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Articolo metodologico

Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

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DOI:

10.3791/67234

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20 settembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare esosomi derivati dalla milza di topo utilizzando una combinazione di digestione con collagenasi di tipo I e ultracentrifugazione.

Abstract

Gli esosomi (Exo) sono strutture a doppio strato lipidico secrete da varie cellule, comprese quelle di animali, piante e procarioti. Studi precedenti hanno rivelato che gli Exo derivati da umorali o surnatanti cellulari sono bersagli promettenti per nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici, sottolineando il loro ruolo significativo nella patogenesi della malattia. L'Exo di derivazione tissutale (Ti-Exo) ha attirato una crescente attenzione grazie alla sua capacità di riflettere accuratamente la specificità dei tessuti e il microambiente. I Ti-Exo, presenti nello spazio interstiziale, svolgono un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare e nella segnalazione tra organi. Nonostante il loro valore riconosciuto nel chiarire i meccanismi della malattia, l'isolamento di Ti-Exo rimane difficile a causa della complessità delle matrici tissutali e della variabilità dei metodi di estrazione. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo pratico per isolare gli esosomi dal tessuto della milza dei topi, fornendo una tecnica riproducibile per successive analisi di identificazione e studi funzionali. Abbiamo utilizzato la digestione della collagenasi di tipo I combinata con l'ultracentrifugazione differenziale per isolare l'Exo derivato dalla milza. Le caratteristiche dell'Exo isolato sono state determinate attraverso la microscopia elettronica, il citometro a nanoflusso e il western blot. L'Exo isolato derivato dalla milza ha mostrato la tipica morfologia delle vescicole a doppio strato lipidico, con dimensioni delle particelle che variano da 30 nm a 150 nm. Inoltre, il profilo di espressione dei marcatori esosomiali ha confermato la presenza e la purezza degli esosomi. Nel complesso, abbiamo stabilito con successo un protocollo pratico per isolare l'Exo derivato dalla milza nei topi.

Introduzione

Gli esosomi (Exo) sono un sottogruppo di vescicole extracellulari (EV), di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm, che incapsulano una vasta gamma di biomolecole, tra cui proteine, acidi nucleici e lipidi1. Queste biomolecole derivano dalle cellule parentali e vengono rilasciate nello spazio extracellulare. Gli exosessuali facilitano lo scambio di informazioni biomolecolari tra le cellule e il microambiente circostante, svolgendo ruoli sia nel sistema procariotico che in quello eucariotico2. Le caratteristiche degli esosomi, come il contenuto, le dimensioni, i componenti della membrana e l'origine cellulare, sono molto variabili e influenzate dal tipo di cellula di origine, dallo stato cellulare e dalle condizioni ambientali.

Gli esosomi sono comunemente classificati in tre categorie in base alla loro origine: derivati da colture cellulari, derivati da fluidi corporei e derivati da tessuti (Ti-Exo). Sebbene gli esosomi derivati da colture cellulari siano stati ampiamente studiati a causa della loro accessibilità e resa costante, il loro uso è limitato da potenziali alterazioni delle caratteristiche cellulari dopo una coltura prolungata, che possono travisare le loro funzioni biologiche 3,4,5. Inoltre, la maggior parte delle colture cellulari sono mantenute in ambienti bidimensionali che non imitano le complesse interazioni intercellulari in vivo, con un potenziale impatto sull'interpretazione dei dati6. Al contrario, gli esosomi isolati da fluidi biologici offrono un'opzione minimamente invasiva per monitorare la progressione della malattia in tempo reale7. Tuttavia, questi campioni contengono spesso una miscela di esosomi di varie origini, complicando l'identificazione accurata della loro fonte primaria8. Date queste sfide, c'è un crescente interesse per i Ti-Exo, che risiedono nell'interstizio extracellulare e sono mediatori chiave della segnalazione intercellulare.

