Method Article

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

DOI:

10.3791/67251

⸱

August 30th, 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Abstract

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I telomeri, le strutture protettive alle estremità dei cromosomi, sono fondamentali per mantenere la longevità cellulare e la stabilità del genoma. Il loro corretto funzionamento dipende da processi strettamente regolati di replicazione, allungamento e risposta al danno. Il complesso shelterin, in particolare il fattore 1 legante la ripetizione dei telomeri (TRF1) e TRF2, svolge un ruolo fondamentale nella protezione dei telomeri ed è emerso come un potenziale bersaglio antitumorale per la scoperta di farmaci. Queste proteine si legano al motivo ripetitivo del DNA telomerico TTAGGG, facilitando la formazione di strutture protettive e il reclutamento di altre proteine telomeriche. I metodi strutturali e le tecniche di imaging avanzate hanno fornito informazioni sulle interazioni proteina-DNA telomeriche, ma l'indagine sui processi dinamici richiede approcci a singola molecola. Strumenti come pinzette magnetiche, pinzette ottiche e microscopia a forza atomica (AFM) sono stati impiegati per studiare le interazioni proteina-DNA telomera, rivelando dettagli importanti come la distorsione del DNA dipendente da TRF2 e la catalisi della telomerasi. Tuttavia, la preparazione di costrutti a singola molecola con motivi ripetitivi telomerici continua ad essere un compito impegnativo, limitando potenzialmente l'ampiezza degli studi che utilizzano metodi meccanici a singola molecola. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo per studiare le interazioni utilizzando DNA telomerico umano a lunghezza intera con pinzette magnetiche. Questo protocollo descrive come esprimere e purificare TRF2, preparare il DNA telomerorico, impostare saggi meccanici a singola molecola e analizzare i dati. Questa guida dettagliata andrà a beneficio dei ricercatori in biologia dei telomeri e nella scoperta di farmaci mirati ai telomeri.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I telomeri sono strutture protettive alle estremità dei cromosomi 1,2,3. L'erosione dei telomeri durante la divisione cellulare porta alla senescenza cellulare e all'invecchiamento, mentre l'allungamento anomalo dei telomeri contribuisce al cancro 4,5. Affinché i telomeri funzionino correttamente, la loro replicazione, allungamento e risposte al danno devono essere altamente regolate 6,7,8. La shelterina, composta da sei subunità, svolge un ruolo centrale nella protezione dei telomeri 9,10,11. Una comprensione più approfondita dei telomeri fornirà preziose informazioni sulla biologia dei telomeri.

TRF1 e TRF2, subunità principali della shelterina, sono proteine leganti i telomeri12,13. Sia TRF1 che TRF2 si legano al motivo ripetitivo del DNA TTAGGG nei telomeri attraverso i loro domini Myb14. Formano dimeri attraverso i loro domini TRFH condivisi, che consentono loro di circondare il DNA telomerico a doppio filamento e di reclutare proteine telomeriche 15,16,17,18,19. TRF2 è particolarmente importante per la formazione di D-loop telomerici e T-loop20,21. A causa del loro ruolo cruciale nella protezione dei telomeri, TRF1 e TRF2 sono emersi come potenziali bersagli farmacologici antitumorali 22,23,24,25.

Sono stati compiuti sforzi significativi per studiare le interazioni proteina-DNA nei telomeri. Metodi biochimici come l'Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e la Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati per esaminare le affinità di legame 20,26. Numerose strutture di proteine leganti telomerici complessate con il DNA sono state chiarite utilizzando la microscopia crioelettronica (cryo-EM), la cristallografia a raggi X e la risonanza magnetica nucleare (NMR)27,28,29. Tecniche di imaging a super-risoluzione come la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) hanno rivelato la formazione di T-loop21 TRF2-dipendente. Recentemente, il sequenziamento dei nanopori è stato sviluppato per profilare le sequenze telomeriche 4,30,31. Queste intuizioni strutturali hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione delle interazioni proteina-DNA telomeriche. Per approfondire le dinamiche delle interazioni proteina-DNA telomeriche, lo sviluppo di nuove tecnologie è essenziale.

