Articolo metodologico

Modellazione del glicocalice endoteliale post-pneumonectomia in un chip fluidico 3D - Un approccio alla fabbricazione di un sistema organo-on-chip basato su vasi

DOI:

10.3791/67246

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16 settembre 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un sistema organ-on-chip (OOC) progettato per imitare la pneumonectomia. Questo sistema studia la potenziale correlazione tra compromissione del glicocalice e complicanze dopo la pneumectomia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il glicocalice endoteliale (GCX), uno strato ricco di carboidrati che riveste la superficie luminale delle cellule endoteliali, svolge un ruolo fondamentale nella regolazione delle risposte cellulari agli stimoli. È composto da proteine transmembrana che fungono da meccanotrasduttori per le risposte cellulari. Sebbene mantenga naturalmente la sua struttura e stabilità in condizioni omeostatiche, l'esposizione a sollecitazioni ad alto taglio può indurre danni con numerose conseguenze. Sono stati esplorati gli effetti generali dello stress di taglio sulle cellule endoteliali, ma l'entità e l'impatto dello stress di taglio sui sistemi vascolari, in particolare dopo la pneumonectomia, non sono stati ben studiati. Per indagare su questo, è stato intrapreso un approccio globale, che prevede la creazione di un modello CAD della vascolarizzazione polmonare prima e dopo la pneumonectomia. Utilizzando la simulazione computazionale dei fluidi, le regioni chiave di elevata sollecitazione e pressione di taglio sono state identificate e replicate in un sistema organ-on-chip (OOC). Le cellule endoteliali microvascolari del polmone umano (HLMVEC) sono state seminate su uno stampo a forma di sezioni selezionate per caratterizzare gli effetti dell'elevato sforzo di taglio in vitro. A seguito della sperimentazione, gli HLMVEC sono stati immunocolorati per valutare qualitativamente la salute del GCX in condizioni di stress normale e aumentato indotto dalla pneumectomia. L'integrazione della modellazione computazionale e dell'analisi sperimentale migliora la nostra comprensione di come i cambiamenti nello sforzo di taglio influenzino GCX, chiarendo i loro effetti sulla funzione vascolare e sulle complicanze post-chirurgiche.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pneumectomia è un intervento chirurgico invasivo e ad alto rischio eseguito per estrarre il polmone destro o sinistro1. Questa procedura è tipicamente utilizzata come opzione di trattamento per vari disturbi gravi come il cancro ai polmoni, la tubercolosi polmonare e le lesioni polmonari traumatiche2. Sebbene la procedura sia promettente, pone rischi significativi, evidenziati dall'aumento dei tassi di complicanze postoperatorie che vanno dalle aritmie agli edemi polmonari1.

Le pneurectomie hanno un profondo impatto sulla dinamica cardiovascolare dirigendo l'intera gittata cardiaca del cuore nel polmone rimanente3. È noto che questo reindirizzamento del flusso sanguigno aumenta la pressione e le sollecitazioni di taglio all'interno del restante sistema vascolarepolmonare 4. Con queste vaste alterazioni nei modelli di flusso sanguigno, il glicocalice endoteliale (GCX) svolge un ruolo fondamentale nel rilevare questi cambiamenti nei modelli di flusso sanguigno5.

Il GCX è uno strato gelatinoso che regola le attività biochimiche in risposta ai cambiamenti nel suo ambiente 6,7. È stato dimostrato che la sua espressione aumenta con l'esposizione prolungata a un flusso uniforme e diminuisce con l'esposizione a un flusso disturbato rispetto alla coltura statica 8,9. Il GCX presenta uno spessore variabile che va da 0,1 a 1 μm su tutto il sistema vascolare e funziona come uno strato essenziale di meccanotrasduzione che riveste le cellule endoteliali dei vasi sanguigni10. La rete è composta da uno strato denso di zuccheri, lipidi e proteine, come mostrato nella Figura 1. Questi zuccheri si legano per formare glicani, che possono esistere liberamente nel flusso sanguigno o attaccati a proteine o lipidi, con conseguente formazione di proteoglicani, glicoproteine o glicolipidi 7,11. I proteoglicani sono composti da catene di glicosaminoglicani (GAG), che si legano alla membrana cellulare attraverso proteine plasmatiche o recettori. Questi GAG includono l'eparan solfato (HS), l'acido ialuronico (HA), il condroitina solfato (CS), il dermatan solfato e il cheratan-solfato12. L'eparan solfato è il GAG predominante, costituendo oltre il 50% del totale dei GAG trovati nel GCX. Queste catene laterali possono legarsi alle proteine del nucleo incorporate, che includono i glipici (ancorati dal glicosilfosfatidilinositolo) e i sindecani (con un dominio che attraversa la membrana), insieme a CD44 (un recettore di adesione superficiale). I complessi sopra descritti svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dei fattori di crescita, nelle reazioni antinfiammatorie, nella facilitazione della dilatazione dei vasi e nel controllo della permeabilità vascolare13.

