Chiarire le alterazioni proteomiche tessuto-specifiche e plasmatiche in salute e malattia

Sommario

La proteomica è una valutazione ad alto rendimento delle interazioni, della funzione, della composizione e delle strutture delle proteine e delle loro attività cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per valutare i cambiamenti proteomici totali in vari campioni biologici, tra cui plasma e tessuti. La metodologia qui riportata è applicabile a tutti i campioni biologici contenenti proteine.

Abstract

La proteomica è lo studio su larga scala delle proteine espresse, concentrandosi sulla loro struttura, funzione, interazioni, abbondanza e modificazioni post-traduzionali all'interno di un sistema biologico. Ad esempio, la fosfoproteomica, un sottoinsieme vitale della proteomica totale, è lo studio dei modelli di fosforilazione e delle alterazioni sulle proteine. La metodologia qui descritta illustra un approccio di proteomica totale per chiarire le alterazioni nei profili complessivi di espressione proteica, compresi i modelli di fosforilazione, nei tessuti plasmatici, cerebrali, polmonari, milza ed epatici raccolti da modelli animali di ricerca (ad esempio, furetti e topi). Questa tecnica è applicabile ad altri tipi di tessuto, nonché a quasi tutti i campioni biologici contenenti proteine (ad esempio, cellule in coltura). Dopo la dissezione, i tessuti di interesse sono stati congelati e conservati a -80 °C. I tessuti sono stati quindi omogeneizzati utilizzando un mortaio e un pestello con azoto liquido per preservare l'integrità delle proteine e i cambiamenti di fosforilazione. La proteina totale è stata estratta dagli omogeneizzati tissutali utilizzando un tampone di lisi con una nucleasi universale e inibitori della proteasi/fosfatasi. Le proteine estratte dal tessuto e dal plasma equivalente sono state convertite in peptidi totali mediante digestione controllata della proteasi utilizzando un kit di preparazione del campione con spettrometro di massa commerciale. I peptidi sono stati analizzati direttamente utilizzando la cromatografia liquida ad altissime prestazioni/spettrometria di massa tandem Orbitrap-tribrid. Le identità delle proteine costituenti sono state ricostruite dai dati spettrali di massa dei peptidi, utilizzando un software di bioinformatica proteomica, come abbinate a una libreria di sequenze di amminoacidi specie-specifiche. Successivamente, l'analisi dovrebbe includere criteri di cutoff rigorosi, in particolare utilizzando solo identificazioni proteiche ad alta confidenza. Differenze proteomiche statisticamente significative (>variazione di 2 volte; p < 0,05) possono essere determinate tra i gruppi di controllo e quelli sperimentali.

Introduzione

La proteomica, come combinazione di sperimentazione del proteoma e analisi dei dati, si concentra sull'identificazione e la quantificazione delle proteine, caratterizzandole in base alla composizione, all'interazione, alle modifiche pre-traduzionali e post-traduzionali (ad esempio, fosforilazione), alla localizzazione sub-cellulare e alla struttura in condizioni fisiologiche¹. La proteomica dell'espressione si occupa di confronti quantitativi di proteine che differiscono in condizioni biologiche mutevoli². Ha anche una grande importanza nella profilazione di una mappa dei percorsi complessi e interconnessi, delle reti e dei sistemi molecolari, che controllano direttamente le principali funzioni biologiche come la proliferazione cellulare, la differenziazione, la senescenza e i meccanismi di morte cellulare. Con il sostanziale progresso della tecnologia sperimentale negli ultimi anni, i metodi di proteomica si sono evoluti da approcci convenzionali, tra cui l'immunoistochimica e il saggio di immunoassorbimento enzimatico, a tecniche ad alto rendimento come la cromatografia liquida ^3,4. Gli approcci basati sulla proteomica stanno guadagnando slancio nella determinazione di fenotipi e sottotipi di malattia unici, nonché nell'identificazione di nuove interazioni target per i farmaci terapeutici (farmacoproteomica). Ad esempio, la stratificazione dei pazienti si è concentrata principalmente su approcci genomici per definire gruppi omogenei e guidare i regimi di trattamento. Lo stato di trascrizione da solo, tuttavia, non predice il destino delle proteine tradotte in seguito (ad esempio, stabilità o modificazione); e quindi, i meccanismi non genomici contribuiscono maggiormente allo sviluppo, alla progressione, alla gravità e alla resistenza della malattia alle terapie ^5,6,7.

Una di queste aree di ricerca che ha beneficiato notevolmente dei confronti quantitativi dell'espressione e dell'attività delle proteine è la scoperta di biomarcatori nel campo delle malattie neurodegenerative e delle lesioni cerebrali traumatiche (TBI). La base per la scoperta di biomarcatori è lo sviluppo di tecniche diagnostiche che facilitino la diagnosi precoce e i potenziali bersagli per l'intervento. La proteomica quantitativa basata su LC/MS-MS abbinata alla bioinformatica ha contribuito alla scoperta di biomarcatori proteici chiave, tra cui la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e l'isoenzima ubiquitina carbossil-terminale idrolasi L1 (UCH-L1), con un grave impatto o un trauma cranico penetrante ^8,9. Ad esempio, il personale militare subisce spesso incidenti di trauma cranico durante le loro missioni, a causa dell'esposizione a esplosioni di bombe (ad esempio, blast-TBI). Tuttavia, la patobiologia sottostante dei deficit neurologici causati da un trauma cranico lieve indotto da blasti rimane poco chiara. Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari e ultrastrutturali delle lesioni cerebrali indotte da blasti richiede una migliore identificazione di specifici surrogati di biomarcatori. Con l'osservazione dei cambiamenti proteomici, gli studi hanno dimostrato che i possibili meccanismi dello stress ossidativo indotto dai blasti nel cervello sono associati alla disfunzione mitocondriale, tra cui la compromissione della dinamica di fissione-fusione, la diminuzione della fosforilazione ossidativa e la compensazione delle attività enzimatiche rilevanti per la respirazione¹⁰. Le informazioni sulla patogenesi precoce della disregolazione indotta dai blasti delle modificazioni post-traduzionali come l'acetilazione, la nitrosilazione, la deaminazione e la fosforilazione possono anche fornire un'ulteriore caratterizzazione dei suoi effetti sulla funzione proteica implicata nel danno assonale, nell'infiammazione e nella rottura della barriera emato-encefalica^11,12. Con il progresso degli approcci di biologia dei sistemi, la mappatura delle informazioni totali del proteoma dal cervello e dai tessuti periferici in diverse specie animali, tra cui roditori e furetti, è diventata una procedura chiave nella ricerca sulle lesioni da esplosione.

In questo articolo, ci concentriamo sul flusso di lavoro della metodologia per valutare gli aspetti quantitativi della proteomica di espressione e le sue modificazioni post-traduzionali a partire dal tessuto o dal plasma, che è stato ampiamente utilizzato per il monitoraggio sia di fenomeni fisiologici che di condizioni patologiche. L'utilizzo della metodologia seguente consente di garantire coerenza e affidabilità nella preparazione dei campioni e nell'acquisizione dei dati. Avendo questa metodologia standardizzata, è possibile effettuare confronti per determinare i modelli proteomici conservati tra i tipi di tessuto e i modelli di fosforilazione unici per tessuti specifici. Insieme a questo, è possibile effettuare analisi su diversi modelli animali preclinici e campioni clinici umani per ottenere modelli di fosforilazione conservati che potrebbero potenzialmente fungere da biomarcatori e per personalizzare i regimi di trattamento farmacologico.

Protocollo

La ricerca è stata condotta nell'ambito di un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'IACUC in una struttura accreditata AAALAC International con una garanzia per il benessere degli animali dei servizi di sanità pubblica e in conformità con l'Animal Welfare Act e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali da laboratorio. Tutte le forniture necessarie per questa procedura sono elencate nella Tabella dei Materiali. La procedura è suddivisa in sette componenti.

CAUTELA. Assicurarsi che vengano seguiti protocolli di sicurezza adeguati quando si lavora con l'azoto liquido per omogeneizzare i tessuti. Il personale del laboratorio indossava guanti da congelatore, un grembiule da congelatore, una maschera chirurgica e una visiera durante l'omogeneizzazione del tessuto congelato. Questa tecnica di omogeneizzazione può essere utilizzata per qualsiasi tipo di tessuto, comprese sostanze estremamente dure come l'osso, semplicemente regolando di conseguenza le dimensioni del mortaio e del pestello. Vedere la Figura 1A per la configurazione iniziale dell'ambiente di lavoro. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le dimensioni utilizzate durante l'omogeneizzazione dei tessuti di topi e furetti.