Gli strumenti a singola molecola sono tecniche potenti per esplorare le interazioni proteina-DNA nei telomeri 32,33,34. Metodi meccanici a singola molecola, come pinzette magnetiche, pinzette ottiche e AFM, sono stati impiegati per studiare la distorsione del DNA TRF2-dipendente, rivelare l'impilamento colonnare mediato da TRF2 della cromatina telomerica umana e osservare la catalisi processativa della telomerasi, tra le altre applicazioni 35,36,37,38,39,40. Questi metodi sono particolarmente utili per sondare le conformazioni topologiche e la cinetica di associazione e dissociazione proteina-DNA.

Tuttavia, la preparazione di costrutti a singola molecola con motivi ripetitivi telomerici presenta ancora delle sfide, il che limita gli studi con metodi meccanici a singola molecola. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo meccanico a singola molecola per studiare le interazioni globali proteina-DNA su telomeri umani a lunghezza intera41. Questo metodo estrae direttamente il DNA telomerico dalle cellule umane, eludendo la laboriosa preparazione del DNA telomerico artificiale. Facilita lo studio dei processi cinetici su lunghi telomeri nativi che si estendono su diverse kilobasi.

In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi per sondare le interazioni proteina-DNA telomerica utilizzando pinzette magnetiche, un popolare strumento meccanico a singola molecola 42,43,44. Dimostriamo come esprimere e purificare le proteine telomeriche, utilizzando TRF2 come esempio, e come preparare il DNA telomerico da cellule umane. Inoltre, mostriamo come impostare un saggio a singola molecola su pinzette magnetiche per studiare le interazioni proteina-DNA telomeriche, e copriamo la successiva analisi dei dati di esperimenti su singole molecole. Questo protocollo andrà a beneficio dei ricercatori nel campo della biologia dei telomeri e della scoperta di farmaci mirati ai telomeri.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiali e metodi generali

  1. Fare riferimento al file della Tabella dei materiali per i sali, le sostanze chimiche, gli antibiotici, gli enzimi, gli anticorpi e i materiali in resina utilizzati in questo protocollo.
  2. Preparare il terreno liquido Luria-Bertani (LB), le piastre di agar LB, il tampone HEPES, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE), la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), il tampone Tris-EDTA (TE) secondo le ricette dei protocolli di porto di sorgente fredda 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Acquisire il vettore pET28a (Addgene), le linee cellulari procariotiche ed eucariotiche (ATCC) attraverso fonti commerciali. Quindi, coltura continua e passaggio in laboratorio.
  4. Per grandi volumi di liquido, sterilizzare in autoclave a 120 °C per 20 min. Per piccoli volumi, utilizzare un filtro sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
  5. Regolare il pH delle soluzioni al livello desiderato utilizzando HCl o NaOH prima di portarle ai loro volumi finali.
    NOTA: Le pinzette magnetiche sono costruite su misura ed eseguite in un ambiente di LabVIEW 2017, mentre l'analisi dei dati a singola molecola viene eseguita in MATLAB 2017 2,54,55.
  6. Per motivi di sicurezza, indossare camici da laboratorio a maniche lunghe, guanti in nitrile (o guanti realizzati con un materiale impermeabile e resistente alla sostanza), occhiali o occhiali di sicurezza e scarpe chiuse.