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Figura 1: Diagramma dei componenti GCX. Schema che rappresenta i componenti del glicocalice endoteliale. Questo schema mostra il glicocalice apicale, che si trova sul lume del vaso, mostrando i suoi proteoglicani e glicoproteine legati alla membrana. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sebbene la connessione precisa tra pneumonectomie e danno da GCX non sia ben studiata, esiste una correlazione plausibile tra i modelli di flusso sanguigno alterati indotti dalle polmonictomie e l'integrità del GCX. È noto che il flusso sanguigno disturbato nel sistema vascolare infligge danni al GCX6. Abbiamo ipotizzato che l'aumento del flusso disturbato e i cambiamenti nello stress di taglio nel sistema vascolare rimanente a seguito di una pneumectomia possano infliggere danni al GCX nel tempo. Questo deterioramento accelerato può catalizzare complicanze e morbilità postoperatorie, aumentando così i rischi intrinseci per la salute generale del paziente13.

Questo protocollo mirava a modellare la vascolarizzazione polmonare dopo la pneutectomia, seguendo la procedura generale delineata nella Figura 2. Le simulazioni dei fluidi sono state condotte su un modello di progettazione assistita da computer che replica la vascolarizzazione polmonare umana con e senza pneumectomia. I modelli di pneumonectomia sono stati creati progettando la vascolarizzazione polmonare 3D in un software di modellazione 3D, sulla base di dimensioni derivate da scansioni TC e dati di letteratura, per poi semplificarli ulteriormente per le simulazioni di flusso in software di fluidodinamica computazionale (CFD). Le simulazioni hanno identificato aree di interesse specifiche, scelte in base alle aree in cui lo stress di taglio era aumentato nei modelli di pneumonectomia rispetto al controllo. Queste aree di interesse sono state scelte per replicare per la costruzione di un modello in vitro . Il modello in vitro ha utilizzato un design a camera fluidica per simulare più sezioni di vascolarizzazione con geometria normale e geometria della pneumonectomia per simulare la differenza nelle condizioni di flusso.

Le cellule endoteliali microvascolari del polmone umano (HLMVEC) sono state coltivate su substrati di polidimetilsilossano (PDMS) rivestiti di fibronectina, modellati per imitare una regione di biforcazione selezionata. I terreni di coltura di cellule endoteliali microvascolari sono stati perfusi attraverso il sistema utilizzando una pompa peristaltica. Infine, le cellule e GCX sono state fissate, immunocolorate con un anticorpo colorante con GCX e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza per valutare le loro condizioni dopo l'esposizione al flusso di fluido. Una cronologia generale del protocollo è disponibile nella Tabella 1.

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Figura 2: Sequenza di sviluppo OOC. Sequenza di sviluppo di un nuovo sistema OOC per studiare gli effetti della pneumonectomia polmonare (1) TAC generata dal sistema vascolare polmonare umano. (2) Geometria della scansione CT utilizzata per identificare le regioni di interesse per il modello CAD 3D. (3) Simulazioni del flusso dei fluidi per determinare le geometrie di interesse per il modello in vitro . (4) Stampo PDMS modellato contenente aree di interesse dai risultati della simulazione (5) Stampo inserito in una custodia acrilica per fissare lo stampo per la perfusione (6) Configurazione completa della camera di flusso (7) Configurazione completa della camera di flusso trasferita all'incubatore (8) Immagini in campo chiaro e fluorescenti scattate dopo l'esposizione a sollecitazioni di taglio. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Cronologia generale del protocollo. Sequenza generale di esecuzione dei passaggi all'interno del protocollo con durata media (h) di ogni passaggio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Protocollo

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Questo studio ha utilizzato i dati di imaging della tomografia computerizzata (TC) della letteratura precedente14 che sono stati raccolti in conformità con gli standard etici istituzionali e federali. Tutti i dati di imaging a cui si è fatto riferimento avevano il consenso informato dei partecipanti, a seguito dell'approvazione da parte dell'Institutional Review Board (IRB) per garantire la protezione dei diritti e della privacy dei partecipanti.