La milza svolge un ruolo cruciale nella funzione immunitaria e nel mantenimento dell'omeostasi interna. Nonostante i protocolli esistenti per isolare il Ti-Exo da organi come il cervello, il fegato e i tumori, i metodi pratici per gli esosomi derivati dalla milza sono riportati limitatamente 9,10. Questo studio mirava a stabilire un protocollo pratico per isolare gli esosomi dal tessuto della milza nei topi modificati da un precedente rapporto11. Descriviamo in dettaglio un metodo che prevede la digestione della collagenasi seguita dall'ultracentrifugazione, che riduce al minimo la rottura della membrana cellulare e garantisce un'elevata purezza e resa di Exo derivato dalla milza. Le caratteristiche dell'Exo isolato utilizzando questo protocollo consolidato sono state convalidate attraverso la microscopia elettronica (TEM), il citometro a nano-flusso (Nano-FCM) e il western blot, confermando l'efficacia del protocollo per ulteriori ricerche sperimentali.

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Protocollo

I campioni sono stati ottenuti da topi, con l'approvazione etica concessa dal Comitato Etico della Guangdong Medical University. Descrizioni dettagliate dei materiali, delle attrezzature e del software utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella dei materiali. I dettagli della preparazione prima dell'estrazione sono illustrati nella Figura 1, mentre il processo di estrazione e arricchimento della milza-eso, è descritto nella Figura 2.

1. Preparazione

  1. Pre-raffreddare le centrifughe ad alta e altissima velocità a 4 °C e impostare la temperatura di un agitatore da tavolo a 37 °C.
  2. Preparare piastre per colture cellulari (figure-protocol-1100 mm), provette da centrifuga sterili da 50 mL, ghiaccio e filtro cellulare sterile (figure-protocol-270 μm) come mostrato nella Figura 1A, B.
  3. Sterilizzare forbici e pinze utilizzando uno spray alcolico al 75%, seguito da sterilizzazione ad alta temperatura. Questi strumenti sono illustrati nella Figura 1C.
  4. Mettere il tessuto della milza in una capsula di Petri sterile figure-protocol-3da 100 mm su ghiaccio e lavare via il sangue superficiale con 1 soluzione salina sterile con tampone di fosfato (PBS) ghiacciata. Asciugare i tessuti della milza con una garza sterile e pesarli dopo l'asciugatura.
    NOTA: Se il fazzoletto è congelato, scongelarlo in un piatto per 15 minuti con ghiaccio prima di procedere.
  5. Idratare il filtro cellulare (figure-protocol-470 μm) versando 1 mL di PBS sterile nel filtro utilizzando una pipetta di trasferimento sterile.
  6. Preparare il tampone digestivo (0,1% di collagenasi di tipo I) utilizzando 1x PBS con un miscelatore a vortice.
    NOTA: Utilizzare 10 ml di tampone digestivo per ogni 100 mg di tessuto della milza. La concentrazione di collagenasi è stata scelta in questo studio in base alle istruzioni del prodotto. Per altri tipi di tessuto, i ricercatori potrebbero dover regolare questi parametri in base alla densità e alla composizione dei tessuti. Si raccomandano esperimenti preliminari con concentrazioni e tempi di digestione variabili per determinare le condizioni ottimali per ciascun tipo di tessuto.

2. Digestione dei tessuti

  1. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi uniformi con le forbici in una piastra di coltura su ghiaccio (Figura 3A) e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml con una pipetta di trasferimento sterile.
  2. Aggiungere il tampone di digestione alla provetta in base al peso del tessuto della milza come indicato sopra (Figura 3B), quindi agitare la provetta con un angolo di 45° su un agitatore orizzontale a 37 °C. Monitora l'andamento della digestione e ferma la digestione quando i pezzi di tessuto si sono dispersi e la maggior parte ha perso la sua forma. Il tempo di digestione dovrebbe variare tra i tessuti. Nelle condizioni sperimentali di questo studio, il tempo di digestione è di circa 30 minuti.
  3. Trasferire la miscela digerita in un colino cellulare (Ф70 μm) a temperatura ambiente (RT) per rimuovere i detriti fibrosi e di tessuto più grandi.
    NOTA: Completare la filtrazione subito dopo la digestione.
  4. Raccogliere il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.