2. Espressione proteica e purificazione di proteine telomerici leganti il DNA

  1. Eseguire colture cellulari e indurre l'espressione proteica.
    1. Inserire la sequenza codificante per le proteine leganti il DNA telomerico (Figura 1A), TRF2 come esempio in questo caso, nel vettore pET28a mediante digestione enzimatica e legatura, con SUMO impiegato come tag di fusione. Inserire tra i siti di restrizione di BamHI e HindIII, producendo il plasmide di pET28a-SUMO-TRF2 (Figura 1B).
    2. Trasformare le cellule BL21(DE3) con il plasmide pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Scongelare un'aliquota di 50 μL di cellule BL21(DE3) competenti su ghiaccio.
      2. Aggiungere 1 μL di DNA del plasmide pET28a-SUMO-TRF2 (contenente 50 ng di DNA) alle cellule competenti. Agitare delicatamente per miscelare senza pipettare su e giù.
        NOTA: Non vortice.
      3. Incubare la miscela con ghiaccio per 30 minuti.
      4. In caso di shock termico, riscaldare la miscela di celle a 42 °C per esattamente 45 s in un bagno d'acqua. Rimettere immediatamente le cellule nel ghiaccio per 2 minuti per stabilizzare le cellule trasformate.
      5. Aggiungere 950 μl di terreno a temperatura ambiente (RT) LB alle celle per facilitare il recupero.
      6. Incubare le cellule trasformate a 37 °C per 1 ora agitando a 220 giri/min.
      7. Distribuire 100 μl della miscela di trasformazione su una piastra di agar LB contenente 50 μg/mL di kanamicina (85,8 μM).
      8. Incubare le celle piastrate per una notte a 37 °C. Dopo l'incubazione, selezionare colonie distinte da utilizzare nell'inoculazione delle colture starter.
        NOTA: Le colonie su piastre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
    3. Prelevare una colonia di cellule BL21(DE3) trasformate e coltivarla in 5 mL di terreno LB integrato con 50 μg/mL di kanamicina (85,8 μM). Incubare per 18 ore a 37 °C agitando a 220 giri/min.
    4. Per aumentare le dimensioni, trasferire 2 mL di coltura notturna a 200 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina (85,8 μM). Continuare l'incubazione a 37 °C con agitazione a 220 giri/min fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD 600) raggiunge 0,6-0,8.
    5. Prelevare 1 mL di coltura come campione di controllo non indotto.
    6. Indurre la coltura rimanente con isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 1 mM e incubare a 20 °C per 17 ore per promuovere l'espressione proteica.
    7. Eseguire SDS-PAGE utilizzando un gel di impilamento al 5% e un gel di separazione al 10%. Caricare i campioni con il buffer di caricamento SDS-PAGE ed eseguire SDS-PAGE inizialmente a 100 V per 30 minuti, seguito da 120 V per 50 minuti in un tampone Tris-glicina. Colorare con il blu di Coomassie per visualizzare l'espressione proteica (vedere le ricette nella Tabella supplementare 1) (Figura 1C).
      NOTA: Vedere la discussione per la risoluzione dei problemi se l'espressione non viene osservata.
  2. Purificare le proteine.
    1. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4 °C, 8500 x g per 10 min. Scartare il surnatante e lavare il pellet in 200 mL di PBS. Centrifugare di nuovo, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 25 mL di tampone di lisi (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 10% glicerolo, 0,5 mM DTT, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro [PMSF]).
      ATTENZIONE: Il PMSF è corrosivo e tossico e provoca ustioni. Indossare indumenti protettivi adeguati, guanti e protezioni per occhi/viso.
      NOTA: Congelare a -80 °C se non si procede immediatamente.
