenuto, le dimensioni, i componenti della membrana e l'origine cellulare, sono molto variabili e influenzate dal tipo di cellula di origine, dallo stato cellulare e dalle condizioni ambientali.

Gli esosomi sono comunemente classificati in tre categorie in base alla loro origine: derivati da colture cellulari, derivati da fluidi corporei e derivati da tessuti (Ti-Exo). Sebbene gli esosomi derivati da colture cellulari siano stati ampiamente studiati a causa della loro accessibilità e resa costante, il loro uso è limitato da potenziali alterazioni delle caratteristiche cellulari dopo una coltura prolungata, che possono travisare le loro funzioni biologiche 3,4,5. Inoltre, la maggior parte delle colture cellulari sono mantenute in ambienti bidimensionali che non imitano le complesse interazioni intercellulari in vivo, con un potenziale impatto sull'interpretazione dei dati6. Al contrario, gli esosomi isolati da fluidi biologici offrono un'opzione minimamente invasiva per monitorare la progressione della malattia in tempo reale7. Tuttavia, questi campioni contengono spesso una miscela di esosomi di varie origini, complicando l'identificazione accurata della loro fonte primaria8. Date queste sfide, c'è un crescente interesse per i Ti-Exo, che risiedono nell'interstizio extracellulare e sono mediatori chiave della segnalazione intercellulare.

La milza svolge un ruolo cruciale nella funzione immunitaria e nel mantenimento dell'omeostasi interna. Nonostante i protocolli esistenti per isolare il Ti-Exo da organi come il cervello, il fegato e i tumori, i metodi pratici per gli esosomi derivati dalla milza sono riportati limitatamente 9,10. Questo studio mirava a stabilire un protocollo pratico per isolare gli esosomi dal tessuto della milza nei topi modificati da un precedente rapporto11. Descriviamo in dettaglio un metodo che prevede la digestione della collagenasi seguita dall'ultracentrifugazione, che riduce al minimo la rottura della membrana cellulare e garantisce un'elevata purezza e resa di Exo derivato dalla milza. Le caratteristiche dell'Exo isolato utilizzando questo protocollo consolidato sono state convalidate attraverso la microscopia elettronica (TEM), il citometro a nano-flusso (Nano-FCM) e il western blot, confermando l'efficacia del protocollo per ulteriori ricerche sperimentali.

Protocollo

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I campioni sono stati ottenuti da topi, con l'approvazione etica concessa dal Comitato Etico della Guangdong Medical University. Descrizioni dettagliate dei materiali, delle attrezzature e del software utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella dei materiali. I dettagli della preparazione prima dell'estrazione sono illustrati nella Figura 1, mentre il processo di estrazione e arricchimento della milza-eso, è descritto nella Figura 2.

1. Preparazione

  1. Pre-raffreddare le centrifughe ad alta e altissima velocità a 4 °C e impostare la temperatura di un agitatore da tavolo a 37 °C.
  2. Preparare piastre per colture cellulari (figure-protocol-1100 mm), provette da centrifuga sterili da 50 mL, ghiaccio e filtro cellulare sterile (figure-protocol-270 μm) come mostrato nella Figura 1A, B.
  3. Sterilizzare forbici e pinze utilizzando uno spray alcolico al 75%, seguito da sterilizzazione ad alta temperatura. Questi strumenti sono illustrati nella Figura 1C.
  4. Mettere il tessuto della milza in una capsula di Petri sterile figure-protocol-3da 100 mm su ghiaccio e lavare via il sangue superficiale con 1 soluzione salina sterile con tampone di fosfato (PBS) ghiacciata. Asciugare i tessuti della milza con una garza sterile e pesarli dopo l'asciugatura.
    NOTA: Se il fazzoletto è congelato, scongelarlo in un piatto per 15 minuti con ghiaccio prima di procedere.
  5. Idratare il filtro cellulare (figure-protocol-470 μm) versando 1 mL di PBS sterile nel filtro utilizzando una pipetta di trasferimento sterile.
  6. Preparare il tampone digestivo (0,1% di collagenasi di tipo I) utilizzando 1x PBS con un miscelatore a vortice.
    NOTA: Utilizzare 10 ml di tampone digestivo per ogni 100 mg di tessuto della milza. La concentrazione di collagenasi è stata scelta in questo studio in base alle istruzioni del prodotto. Per altri tipi di tessuto, i ricercatori potrebbero dover regolare questi parametri in base alla densità e alla composizione dei tessuti. Si raccomandano esperimenti preliminari con concentrazioni e tempi di digestione variabili per determinare le condizioni ottimali per ciascun tipo di tessuto.