3. Isolamento degli esosomi mediante centrifugazione differenziale

  1. Centrifuga filtra a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione si può vedere un pellet contenente cellule residue, detriti cellulari e nuclei, come mostrato nella Figura 3C.
  2. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 3000 x g per 20 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione si può vedere un pellet contenente corpi apoptotici e microsomi, come mostrato nella Figura 3D.
  3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Il pellet contenente microvescicole e la membrana plasmatica possono essere visti dopo la centrifugazione, come mostrato nella Figura 3E.
  4. Ultracentrifugare il surnatante risultante a 120.000 x g per 2 ore a 4 °C. Un pellet può essere visto sul fondo della provetta dopo la centrifugazione, come mostrato nella Figura 3F.
  5. Scartare il surnatante, lavare il pellet con PBS e centrifugare nuovamente a 120.000 x g per 2 ore a 4 °C per ottenere gli esosomi. Dopo la centrifugazione, è possibile vedere un pellet sul fondo della provetta, come mostrato nella Figura 3G.
  6. Sciogliere gli esosomi isolati con PBS sterile (200 μl per milza) e conservare gli esosomi isolati in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml a -80 °C.

4. Caratterizzazione degli esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

NOTA: TEM è stato utilizzato per determinare se l'Exo estratto mostrava le caratteristiche delle vescicole. I campioni Exo identificati al microscopio elettronico devono essere campioni freschi o conservati brevemente a 4 °C per un breve periodo.

  1. Fissare gli esosomi (2-6 μg/μL) con paraformaldeide al 2% al microscopio elettronico (EM) a RT per 2 ore.
  2. Porre 10 μL di soluzione di esosoma su una rete di rame, incubare a RT per 10 minuti, sciacquare con acqua distillata sterile e tamponare il liquido in eccesso con carta assorbente.
  3. Colorare la rete di rame con acetato di uranile al 2% per 1 minuto, tamponare il liquido in eccesso con carta da filtro e asciugare sotto una lampada a incandescenza per 2 minuti.
  4. Osservare il campione preparato al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.

5. Distribuzione dimensionale e misurazione della concentrazione di particelle degli esosomi

  1. Caricare le nanoparticelle standard di polistirene (250 nm) sul citometro a nanoflusso.
  2. Misurare la concentrazione proteica dei campioni Exo utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA. Diluire il campione Exo con PBS in base ai risultati del test delle proteine BCA (diluire gli esosomi a 1-10 ng/μL), quindi caricare i campioni Exo nel nanoflusso per misurare l'intensità di dispersione laterale (SSI).
  3. Calcolare Concentrazione di exo in base al rapporto tra SSI e concentrazione di particelle nelle nanoparticelle standard di polistirene.
    NOTA: Per la misurazione delle dimensioni, viene generata una curva standard caricando nanoparticelle di silice standard con dimensioni del gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sul citometro a flusso nanometrico. Di seguito è riportato il caricamento dell'esempio Exo. La distribuzione dimensionale di Exo è stata calcolata secondo la cura standard.