    2. Aggiungere 5 μL di 100 mg/mL di lisozima, 5 μL di 1 U/μL di DNasi I e 5 μL di 10 mg/mL di RNasi A alle cellule risospese.
    3. Eseguire la sonicazione sul ghiaccio, con raffiche di 1 s a 250 W seguite da una pausa di 2 s, per un totale di 30 minuti.
    4. Centrifugare a 38.000 x g, 4 °C per 40 minuti (30-60 minuti è accettabile) e filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
    5. Preparare 500 mL di tampone legante la colonna di Ni sciogliendo 8,76 g di NaCl (concentrazione finale 300 mM) e 0,68 g di imidazolo (concentrazione finale 20 mM) in 20 mM HEPES (pH 8,0). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: L'imidazolo è pericoloso e può causare irritazione alla pelle e agli occhi. Può anche danneggiare un nascituro. Evitare il contatto con occhi, pelle e indumenti. Non ingerire o inalare. Indossare dispositivi di protezione individuale, compresa la protezione per il viso.
    6. Preparare tamponi per eluizione in colonna Ni (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl) con concentrazioni crescenti di imidazolo (100 mM, 200 mM, 300 mM e 500 mM) per l'eluizione graduale, assicurandosi che tutti i tamponi siano filtrati in modo appropriato.
    7. Caricare il surnatante filtrato sulla colonna di Ni pre-equilibrata nel tampone legante (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo). Lavare con il tampone legante ed eluire la proteina con il gradiente di imidazolo preparato, raccogliendo 12 frazioni, ciascuna con 1 mL (Figura 1C). Combina frazioni con purezza del >95%.
    8. Misurare la concentrazione della proteina di fusione 6xHis-sumo-TRF2 eluita mediante A280 in uno spettrofotometro.
    9. Per le proteine utilizzate nei saggi a singola molecola, aggiungere sumo proteasi secondo le istruzioni del produttore (in genere 0,125 U di proteasi per 2 μg di proteina di fusione) e consentire la digestione notturna a 4 °C.
    10. Dopo il trattamento con sumo proteasi, caricare nuovamente la miscela su una colonna di Ni per legare qualsiasi proteina di fusione non digerita e il sumo marcato con His, consentendo il passaggio della proteina TRF2 senza tag. Raccogli il flusso.
  3. Determinare la concentrazione proteica e immagazzinare le proteine.
    1. Concentrare la proteina TRF2 purificata utilizzando un'unità di filtro centrifugo cutoff da 30 kDa e scambiarla in un tampone di conservazione contenente 20 mM di HEPES (pH 8,0), 150 mM di NaCl, 0,5 mM di DTT, per ridurre la concentrazione di imidazolo al di sotto di 150 mM.
    2. Ripetere il processo di concentrazione fino a quando il volume non si riduce a meno di 1 ml.
    3. Analizzare i campioni di ogni fase di purificazione mediante SDS-PAGE per valutare la purezza e l'integrità della proteina (Figura 1C).
      NOTA: La cromatografia di affinità viene utilizzata per purificare le proteine, raccogliere e lavare i campioni eluiti ed eseguire SDS-PAGE per valutare l'integrità delle proteine e garantire il controllo di qualità. Quando la cromatografia di affinità da sola non soddisfa i requisiti di purezza, viene impiegata la cromatografia ad esclusione dimensionale per migliorare ulteriormente la purezza delle proteine. Le curve di assorbanza UV aiutano a valutare le frazioni di eluizione e SDS-PAGE verifica l'integrità delle proteine, garantendo un rigoroso controllo di qualità durante tutto il processo.
    4. Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale del 50% alla proteina concentrata e scambiata con tampone per la conservazione.
    5. Conservare le proteine a -80 °C.