1. Macinazione criogenica di tessuti con mortaio e pestello

1. Prendi il peso di una provetta di raccolta vuota e registralo. Nella provetta di raccolta, pesare il tessuto utilizzando una bilancia analitica e registrare il peso su un quaderno da laboratorio. Sottrarre il peso di una provetta vuota dal tessuto più il peso della provetta per ottenere i mg di tessuto utilizzati.
   NOTA: I tessuti che sono stati valutati per gli studi di proteomica includono cervello, polmone, fegato e milza. L'intero tessuto è stato macinato criogenicamente in polvere utilizzando un mortaio e un pestello.
2. Versare l'azoto liquido nel criopode, ma assicurarsi che sia riempito a meno della metà.
3. Trasferire la provetta contenente il campione e la/e provetta/e da microcentrifuga da 1,5 mL vuota, precedentemente sterilizzata in autoclave, sul rack per provette situato nel criopode. Ciò garantisce che il campione rimanga congelato durante il raffreddamento del mortaio e del pestello, evitando che il campione si scongeli durante il trasferimento del tessuto omogeneizzato nelle provette per microcentrifuga vuote da 1,5 mL.
4. Versare l'azoto liquido sul mortaio e sul pestello per raffreddare questi strumenti prima dell'uso. Il mortaio e il pestello si trovano all'esterno del criopode (Figura 1A, B).
5. Trasferire il tessuto nella malta raffreddata contenente azoto liquido (Figura 1B).
6. Esercitare ripetutamente pressione sul tessuto congelato usando il pestello e fare un movimento rotatorio e stridente con il pestello contro il tessuto fino a quando il tessuto non viene macinato in una polvere fine (Figura 1C).
   1. Assicurarsi che non venga applicata una forza eccessiva, che comporta il rischio che i campioni fuoriescano dalla malta. Assicurati di avere un controllo fermo sul pestello.
   2. Aggiungere ulteriore azoto liquido alla malta omogeneizzando i tessuti di grandi dimensioni per ridurre la possibilità di scongelamento del campione durante la macinazione.
   3. Durante la macinazione del tessuto, controllare che non si stia scongelando. Se si sta scongelando, mettere ulteriore azoto liquido nel mortaio.
7. Immergere le estremità delle spatole di metallo nell'azoto liquido per raffreddarle. Questo aiuta a trasferire facilmente il tessuto omogeneizzato nella provetta da 1,5 mL. In questo modo si evita che il tessuto si scongeli e si attacchi alla spatola durante il trasferimento.
8. Una volta che il tessuto è stato omogeneizzato in una polvere fine e le spatole metalliche sono state raffreddate, trasferire con cura la polvere di tessuto omogeneizzata nelle nuove provette da 1,5 mL.
   1. Suddividere il campione in aliquote a seconda del numero di saggi da completare.
      NOTA: Ad esempio, in questo studio dovevano essere completati quattro test per i campioni, quindi il tessuto omogeneizzato è stato equamente aliquotato in quattro provette da 1,5 ml.
   2. Conservare il tessuto omogeneizzato in eccesso in una provetta di raccolta snap-top autoclavata da 5 mL.
9. Conservare i tessuti aliquotati in un congelatore a -80 °C fino a future analisi, con un uso realistico entro 1 anno per ridurre al minimo l'aria e l'ossidazione leggera delle proteine.
10. Pesare la provetta di raccolta vuota.
11. Sottrarre il peso della provetta di raccolta vuota dalla misurazione iniziale (provetta di raccolta più campione) per ottenere il peso del campione di tessuto.

2. Lisi tissutale per l'isolamento delle proteine

1. Raccogli il ghiaccio secco in un contenitore per il ghiaccio.
2. Mettere una griglia per provette nel ghiaccio secco e lasciarla raffreddare.
3. Rimuovere i campioni di tessuto omogeneizzati dal congelatore a -80 °C e collocarli nel rack per provette refrigerate. In questo modo si evita lo scongelamento dei campioni, che potrebbe causare la degradazione delle proteine e/o le variazioni della fosforilazione durante il processo di pesata.
   1. Assicurarsi che le provette da 1,5 mL contenenti il campione rimangano congelate sul rack delle provette in ghiaccio secco.
4. Inserire una nuova provetta canonica da 50 ml nel ghiaccio secco.
5. Rimuovere il tappo dalla provetta canonica da 50 ml e posizionare le spatole di plastica monouso nella provetta canonica da 50 ml per mantenerle fresche. In questo modo si evita che il campione si attacchi alle spatole durante il trasferimento alle provette di omogeneizzazione.
6. Per la lisi dei tessuti e l'isolamento delle proteine, utilizzare provette da 2 mL contenenti cinque perle di ceramica da 2,8 mm (denominate provette omogeneizzanti in questo protocollo).
7. Etichettare il tappo e il lato della provetta omogeneizzatrice con l'ID del campione utilizzando un pennarello a inchiostro permanente.
8. Posizionare le provette omogeneizzanti etichettate nel rack per provette situato nel ghiaccio secco per mantenere le provette fredde e prevenire lo scongelamento del campione.
9. Posizionare una provetta omogeneizzante su una bilancia analitica e tarare la scala.
10. Rimettere la provetta omogeneizzante nel rack per provette su ghiaccio secco.
11. Rimuovere il coperchio dalla provetta di omogeneizzazione contenente le perle e, utilizzando una delle spatole di plastica raffreddate, trasferire da 5 mg a 10 mg di campione di tessuto in polvere nella rispettiva provetta di omogeneizzazione.
12. Riposizionare il coperchio sul tubo di omogeneizzazione.
13. Pesare la provetta di omogeneizzazione sulla bilancia analitica e registrare la quantità di campione nella provetta di omogeneizzazione.
    1. Utilizzare questo peso per determinare la quantità di tampone di lisi necessaria per un'efficace estrazione delle proteine totali.
14. Una volta registrato il peso, riposizionare la provetta omogeneizzante contenente il campione nel rack per provette su ghiaccio secco per mantenerla fredda.
15. Smaltire la spatola di plastica usata.
16. Utilizzare una spatola di plastica nuova e pulita per ogni campione da trasferire e pesare per evitare la contaminazione incrociata. Ripetere i passaggi da 2.9 a 2.15 per tutti i campioni.
17. Dopo aver trasferito tutti i campioni nelle singole provette di omogeneizzazione, calcolare la quantità di Protein Lysis Master Mix necessaria.
    1. Preparare il volume richiesto di Protein Lysis Master Mix, che viene calcolato in base al numero di campioni che devono essere lavorati e al peso di ciascun campione in polvere. Aggiungere 100 μl di Protein Lysis Master Mix per 5 mg di tessuto in ciascuna provetta.
    2. Fare riferimento alle linee guida dell'azienda per i volumi dei reagenti per la produzione della Protein Lysis Master Mix (fare riferimento alla Tabella dei materiali).
18. Collocare le provette omogeneizzatrici contenenti i campioni omogeneizzati in polvere in un blocco freddo a 4 °C. I tubi omogeneizzatori non possono più rimanere sul ghiaccio secco. Posizionando le provette omogeneizzatrici sul blocco freddo si evita il congelamento della soluzione di lisi.
19. Rimuovere il coperchio dalle provette di omogeneizzazione e trasferire la quantità calcolata di Protein Lysis Master Mix necessaria nella rispettiva provetta di omogeneizzazione utilizzando la pipetta di capacità appropriata.
    1. Riposizionare il coperchio sui tubi omogeneizzatori e ruotare i coperchi finché non sono ben serrati.
20. Posizionare le provette del campione nell'omogeneizzatore e impostarlo su un programma per tessuti molli (velocità 4500 giri/min, 2 x 30 s per ciclo, 30 s di pausa) a 4 °C per l'omogeneizzazione.
21. Una volta completato il ciclo di omogeneizzazione, rimuovere le provette dallo strumento e riporle nel blocco freddo a 4 °C.
    1. Ispezionare visivamente le provette del campione. Assicurarsi che non sia più visibile alcun campione in polvere. Se il campione è ancora visualizzato in tutto il Master Mix di lisi proteica, completare nuovamente la lisi tissutale sullo strumento.
    2. Ottimizza le impostazioni per il tipo di tessuto utilizzato. Ad esempio, il tessuto in polvere derivato da organi fibrosi (ad esempio, il cuore) può richiedere cicli aggiuntivi o un numero di giri più elevato.
22. Trasferire le provette omogeneizzatrici in una centrifuga. Immettere le seguenti impostazioni sulla centrifuga: 16.000 g per 10 minuti a 4 °C e premere Start sulla centrifuga.
23. Una volta completata la centrifugazione, ritrasferire con cura le provette omogeneizzatrici nel blocco freddo a 4 °C.
24. Etichettare le nuove provette da 1,5 mL sul coperchio e sul lato con l'ID del campione e qualsiasi altra informazione pertinente. Una volta etichettate, posizionare queste provette da 1,5 mL in un blocco freddo a 4 °C.
    NOTA: Le provette sono state etichettate con almeno le seguenti indicazioni: ID animale, punto temporale dello studio, tipo di animale e tipo di tessuto.
25. Trasferire il lisato proteico corrispondente dalle provette omogeneizzatrici alle rispettive provette da 1,5 mL etichettate conservate su un blocco freddo a 4 °C.
26. Conservare i campioni a -80 °C per ulteriori analisi. Questo è un punto di sosta sicuro.