6. Lisi e conferma dell'immunoblot delle proteine esosomiche

  1. Aggiungere 100 μl di tampone di lisi per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) al pellet dell'esosoma per l'analisi delle proteine.
  2. Agitare energicamente, coprire con parafilm, oscillare per 20 minuti a RT, quindi agitare di nuovo.
  3. Centrifugare brevemente a 1000 x g per 30-60 s per raccogliere il campione, trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e conservarlo a una temperatura compresa tra -20 °C e -80 °C fino all'analisi.
  4. Per l'immunoblot, mescolare i campioni con un tampone di caricamento 5x per ottenere una concentrazione 1x e prepararsi per l'elettroforesi su gel.
  5. Se si desidera controllare l'omogeneizzato dell'intero tessuto, utilizzare un tampone di lisi forte con un inibitore della proteasi per lisare il tessuto, come descritto sopra. Quindi, centrifugare i campioni a 10.000 x g per 10 minuti e scartare la matrice extracellulare rimanente, le cellule intere o i detriti cellulari intatti.
  6. Far bollire il tampone del campione contenente esosomi o omogeneizzato di tessuto a 95 °C per 5-10 minuti. Caricare la stessa quantità di proteine per corsia in un gel SDS-PAGE al 10%. Carico uguale proteina di tessuto omogenato come controllo.
  7. Procedere con l'elettroforesi su gel sotto una tensione di 80 V per circa 2 ore utilizzando il tampone per elettroforesi convenzionale. Eseguire l'analisi western blot per confermare l'espressione della proteina Exo nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di Exo in frazioni.

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Risultati

Isolamento e purificazione di esosomi derivati dalla milza
Per isolare gli esosomi dal tessuto della milza di topo, abbiamo impiegato una combinazione di digestione della collagenasi e ultracentrifugazione differenziale (Figura 2). Le fasi iniziali prevedevano il pretrattamento del tessuto della milza per rimuovere il sangue superficiale, seguito dalla digestione con collagenasi di tipo I. Questo trattamento enzimatico ha facilitato la rottura dei componenti della matrice...

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Discussione

Recenti ricerche hanno riportato che gli esosomi derivati dalla milza (Spleen-Exo) svolgono un ruolo fondamentale nel trattamento del cancro gastrico12. Per chiarire ulteriormente le funzioni di Spleen-Exo, è necessario stabilire un metodo riproducibile e ottimale per la loro estrazione dal tessuto della milza. Sebbene esistano protocolli per isolare gli esosomi dal cancro del cervello e del fegato13,14, i...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82370281, 81870222), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (2022A1515012103) e dalla Scienza, dal Progetto di allocazione competitiva del Fondo speciale per lo sviluppo tecnologico della città di Zhanjiang (2021A05086) e dalla Startup Foundation del Secondo ospedale affiliato della Guangdong Medical University (23H03).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
70 µ m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 anticorpoCell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Anti GM130 anticorpoProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anti TSG101 anticorpoAbcam Plc, Regno Unito125011
Piatto per colture cellulariWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Cina704001
Provetta per centrifugaWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Cina788211
Collagenasi di tipo ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Agitatoretermostatico da tavoloShanghai bluepard instruments Co., Ltd., CinaTHZ-100
tampone per elettroforesiWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., CinaG2081-1L
Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., CinaN30E
Sistema di imaging a fluorescenza/chemiluminescenza.Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., CinaGelView 6000Plus
HRP Capra anti-Topo IgGProteintech Group, Inc.China 15014
HRP capra anti-coniglio IgG ProteintechGroup, Inc.Cina 15015
lettore di micropiastreMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai  Medico  Strumenti (gruppo) Co., Ltd.,CinaWA1010
Pinzette microscopicheShanghai  Medico  Strumenti (gruppo) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro centrifugaThermo Fisher Scientific, USA75009750
Forbici oftalmicheShanghai  Medico  Strumenti (gruppo) Co., Ltd.,CinaY00030
Pinzette oftalmicheShanghai  Medico  Strumenti (Gruppo) Co., Ltd., Cina JD1060
Optima XPN-100 Centrifuga di ultrafiltrazioneBeckman Coulter, USAA94469
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., CinaP1003
RIPA (forte, senza inibitori)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina P0013K
RighelloDeli  Produzione  Azienda, Cina
SDS-PAGE Buffer di caricamento del campione, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina P0015
Trasferimento PipetBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Microscopio elettronico a trasmissioneHitachi, GiapponeH-7650
Provetta per ultracentrifugazioneBeckman Coulter, USA355618
Western Transfer Buffer Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Cina G2028-1L
Kit di analisi della proteina BCA potenziato tampone di lisi

Riferimenti

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