3. Preparazione di frammenti di restrizione telomerica umana

  1. Estrarre il DNA genomico.
    1. Seguendo il diagramma di flusso (Figura 2A), centrifugare 1 x 107 celle a 1000 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante. Per il lavaggio, risospendere le cellule in 200 μL di PBS, centrifugare nuovamente a 1000 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante.
    2. Aggiungere 760 μl di tampone contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM di NaCl, 100 mM di EDTA e 1% di SDS alla provetta contenente 1 x 107 cellule e risospendere delicatamente mediante pipettaggio per evitare bolle d'aria.
      NOTA: Non vortice.
    3. Per la digestione delle proteine e l'eliminazione delle DNasi e delle RNasi nel campione, aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL, corrispondente a 40 μl di una soluzione madre da 10 mg/mL. Picchiettare il fondo del tubo per mescolare (non vortice).
    4. Incubare per una notte a 37 °C.
    5. Aggiungere 265 μl di NaCl 5,4 M. Mescolare per 5 minuti capovolgendo il tubo cinque volte al minuto, quindi mettere sul ghiaccio per 20 minuti.
    6. Centrifugare alla massima velocità (ad es. 16.900 x g) per 10 minuti a RT.
    7. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga e aggiungere un volume uguale di isopropanolo (circa 750 μL), evitando la formazione di lipidi o sedimenti galleggianti. Il DNA è nel surnatante.
    8. Capovolgere il tubo cinque volte per mescolare. Confermare visivamente la presenza di un pellet di DNA che precipita nella provetta da centrifuga.
    9. Centrifugare a RT alla massima velocità per 10 min.
    10. Scartare il surnatante. Lavare il pellet di DNA con 500 μL di etanolo al 70% capovolgendo la provetta da centrifuga cinque volte.
      NOTA: Il pellet è DNA.
    11. Centrifugare a RT alla massima velocità (ad es. 16.900 x g) per 10 min.
    12. Rimuovere con cura tutto il surnatante, lasciando il pellet di DNA. Lasciare asciugare il pellet all'aria a RT per 5 minuti.
      NOTA: Evitare l'essiccazione eccessiva, poiché il DNA genomico può diventare difficile da sciogliere.
    13. Risospendere il pellet di DNA in 475 μL di tampone TE (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA). Mescolare delicatamente picchiettando il fondo del tubo. Per la digestione dell'RNA durante la preparazione del DNA, aggiungere 25 μL di RNasi A da 10 mg/mL (concentrazione finale 0,5 mg/mL) e mescolare picchiettando delicatamente fino a quando il pellet di DNA non si è completamente sciolto.
      NOTA: Evitare il vortice per evitare il taglio del DNA.
    14. Incubare il campione di DNA a 4 °C per una notte.
    15. Eseguire un'estrazione con fenolo trisaturato di uguale volume: aggiungere 500 μl di fenolo alla provetta da centrifuga, mescolare delicatamente con una pipetta e centrifugare alla massima velocità per 10 minuti a 4 °C.
      ATTENZIONE: L'esposizione al fenolo può causare irritazione alla pelle, agli occhi, al naso, alla gola e al sistema nervoso. Evitare il contatto con occhi, pelle e indumenti. Non ingerire o inalare. Indossare dispositivi di protezione individuale, compresa la protezione per il viso.
      NOTA: Il DNA si trova nella fase acquosa superiore, le proteine si trovano nell'interfase e la fase organica si trova nella parte inferiore.