1. Modellazione della vascolarizzazione polmonare in software CAD

  1. Ricerca geometrie fisiologiche dei vasi primari da modellare.
  2. Utilizzare le immagini TC dei pazienti dei vasi da modellare per scegliere le geometrie specifiche da replicare, mostrate nella Figura 2.
    NOTA: Per questo protocollo, sono state utilizzate scansioni TC polmonari in condizioni cliniche della letteratura precedente14. Questo protocollo consente inoltre l'utilizzo di qualsiasi dato di scansione TC per generare modelli in vitro .
    1. Apri un visualizzatore DICOM e importa le immagini CT. Naviga tra le sezioni per identificare le imbarcazioni di interesse. Salva le immagini pertinenti per ulteriori analisi.
      NOTA: Il vaso replicato per questo protocollo era il sistema vascolare polmonare, poiché l'applicazione di questo protocollo è quella di modellare il glicocalice endoteliale in condizioni sane e post-pneumonectomia. Altre posizioni possono essere utilizzate per diverse applicazioni.
  3. Utilizzando ImageJ FIJI v1.54f15, è possibile misurare i diametri dei vasi dalle immagini CT o dai valori della letteratura.
    1. Aperto ImageJ FIJI e Importa le immagini CT salvate: selezionare File > Apri.
    2. Seleziona lo strumento Linea dalla barra degli strumenti per disegnare una linea che attraversa la lunghezza della barra della scala sull'immagine CT.
    3. Quindi selezionare Analizza > Imposta scala. Immettere la distanza nota (ad esempio, se la barra della scala nell'immagine è di 10 mm, immettere 10 come distanza nota). Inserire l'unità di lunghezza (ad esempio, mm). Fare clic su OK.
  4. Utilizzare lo strumento linea per misurare i diametri. Per fare ciò, selezionare lo strumento Linea dalla barra degli strumenti e disegnare una linea che attraversa il diametro del recipiente. Quindi selezionare Analizza > Misura per ottenere il valore del diametro.
  5. Ripetere i passaggi 1.3 e 1.4 per tutte le imbarcazioni di interesse e registrare le misurazioni.
  6. Compila le misurazioni dei serbatoi in tipi di segmenti per facilitare la modellazione.
    1. Crea un foglio di calcolo per classificare le misure del vaso ed etichettare ogni riga con il nome del vaso, la misurazione e il tipo di segmento (ad esempio, arteria, vena).
  7. Crea una tabella di riferimento per le lunghezze e i diametri dei segmenti vascolari in base alla letteratura e alle misurazioni radiografiche.
  8. Genera un modello 3D utilizzando un software di modellazione 3D per replicare la geometria e le dimensioni delle immagini CT.
    1. Aprire il software e creare un nuovo file di parti: selezionare File > nuova parte > e selezionare Schizzo > Crea schizzo e disegnare il profilo utilizzando le quote di ImageJ.
    2. Utilizzare le sweep di superficie e il loft per la geometria 3D: per le sweep, selezionare Funzioni > Estrusione/Base di sweep. Per i loft, selezionare Caratteristiche > Sporgenza/Base loft.
    3. Perfeziona il modello in modo che corrisponda alle misure esatte.
  9. Identificare le variazioni del modello da sviluppare, come un modello di controllo e un modello di pneumonectomia.
    1. Delineare le diverse condizioni (ad esempio, normale vs. pneumonectomia) ed elencare i cambiamenti strutturali necessari per ciascuna variazione.
  10. Duplica il modello originale per la modifica per creare i modelli sperimentali in base ai tuoi parametri (ad esempio, pneumonectomia destra e sinistra).
    1. Salvare il modello originale, quindi selezionare File > Salva come copia per creare copie per ogni condizione sperimentale.
    2. Modificare ogni copia in base ai parametri definiti (ad esempio, pneumonectomia destra e sinistra).
  11. Converti il modello da un file di parti a un file Parasolid per simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD).
    1. Seleziona File > Salva con nome. Scegliere Parasolid (*.x_t) dall'elenco a discesa del tipo di file, quindi salvare il file nella directory desiderata.

2. Simulazione del flusso del fluido

NOTA: Questo passaggio è utile per localizzare le regioni di sforzo di taglio modificato dopo la pneumectomia per selezionare la geometria vascolare da replicare per il sistema in vitro . Inoltre, la licenza software deve supportare l'Import Module.

