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Articolo metodologico

Un modello murino immaturo di ostruzione ureterale unilaterale reversibile

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DOI:

10.3791/67238

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4 aprile 2025

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1Department of Urology Children's Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Structural Birth Defect and Reconstruction, National Clinical Research Center for Child Health and Disorders, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, 2Chongqing Key Laboratory of Structural Birth Defect and Reconstruction, Chongqing Key Laboratory of Children Urogenital Development and Tissue Engineering, Children's Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Urology, Children's Hospital of Chongqing Medical University

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un modello passo-passo riproducibile di ostruzione ureterale unilaterale.

Abstract

L'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è una causa comune di malattia renale cronica (CKD), che porta alla progressione della fibrosi interstiziale renale e, infine, a danno renale irreversibile. L'attenuazione dell'UUO è fondamentale. In letteratura sono stati stabiliti diversi modelli animali di ostruzione ureterale unilaterale reversibile (RUUO), che consentono l'osservazione dei cambiamenti strutturali e del danno funzionale, simulando anche i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici a seguito del sollievo dall'ostruzione ureterale. In questo studio, è stato stabilito un modello di ostruzione reversibile nell'uretere murino unilaterale utilizzando un tubo di silicone. Un danno renale significativo è stato osservato prima del sollievo dall'ostruzione, con un parziale recupero osservato in seguito. A differenza dell'UUO, questo modello previene l'idronefrosi progressiva, portando a esiti patologici distinti. Questa semplice procedura chirurgica dimostra un alto tasso di successo ed è promettente come modello classico per lo studio della nefropatia ostruttiva reversibile e dei potenziali trattamenti per la fibrosi interstiziale renale. Inoltre, fornisce una piattaforma pratica per studiare i meccanismi di recupero dalla nefropatia ostruttiva, dalla rigenerazione delle cellule renali e dal rimodellamento dei tessuti.

Introduzione

L'ostruzione uretrale contribuisce in modo significativo alla fibrosi interstiziale renale e alla malattia renale cronica (CKD), portando potenzialmente a danni strutturali irreversibili e menomazioni funzionali nel rene1. Sebbene l'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) sia ampiamente utilizzata per studiare il danno renale e la CKD, non replica accuratamente i meccanismi di recupero spontaneo che si verificano dopo la rimozione di un'ostruzione. Il modello UUO prevede la legatura dell'uretere sinistro con punti di sutura, con conseguente ostruzione permanente, dilatazione ureterale, idronefrosi, compressione del parenchima renale e assottigliamento corticale. L'esame istologico rivela tipicamente dilatazione tubulare, necrosi delle cellule epiteliali tubulari, infiammazione interstiziale progressiva e fibrosi2. Questo modello studia principalmente la fibrosi interstiziale renale e la perdita irreversibile della funzionalità renale dovuta a un'ostruzione persistente.

Tuttavia, molte malattie renali riscontrate nella pratica clinica, come l'ostruzione causata da calcoli ureterali o tumori, sono reversibili. Il modello di ostruzione ureterale unilaterale reversibile (RUUO) consente il ripristino parziale della struttura renale e della funzione delle vie urinarie, risolvendo infine l'idronefrosi. Il recupero può essere valutato attraverso tecniche di imaging, esame istologico e analisi dei biomarcatori per quantificare la riduzione del danno renale e della fibrosi3. Questo modello imita da vicino la fase di recupero della nefropatia ostruttiva in ambito clinico ed è più adatto dell'UUO per studiare processi chiave come l'infiammazione, le risposte immunitarie, la rigenerazione cellulare e il rimodellamento dei tessuti 4,5,6,7,8.

Il modello RUUO consente ai ricercatori di analizzare la riparazione e la rigenerazione renale dopo il sollievo dalla lesione, affrontando i limiti dell'UUO negli studi dinamici. Confrontando diversi punti temporali prima e dopo l'ostruzione, i ricercatori possono studiare i percorsi molecolari coinvolti nella lesione e nella riparazione, tra cui infiammazione, apoptosi, fibrosi e rigenerazione. Questo approccio migliora la comprensione dei meccanismi di recupero renale e identifica potenziali bersagli terapeutici 2,3,4,5,8,9,10. Sebbene la fibrosi renale sia spesso considerata irreversibile, le osservazioni cliniche suggeriscono che il sollievo precoce dall'ostruzione durante le fasi iniziali della fibrosi può arrestare o addirittura invertire la progressione della malattia. Il modello RUUO fornisce una preziosa piattaforma sperimentale per studiare questo fenomeno11.

Inoltre, il modello RUUO facilita lo studio dell'inversione della fibrosi dopo il sollievo dall'ostruzione, offrendo approfondimenti sui meccanismi di recupero e sulle potenziali terapie antifibrotiche 3,4. Di conseguenza, questo modello è molto pratico per la ricerca traslazionale. L'obiettivo principale di questo modello sperimentale è indurre la nefropatia ostruttiva attraverso l'incannulamento ureterale, seguito da un sollievo standardizzato in un momento predefinito per garantire la coerenza. È ottimizzato per semplicità, riproducibilità e sicurezza, il che lo rende uno strumento efficace per la ricerca sperimentale.