2. Digestione dei tessuti

  1. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi uniformi con le forbici in una piastra di coltura su ghiaccio (Figura 3A) e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml con una pipetta di trasferimento sterile.
  2. Aggiungere il tampone di digestione alla provetta in base al peso del tessuto della milza come indicato sopra (Figura 3B), quindi agitare la provetta con un angolo di 45° su un agitatore orizzontale a 37 °C. Monitora l'andamento della digestione e ferma la digestione quando i pezzi di tessuto si sono dispersi e la maggior parte ha perso la sua forma. Il tempo di digestione dovrebbe variare tra i tessuti. Nelle condizioni sperimentali di questo studio, il tempo di digestione è di circa 30 minuti.
  3. Trasferire la miscela digerita in un colino cellulare (Ф70 μm) a temperatura ambiente (RT) per rimuovere i detriti fibrosi e di tessuto più grandi.
    NOTA: Completare la filtrazione subito dopo la digestione.
  4. Raccogliere il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.

3. Isolamento degli esosomi mediante centrifugazione differenziale

  1. Centrifuga filtra a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione si può vedere un pellet contenente cellule residue, detriti cellulari e nuclei, come mostrato nella Figura 3C.
  2. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 3000 x g per 20 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione si può vedere un pellet contenente corpi apoptotici e microsomi, come mostrato nella Figura 3D.
  3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Il pellet contenente microvescicole e la membrana plasmatica possono essere visti dopo la centrifugazione, come mostrato nella Figura 3E.
  4. Ultracentrifugare il surnatante risultante a 120.000 x g per 2 ore a 4 °C. Un pellet può essere visto sul fondo della provetta dopo la centrifugazione, come mostrato nella Figura 3F.
  5. Scartare il surnatante, lavare il pellet con PBS e centrifugare nuovamente a 120.000 x g per 2 ore a 4 °C per ottenere gli esosomi. Dopo la centrifugazione, è possibile vedere un pellet sul fondo della provetta, come mostrato nella Figura 3G.
  6. Sciogliere gli esosomi isolati con PBS sterile (200 μl per milza) e conservare gli esosomi isolati in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml a -80 °C.

4. Caratterizzazione degli esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

NOTA: TEM è stato utilizzato per determinare se l'Exo estratto mostrava le caratteristiche delle vescicole. I campioni Exo identificati al microscopio elettronico devono essere campioni freschi o conservati brevemente a 4 °C per un breve periodo.

  1. Fissare gli esosomi (2-6 μg/μL) con paraformaldeide al 2% al microscopio elettronico (EM) a RT per 2 ore.
  2. Porre 10 μL di soluzione di esosoma su una rete di rame, incubare a RT per 10 minuti, sciacquare con acqua distillata sterile e tamponare il liquido in eccesso con carta assorbente.
  3. Colorare la rete di rame con acetato di uranile al 2% per 1 minuto, tamponare il liquido in eccesso con carta da filtro e asciugare sotto una lampada a incandescenza per 2 minuti.
  4. Osservare il campione preparato al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.