    16. Ripeti tre volte. Prendi il surnatante del DNA (circa 280 μL).
    17. In base al volume del campione di DNA, aggiungere 1/10 di volume (28 μL) di acetato di sodio 3 M (concentrazione finale 0,3 M, pH 5,2) e 2 volumi (616 μL) di etanolo freddo al 100%. Posizionare la provetta da centrifuga a -80 °C per 2-3 ore.
    18. Centrifugare alla massima velocità (ad es. 16.900 x g) per 10 minuti a 4 °C. Scongelare la soluzione con ghiaccio se congelata prima della centrifugazione.
    19. Scartare il surnatante e lavare 3-4 volte con etanolo al 70% capovolgendo la provetta da centrifuga. Centrifugare alla massima velocità per 5 min a 4 °C.
    20. Rimuovere l'etanolo e lasciare asciugare il pellet all'aria a RT per 5 minuti.
    21. Aggiungere 100 μl di tampone TE, picchiettare la provetta per miscelare e lasciarla riposare a 4 °C per 2 ore per scioglierla completamente.
      NOTA: Esaminare l'integrità del DNA genomico su un gel di agarosio all'1% (Figura 2B).
    22. Conservare il DNA a -20 °C in congelatore. Rimarrà stabile per almeno 1 anno.
  2. Eseguire la digestione e la modifica genomica del DNA.
    1. Prelevare 4 μg di DNA genomico e combinarli con 1 μL di CviAII (10 U), 2 μL di tampone di digestione 10x (vedere la Tabella supplementare 1 per le ricette) e aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 20 μL. Incubare la miscela a 25 °C per 12 ore.
      NOTA: FatI può sostituire CviAII, che è ora fuori produzione da NEB.
    2. Aggiungere 1 μL di NdeI (20 U), 1 μL di MseI (10 U) e 1 μL di BfaI (10 U) alla stessa provetta contenente la miscela precedente (20 μL). Inoltre, aggiungere 2 μL di tampone di digestione 10x e 15 μL di acqua per ottenere un volume totale di 40 μL. Incubare a 37 °C per 12 ore, quindi inattivare a caldo tutti gli enzimi a 80 °C per 20 minuti.
      NOTA: La digestione del DNA genomico può essere esaminata utilizzando il metodo del frammento di restrizione terminale (TRF) (Figura 2C). La combinazione dei quattro enzimi di restrizione (CviAII, NdeI, MseI e BfaI) digerisce il DNA genomico in frammenti di circa 800 bp e produce i TRF con una minima contaminazione subtelomerica del DNA.
    3. Per la modifica della digossigenina, prelevare 40 μL di DNA genomico digerito e aggiungere 4 μL di 1 mM di dATP (concentrazione finale 0,08 mM), 4 μL di 1 mM di digossigenina-11-dUTP (concentrazione finale 0,08 mM), 1 μL di frammento di Klenow (5 U), 0,5 μL di 100 mM DTT (concentrazione finale 1 mM) e 1 μL di tampone di digestione 10x. Incubare a 37 °C per 12 ore, quindi riscaldare a 75 °C per 20 minuti per inattivare il frammento di Klenow.
    4. Per la marcatura della biotina, prelevare 12,5 μL di DNA genomico modificato con digossigenina (1 μg) e aggiungere 1 μL di sonda telomerica biotinilata da 1 μM (cioè 1 pmol) che sono complementari alla sporgenza telomerica a filamento singolo. Aggiungere 611,5 μl di tampone TE Li (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) per diluire gli ioni K da 50 mM a 1 mM, ottenendo un volume totale di 625 μl, che può essere diviso in 16 provette da 39 μl ciascuna.
    5. Riscaldare a 75 °C per 3 minuti in un termociclatore, quindi diminuire la temperatura di 0,1 °C ogni 30 s fino a raggiungere i 25 °C.
    6. Conservare i campioni di DNA a -20 °C per almeno un anno.