  1. Impostare un nuovo studio del flusso laminare allo stato stazionario.
    1. Selezionate Creazione guidata modello (Model Wizard) > 3D (dimensione spaziale) > flusso fluido > flusso monofase > flusso laminare (spf), > selezionate Aggiungi (Add ) per aggiungere l'interfaccia fisica del flusso laminare > selezionate Studio (Study >), selezionate Stazionario (Station) in Studio generale > selezionate Fatto ( Done).
  2. Aggiungi geometria dal modello CAD.
    1. Importare il file Parasolid. Selezionare Facce del tappo e, nella finestra Grafica, selezionare la circonferenza della parete interna del recipiente in corrispondenza di ogni ingresso e uscita aperti. Questi saranno i bordi di delimitazione delle facce del cappuccio. Selezionare Forma unione e Compila tutto.
    2. Selezionare Rimuovi dettagli e assicurarsi che tutte le opzioni siano selezionate in Dettagli da rimuovere, quindi selezionare Compila tutto per rimuovere la geometria non necessaria.
  3. Creazione della Mesh 1 (parete del vaso mesh + dominio fluido meshato).
    1. Impostare Dimensione su predefinito: extra fine, calibrare per la fluidodinamica.
    2. Impostare Dimensione 1 su predefinito: extra fine, calibrare per la fluidodinamica, per la selezione di entità geometriche, specificare Limite e Manuale. Nella finestra Grafica, selezionare tutte le facce esterne visibili del dominio della parete del serbatoio, inclusa la faccia ad anello attorno alla faccia del tappo. Non selezionare le facce del tappo all'ingresso e alle uscite.
      NOTA: Selezionare la faccia del cappuccio alla fine della sezione rimossa a destra e a sinistra dei modelli di pneumonectomia, in quanto questi sono considerati confini geometrici dopo una pneumectomia.
    3. In Affinamento angolo, seleziona Dominio e Manuale. Nella finestra Grafica, selezionare [Dominio] 1 (parete del serbatoio) e [Dominio] 2 (fluido).
    4. In Selezione contorno, assicurarsi che i limiti siano gli stessi specificati in "Selezione entità geometrica" da "Dimensione 1".
    5. In Tetraedro libero 1 selezionare Rimanente per Livello entità geometrica in Selezione dominio.
    6. In Livelli limite 1 (Boundary Layers 1) e Selezione entità geometrica (Geometric Entity Selection), specificate Dominio (Domain), quindi selezionate Manuale (Manual) nell'area grafica [Dominio] 1 (Domain] 1 ) e [Dominio] 2. Le proprietà del layer limite saranno la stessa selezione specificata nella Dimensione 1.
    7. Creare la mesh selezionando Crea tutto in Mesh 1.
  4. Creazione di Mesh 2 (solo dominio fluido meshato).
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Mesh 1, selezionare Importa per creare "Mesh 2" ed eliminare Importa 2.
    2. In Importa 1 selezionare Sequenza mesh per selezionare automaticamente Mesh 1. Assicurati che l'opzione Crea automaticamente mesh di origine, Importa elementi di dominio e Importa domini senza mesh siano selezionati, quindi seleziona Importa. Tutte le impostazioni definite nella Mesh 1 verranno trasferite alla Mesh 2.
    3. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Mesh 2 e selezionare Elimina entità. Per Elimina entità 1, in Selezione entità geometrica selezionare Dominio, selezionare Manuale, nella finestra grafica selezionare [Dominio] 1 (parete del recipiente), quindi selezionare Costruisci tutto per lasciare solo la geometria del fluido perché la superficie della mesh del dominio del fluido si troverà all'interfaccia tra il flusso del fluido e la parete interna dei recipienti.
  5. Aggiungi materiale di flusso: crea un nuovo materiale utilizzando le proprietà del sangue dalla letteratura. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Materiali e selezionare Materiale vuoto. Selezionare Dominio nella selezione a livello di entità geometrica, quindi selezionare Tutti i domini. Selezionare Non solido per Tipo di materiale, aggiungere le proprietà del materiale del sangue, tra cui viscosità e densità.
  6. Impostare le condizioni al contorno e i parametri dello studio del flusso laminare.
    1. Selezionare Flusso laminare (spf), in Selezione dominio selezionare Tutti i domini. Verrà elencato solo [Dominio] 1. Il dominio 1 in questo caso è la geometria del fluido, non la parete del vaso. Proprietà fluido 1 viene riempito automaticamente dal materiale definito nel passaggio 5.
    2. Impostare la pressione dei valori iniziali 1 sulla pressione sanguigna fisiologica. Impostate la condizione al contorno per la parete 1 su antiscivolo.
    3. Selezionate Ingresso 1 (Inlet 1 ) nell'area grafica e impostate la condizione al contorno su Flusso completamente sviluppato (Fully developed flow). Assicurarsi che l'opzione Applica condizione su ciascuna selezione disgiunta separatamente sia selezionata.
    4. In Flusso completamente sviluppato, selezionare Portata e immettere la velocità.
    5. Per Uscita 1 (Outlet 1), selezionate tutte le uscite nell'area grafica e verificate che la condizione al contorno sia impostata su Pressione (Pressure).
    6. In Condizioni di pressione, selezionare Totale e immettere la pressione. Selezionare Media e Sopprimi riflusso.
  7. Impostare ed eseguire lo studio.
    1. Per il Passaggio 1: Stazionario in Studio, assicurarsi che la sezione Fisica e variabili corrisponda allo studio previsto e che il componente Selezione mesh 1 sia impostato come Mesh 2. Selezionare Calcola.
  8. Analizza i risultati delle sollecitazioni di taglio.
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Pressione (spf) e selezionare Duplica. Rinominarla come Sollecitazione di taglio.
    2. In Sollecitazione di taglio, selezionare Superficie e modificare il set di dati in Studio 1/Soluzione 1 (sol1).
    3. In Espressione, digitare spf.sr*spf.mu set units to Pa.
      NOTA: Questo sta per "velocità di taglio del flusso monofase * viscosità del flusso monofase".
    4. Quindi, seleziona Trama e fai clic con il pulsante destro del mouse su Trasparenza 1 e seleziona Disabilita.
    5. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Shear Stress e selezionare Volume per modificare il set di dati in Studio 1/Soluzione 1 (sol1).
    6. In Espressione digitare spf.sr*spf.mu e impostare le unità su Pa.
    7. Seleziona Grafico, fai clic con il pulsante destro del mouse su Superficie e seleziona Disabilita per analizzare visivamente il "Volume 1" per determinare le aree della nave di interesse da studiare nel modello OOC

3. Preparazione degli stampi PDMS

  1. Utilizzando i risultati della simulazione dei fluidi, è possibile scegliere le geometrie per il controllo e la pneumonectomia selezionando le aree che presentano differenze significative nello sforzo di taglio tra i modelli di controllo e di pneumonectomia e replicarle come stampi negativi in CAD. Le dimensioni dei modelli CAD di controllo e della vascolarizzazione della pneumectomia sono mostrate nelle Figure 3 e 4.
  2. Inoltre, progettare tappi per l'ingresso e l'uscita dello stampo per evitare perdite durante la semina delle cellule.
  3. Utilizzando una stampante 3D, stampa gli stampi e i tappi utilizzando il filamento PLA.
  4. Ottenere gli stampi in acido polilattico (PLA) che sono stati stampati in 3D (controllo + pneumonectomia) (Figura 5A).
  5. Pesare 10 parti di elastomero siliconico a base e 1 parte di elastomero siliconico per ottenere un totale di 30 ml di miscela (rapporto massa/massa 10:1) per riempire gli stampi fino a uno spessore di 3 mm (Figura 5B).
    NOTA: Non mescolare le soluzioni madre durante il processo di pesatura. Utilizzare materiali di pesata separati per ciascun reagente.
  6. Versare la base elastomerica e l'agente indurente insieme e mescolare accuratamente
    NOTA: Questo può essere fatto in una barca di pesatura.
  7. Versare la soluzione ben miscelata negli stampini (circa 15 ml per metà stampo) (Figura 5C).
  8. Degassare il PDMS mettendolo in una camera a vuoto per 30 - 60 minuti o fino a quando non rimangono bolle (Figura 5D).
  9. Rimuovere il PDMS dalla camera a vuoto e polimerizzare a temperatura ambiente per 48 ore.
    NOTA: Non è stato utilizzato un forno per l'indurimento a causa della capacità termica degli stampi in PLA.
  10. Estrarre il PDMS dallo stampo in PLA.
  11. Sciacquare abbondantemente lo stampo in PLA con acqua DI per assicurarsi che non rimangano impurità sulla sua superficie in modo che possa essere riutilizzato.