3. Quantificazione delle proteine totali

1. Prelevare i campioni dal congelatore a -80 °C e scongelarli su ghiaccio umido in un secchiello per il ghiaccio.
2. Una volta scongelati, agitare tutti i campioni e gli standard del kit di quantificazione delle proteine per almeno 3 s.
3. Aggiungere 10 μl di ciascuna replica di standard, campioni e bianchi appropriati in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti in base al layout schematico (Figura 2A).
   NOTA: Per ogni campione di tessuto, nell'analisi del saggio delle proteine viene utilizzata una diluizione 1:100 del lisato proteico in soluzione salina preferibilmente tamponata con fosfato. Il layout schematico può essere modificato a seconda del numero di campioni utilizzati nel test delle proteine. I campioni, gli standard e i bianchi appropriati vengono caricati in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti in triplicato per valutare l'accuratezza della concentrazione proteica, ma se molti campioni devono essere inseriti in una piastra, i duplicati sono accettabili.
   1. Per i campioni con una bassa quantità di tessuto di partenza (cioè inferiore a 5 mg), utilizzare solo una singola replica o duplicati per il saggio delle proteine per massimizzare la quantità di lisato proteico disponibile per la successiva digestione delle proteine.
   2. Assicurarsi che vengano utilizzati pipettaggi accurati e calibrati.
4. Capovolgere più volte il flacone del reagente per il dosaggio delle proteine per mescolare bene, quindi versarlo in un serbatoio di reagenti da 10 ml.
5. Utilizzando una pipetta multicanale con capacità massima di 200 μl, aggiungere 150 μl di reagente per il dosaggio delle proteine alla colonna 1.
6. Pipettare più volte su e giù per miscelare il reagente del dosaggio delle proteine con i 10 μl di contenuto già presenti nel pozzetto per ridurre il precipitato nei pozzetti.
7. Eliminare i puntali della pipetta e posizionare i nuovi puntali sulla pipetta multicanale con capacità massima di 200 μl.
8. Ripetere i passaggi 3.5-3.7 fino a quando il reagente del saggio delle proteine non viene aggiunto all'intera piastra a 96 pozzetti.
   1. Utilizzare puntali per pipette nuovi per ogni colonna di pozzetti per evitare la contaminazione incrociata.
   2. Assicurarsi che almeno un pozzetto sia lasciato vuoto senza reagenti o campioni aggiunti da utilizzare come valore di assorbanza in bianco per la quantificazione delle proteine.
9. Una volta che il reagente per il dosaggio delle proteine è stato aggiunto a tutti i pozzetti necessari, coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di alluminio.
10. Agitare la piastra a 96 pozzetti su uno strumento a vortice per 1 minuto a velocità media, quindi incubarla a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti prima di leggere la piastra.
11. Ispezionare la piastra a 96 pozzetti e la guarnizione in foglio di alluminio. Se il reagente rimane attaccato alla guarnizione del foglio di alluminio, posizionarlo con un'apposita bilancia all'interno di una centrifuga.
    1. Tenere premuta la centrifuga rapida fino a raggiungere circa 200 g.
    2. Estrarre la piastra a 96 pozzetti e ispezionare visivamente la guarnizione del foglio di alluminio per assicurarsi che non rimanga liquido sulla lamina.
12. Rimuovere lentamente la guarnizione in foglio di alluminio e riposizionare il coperchio trasparente sulla piastra a 96 pozzetti (Figura 2B).
13. Leggere la piastra a 96 pozzetti su uno spettrofotometro a 660 nm, dopo aver lasciato sviluppare la reazione colorimetrica per 5 minuti.
    NOTA: Le letture dell'assorbanza utilizzando uno spettrofotometro UV/visibile vengono misurate a temperatura ambiente. Il saggio delle proteine a 660 nm si basa sul legame di un complesso proprietario, colorante-metallo alla proteina in condizioni acide, che provoca uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante, che viene misurato a 660 nm.
14. Utilizzare le letture dell'assorbanza degli standard noti per creare la curva standard utilizzando il software grafico (Figura 2C-E), che viene ulteriormente applicato per calcolare le concentrazioni proteiche per tutti i campioni.

4. Digestione delle proteine

CAUTELA. Assicurarsi che vengano seguiti protocolli di sicurezza adeguati quando si lavora con le sostanze chimiche pericolose utilizzate nel protocollo seguente. Il personale del laboratorio indossava dispositivi di protezione individuale (DPI) e completava questi passaggi in una cappa chimica. Rivedere tutte le schede di sicurezza prima di lavorare con queste sostanze chimiche.

1. Etichettare un nuovo set di provette per microcentrifuga da 1,5 mL con gli ID dei campioni sul coperchio e sul lato delle provette con inchiostro permanente. Includi qualsiasi altra informazione pertinente.
   1. In base all'equazione della curva standard, alle letture dell'assorbanza del campione e al fattore di diluizione, calcolare la concentrazione proteica di ciascun campione in microgrammi per microlitro (μg/μL). Utilizzare questo valore per calcolare il volume richiesto di lisato campione contenente 100 μg di proteine (Figura 2C-E). Trasferire questo volume calcolato di lisato campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
2. Portare il volume finale a 100 μl con il tampone di lisi; Questo è il volume iniziale necessario per il protocollo di digestione.
   NOTA: Il volume finale del campione proteico più il tampone di lisi deve essere pari a 100 μl.
3. Secondo la letteratura pubblicata in precedenza, utilizzare 1,5 μL di plasma per la digestione, che è approssimativamente uguale a 100 μg di proteine.
4. Aggiungere 50 μL di soluzione di riduzione (10 mM di ditiotreitolo) a ciascuna provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, chiudere le parti superiori e agitare brevemente per 3 s. Quindi aggiungere 50 μL di soluzione di alchilazione (30 mM di iodoacetammide) a ciascun campione, chiudere le parti superiori e agitare per 3 s.
5. Incubare i campioni a 95 °C utilizzando un blocco termico per 11 minuti per ridurre e alchilare, rispettivamente, il campione proteico. Questo scinde tutti i ponti disolfuro e li copre con un gruppo acetammidico, impedendone la riformazione, e quindi denatura la proteina in uno stato completamente dispiegato e massimizza l'esposizione dei siti di digestione dei peptidi.
6. Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni dal blocco termico e lasciarli raffreddare a RT.
7. In attesa che i campioni si raffreddino, ricostituire la miscela liofilizzata di tripsina/proteasi Lys-C (rapporto 1:1, 50 μg ciascuno) con la soluzione di ricostituzione enzimatica aggiungendo 515 μL di liquido a 1 fiala di reagente solido, ovvero 0,1 μg/μL ciascuno. Evitare il contatto diretto della pelle con la soluzione di proteasi e tutti i passaggi successivi, poiché la tripsina può essere un grave irritante e allergene.
8. Una volta che i campioni si sono raffreddati a RT, aggiungere 50 μl di miscela di proteasi tripsina/lis-C ricostituita (2,5 μg ciascuno) alla soluzione del campione di proteine ridotte e alchilate e agitare brevemente.
9. Incubare su un termomiscelatore a 37 °C e impostare a 1000 giri/min per 3 ore per digerire il campione proteico.
   NOTA: La proteasi Lys-C è inclusa per aiutare a scindere tutti i siti che sono resistenti alla digestione da parte della tripsina, a causa del ripiegamento o della sequenza di aminoacidi (ad esempio, i legami Lys-Pro). Questo non solo riduce ogni proteina in numerosi peptidi conoscibili di dimensioni e carica totale ragionevolmente piccole, ma è anche altamente riproducibile se si seguono attentamente le stesse condizioni di digestione. Il tempo di incubazione di 3 ore durante la digestione è il tempo minimo che raccomandiamo per garantire la completa scissione di tutte le proteine.
10. Dopo le 3 ore di incubazione, rimuovere dal termomiscelatore utilizzando un paio di pinze per evitare ustioni alle dita.
11. Aggiungere 50 μl di soluzione di arresto della digestione (acido trifluoroacetico al 6% o acido formico in acqua) al campione e agitare brevemente.
    NOTA: Questo inibisce la reazione, poiché le due proteasi hanno attività massime a un pH neutro 7-8.
12. Conservare i campioni in un congelatore a -80 °C in quanto ciò interrompe anche l'attività residua della proteasi. Questo è un punto di sosta sicuro.