4. Impostazione di una cella di flusso per un campione di DNA telomerico su pinzette magnetiche

  1. Realizzare una cella a flusso per saggi a singola molecola.
    1. Utilizzare una smerigliatrice elettrica per praticare dei fori poiché l'ingresso e l'uscita sui vetrini coprioggetti superiori (vetro di copertura # 2 con uno spessore di 0,2 mm).
    2. Pulire i vetrini coprioggetti con il detersivo mediante sonicazione per 30 minuti.
    3. Lavare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura 3 volte.
    4. Pulire i vetrini coprioggetti in isopropanolo mediante sonicazione per 30 min.
    5. Lavare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura 3 volte.
    6. Pulire i vetrini coprioggetti in ultra-puro mediante sonicazione per 15-30 minuti.
    7. Asciugare i vetrini coprioggetti con azoto.
      NOTA: Il protocollo può essere interrotto qui e i vetrini coprioggetti puliti possono essere conservati per un uso successivo.
    8. Rivestire i vetrini coprioggetti inferiori (senza fori) con 20 μl di nitrocellulosa allo 0,1% e aggiungere le perle di riferimento (diluizione 20x, diametro 3 μm). Infornare a 100 °C per 4 min.
    9. Utilizzare un bisturi per tagliare i distanziatori di parafilm a doppio strato secondo uno stampo metallico. Lo stampo è un pezzo rettangolare in lega di alluminio con le stesse dimensioni del vetrino coprioggetti, caratterizzato da un centro scavato per facilitare il taglio del canale.
    10. Assemblare il sandwich della cella di flusso (Figura 3A). Riscaldare a 85 °C e massaggiare con due tamponi fino a quando il parafilm sigilla il canale.
    11. Rivestire la cella di flusso con un anticorpo. Iniettare 70 μL di anticorpo anti-digossigenina (0,1 mg/mL) direttamente nella cella a flusso. Lasciare a RT per 1 ora.
    12. Passivare la cella di flusso. Iniettare 70 μL di 10 mg/mL di BSA per sostituire l'anticorpo anti-digossigenina. Partenza da RT per 12 h. Gli anticorpi anti-digossigenina non legati verranno eliminati nelle fasi successive con un lavaggio rigoroso.
      NOTA: Conservare la cella di flusso a 4 °C per 1-2 settimane.
    13. Verificare la presenza di un legame aspecifico inserendo nella cella di flusso 5 μL di perle MyOne (10 mg/mL) lavate (o 5 μL di M270 (10 mg/mL) lavate senza DNA. Lasciare agire per 10 minuti, quindi sciacquare le perle utilizzando un tampone di lavoro (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Conta il numero di perline attaccate alla superficie in un campo visivo. Una superficie ben trattata dovrebbe mostrare zero o solo poche perline.
  2. Isolare e immobilizzare i legami di DNA telomerico in una cella a flusso.
    1. Prelevare 10 μL di microsfere M270 (10 mg/mL) o 5 μL di MyOne da 10 mg/mL e lavarle cinque volte con 50 μL di tampone di lavoro (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) utilizzando un magnete.
    2. Prendi 500 ng di DNA genomico digerito e mettili in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere tutte le microsfere (50 μl) sopra il campione di DNA.
    3. Senza pipettaggio, agitare delicatamente la provetta da centrifuga alcune volte per miscelare le microsfere e il campione di DNA. Lasciare il composto in ghiaccio per 1 ora. Lavare con 500 μL di tampone di lavoro tre volte utilizzando un magnete per tirare le perle verso il basso, con intervalli di 10 minuti tra i lavaggi.
    4. Risospendere il campione utilizzando 30 μl di tampone di lavoro e caricare la miscela nella cella di flusso. Lasciare agire per 30 min. Sciacquare le perline magnetiche non legate.
      NOTA: Il DNA telomerico è legato tra il vetrino coprioggetti inferiore e la perlina magnetica attraverso interazioni di affinità mediate da digoxigenina-anticorpo e biotina-streptavidina (Figura 3B).
  3. Impostazione di una cella di flusso su una pinzetta magnetica
    1. Pulire la cella a flusso con etanolo al 70% e asciugare la superficie con un panno per lenti. Posizionare la cella di flusso pulita sul portacampioni inferiore e assemblare delicatamente il rack superiore utilizzando un cacciavite.
    2. Applicare una goccia di olio per lenti sulla superficie inferiore della cella di flusso, dove si allinea con la lente dell'obiettivo. Quindi, posizionare il portacampione sopra la lente dell'obiettivo e fissarlo con un cacciavite.
    3. Seleziona una coppia di magneti cubici da 5 mm disposti in configurazione verticale. Allineare il supporto del magnete con l'asse X del percorso della luce delle pinzette magnetiche per l'imaging.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. La direzione del campo magnetico è allineata e quindi determinata dall'orientamento del supporto del magnete.
    4. Avvia il software di programmazione grafica e collega i controller per le pinzette magnetiche. Regolare il campo visivo per individuare un cordone di riferimento nella parte inferiore della cella di flusso e regolare leggermente la lente dell'obiettivo in modo che il cordone di riferimento mostri chiari anelli di diffrazione.
    5. Spostare i magneti verso il basso verso la parte superiore della cella di flusso.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Cambiamenti improvvisi nel modello di diffrazione delle perle indicano che i magneti hanno appena toccato la superficie della cella di flusso. Questa posizione è considerata l'offset per il punto zero di misura.
      NOTA: Abbassare i magneti con cautela, iniziando con passi più grandi e passando gradualmente a gradini più piccoli. Muoversi con incrementi di 0,1 mm per evitare di danneggiare la cella di flusso quando ci si avvicina alla cella di flusso.
    6. Sollevare i magneti nella posizione più alta e rimuovere il supporto del magnete.
    7. Accendere la pompa peristaltica collegata al flacone di scarico ed eliminare il liquido. Aggiungere 100 μl di tampone di lavoro all'ingresso e impostare la portata della pompa peristaltica a 100 μl/min per riempire la cella di flusso con il tampone.