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Figura 3: Disegno CAD 3D della vascolarizzazione di controllo. Dimensioni, in mm, del modello di vascolarizzazione di controllo in una vista dall'alto e una vista laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Disegno CAD 3D del sistema vascolare per pneumonectomia. Dimensioni, in mm, del modello di vascolarizzazione per pneumonectomia in una vista dall'alto e una vista laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Creazione di stampi PDMS. Creazione di stampi PDMS. (A) Stampi in PLA stampati in 3D per esperimenti di controllo (arancione) e pneumonectomia (verde). (B) Bilancia con materiali per la produzione di PDMS. (C) Versare la miscela PDMS (base 10:1 + agente indurente) negli stampi stampati in 3D. (D) Degasaggio del PDMS in una camera a vuoto. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Coltura cellulare e semina

  1. Utilizzare una tecnica asettica adeguata secondo i protocolli di laboratorio locali.
  2. Spruzzare con etanolo al 70% e portare tutti i materiali e i componenti necessari nell'armadio di biosicurezza (BSC) (Figura 6A), compresi i pezzi PDMS e quattro pezzi di nastro biadesivo.
  3. Posizionare due pezzi di nastro biadesivo in ciascuna piastra di coltura cellulare (Figura 6B).
  4. Posizionare ogni metà del sistema vascolare PDMS nella propria piastra di coltura cellulare sopra il nastro biadesivo (Figura 6C).
  5. Sterilizzare ulteriormente tutti i componenti mediante esposizione alla luce UV per 20 minuti nel BSC.
  6. Scongelare la tripsina, i terreni di coltura HLMVEC e 20 μg/mL di fibronectina a 37 °C, se necessario.
  7. Posizionare diverse gocce da 30 μL di 20 μg/mL di fibronectina lungo il sistema vascolare PDMS utilizzando una micropipetta. Inclinare il PDMS se necessario, utilizzare una punta per pipetta per rivestire uniformemente il PDMS (Figura 7A).
  8. Incubare i pezzi del PDMS per 30 minuti mentre si trovano nel BSC.
  9. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di fibronectina e lasciare asciugare i pezzi di PDMS nel BSC (Figura 7B).
  10. Portare un pallone confluente di cellule HLMVEC dall'incubatore (37 °C, 5% CO2) nella BSC.
  11. Aspirare i terreni di coltura HLMVEC dal pallone di coltura. Sciacquare brevemente con tripsina o PBS sterile.
  12. Aspirare il lavaggio e aggiungere 3 ml di tripsina al pallone. Incubare a 37 °C, 5% CO2 per 5 min. Osservare le cellule con un microscopio per confermare che tutte le cellule siano staccate dal pallone.
  13. Aggiungere 9 mL di terreno di coltura completo HLMVEC per arrestare l'azione della tripsina.
  14. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL, quindi sciacquare il pallone con 10 mL di terreno di coltura HLMVEC per raccogliere le cellule rimanenti.
  15. Trasferire nella provetta da 50 mL. Centrifugare le celle a 220 x g per 5 min.
  16. Al termine, confermare visivamente il pellet della cella sul fondo del tubo. Spruzzare il tubo con etanolo al 70% e portarlo nella cabina di biosicurezza. Aspirare il surnatante, lasciando il pellet.
  17. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno di coltura HLMVEC fresco e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcola il numero totale di cellule utilizzando le equazioni seguenti, dove AH è il numero di cellule contate per emocitometro quadrato. Mantieni le celle sul ghiaccio.
    figure-protocol-4
  18. Portare la concentrazione di cellule a 2 x 106 cellule/mL con il terreno di coltura HLMVEC.
  19. Posizionare i tappi stampati in 3D alle estremità di ciascuna metà vascolare per eliminare le perdite di sospensione cellulare dallo stampo PDMS, come mostrato nella Figura 5 (4 tappi totali, 2 per pezzo PDMS) (Figura 7C).
  20. Seminare 300 μl di sospensione cellulare HLMVEC (600 k cellule) utilizzando una micropipetta in ciascun pezzo PDMS (Figura 7D).
  21. Trasferire delicatamente i pezzi di PDMS contenenti cellule HLMVEC nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 1-2 ore per il fissaggio (Figura 7E).
  22. Ispezionare con un microscopio per confermare visivamente il corretto attacco di HLMVEC ai substrati PDMS.
  23. Riportare le metà del sistema vascolare PDMS al BSC.
  24. Rimuovere i quattro tappi, aggiungere una quantità sufficiente di terreno di coltura HLMVEC per immergere le metà dei vasi PDMS e rimettere le piastre di coltura contenenti i vasi PDMS nell'incubatore (Figura 7F).
  25. 6-10 ore dopo la semina, pipettare manualmente il terreno di coltura HLMVEC che circonda il PDMS verso il sistema vascolare per rinfrescare il terreno più vicino alle cellule.