5. Pulizia, essiccazione e risospensione dei peptidi

NOTA: Questa procedura serve principalmente a rimuovere i reagenti di digestione, in particolare i sali non volatili, che possono facilmente danneggiare lo strumento LC/MS-MS, oltre ad aiutare a isolare e concentrare i peptidi prodotti. La pulizia dei peptidi viene eseguita utilizzando colonne di centrifuga di desalinizzazione fornite in kit, preconfezionate con una resina di esclusione dimensionale (filtrazione gel) che inizialmente cattura i peptidi e quindi consente il lavaggio in particolare dei sali. Trasferimento completo dei reagenti del kit alle colonne di centrifuga in una cappa chimica, in quanto contengono solventi organici tossici.

CAUTELA. Assicurarsi che le procedure di sicurezza adeguate, incluso l'uso di DPI e le norme di contenimento dei rifiuti pericolosi, siano seguite quando si lavora con le sostanze chimiche pericolose nel protocollo seguente. Completare questi passaggi in una cappa chimica e rivedere tutte le schede di sicurezza prima di lavorare con queste sostanze chimiche.

1. Rimuovere i campioni dal congelatore a -80 °C e lasciare che i campioni arrivino a RT.
2. Rimuovere il tappo bianco nella parte inferiore della colonna di pulizia dei peptidi, allentare il tappo superiore verde e inserirlo in una provetta di raccolta da 2 ml.
3. Metterli nella centrifuga, chiudere il coperchio, premere start e centrifugare a 3000 g per 2 minuti per rimuovere tutto il liquido di condizionamento pre-spedizione.
4. Gettare il flusso in un contenitore per rifiuti pericolosi e posizionare la colonna di pulizia dei peptidi in una nuova provetta di raccolta da 2 mL.
5. Etichettare i coperchi verdi della colonna di pulizia dei peptidi con gli ID del campione, utilizzando un pennarello a inchiostro permesso.
6. Trasferire delicatamente la preparazione di digestato proteico, che ha un volume di circa 300 μl, nella colonna di purificazione dei peptidi secchi, utilizzando una pipetta da 200 μl (ad esempio, 150 μl due volte).
   1. Assicurarsi che non si osservino bolle nella parte superiore della resina della colonna di rotazione. Se si osservano bolle, rimuoverle picchiettando delicatamente la colonna o utilizzando un puntale di pipetta pulito da 10 μl per disperdere le bolle.
      NOTA: Le bolle d'aria intrappolate possono ostacolare la transizione graduale del campione nella resina e, quindi, influire negativamente sull'efficienza della pulizia e della resa dei peptidi.
7. Metterli nella centrifuga, chiudere il coperchio, premere Start e centrifugare a 1.500 g per 2 minuti.
8. Gettare il flusso in un contenitore per rifiuti pericolosi e posizionare la colonna di pulizia dei peptidi in una nuova provetta di raccolta da 2 mL.
9. Aggiungere 300 μl della soluzione di lavaggio A (acqua, acido trifluoroacetico allo 0,1% / TFA) sopra la resina della colonna, sempre utilizzando una pipetta da 200 μl.
   1. Assicurarsi che non si osservino bolle nella parte superiore della resina della colonna di rotazione. Se si osservano bolle, rimuoverle picchiettando delicatamente la colonna o utilizzare un puntale per pipetta pulito da 10 μl per disperdere le bolle.
10. Metterli nella centrifuga, chiudere il coperchio, premere Start e centrifugare a 1.500 g per 2 minuti.
11. Gettare il flusso in un contenitore per rifiuti pericolosi e posizionare la colonna di pulizia dei peptidi in una nuova provetta di raccolta da 2 mL.
12. Aggiungere 300 μl di soluzione di lavaggio B (5% metanolo, 0,1% TFA) sopra la resina della colonna, sempre utilizzando una pipetta da 200 μl.
    1. Assicurarsi che non si osservino bolle nella parte superiore della resina della colonna di rotazione. Se si osservano bolle, rimuoverle picchiettando delicatamente la colonna o utilizzare un puntale per pipetta pulito da 10 μl per disperdere le bolle.
13. Metterli nella centrifuga, chiudere il coperchio, premere Start e centrifugare a 1.500 g per 2 minuti.
14. Gettare il flusso in un contenitore per rifiuti pericolosi e posizionare la colonna di pulizia dei peptidi in una nuova provetta di raccolta da 2 mL.
15. Ripetere ancora una volta i passaggi 5.12-5.14 in modo che la colonna venga lavata due volte con la soluzione di lavaggio B.
16. Trasferire la colonna di purificazione dei peptidi in una nuova provetta per microcentrifuga da 2 mL.
    1. Assicurarsi che le provette per microcentrifuga da 2 ml utilizzate in questa fase siano le provette di raccolta a basso legame proteico fornite in kit.
    2. Per conservare la quantità disponibile di provette di raccolta a basso contenuto proteico, utilizzare quelle standard da laboratorio per le fasi di lavaggio precedenti.
17. Aggiungere 300 μl di soluzione di eluizione (50% acetonitrile, 0,1% TFA) sopra la resina della colonna, sempre utilizzando una pipetta da 200 μl.
    1. Assicurarsi che non si osservino bolle nella parte superiore della resina della colonna di rotazione. Se si osservano bolle, rimuoverle picchiettando delicatamente la colonna o utilizzare un puntale per pipetta pulito da 10 μl per disperdere le bolle.
18. Metterli nella centrifuga, chiudere il coperchio, premere Start e centrifugare a 1.500 g per 3 minuti per raccogliere il campione di peptide pulito nella nuova provetta di raccolta da 2 ml a basso legame proteico.
    1. Se lo si desidera, trasferire 125 μl (circa la metà) della soluzione peptidica pulita eluita in un flaconcino di vetro da 1 mL, utilizzando una pipetta da 200 μl, e conservare a -80 °C.
       NOTA: Questa aliquota può essere utilizzata in seguito per ulteriori analisi, come l'etichettatura TMT (Tandem Mass Tag) dei peptidi, come fatto da un kit disponibile in commercio, per una quantificazione più precisa tra i campioni, in particolare i set preparati in modo indipendente.
19. Conservare il campione rimanente, circa 175 μL, a -30 °C nelle provette da 2 mL a basso legame proteico fino al momento di procedere con l'essiccazione e la ricostituzione. Questo è un punto di sosta sicuro.
20. Per asciugare il campione, scongelare il campione di peptidi da -30 °C a RT. Se si procede con l'essiccazione e la ricostituzione subito dopo la pulizia dei peptidi, ignorare questo passaggio.
21. Aprire le provette per microcentrifuga da 2 mL e inserirle in un concentratore per centrifuga sottovuoto.
    1. Assicurarsi di bilanciare il concentratore per centrifuga a vuoto se viene eseguito un numero dispari di campioni contemporaneamente.
    2. Chiudere il coperchio del concentratore della centrifuga sottovuoto e premere Start.
    3. Lasciare che i campioni funzionino sul concentratore centrifugo sottovuoto per 3 ore, senza applicazione di riscaldamento.
    4. Ispezionare periodicamente le provette per assicurarsi che non rimanga liquido all'interno, in quanto ciò può interferire con il legame dei peptidi alla colonna di separazione dello strumento LC/MS-MS.
    5. Se si osserva ancora del liquido, continuare a far girare i campioni per un altro tempo.
    6. Controllare tra 30 minuti e 1 ora per vedere se rimane del liquido nel tubo.
       NOTA: I peptidi sono altamente stabili durante questo processo in quanto si trovano in condizioni di vuoto e non si deteriorano a causa di un breve periodo di secchezza o di calore moderato generato dal solo funzionamento del concentratore della centrifuga a vuoto.
22. Una volta asciutto, risospendere immediatamente il campione in 50 μL di acido formico allo 0,1% in acqua di grado MS (ad esempio, 5 μL di acido formico al 100% in 5 mL di acqua).
    1. Aggiungere 50 μl di acido formico allo 0,1% sul fondo della provetta da 2 mL a basso contenuto proteico contenente il campione di peptide essiccato, utilizzando una pipetta da 200 μl.
23. Chiudere i tappi, quindi vorticare per 15 s.
24. Trasferire i campioni ricostituiti nelle rispettive fiale di vetro da 1 mL, utilizzando una pipetta da 200 μL.
25. Conservare le fiale di vetro contenenti i campioni ricostituiti a -30 °C e analizzarle con un approccio basato su LC-MS/MS il prima possibile.
    NOTA: I campioni di peptidi congelati sono stabili a -30 °C per la conservazione a breve termine e a -80 °C per la conservazione più lunga.