5. Distribuzione dimensionale e misurazione della concentrazione di particelle degli esosomi

  1. Caricare le nanoparticelle standard di polistirene (250 nm) sul citometro a nanoflusso.
  2. Misurare la concentrazione proteica dei campioni Exo utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA. Diluire il campione Exo con PBS in base ai risultati del test delle proteine BCA (diluire gli esosomi a 1-10 ng/μL), quindi caricare i campioni Exo nel nanoflusso per misurare l'intensità di dispersione laterale (SSI).
  3. Calcolare Concentrazione di exo in base al rapporto tra SSI e concentrazione di particelle nelle nanoparticelle standard di polistirene.
    NOTA: Per la misurazione delle dimensioni, viene generata una curva standard caricando nanoparticelle di silice standard con dimensioni del gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sul citometro a flusso nanometrico. Di seguito è riportato il caricamento dell'esempio Exo. La distribuzione dimensionale di Exo è stata calcolata secondo la cura standard.

6. Lisi e conferma dell'immunoblot delle proteine esosomiche

  1. Aggiungere 100 μl di tampone di lisi per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) al pellet dell'esosoma per l'analisi delle proteine.
  2. Agitare energicamente, coprire con parafilm, oscillare per 20 minuti a RT, quindi agitare di nuovo.
  3. Centrifugare brevemente a 1000 x g per 30-60 s per raccogliere il campione, trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e conservarlo a una temperatura compresa tra -20 °C e -80 °C fino all'analisi.
  4. Per l'immunoblot, mescolare i campioni con un tampone di caricamento 5x per ottenere una concentrazione 1x e prepararsi per l'elettroforesi su gel.
  5. Se si desidera controllare l'omogeneizzato dell'intero tessuto, utilizzare un tampone di lisi forte con un inibitore della proteasi per lisare il tessuto, come descritto sopra. Quindi, centrifugare i campioni a 10.000 x g per 10 minuti e scartare la matrice extracellulare rimanente, le cellule intere o i detriti cellulari intatti.
  6. Far bollire il tampone del campione contenente esosomi o omogeneizzato di tessuto a 95 °C per 5-10 minuti. Caricare la stessa quantità di proteine per corsia in un gel SDS-PAGE al 10%. Carico uguale proteina di tessuto omogenato come controllo.
  7. Procedere con l'elettroforesi su gel sotto una tensione di 80 V per circa 2 ore utilizzando il tampone per elettroforesi convenzionale. Eseguire l'analisi western blot per confermare l'espressione della proteina Exo nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di Exo in frazioni.

Risultati

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Isolamento e purificazione di esosomi derivati dalla milza
Per isolare gli esosomi dal tessuto della milza di topo, abbiamo impiegato una combinazione di digestione della collagenasi e ultracentrifugazione differenziale (Figura 2). Le fasi iniziali prevedevano il pretrattamento del tessuto della milza per rimuovere il sangue superficiale, seguito dalla digestione con collagenasi di tipo I. Questo trattamento enzimatico ha facilitato la rottura dei componenti della matrice extracellulare, liberando così gli esosomi preservandone l'integrità. Dopo la digestione, sono state impiegate una serie di fasi di centrifugazione per rimuovere in sequenza i detriti cellulari, i corpi apoptotici e le vescicole più grandi, culminando nell'ultracentrifugazione del surnatante a 120.000 x g per pellettare gli esosomi. Le successive procedure di isolamento hanno prodotto pellet solubili in PBS arricchiti con Exo derivato dalla milza, come mostrato nella Figura 3G.

Risultati TEM
La morfologia degli esosomi isolati è stata esaminata utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, un metodo gold standard per studiare la caratterizzazione degli esosomi. La TEM è comunemente usata per convalidare la presenza di esosomi, valutare la qualità degli esosomi e osservare la morfologia degli esosomi. Le immagini TEM (Figura 4A) hanno rivelato la presenza di vescicole a forma di coppa, caratteristiche degli esosomi. Queste vescicole hanno mostrato una chiara struttura a doppio strato lipidico, confermando il successo dell'isolamento degli esosomi dal tessuto della milza.

Distribuzione delle dimensioni di Spleen-Exo
La distribuzione dimensionale e la concentrazione degli esosomi sono state determinate utilizzando un citometro a nanoflusso. I risultati (Figura 4B) hanno indicato che il diametro degli esosomi isolati variava da 30 a 150 nm, con una concentrazione di picco a circa 60 nm. Il diametro delle particelle isolate era prevalentemente compreso tra 50 e 80 nm, con una concentrazione media di particelle di 4,6 x 109 particelle/mL. Questo intervallo di dimensioni è coerente con le caratteristiche precedentemente riportate degli esosomi, convalidando ulteriormente il protocollo di isolamento.