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Figura 6: Fissaggio degli stampi PDMS alle piastre. Passaggi di base per il fissaggio del sistema vascolare PDMS alle piastre di coltura cellulare. (A) Materiali necessari per posizionare le metà della vascolarizzazione PDMS nelle piastre di coltura. (B) Due pezzi di nastro biadesivo sono posizionati diagonalmente in ciascuna piastra di coltura sterile. (C) Metà della vascolarizzazione PDMS montate sopra il biadesivo. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Semina di HLMVEC in stampi PDMS. Passaggi per la semina di HLMVEC nel sistema vascolare PDMS. (A) Riempire il sistema vascolare 150-300 μL con 20 μg/mL di fibronectina. (B) Aspirare la fibronectina in eccesso utilizzando la tecnica del tilt tap. (C) Tappare le estremità della metà del sistema vascolare PDMS con tappi stampati in 3D. (D) Seminare 500-600K cellule in terreno da 300 μL in ciascuna metà vascolare. (E) Posizionare le metà del PDMS nell'incubatore per 1-2 ore per facilitare l'adesione delle cellule. (F) Coprire le metà del PDMS con i supporti e rimuovere i tappi. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Assemblaggio e funzionamento del sistema di flusso

  1. Eseguire la procedura di flusso una volta che le cellule nelle metà del sistema vascolare PDMS sono completamente confluenti, come determinato mediante ispezione visiva al microscopio.
  2. Calibrare la pompa peristaltica secondo il protocollo del produttore prima di eseguire un esperimento.
  3. Autoclavare in autoclave tutti i componenti autoclavabili, compresi i tubi di flusso, i connettori dei tubi, il serbatoio della siringa e il tappo in gomma.
  4. Immergere i blocchi acrilici, le viti, i tappi, i tubi Masterflex L/S 16 lunghi 1 pollice e il coperchio della piastra Petri da 15 mm in etanolo al 70% per 15 minuti e trattamento UV per 20 minuti in un BSC, capovolgendoli a metà.
  5. Una volta sterilizzate tutte le altre apparecchiature e materiali, portare le metà del sistema vascolare PDMS nel BSC.
  6. Aspirare il terreno HLMVEC dalla piastra di Petri contenente le metà del sistema vascolare (Figura 8A, B).
  7. Posizionare le metà del PDMS nei due blocchi di policarbonato, assicurandosi che siano allineate (Figura 8C).
  8. Applicare sigillante siliconico alle estremità del sistema vascolare, dove il tubo sarà attaccato alle metà del PDMS, e posizionare il tubo lungo un pollice nelle due estremità del sistema vascolare inferiore (Figura 8D).
  9. Capovolgere il blocco acrilico superiore (contenente la metà superiore del sistema vascolare PDMS) sul blocco acrilico inferiore (contenente la metà inferiore del sistema vascolare PDMS) (Figura 8E).
  10. Imbullonare i blocchi acrilici insieme al blocco filettato sul fondo e tappare le estremità libere dei tubi lunghi un pollice con i tappi stampati in 3D (Figura 8F).
  11. Rimuovere un tappo e iniettare delicatamente 500 μL di terreno di coltura HLMVEC nel sistema vascolare, inclinandolo per evitare la formazione di bolle d'aria, quindi riposizionare il tappo.
  12. Posizionare l'intero chip assemblato nell'incubatrice per consentire al silicone di polimerizzare per 1-2 ore.
  13. Portare il chip assemblato e tutti gli altri materiali sterili nel BSC e collegare tutto per configurare il sistema di flusso secondo la Figura 9. Assicurarsi che il tubo che attraversa la pompa peristaltica fino all'ingresso del sistema vascolare sia collegato al fondo del serbatoio della siringa. Ciò consentirà alla gravità di alimentare il tubo e ridurre le bolle d'aria nel sistema.
  14. Adescare delicatamente il sistema di flusso con il fluido HLMVEC. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL, iniettare 30 mL di terreno nella parte superiore del serbatoio della siringa (Figura 10B). Far funzionare la pompa peristaltica a una portata bassa per riempire il tubo. Continuare ad aggiungere il terreno al serbatoio fino a quando il sistema non è completamente adescato e tutte le bolle sono state rimosse.
    NOTA: Le bolle d'aria possono tagliare le celle durante l'esperimento di flusso.
  15. Collegare il tubo all'ingresso del serbatoio (dall'uscita dello stampo vascolare) utilizzando un raccordo fissato a un tappo di gomma posto nella parte superiore del serbatoio (Figura 10C).
  16. Staccare il sistema di flusso dalla pompa peristaltica e posizionarlo sulla vaschetta metallica. Trasportare delicatamente l'intero impianto dal BSC all'incubatore (37 °C, 5% CO2). Alimentare il tubo alla pompa peristaltica attraverso la parte posteriore dell'incubatrice.
  17. Ricollegare la pompa peristaltica e impostarla sulla portata desiderata per emulare la portata sanguigna attraverso il modello vascolare.
  18. Avviare la pompa e assicurarsi che non siano presenti perdite. Far funzionare il sistema per 24 ore o per la durata desiderata. Controllare periodicamente la presenza di perdite.