6. Acquisizione dati di campioni peptidici su uno strumento UHPLC/MS-MS

CAUTELA. Assicurarsi che vengano seguiti i protocolli di sicurezza adeguati quando si lavora con un sistema di spettrometro di massa tandem tribrid ad altissime prestazioni/cromatografia liquida ad altissime prestazioni/Orbitrap. Il personale di laboratorio indossava DPI e si sottoponeva a una formazione formale e pratica sugli strumenti fornita dal produttore UHPLC/MS-MS. Le principali precauzioni sono la corretta gestione delle fasi mobili di solventi acidi e organici per l'UHPLC e la sorgente di ionizzazione ad alta tensione per la MS.

1. Eseguire separazioni di peptidi utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC). La colonna LC è un design a separazione rapida (RSLC) in fase inversa C18 con capacità di elettrospray, di dimensioni 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm, posizionato in linea dopo una pre-colonna di protezione dello stesso materiale.
2. Utilizzare le seguenti fasi mobili UHPLC: 0,1% di acido formico in acqua (solvente A), 0,1% di acido formico in acetonitrile (solvente B) e 0,1% di acido formico in 90% di acqua e 10% di metanolo (solvente C).
   NOTA: Tutti i solventi e l'acido formico, utilizzati per la preparazione delle fasi mobili, sono certificati LC/MS e prodotti solo secondo necessità. L'UHPLC ha un'unità di filtrazione e degasaggio prima delle pompe, quindi le fasi mobili non vengono filtrate manualmente e spurgate dall'aria.
3. Impostare le iniezioni programmate dei peptidi totali preparati per i campioni di plasma e tessuto a 3 μL per cominciare, che equivale a ~3 μg di materiale peptidico come determinato dalla quantità iniziale di proteine utilizzate.
   NOTA: Questo dovrebbe produrre un'intensità del segnale MS ideale per la massima identificazione delle proteine. Il volume di iniezione può essere aumentato fino a 15 μl per aumentare ulteriormente l'uscita del segnale o diminuito fino a 1 μl se è evidente un sovraccarico.
4. Mantenere la colonna e l'autocampionatore rispettivamente a 40 °C e 10 °C.
5. Impostare la portata del solvente per l'acquisizione della proteomica a una costante di 0,3 μL/min, utilizzando le nano-pompe UHPLC, con un gradiente di separazione lineare delle fasi mobili da acqua (A) ad acetonitrile (B).
6. Eseguire i lavaggi della siringa di iniezione e del circuito del campione (capacità di 20 μl) utilizzando la fase mobile di acqua e metanolo (C), con la pompa di carico UHPLC inizialmente impostata a 5 μl/min.
7. Durante la separazione del campione per un totale di 80 minuti, impostare il gradiente LC (curve lineari) come segue: Iniziale - 5% B; 0-60 min - 32% B; 60-61 min - 95% B; 61-65 minuti - 95% B; 65-66 minuti - 2% B; e 66-80 min - 2% B. Allo stesso modo, far funzionare la pompa di carico a un costante 100% di A, ma regolare la portata linearmente come segue: Iniziale - 5 μL/min; 0-5 min - 1 μL/min; 5-61 min - 5 μL/min; e 61-80 min - 5 μL/min (Figura 3A).
8. Iniettare campioni di peptidi sconosciuti come esecuzioni duplicate sequenziali.
9. Per evitare il carryover, eseguire almeno due iniezioni sequenziali in bianco di acido formico allo 0,1% in acqua tra i campioni utilizzando un gradiente LC troncato (curve lineari) per un totale di 35 minuti come segue: Iniziale - 5% B; 0-23 min - 32% B; 23-24 min - 95% B; 24-30 min - 95% B; 30-31 minuti - 2% B; e 31-35 min - 2% B (Figura 3B).
   1. Assicurarsi che le impostazioni per la pendenza LC della pompa di carico rimangano invariate.
   2. Per i campioni di peptidi che presentano alti livelli di contaminanti endogeni, come il fegato (ad es. acidi biliari), includere un terzo bianco ogni 3-5 campioni e alla fine della corsa per aiutare a pulire la colonna LC. Consiste nell'iniettare da 1 a 2 μl di soluzione contenente il 25% ciascuno di acetonitrile, isopropanolo, metanolo e acqua.
   3. In alternativa, o in combinazione con il passaggio precedente, eseguire una variazione percentuale del gradiente LC potenziato (cioè altalena) su un totale di 35 minuti come dilavamento del sistema come segue: Iniziale - 2% B; 0-3 minuti - 2% B; 3-4 minuti - 95% B; 4-10 minuti - 95% B; 10-11 minuti - 2% B; e 11-15 minuti - 2% B; 15-16 min - 95% B; 16-20 min - 95% B; 20-21 min - 2% B; 21-25 min - 2% B; 25-26 minuti - 95% B; 26-30 min - 95% B; 30-31 minuti - 2% B; e 31-35 min - 2% B (Figura 3C).
10. Effettuare la rilevazione dei peptidi, cioè delle masse molecolari corrispondenti, man mano che vengono separati ed eluiti dalla colonna LC, utilizzando un Orbitrap e un sistema di spettrometro di massa a quadrupolo tandem combinato con trappola ionica (MS-MS).
    1. Prima di eseguire le esecuzioni del campione, collegare la colonna LC direttamente alla parte anteriore della sorgente di ionizzazione nano spray (NSI) intercambiabile dello strumento MS, che si trova nell'angolo anteriore in alto a sinistra del dispositivo.
       NOTA: Questo espone l'ago elettrospray incorporato nella colonna LC che eroga i peptidi, sospesi all'interno di micro-goccioline cariche di solvente LC in fase mobile, nell'ingresso del tubo di trasferimento ionico del rivelatore.
    2. Inoltre, per migliorare l'efficienza di volatilizzazione dell'elettrospray, accendere l'unità di riscaldamento integrata della sorgente NSI e impostarla a 40 °C.
11. Inoltre, prima dell'esecuzione del campione, verificare che vi sia un ingresso esterno soddisfacente di azoto compresso ed elio gassoso nello strumento MS. A tal fine, è possibile utilizzare serbatoi di bombole in acciaio di dimensioni 300 di grado di purezza ultra elevata per ciascun gas, con i manometri di regolazione impostati su pressioni di flusso statiche rispettivamente di 60 e 40 psi.
12. Se lo strumento MS emette avvisi sull'instabilità dell'ingresso di azoto gassoso, aumentare la pressione fino a un massimo di 100 psi. Assicurati che i serbatoi siano pieni almeno al 10-20%, che è una lettura del manometro della valvola superiore di ~250-500 psi; e in caso contrario, cambiali con quelli nuovi. Scendere al di sotto del 10% della piena capacità ha il rischio di attirare contaminanti nello strumento MS, che possono depositarsi sul fondo dei serbatoi di gas.
13. Effettuare in anticipo il metodo dello spettrometro di massa utilizzando un modello fornito da un software di controllo progettato per la rilevazione ottimale dei peptidi e delle loro modifiche post-traduzionali (Figura 3D-H) e inserire le seguenti condizioni standard:
    1. Impostare il periodo di rilevamento totale su 80 min.
    2. Impostare la modalità di rilevamento generale su peptidi.
    3. Impostare la sorgente NSI sulla modalità positiva (cioè la carica degli ioni peptidi).
    4. Impostare la tensione dell'ago del nano-spray a 2000 V e mantenerla statica.
    5. Impostare l'ingresso dell'azoto gassoso sull'NSI e impostare i rilevatori su statico.
    6. Impostare la temperatura del tubo di trasferimento ionico a 275 °C.
    7. Rilevare le masse degli interi peptidi (cioè gli ioni genitori; MS1) impostando l'intervallo di scansione su 350-2000 m/z, l'obiettivo RF su 30%, il tempo massimo di iniezione su Auto e l'analizzatore di massa orbitrap su una risoluzione di 120.000.
       NOTA: La capacità alternativa di intrappolare gli ioni dello strumento non viene utilizzata qui per lo screening delle masse peptidiche, in quanto è meno sensibile per il monitoraggio di questo tipo di molecola rispetto all'orbitrap.
    8. Impostare i filtri ionici per discriminare tra quei peptidi che hanno più stati di carica in un intervallo da 2 a 7. Ciò consente allo strumento, durante la registrazione dei dati, di convertire automaticamente i rapporti massa su carica (m/z) intrinsecamente rilevati delle molecole nelle loro masse esatte. Allo stesso modo, un peptide con un solo stato di carica (m/z = 1) non richiede alcun fattore di conversione per ottenere la sua massa esatta.
    9. Impostare le porte di esclusione dinamica per gli ioni su 1 passaggio alla durata di 60 s, tolleranza di massa di ±10 ppm e per eliminare qualsiasi molecola con atomi isotopici naturali presenti (ad esempio, ¹⁴C).
    10. Rilevare le masse di frammenti di conferma dell'identità generati per i peptidi (ad esempio, ioni figli; MS2) impostando lo strumento sull'acquisizione dipendente dai dati (modalità DDA).
    11. Catturare i peptidi interi (cioè gli ioni genitori) mediante isolamento del quadrupolo, utilizzando un'impostazione per la finestra di tolleranza alla variabilità di massa di m/z = 1,6.
    12. Eseguire la frammentazione dei peptidi catturati impostando la modalità di impatto degli elettroni su HCD (ad esempio, dissociazione collisionale ad alta energia utilizzando azoto ed elio gassoso come agente di trasferimento degli elettroni), l'energia di collisione al 30%, l'intervallo di scansione su Auto, il tempo massimo di iniezione su Auto e l'analizzatore di massa Orbitrap su una risoluzione di 30.000.
    13. Acquisire i dati finali (ioni MS1 e MS2) impostando la forma del picco del segnale su un formato centroide.
14. Mantenere determinazioni di massa accurate per i peptidi rilevati calibrando regolarmente lo strumento, di solito prima di ogni esecuzione del lotto di campioni, come descritto di seguito.
    1. Posizionare lo strumento MS in uno stato di spegnimento della sorgente ionica, utilizzando il software di controllo, e sostituire la sorgente NSI con la sorgente alternativa di ionizzazione elettrospray riscaldata internamente (HESI) del dispositivo. Questa è la fonte utilizzata per applicazioni che possono richiedere volumi di iniezione del campione molto grandi e una corrispondente elevata portata (1-2500 μL/min) per la pompa LC, ad esempio esperimenti di metabolomica e farmacocinetica dei farmaci.
    2. Selezionare l'opzione di controllo della calibrazione completa sul software di controllo.
    3. Riempire una siringa di vetro da 500 μl con uno stantuffo rivestito in teflon e un ago smussato in acciaio inossidabile con una soluzione standard MS disponibile in commercio, quindi collegare la linea del tubo capillare in PTFE alla sorgente HSEI (mentre è spenta).
       NOTA: Lo standard qui utilizzato contiene una miscela di molecole naturali e sintetiche (16 in totale, ad esempio caffeina) che coprono un intervallo di massa di m/z = 50-2800 e coprono un'ampia gamma di possibili tipi di legami chimici, in particolare quelli associati ai peptidi (ad esempio, gruppi ammidici).
    4. Avviare un'infusione costante dello standard MS nella sorgente HSEI (mentre è accesa), utilizzando una velocità di 3-5 μL/min come fatto con una pompa a siringa. Una volta che un modello stabile di picchi standard è stato notato sulla finestra di visualizzazione in tempo reale del software di controllo, attivare il controllo automatico della calibrazione.
       NOTA: Se non vengono rilevati problemi con la sensibilità e l'accuratezza delle determinazioni di massa per lo standard, una calibrazione completa riuscita richiede in genere < 40 minuti. Allo stesso modo, solo se lo strumento supera tutti i parametri hardware MS che vengono controllati è considerato affidabile per l'esecuzione di campioni.
    5. Confermare il successo della calibrazione reimpostando la sorgente NSI e la colonna LC, quindi eseguendo una soluzione standard di [Glu 1]-Fibrinopeptide B umano (Glu-Fib) alle quantità totali iniettate che coprono 1-10 ng (ad esempio, 1, 2, 6 e 10 ng). Utilizzare gli stessi metodi di separazione LC e MS di quelli descritti sopra per i campioni sconosciuti.
    6. Controllare lo standard Glu-Fib per il tempo di ritenzione LC appropriato (~20 min), la presenza di ioni MS1 e MS2 (m/z = 1285,54, 813,39, 785,84, 445,12, 333,19 e 175,12) e la linearità dell'aumento delle aree di picco con la quantità iniettata.
    7. Quindi generare tabelle di sequenza, utilizzando il software di controllo e acquisizione dati, per l'esecuzione del peptide sconosciuto e dei campioni bianchi che contengono colonne per l'inserimento del tipo di campione, del nome del file, dell'ID del campione, del percorso dei dati, del metodo dello strumento LC/MS, della posizione della fiala e del volume di iniezione (Figura 3D-E).
    8. Salvare i file di dati MS risultanti (estensione: RAW; 500 - 800 GB ciascuno) nella cartella del percorso designata sul disco rigido del computer dello strumento. Quindi trasferisci questi file su un computer workstation che è abbastanza potente da pilotare il software di bioinformatica, come descritto più avanti, che converte i dati spettrali di massa peptidici estremamente estesi e complessi (cioè i segnali MS1 e MS2) nei corrispondenti profili di composizione proteica totale.