Analisi del western blot
Per confermare la presenza di marcatori esosomiali, abbiamo eseguito un'analisi western blot. I marcatori esosomiali TSG101 e CD9 sono stati rilevati nei campioni di Spleen-Exo, mentre GM130, una proteina della matrice di Golgi utilizzata come controllo negativo, non è stata rilevata (Figura 4C). In confronto, la proteina di questi marcatori era espressa nei tessuti della milza di topo (Spleen-T). Ciò indica l'elevata purezza degli esosomi isolati, in quanto privi di contaminanti cellulari.

figure-results-1
Figura 1: Preparazione dell'alimentazione. (A) Provette da centrifuga da 50 mL, piastre di coltura, ghiaccio e strumenti chirurgici sono stati collocati in una cabina di biosicurezza. (B) Un filtro cellulare sterile (figure-results-270 μm). (C) Strumenti chirurgici sterilizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 2: Procedura di isolamento Spleen-Exo. Preparare il tessuto della milza e tagliarlo a pezzetti in PBS ghiacciato, seguito dalla digestione con collagenasi di tipo I e dalla centrifugazione come indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 3: Immagini rappresentative dell'isolamento milza-eso. (A) Piccoli blocchi di milza pronti per la successiva digestione. (B) Blocchi di tessuto della milza con tampone per la digestione. (C) Pellet dopo centrifugazione 500 x g . (D) Pellet dopo 3.000 x g di centrifugazione. (E) Pellet dopo 10.000 x g di centrifugazione. (F) Pellet dopo 120.000 x g di centrifugazione. (G) Pellet di esosomi dopo centrifugazione 120.000 x g . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Identificazione di Spleen-Exo. (A) I risultati TEM mostrano particelle isolate come vescicole membranose rotonde o ovali con morfologia a coppa. Barra della scala = 200 nm e 50 nm, rispettivamente. (B) L'analisi della distribuzione dimensionale mediante Flow Nano Analyzer ha mostrato che il diametro di Spleen-Exo variava prevalentemente da 50 nm a 80 nm, con una concentrazione media di particelle di 4,6 × 109 particelle/mL. (C) Analisi Western blot che mostra l'espressione di proteine marcatrici specifiche per gli esosomi (TSG101 e CD9) in Spleen-Exo, con espressione negativa di GM130. Questi marcatori erano rilevabili in campioni proteici estratti dalla milza di topo (gruppo Milza-T). Sono state mostrate le immagini rappresentative del western blot (n = 6 tessuti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Recenti ricerche hanno riportato che gli esosomi derivati dalla milza (Spleen-Exo) svolgono un ruolo fondamentale nel trattamento del cancro gastrico12. Per chiarire ulteriormente le funzioni di Spleen-Exo, è necessario stabilire un metodo riproducibile e ottimale per la loro estrazione dal tessuto della milza. Sebbene esistano protocolli per isolare gli esosomi dal cancro del cervello e del fegato13,14, i metodi per altri tessuti rimangono poco sviluppati e richiedono ulteriori conferme. In questo studio, abbiamo delineato un metodo pratico per isolare l'Exo dal tessuto della milza.

Negli ultimi anni, sono stati utilizzati vari metodi per estrarre l'Exo nella ricerca scientifica e nelle applicazioni, tra cui l'ultracentrifugazione, la centrifugazione a gradiente di densità, l'immunoassorbimento a biglie magnetiche, l'ultrafiltrazione e la precipitazione polimerica15. L'ultracentrifugazione rimane il metodo gold standard per l'estrazione di Exo da varie fonti. Studi precedenti si sono concentrati sull'interruzione delle strutture tissutali per ottenere concentrazioni più elevate di Exo, che consiste in fonti intracellulari ed extracellulari di Exo16. La collagenasi riduce al minimo l'impatto sull'integrità della membrana cellulare, garantendo la purezza di Ti-Exo3. La collagenasi è stata utilizzata per estrarre vescicole extracellulari da tessuti di melanoma metastatico umano, adiposo, cancro del colon e cancro al fegato 5,10,13,17. Tuttavia, la concentrazione e il tempo di digestione della collagenasi variano tra i diversi tessuti.