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Protocollo

Questo studio sugli animali ha aderito alle linee guida della Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca dell'Ospedale Pediatrico dell'Università di Medicina di Chongqing. Un totale di 27 ratti maschi di Sprague Dawley (SD) sono stati ottenuti commercialmente e ospitati nel Laboratory Animal Center dell'Ospedale Pediatrico dell'Università di Medicina di Chongqing (SPF, numero di licenza: SYXK (Chongqing) 2007-0016). I ratti sono stati mantenuti in condizioni di temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua.

Il protocollo è stato condotto su ratti SD maschi di età compresa tra 6 e 8 settimane ed è applicabile a ratti di tutte le età con ureteri bilaterali. In questo studio, quindici ratti SD maschi di 6 settimane sono stati assegnati in modo casuale a tre gruppi: il gruppo nativo (n = 5), il gruppo UUO (n = 5) e il gruppo RUUO (n = 5). Inoltre, cinque ratti SD di 8 settimane (n = 5) sono stati inclusi come gruppo di controllo aggiuntivo. Per stabilire il modello RUUO, sono stati utilizzati 12 ratti, con 7 ratti aggiuntivi procurati per tenere conto di potenziali rischi come mortalità intraoperatoria e postoperatoria, fallimenti chirurgici, ostruzione incompleta e inversione non riuscita. Ciò ha garantito un minimo di 5 ratti per gruppo per le analisi successive.

Tutte le procedure chirurgiche sono state condotte in stretta conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il personale chirurgico ha aderito ai protocolli dei dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui maschere chirurgiche, guanti e camici. Per ogni procedura sono stati utilizzati strumenti chirurgici sterili e sono stati sterilizzati in autoclave prima e dopo l'uso per mantenere la sterilità. I materiali di scarto, compresi i campioni taglienti e biologici, sono stati smaltiti nel rispetto dei protocolli di gestione dei rifiuti pericolosi per mitigare i rischi di contaminazione e garantire la sicurezza.

1. Preparazione degli animali e degli strumenti

  1. Eseguire tutte le procedure utilizzando strumenti e materiali di consumo sterili (autoclavati). Tagliare il tubo di silicone sterilizzato (diametro interno: 1,5 mm, diametro esterno: 2,5 mm) in segmenti di circa 1 cm. Praticare un'incisione longitudinale lungo un lato della parete del tubo per un uso successivo.
  2. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (40 mg/kg) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare un'anestesia adeguata controllando l'assenza di risposte riflesse, come il riflesso di ritiro del pedale, al momento del pizzicamento delle dita dei piedi. Applicare un unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale durante l'anestesia.
  3. Depilare l'addome del ratto dal processo xifoideo alla sinfisi pubica ed estenderlo bilateralmente alla linea mediana.
  4. Posizionare il ratto in posizione supina su un cuscinetto chirurgico riscaldato e fissare i suoi arti con corde di gomma.
  5. Stendere un foglio fenestrato sterile per mantenere un campo sterile. Preparare la pelle con una soluzione di iodio povidone. Praticare un'incisione cutanea sulla linea mediana lungo l'addome, che si estende dalla regione subxifoidea fino a poco sotto l'ombelico, per fornire un'adeguata esposizione dei reni e degli ureteri superiori.
  6. Incidere i tessuti sottocutanei e la fascia lungo la linea mediana utilizzando le forbici chirurgiche. Seziona meticolosamente la pelle e i tessuti sottostanti strato per strato ed esponi completamente lo spazio retroperitoneale usando una pinza per tessuti.

2. Chirurgia ostruttiva per ostruzione ureterale unilaterale reversibile

  1. Ritrarre l'intestino sul lato destro della cavità addominale utilizzando un tampone sterile per facilitare la visualizzazione diretta dell'uretere sinistro. Coprire l'uretere con una garza imbevuta di soluzione salina per evitare che si secchi.
  2. Sezionare e mobilizzare l'uretere sinistro utilizzando una pinza microscopica, liberando circa 1,5 cm dai tessuti circostanti.
  3. Posizionare un tubo di silicone lungo 1 cm (diametro interno: 1,5 mm, diametro esterno: 2,5 mm) sotto l'uretere liberato. Utilizzare una pinza per garantire il completo involucro all'interno del tubo.
  4. Legare il tubo di silicone e la parte centrale dell'uretere utilizzando un filo di seta 3-0 per indurre l'ostruzione ureterale. Evitare un'eccessiva forza di legatura. Tirare gradualmente il tubo di silicone lungo l'asse longitudinale dell'uretere per garantire una legatura sicura ma non scivolante.
  5. Riposizionare con cura l'intestino all'interno della cavità peritoneale, assicurandosi un corretto allineamento senza tensioni o ostruzioni.
  6. Sutura il muscolo addominale e gli strati fasciali utilizzando una sutura 2-0 non assorbibile con un ago da taglio curvo in modo continuo per fornire un'adeguata resistenza alla trazione. Chiudere la pelle con una sutura 4-0 non assorbibile, garantendo l'allineamento anatomico e una tensione uniforme per favorire la guarigione e ridurre al minimo il rischio di deiscenza della ferita.
  7. Disinfettare il sito dell'incisione con una soluzione di iodio povidone. Lasciare che i ratti si riprendano in condizioni controllate a una temperatura costante per 7 giorni.