7. Conversione dei dati grezzi della SM in risultati rappresentativi del proteoma totale

NOTA: I dati grezzi MS acquisiti per i campioni di peptidi vengono elaborati in profili di composizione proteica totale (proteoma), utilizzando un software bioinformatico. In breve, il software bioinformatico ricostruisce le proteine originali nel campione confrontando i dati grezzi della MS con i loro spettri noti di peptidi MS1 e MS2 trovati in una libreria di riferimento di proteomi specie-specifica basata sul web, attraverso un'ampia e unica copertura della sequenza di amminoacidi della proteina. Le abbondanze relative di ciascuna proteina identificata sono determinate dal programma utilizzando le intensità del segnale MS1 dei suoi peptidi unici abbinati. Le abbondanze determinate possono essere confrontate in modo affidabile tra i campioni, ma solo se vengono eseguite all'interno dello stesso lotto di preparazione e utilizzando impostazioni LC e MS identiche. In caso contrario, dovranno essere impiegate le tecniche quantitative assolute precedentemente menzionate basate su recuperi di ioni standard/reporter interni, come la marcatura selettiva TMT dei peptidi all'interno di ciascun campione.

1. Scaricare sul disco rigido del computer workstation il file di riferimento del proteoma dalla libreria basata sul web.
   1. Trovalo utilizzando il database che si trova sul sito web di Uniprot per le specie campione di interesse (ad esempio, furetti / Mustela furo). Questo è chiamato file FASTA. Utilizzare lo strumento di ricerca Proteomes e la visualizzazione Tabella per individuare e quindi scaricare il file di riferimento del proteoma.
   2. Per massimizzare il numero possibile di identificazioni proteiche generate, selezionare sia le voci peer-reviewed (Swiss-Prot) che non revisionate (TrEMBL) del comitato nel database Uniprot quando si crea il file FASTA. Allo stesso modo, scegli l'opzione per includere tutte le isoforme esaminate per le proteine.
2. Apri il software di bioinformatica, ad esempio Proteome Discoverer, alla scheda Pagina iniziale , quindi seleziona la scheda Amministrazione .
3. Vai alla sottoscheda Mantieni file FASTA e quindi scarica nel programma il file FASTA specifico per la specie di cui sopra generato per i tuoi esperimenti.
4. Tornare alla scheda Pagina iniziale e fare clic su Nuovo studio/analisi e, nella finestra di dialogo, digitare un nome di studio nel campo Nome studio e selezionare una cartella di file per salvare lo studio nel campo Directory principale dello studio .
5. Per il momento, lascia vuoti i campi Flusso di lavoro di elaborazione e Flusso di lavoro di consenso , poiché verranno selezionati per un secondo momento.
6. Fare clic su OK per salvare e uscire dalla finestra di dialogo, che visualizzerà la pagina Definizione studio .
7. Vai alla scheda Definizione studio e digita i dettagli del progetto nella casella Descrizione studio situata al centro a sinistra.
8. Vai alla scheda File di input e fai clic su Aggiungi file.
   1. Verrà visualizzata una finestra di dialogo in cui è possibile selezionare e scaricare dal disco rigido del computer i file di dati grezzi necessari per essere elaborati nei risultati del profilo di composizione proteica totale (proteoma).
9. Fare clic sui file di dati MS grezzi che sono ora elencati nella scheda File di input , che possono essere selezionati ed evidenziati singolarmente o tutti in una volta.
10. Trascinali e rilasciali nella sezione File per l'analisi della casella Analisi situata al centro a destra come parte della sottocasella Passaggio di elaborazione .
11. Vai alla scheda Flussi di lavoro e fai clic su Modifica, che si trova accanto all'intestazione Passaggio di elaborazione della casella Analisi situata al centro a destra.
12. Fare clic su Apri comune e dalla cartella ProcessingWF_Tribrid , selezionare il file del flusso di lavoro di elaborazione designato specificamente per le sotto-identificazioni delle fosfoproteine, come ottenuto nella rilevazione della MS basata sulla frammentazione HCD (Figura 4A).
    NOTA: Nella casella Struttura del flusso di lavoro verrà quindi visualizzato un diagramma delle fasi di elaborazione contenente i nodi modificabili. Ci saranno due nodi, come descritto di seguito, contrassegnati da punti esclamativi che indicano che è necessario inserire informazioni specifiche dell'esperimento da parte dell'utente.
13. Nel diagramma ad albero del flusso di lavoro di elaborazione, fare clic su e aprire il nodo RC Spectrum Files .
    1. Nella categoria Parameters of Spectrum Files RC , trovare e selezionare sotto il parametro Protein Database il file FASTA, precedentemente generato utilizzando il sito web Uniprot, per la libreria di riferimento specie-specifica di spettri peptidici MS che verrà ricercata per identificare le proteine di interesse sperimentale.
14. Fare clic su e aprire il nodo Sequest HT e apportare le seguenti tre modifiche:
    1. Nel parametro Database proteine , selezionare lo stesso file FASTA, come descritto sopra.
    2. Nel parametro Nome enzima , selezionare Tripsina (completa) o in alternativa Lys-C, che sono le proteasi principali e di riserva utilizzate per preparare il digestato peptidico originale.
    3. Nel parametro Modifiche dinamiche , assicurarsi che sia stato selezionato almeno Phospho / +79.966 Da (S, T, Y ).
       1. Utilizzare quest'ultima impostazione per rivelare peptidi associati a proteine che sono modificate post-traduzionalmente dalla fosforilazione, attraverso la ricerca delle corrispondenti perdite di spettri MS di uno o più gruppi fosfato (m/z = 79,97).
       2. Trova i siti amminoacidici occupati dal fosfato (ad esempio, serina, treonina o tirosina) in base alle alterazioni attese nei loro modelli di frammentazione MS2.
       3. Aggiungere altre modifiche post-traduzionali proteiche di interesse di routine allo stesso modo al nodo Sequest HT a questo punto, ad esempio metilazione, acetilazione, miristillazione, se l'esatta perdita di massa dei gruppi correlati è nota. Allo stesso modo, espandere la ricerca dei siti di fosforilazione ad altri amminoacidi meno frequentemente riportati, ad esempio l'istidina.
          NOTA: i nodi Spectrum Files RC e Sequest HT dell'albero del flusso di lavoro per la fase di elaborazione sono gli unici due che richiedono la regolazione dei parametri.
    4. Lasciare il resto come impostazioni predefinite, poiché queste sono già state ottimizzate dal produttore per produrre il maggior numero di identificazioni proteiche designate di interesse. Analogamente, questo vale per tutti gli altri nodi nella struttura del flusso di lavoro.
    5. Assicurarsi che i nodi Percolator e IMP-ptmRS siano inclusi alla fine dell'albero del flusso di lavoro.
       NOTA: Percolator utilizza l'adattamento reiterativo per perfezionare notevolmente i risultati finali. IMP-ptmRS è essenziale per riportare l'identificazione appropriata e la localizzazione del sito di tutte le modificazioni post-traduzionali delle proteine, inclusa quella della fosforilazione.
15. Torna alla scheda Flussi di lavoro e fai clic su Modifica che si trova accanto all'intestazione del Passaggio di consenso della casella Analisi situata in alto a destra. Verrà visualizzato il diagramma ad albero del flusso di lavoro per la fase di consenso.
16. Fare clic su Apri comune e dalla cartella ConsensusWF selezionare il file del flusso di lavoro di consenso che produrrà il formato di output desiderato per i risultati del profilo di composizione proteica (proteoma) (Figura 4B).
    NOTA: nella casella Struttura del flusso di lavoro verrà aperto un diagramma dei passaggi di consenso contenente i nodi modificabili. Il diagramma utilizzato per l'elaborazione dei dati è generato dalla modifica del flusso di lavoro di consenso di base, in cui i nodi in linea Feature Mapper e Precursor Ions Quantifier sono stati aggiunti come ramo del nodo MSF Files iniziale, per facilitare la quantificazione delle abbondanze relative alle proteine. Mentre tutti i nodi del flusso di lavoro contengono già parametri ottimizzati stabiliti dal produttore, ce ne sono alcuni che contengono voci molto importanti da ricontrollare per la corretta selezione come descritto di seguito.
17. Nel diagramma ad albero del flusso di lavoro, fare clic su e aprire il nodo Quantificatore di ioni precursori . Questo è il nodo essenziale per quantificare le abbondanze relative di ciascuna proteina identificata.
    1. Nella categoria Impostazioni generali di quantificazione , trova e seleziona sotto il parametro Peptidi da utilizzare l'opzione Unico + Rasoio .
       NOTA: I peptidi unici sono quelli che contengono sequenze di aminoacidi esclusive di una singola proteina; e quindi, vengono utilizzati per determinarne in modo specifico la quantità in base alle intensità del segnale MS. I peptidi del rasoio sono quelli condivisi tra gruppi di proteine; e quindi, vengono utilizzati per mettere in accordo le abbondanze relative calcolate.
    2. Nella categoria Normalizzazione e Ridimensionamento , modificare entrambi i parametri Modalità di normalizzazione e Modalità di ridimensionamento con l'opzione Nessuno , poiché questo tipo di regolazione è troppo limitato per un'applicazione affidabile nell'intero proteoma.
       NOTA: Queste impostazioni vengono attivate solo quando si desidera normalizzare le abbondanze relative calcolate di proteine selezionate di interesse rispetto a quelle che sono stabilmente intrinseche alla cellula, ad esempio i geni di pulizia, e quindi esprimere i valori risultanti come un rapporto scalato.
    3. Quindi, fare clic e aprire il nodo Filtro peptidi e proteine e nella categoria Filtri peptidici modificare i parametri Affidabilità peptidica almeno e Mantieni PSM confidenza inferiore rispettivamente sulle opzioni Alta e Falso . Questo imposta le corrispondenze peptidiche utilizzate per effettuare le identificazioni delle proteine al massimo livello di significatività di adattamento (cioè ≥ 95%).
       NOTA: In alternativa, il primo parametro può essere impostato su Medio per rilassare il rigore delle corrispondenze peptidiche e quindi aumentare notevolmente l'output dei colpi proteici; Ma questo al contrario porta a un rischio molto elevato di generare molte false identificazioni. Allo stesso modo, non dovrebbe mai accadere che un valore "Basso" venga utilizzato come opzione accettabile per entrambi i parametri.
    4. Questi sono gli unici nodi della fase di consenso che devono essere regolati i parametri, lasciando il resto come utilizzando le impostazioni predefinite.
       NOTA: Nel complesso, il flusso di lavoro della fase di consenso gestisce tutte le analisi post-hoc, ovvero la determinazione delle abbondanze relative alle proteine, le confidenze di identificazione (ad esempio, i tassi di falsa scoperta e i punteggi di corrispondenza spettrale dei peptidi) e la copertura peptidica mappata. Le statistiche dei risultati e le distribuzioni dei dati sono fornite anche come tabelle finali.
18. Una volta che i flussi di lavoro di elaborazione e consenso di cui sopra sono stati implementati, salva l'intero studio e fai clic sull'icona Esegui (ingranaggi) situata nella parte superiore della casella Analisi . Se vengono elaborati più file di dati MS grezzi contemporaneamente, prima di avviare l'esecuzione dell'elaborazione, fare clic e selezionare l'icona Per file (quadrato) nelle vicinanze.
    NOTA: L'elaborazione di un file di dati grezzi MS in un file di risultati del proteoma totale richiede in genere 20-40 minuti, ma può produrre un elenco aggiornato di molte migliaia di identificazioni di proteine che vanno da corrispondenze di confidenza bassa, media a alta (cioè con una ponderazione verso risultati elevati), insieme alle modifiche del fosfato presenti all'interno di ciascuna entità (Figura 4C). I principali parametri di output dei risultati per le proteine identificate sono FDR (confidenza), Master (se il file FASTA/voce della libreria è stata esaminata), Adesione #, Descrizione, Copertura %, Copertura della sequenza, Corrispondenze spettrali peptidiche (ad esempio, numero di peptidi unici), Caratteristiche fisiche (ad esempio, MW in kDa), Abbondanze relative e Modifiche (ad esempio, gruppi di fosforilazione).
    1. I risultati totali del proteoma sono disposti in ordine crescente o decrescente o interamente filtrati, utilizzando l'icona Imbuto sulla barra degli strumenti (Figura 4C), in base agli interessi della ricerca, ad esempio, mostrano solo quelli con un'identificazione ad alta confidenza (FDR proteico) o un alto grado di corrispondenza peptidica (ad esempio, per percentuale di copertura e/o numero di unici trovati).
    2. Se si desiderano specificamente informazioni sulla modifica post-traduzionale, filtrare le proteine identificate con fosforilazione per ulteriori analisi.
    3. Salva i risultati filtrati, senza modificare il nome del file, in quanto possono essere ripristinati all'output originale semplicemente rimuovendo i filtri applicati e aggiornando la finestra.