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Figura 8: Costruzione del chip di flusso. Costruzione del chip di flusso. (A) Aspirare i terreni dalla piastra di coltura cellulare. (B) Il PDMS si dimezza dopo che il fluido è stato aspirato. (C) Rimuovere le metà del PDMS dalla piastra con altri materiali necessari per costruire il chip (tappo, filtro per siringa, pezzi di tubo da 1/2", sigillante siliconico, 10 viti e blocchi acrilici). (D) Posizionare le metà del PDMS nei blocchi acrilici e applicare il sigillante siliconico nelle posizioni contrassegnate in rosso. (E) Posizionare il tubo nelle rispettive aperture. (F) Collegare le metà della camera di flusso e collegare il tappo e il filtro della siringa. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Configurazione del sistema di flusso. Impostazione del sistema di flusso. L'intero sistema di flusso è costruito utilizzando tubi, connettori per tubi, una pompa peristaltica, un serbatoio per siringhe, un supporto di supporto e il chip di flusso. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Adescamento del sistema di flusso. Adescamento del sistema di flusso con fluidi. (A) Semplice configurazione del sistema di flusso senza fluidi. (B) Il tappo di gomma viene rimosso dal serbatoio della siringa e il terreno viene aggiunto continuamente fino a quando il tubo non viene riempito e ci sono 20-30 ml di terreno in eccesso nel serbatoio. (C) Sistema di flusso innescato con fluidi HLMVEC. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Fissaggio e colorazione

  1. Lavare ogni metà del sistema vascolare PDMS in PBS per 5 minuti. Aggiungerne abbastanza per immergere l'intera sezione vascolare.
  2. Aspirare il PBS dal sistema vascolare inclinando la placca e lasciando che il PBS defluisca, quindi aspirare il deflusso con il vuoto.
  3. Aggiungere 600 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS a ciascuna metà vascolare e incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.
  4. Aspirare la soluzione di PFA in un contenitore di scarto adeguato utilizzando il metodo al punto 2.
  5. Lavare le celle fisse 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuna utilizzando la procedura del passaggio 2.
    NOTA: Smaltire ciascuno di questi lavaggi in un apposito contenitore per la formaldeide.
  6. Tappare le estremità delle metà del sistema vascolare PDMS con i tappi puliti stampati in 3D.
  7. Preparare il 3% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per il blocco.
  8. Riempire le metà vascolari con 600 μL di soluzione bloccante e incubare per 30 minuti a RT.
  9. Rimuovere i tappi e aspirare la soluzione bloccante.
  10. Preparare una diluizione 1:200 della lectina agglutinina del germe di grano (WGA) con una biotina coniugata (anticorpo primario) in una soluzione BSA al 3% per colorare GCX9.
  11. Rimettere i tappi per tappare le estremità del sistema vascolare e aggiungere 500 μL di soluzione di anticorpi primari a ciascuna metà vascolare.
  12. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 1 ora.
  13. Aspirare delicatamente l'anticorpo primario seguendo la tecnica utilizzata in precedenza.
  14. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
  15. Preparare una diluizione 1:500 del coniugato di streptavidina WGA (anticorpo secondario) in una soluzione di BSA al 3%.
  16. Rimettere i tappi per tappare le estremità del sistema vascolare e aggiungere 500 μL di soluzione di anticorpi secondari a ciascuna metà vascolare.
  17. Ripetere i passaggi 6.12-6.14.
  18. Aggiungere il terreno di montaggio DAPI alla superficie vascolare erogando gocce da 30 μl a intervalli per riempire completamente il sistema vascolare.
  19. Posizionare i vetrini coprioggetti sul PDMS per coprire i canali vascolari.
  20. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente.
  21. Coprire le piastre con carta stagnola e conservare a 4 °C fino all'imaging.

7. Imaging

  1. Accendere il microscopio e aprire l'applicazione di visualizzazione sul computer collegato.
  2. Aprire il microscopio e alzare la luce. Fissare la piattaforma appropriata per adattarsi ai campioni (versatile supporto per piastre di Petri).
  3. Posizionare un campione sul portapiatto all'interno del microscopio con l'area di interesse centrata sopra l'obiettivo.
  4. Abbassare la luce e chiudere il coperchio del microscopio.
  5. Sul software del microscopio, selezionare l'opzione Acquisisci immagini fisse .
  6. Scegli il tipo di campione, usa versatile.
  7. Selezionare l'obiettivo appropriato nella sezione delle lenti per una visualizzazione ottimale.
  8. Nel software del microscopio, regolare la posizione dell'obiettivo per allinearla con una regione di interesse (ROI).
  9. Seleziona l'autofocus e le celle dovrebbero essere approssimativamente a fuoco.
  10. Regolare manualmente la messa a fuoco per chiarire completamente l'immagine.
  11. Regola la luminosità e l'esposizione per visualizzare le celle in modo più chiaro.
  12. Attiva il multicolore e il colore nel software.
  13. Nelle impostazioni CH, attivare CH1 Floor DAPI e CH2 Floor GFP.
  14. Regola la luminosità di ciascun canale separatamente per visualizzare chiaramente le immagini.
  15. Selezionare Z-Stack nel software del microscopio.
  16. Regolare la messa a fuoco sul piano più alto per l'immagine e selezionare imposta per impostare il limite superiore
  17. Regolare la messa a fuoco sul piano più basso dell'immagine e selezionare imposta per impostare il limite inferiore
  18. Selezionare lo spessore della fetta desiderato e premere Avvia acquisizione per scattare l'immagine.
    NOTA: Queste immagini verranno anche inviate al software di analisi del microscopio per ulteriori modifiche.