3. Chirurgia di sollievo dell'ostruzione ureterale unilaterale reversibile

  1. Preparare gli animali e gli strumenti necessari, garantendo una configurazione sterile per la riapertura addominale e la piena esposizione della cavità addominale.
  2. Sezionare accuratamente il nodo del tubo di silicone utilizzando una lama di bisturi. Rimuovere il tubo e irrigare la cavità addominale con soluzione fisiologica normale per ridurre al minimo l'adesione e il rischio di infezione.
  3. Riposizionare l'intestino e suturare l'incisione della parete addominale a strati utilizzando suture 4-0 non assorbibili. Sterilizzare il sito di incisione con una soluzione di iodio povidone. Posizionare il ratto in un ambiente a temperatura controllata per un periodo di recupero postoperatorio di 7 giorni.
  4. Il giorno 14 postoperatorio, anestetizzare i ratti (seguendo la procedura menzionata al punto 1.2) e raccogliere campioni di rene sezionando trasversalmente i reni in due metà9.
  5. Conservare una metà in paraformaldeide al 4% per l'esame istopatologico e congelare rapidamente l'altra metà in azoto liquido per la conservazione a -80 °C per la successiva analisi molecolare. Raccogli campioni di sangue per analisi biochimiche.
  6. Eseguire l'eutanasia tramite asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale seguendo le linee guida etiche.

4. Valutazioni di follow-up

  1. Monitora il peso corporeo dopo RUUO per valutare il recupero generale. Confrontare le variazioni di peso con i gruppi di controllo e UUO.
  2. Misurare il peso e il volume dei reni per valutare il recupero renale.
  3. Monitorare i livelli sierici di creatinina (Scr) come indicatore del miglioramento della funzionalità renale9.
  4. Iniettare il blu di metilene nella pelvi renale per confermare la pervietà ureterale. Osservare la peristalsi ureterale e la colorazione per valutare il recupero post-ostruzione.
  5. Eseguire la colorazione H&E per valutare l'integrità tubulare e la struttura renale dopo RUUO 8,10.
  6. Condurre la colorazione tricromica di Masson per valutare la regressione della fibrosi interstiziale renale 8,10.
  7. Confrontare i punteggi di danno renale 3,8 tra i gruppi UUO e RUUO per quantificare il recupero tissutale.

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Risultati

Sono stati valutati gli effetti dell'UUO e del suo successivo rilascio (RUUO) sul peso corporeo, sul peso dei reni, sul volume dei reni e sui livelli di creatinina sierica (Scr), come riassunto nella Tabella 1. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD), con n = 5 per gruppo.

A 6 settimane, il gruppo nativo mostrava un peso corporeo medio di 234 g ± 16 g, un peso renale di 0,9107 g ± 0,0475 g e un volume renale di 0,8962 cm³ ± 0,0502 cm³. Entro 8 settimane, i...

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Discussione

Questo modello utilizza un tubo di silicone per circondare l'uretere, fornendo supporto strutturale, seguito da una legatura con un filo di seta per indurre la completa ostruzione ureterale attraverso la compressione. Dopo sette giorni, la legatura e il tubo in silicone vengono rimossi per facilitare la decompressione renale e il ripristino dell'integrità e della funzionalità delle vie urinarie.

I tubi in silicone, realizzati con elastomeri siliconici, offrono...

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Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma per l'innovazione giovanile nella medicina del futuro, dall'Università di medicina di Chongqing (W0056), dal progetto congiunto di innovazione tecnologica e sviluppo di applicazioni TCM di Chongqing Science and Health (2020ZY023877).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PinzeShanghai Medical Devices Co., Ltd20220032
GarzaSichuan Kelun Co., Ltd20172140152
Kit per macchie di ematossilina ed eosinaSolarbioG1120
Aghi per insulinaKDL Medical Devices20193140938
Masson' s Kit di macchie tricromaticheSolarbioG1340
Batuffoli di cotone medicoSichuan Kelun Co., Ltd20170037
Bastoncini di cotone medicoSichuan Kelun Co., Ltd20172140026
Blu di metileneTianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory14038-43-8
Pinze microscopicheSuqian Shifeng Medical Devices Co., LtdS50985
PortaaghiSuqian Shifeng Medical Devices Co., LtdS7005
Soluzione di iodio povidoneSichuan Kelun Co., Ltd514001
SalineSichuan Kelun Co., Ltd20220004
SD RatsSPF (Pechino) Biotechnology Co., LtdD025
Tubi in siliconeTaizhou Chunshi New Materials Co., LtdCS356
Sutura di seta Qiangsheng Medical Devices Co., LtdSA84G
Lama chirurgicaHuanan Yunyue Medical Devices Co., LtdCE0434
Forbici chirurgicheShanghai Medical Devices Co., LtdJ21130
SiringaTongmai dispositivi medici20183140304
Pinze per tessutiJiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., LtdJ36030

Riferimenti

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