Risultati

Visualizzazione dei risultati del proteoma totale mediante elaborazione opzionale in grafici vulcanici
I risultati totali del proteoma per ciascun campione possono essere facilmente ricercati per accesso # o descrizione per specifiche proteine di interesse per la ricerca e le abbondanze relative associate vengono mediate e quindi confrontate tra i gruppi di trattamento per differenze significative (ad esempio, come per i valori p derivati dal test t). In alternativa, può essere di grande valore esplor...

Discussione

Il metodo di cui sopra utilizzava tessuti congelati in azoto liquido per arrestare immediatamente tutta l'attività biologica prima di trasferirli a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Una volta raccolti tutti i campioni, si è verificata l'omogeneizzazione dei tessuti. Durante l'omogeneizzazione, è fondamentale mantenere freddi tutti i tessuti e gli strumenti per prevenire la riattivazione o la degradazione delle proteine. Inoltre, durante l'estrazione iniziale delle proteine dal...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per il dosaggio delle proteine da 660 nm	Pierce / Termo Scientifico	22662	Per i BCA per determinare le concentrazioni proteiche dei campioni, contiene il reagente per il dosaggio delle proteine Pierce da 660 nm e gli standard per il dosaggio delle proteine pre-diluiti
Acetonitrile, grado Optima LC/MS	Thermo Fisher Scientifico	Codice 047138.K2	Acetonitrile ultrapuro utilizzato per cromatografia liquida/spettrometria di massa
Foglio di alluminio Plate-Seal	Beckman Coulter	538619	Guarnizione utilizzata durante lo sviluppo della piastra per il dosaggio delle proteine
Lettore multimodale BioTek Synergy Neo2 / Spettrometro UV-Vis	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195	Spettrofotometro/strumento lettore di piastre per saggi utilizzato per completare le letture dell'assorbanza a 660 nm per determinare le concentrazioni di proteine.
Soluzione di lavaggio per strumenti ChromaCare LC-MS	Thermo Fisher Scientifico	T111101000	Soluzione contenente il 25% di acetonitrile, isopropranolo, metanolo e acqua per aiutare a pulire il sistema LC dopo l'analisi dei campioni
CK28 Tubo Precellys	Bertin Corp / Tecnologie	P000911LYSK0A.0	I tessuti omogeneizzati vengono inseriti in queste provette per la lisi tissutale e l'isolamento delle proteine utilizzando lo strumento Precellyis. Queste sono le provette utilizzate dal nostro laboratorio indicate nel protocollo come "provette omogeneizzanti".
Criopode	Brooks / Azenta Scienze della vita	https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier	Contenitore utilizzato per contenere l'azoto liquido per il raffreddamento della malta durante l'omogeneizzazione del tessuto
Kit di preparazione dei campioni EasyPep Mini MS	Thermo Fisher Scientifico	A40006	Un kit può elaborare 20 campioni, il contenuto include la soluzione di lisi per l'estrazione delle proteine, la nucleasi universale integrata nella soluzione di estrazione e i regeanti necessari per le fasi 1.4 e 1.5
Colonna EASY-Spray C18 LC (15 cm L, 50 &; micro; m Dia, e 2 µ m granulometria)	Thermo Fisher Scientifico	ES901	Colonna LC Electrospray utilizzata per la separazione dei peptidi prima del rilevamento della MS
Soluzione di calibrazione FlexMix	Pierce / Termo Scientifico	Codice A39239	Miscela di 16 molecole standard utilizzate per calibrare l'accuratezza e la sensibilità del rivelatore dello strumento MS prima dell'esecuzione del campione
Acido formico, grado LC/MS	Thermo Fisher Scientifico	85178	Acido formico ultrapuro utilizzato per acfidare tutte le soluzioni e i campioni LC ad una concentrazione finale dello 0,1% (v/v)
Arrestare la proteasi e Cocktail di inibitori monouso della fosfotasi (100x)	Thermo Fisher Scientifico	78442	Integrato nel tampone di estrazione per prevenire la degradazione di proteine e fosfoproteine nel campione
Metanolo, grado Optima LC/MS	Thermo Fisher Scientifico	Codice 047192.K2	Metanolo ultrapuro utilizzato per cromatografia liquida/spettrometria di massa
Malta per porcellana, 150 mL	Thermo Fisher Scientifico	FB961C	Capacità di 150 ml, utilizzata per omogeneizzare i tessuti di furetto più piccoli (ad esempio, il cervello)
Malta per porcellana, 275 mL	Thermo Fisher Scientifico	FB961D	Capacità di 275 ml, utilizzata per omogeneizzare tessuti di furetti di grandi dimensioni (ad es. fegato)
Malta per porcellana, 50 mL	Thermo Fisher Scientifico	FB961A	Capacità di 50 mL, utilizzata per l'omogeneizzazione di tessuti di topo
Pestello in porcellana, 50 mL	Thermo Fisher Scientifico	FB961K	Da utilizzare con malta da 50 mL
Pestelli in porcellana, 150 mL	Thermo Fisher Scientifico	FB961M	Da utilizzare con malta da 150 mL
Pestelli in porcellana, 275 mL	Thermo Fisher Scientifico	FB961N	Da utilizzare con malta da 275 mL
Precellys	Bertin Corp / Tecnologie	https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/	Strumento utilizzato per omogeneizzare campioni di tessuto. Sono state utilizzate le seguenti impostazioni: 4500 giri/min, 2 x 30 s per ciclo, 30 s di pausa.
Reagente per saggi proteici	Pierce / Termo Scientifico	22662	Reagente per il dosaggio delle proteine utilizzato nei passaggi 3.4– 3.8
Scopritore di proteoma	Thermo Fisher Scientifico	CSW0064764	Software bioinformatico per l'analisi di dati di proteomica/fosfoproteomica
Fiale per iniezione LC con tappo a vite SureSTART MSCERT (0,02– Capacità 1,5 mL)	Thermo Fisher Scientifico	6PMCK39TR	Fiale di vetro con tappo a vite (PTFE, setti pre-fessurati) certificate per applicazioni ad alta prestazione utilizzate per contenere campioni per iniezione sullo strumento LC/MS.
Sistema Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)	Thermo Fisher Scientifico	LC: scontato / MS: FETD2-10002, su richiesta speciale	Strumento di cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) ad altissima preformanza utilizzato per separare e quindi rilevare in base al peso molecolare i peptidi nei campioni
Nucleasi universale per lisi cellulare, 100kU, 400 & micro; L	Pierce / Termo Scientifico	88702	È stata acquistata un'ulteriore nucleasi universale.
Vacufuge Plus	Eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748	Vacufuge utilizzato per essiccare i campioni di peptidi prima della ricostituzione.
Acqua, grado Optima LC/MS	Thermo Fisher Scientifico	Codice 047146.K2	Acqua ultrapura utilizzata per cromatografia liquida/spettrometria di massa