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Risultati

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I risultati dello studio allo stato stazionario a flusso laminare di simulazione dei fluidi hanno mostrato un aumento dello sforzo di taglio in alcune biforcazioni nei modelli di pneumonectomia rispetto al modello di controllo, mostrato nella Figura 11. Visualizzate nel passaggio 2.8 del protocollo, le aree rosse denotano aree di elevata sollecitazione di taglio, mentre le aree blu mostrano aree di bassa sollecitazione di taglio.

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La modellazione vascolare è un nuovo importante campo di esplorazione. Il successo della creazione di un modello vascolare accurato è molto promettente per il progresso nel campo dell'ingegneria tissutale e dello sviluppo di farmaci. Questo articolo delinea un nuovo metodo per generare un sistema vascolare OOC che può essere utilizzato per emulare una pneumectomia o qualsiasi altro sistema vascolare o geometria per studiare un potenziale legame tra la compromissione della GCX e le compli...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano esprimere la nostra più profonda gratitudine al Dipartimento di Ingegneria Biomedica del Worcester Polytechnic Institute per il loro supporto e guida. Vorremmo fornire un ringraziamento speciale a Megan Ouellette, John Martel e Sudish Vengat per i loro sforzi di collaborazione e idee innovative che hanno notevolmente migliorato la qualità e la fattibilità di questa ricerca. Inoltre, vorremmo ringraziare Samantha Cocchiaro e Udaya Rattan per i loro contributi in laboratorio e il loro supporto e assistenza essenziali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#8-32 x 3/4 pollici Vite a macchina zincata a testa tonda Combo (confezione da 8)Everbilt204274613-
0,25% EDTA-tripsinaThermoFisher Scientifico25200056 -
Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 15 mlTermo Scientifico12-565-269-
Piatto 35x10mm, Nunclon DeltaTermo Scientifico153066-
Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 mlTermo Scientifico12-565-271-
Tappi in gomma assortitiFisherbrand14-132
Fiasche trattate per colture cellulari BioLite (25cm^2)Termo Scientifico12-556-009-
Fiasche trattate per colture cellulari BioLite (75cm^2)Termo Scientifico12-556-010-
COMSOL MultiphysicsIL BAGNON/A-
Biadesivo 3M16758005-
Epredia Richard-Allan Scientific Cover Glass Termo Scientifico22-050-218-
Siero fetale bovinoThermoFisher Scientific A5256701 -
FibronectinaThermoFisher Scientific 33016015 20 μ diluizione g/mL
Bagnomaria a controllo digitale Isotemp Fisherbrand: Modello 210Fisherbrand15-462-10Q-
Fisherbrand Siringa sterile (60mL)Fisherbrand14-955-461-
Cellule endoteliali microvascolari polmonari umaneSigma Aldrich540-05A -
Microscopio a fluorescenza Keyence BZX810KeyenceN/A-
Kit elastometro siliconico Krayden Dow Sylgard 184. Trasparente, (1,1 libbre)Dow4019862-
Lastra acrilica colata Marga Cipta spessore 1/2', 48x96'Marga CiptaN/A-
Testa della pompa Masterflex L/S Easy-Load IIImpianto MasterFlex77200-50
Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, silicone polimerizzato al platino, L/S 16; 25 piediImpianto MasterFlex96410-16-
Pompa peristaltica standard Masterflex L/SAzienda Masterflex07522-20
Micropipetta da 0,2 a 2 μ LFisherbrandFBE00002-
Micropipetta da 10 a 100 μ LFisherbrandFBE00100-
Micropipetta da 100 a 1000 μ LFisherbrandFBE01000-
Micropipetta da 5 a 50 μ LFisherbrandFBE00050-
Terreno di crescita delle cellule endoteliali microvascolari (500 ml)Sigma - Aldrich111-500-
Filtri per siringhe sterili NalgeneTermo Scientifico725-2520-
Nikon Eclipse TS-100 Microscopio a fluorescenzaNikonNI-TS100
Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS, 10X), formula di DulbeccoTermo ScientificoJ61917. K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Nero 1kgPrusaPRM-PLA-GLX-1000-
Microscopio ibrido Rebel, verticale e invertito, scopri EchoECO76376-746-
Sigillante siliconico Loctite908570-
SolidWorksDassault SystèmesN/A
Pipette sierologiche monouso sterili in polistirene con striscia di ingrandimento (10 ml)Fisherbrand13-678-11E-
Pipette sierologiche monouso sterili in polistirene con striscia di ingrandimento (25mL)Fisherbrand13-678-11-
Pipette sierologiche monouso sterili in polistirene con striscia di ingrandimento (50 ml)Fisherbrand13-678-11F-
Pipette sierologiche monouso sterili in polistirene con striscia di ingrandimento (5mL)Fisherbrand13-678-11D-
Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugatoInvitrogen S32354
Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugatoInvitrogenS32354-
Siringa di ricerca BD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albumina, Bovino, Frazione V, 35% soln., Reagente, Senza Acidi Grassi, con azide come conservanteTermo ScientificoN12H004-
Connettori per tubiFisherbrand01-000-161-
Supporto di montaggio antifading VECTASHIELD con DAPI VectashieldH-1200-10-
Incubatore VWR CO2 con rivestimento ad acquaAvantar 10810-744 -
Anticorpo biotinilato WGAVettoreB-1025-

Riferimenti

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