Abbiamo stabilito un protocollo specifico per l'isolamento della milza-exo utilizzando la collagenasi di tipo I per la digestione, seguita dalla filtrazione attraverso l'ultracentrifugazione differenziale, per produrre milza-esodo di alta qualità. L'ultracentrifugazione è in grado di rimuovere efficacemente le cellule residue, le grandi vescicole, i detriti cellulari e i corpi apoptotici dai campioni16. Crescitelli et al. hanno impiegato la collagenasi D e l'ultracentrifugazione a gradiente per isolare piccole vescicole extracellulari con una dimensione media di 75 nm di diametro5. Rispetto al loro protocollo, il nostro protocollo utilizzava la collagenasi di tipo I e un'ulteriore fase di ultracentrifugazione a 120.000 x g per ottenere una purezza ottimale degli esosomi. A differenza dei precedenti studi che utilizzavano l'omogeneizzazione tissutale per ottenere la sospensione tissutale14,18, il nostro approccio preserva l'integrità della membrana delle cellule nei tessuti. Inoltre, Vella et al. hanno applicato la centrifugazione in gradiente di densità (un triplo gradiente di saccarosio) per generare tre gruppi di particelle, che hanno richiesto più tempo per l'operazione10. Questo approccio ha prodotto grandi vescicole con una dimensione superiore a 200 nm, una popolazione eterogenea di vescicole con dimensioni comprese tra 50 nm e 200 nm e piccole vescicole di circa 20 nm. Il protocollo descritto in questo protocollo di studio prevede una serie di passaggi di ultracentrifugazione per eliminare metodicamente le cellule residue, i detriti cellulari, i corpi apoptotici e le vescicole più grandi, migliorando così la purezza dell'Exo ottenuto. Sottolineiamo un'attenta manipolazione durante la raccolta del surnatante per evitare di disturbare i pellet sedimentati.

Valutiamo la morfologia e la purezza dello Spleen-Exo isolato attraverso l'analisi TEM e il tracciamento delle nanoparticelle. Entrambi i saggi hanno rivelato che le particelle derivate dalla milza isolate da questo protocollo mostravano un doppio strato lipidico e vescicole a forma di coppa con dimensioni comprese tra 30 nm e 150 nm, che sono le caratteristiche tipiche degli esosomi19. CD9 e TSG101 sono marcatori esosomici19 e GM130, una proteina di Golgi, è usata come marcatore negativo per l'identificazione degli esosomi20. I risultati hanno mostrato che Spleen-Exo era positivo per CD9 e TSG101, mentre GM130 non è stato rilevato, confermando il successo dell'isolamento di Exo di alta qualità derivato da tessuti dalla milza.

Per ottenere un Ti-Exo di alta qualità, è essenziale selezionare il tipo di enzima, la concentrazione e la durata della digestione appropriati, nonché una corretta conservazione dei tessuti. Non abbiamo osservato differenze significative nelle concentrazioni proteiche tra Exo derivate da tessuti di milza freschi e congelati (dati non mostrati), indicando la fattibilità del trattamento di grandi quantità di tessuti congelati per ridurre il flusso di lavoro. L'isolamento di Ti-Exo richiede un lungo tempo di funzionamento per l'ultracentrifuga, il che rende poco pratico completare l'intero protocollo entro un periodo di tempo appropriato quando si utilizzano tessuti freschi in applicazioni cliniche. Pertanto, l'utilizzo di tessuti congelati per l'isolamento degli esosomi sarebbe un'opzione migliore. Lo scongelamento a 37 °C non è adatto per i tessuti congelati a causa della penetrazione incompleta degli agenti crioprotettivi nei tessuti. È stato riportato che quando si esegue l'isolamento degli esosomi utilizzando tessuti congelati che si scongelano sul ghiaccio, la resa degli esosomi non ha mostrato alcun significato in termini di contenuto rispetto ai tessuti freschi21. Pertanto, abbiamo scongelato i tessuti della milza congelati sul ghiaccio per eseguire l'isolamento degli esosomi quando si utilizzano i campioni di conservazione a -80 °C.

Tuttavia, il protocollo descritto in questo studio presenta diverse limitazioni. Le fasi estese dell'estrazione e dell'identificazione richiedono molto tempo. Dato l'obiettivo finale di applicare la ricerca Exo al trattamento clinico delle malattie, metodi più rapidi ed economici stanno diventando sempre più critici. Inoltre, mentre i risultati si basano su campioni di tessuto di topo, l'applicabilità ai tessuti umani rimane da determinare.

In conclusione, il protocollo fornisce un metodo per estrarre Exo altamente puro dal tessuto della milza, adatto per analisi dettagliate a valle. L'exo derivato dai tessuti riflette il microambiente della loro origine in modo più accurato e ha un potenziale significativo per chiarire i processi fisiologici e patologici negli organismi viventi. Studi futuri potrebbero adattare questo protocollo ai tessuti umani, consentendo l'estrazione di esosomi clinicamente rilevanti per scopi diagnostici e terapeutici. Questa tecnica potrebbe essere particolarmente utile nello studio del ruolo degli esosomi nelle risposte immunitarie, data la funzione critica della milza nel sistema immunitario. Inoltre, il protocollo potrebbe essere modificato per isolare gli esosomi da altri tessuti, aiutando potenzialmente lo sviluppo di biomarcatori tessuto-specifici e terapie mirate. Migliorando la nostra comprensione della biologia degli esosomi, questo protocollo può contribuire ai progressi nella medicina di precisione e allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82370281, 81870222), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (2022A1515012103) e dalla Scienza, dal Progetto di allocazione competitiva del Fondo speciale per lo sviluppo tecnologico della città di Zhanjiang (2021A05086) e dalla Startup Foundation del Secondo ospedale affiliato della Guangdong Medical University (23H03).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
70 µ m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 anticorpoCell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Anti GM130 anticorpoProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anti TSG101 anticorpoAbcam Plc, Regno Unito125011
Piatto per colture cellulariWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Cina704001
Provetta per centrifugaWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Cina788211
Collagenasi di tipo ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Agitatoretermostatico da tavoloShanghai bluepard instruments Co., Ltd., CinaTHZ-100
tampone per elettroforesiWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., CinaG2081-1L
Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., CinaN30E
Sistema di imaging a fluorescenza/chemiluminescenza.Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., CinaGelView 6000Plus
HRP Capra anti-Topo IgGProteintech Group, Inc.China 15014
HRP capra anti-coniglio IgG ProteintechGroup, Inc.Cina 15015
lettore di micropiastreMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai  Medico  Strumenti (gruppo) Co., Ltd.,CinaWA1010
Pinzette microscopicheShanghai  Medico  Strumenti (gruppo) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro centrifugaThermo Fisher Scientific, USA75009750
Forbici oftalmicheShanghai  Medico  Strumenti (gruppo) Co., Ltd.,CinaY00030
Pinzette oftalmicheShanghai  Medico  Strumenti (Gruppo) Co., Ltd., Cina JD1060
Optima XPN-100 Centrifuga di ultrafiltrazioneBeckman Coulter, USAA94469
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., CinaP1003
RIPA (forte, senza inibitori)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina P0013K
RighelloDeli  Produzione  Azienda, Cina
SDS-PAGE Buffer di caricamento del campione, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina P0015
Trasferimento PipetBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Microscopio elettronico a trasmissioneHitachi, GiapponeH-7650
Provetta per ultracentrifugazioneBeckman Coulter, USA355618
Western Transfer Buffer Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Cina G2028-1L
Kit di analisi della proteina BCA potenziato tampone di lisi

Riferimenti

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