5. Misure di un telomero utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

  1. Configura la fotocamera.
    1. Impostate la scala di grigi della fotocamera CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) con una regolazione della luminosità su 150 livelli.
    2. Definisci le dimensioni della regione di interesse (ROI).
    3. Impostare il framerate su 200 Hz con un tempo di esposizione di 5000 μs.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Assicurarsi che il tempo di inattività dell'otturatore sia impostato su zero.
    4. Spostare la posizione del magnete a 3 cm (circa 8 pN) e regolare la messa a fuoco dell'obiettivo sulle perline.
  2. Stabilire la tabella di ricerca (LUT).
    1. Spostare i magneti in una posizione corrispondente a 8 pN per allungare saldamente la perlina magnetica legata al DNA.
    2. Impostare la LUT su 200 passi con una dimensione del passo di 0,05 μm.
    3. Utilizzare una fotocamera CMOS per catturare i profili delle perline magnetiche in diverse posizioni per stabilire la LUT.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Le perle di polistirene fissate nella cella di flusso fungono da perline di riferimento per eliminare la deriva per le perle di interesse.
  3. Progetta un esperimento meccanico a singola molecola.
    1. Scrivi uno script in MATLAB per controllare i movimenti motori per saggi di rampa di forza o salto di forza.
      NOTA: Questo è un passaggio critico. Questo script codifica i comandi per i movimenti del magnete. La velocità di carico della forza viene impostata in questa fase per un saggio di rampa di forza. Qui vengono determinati anche i livelli e la durata dei saggi di salto di forza (Figura 4, File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3).
    2. Importa lo script in un software di programmazione grafica per testare gli esperimenti su una singola molecola.
    3. Controllare il numero totale di fotogrammi necessari per l'esecuzione dell'esperimento a singola molecola e assicurarsi che la memoria disponibile superi questo requisito.
      NOTA: I dati andranno persi se la memoria allocata è inferiore a quella richiesta perché il salvataggio dei dati richiede tempo.
    4. Verificare la velocità massima di imaging per determinare il numero massimo di microsfere che possono essere monitorate contemporaneamente.
      NOTA: L'esperimento verrà terminato se viene superato il limite di velocità di imaging.
    5. Utilizzando un saggio di salto di forza come esempio, esegui l'esperimento meccanico a singola molecola. Le forze vengono applicate bruscamente alla perlina magnetica, che trasmette queste forze alla molecola di DNA, allungandola immediatamente verso l'alto.

6. Misurazioni di TRF1/2 su un telomero utilizzando pinzette magnetiche

  1. Saggio a rampa di forza
    1. Utilizzando TRF1 come esempio, caricare 200 μL di 10 nM TRF1 nella cella di flusso a una velocità di flusso lenta (ad esempio, 30 μL/min). Attendere 30 minuti affinché TRF1 si leghi al DNA telomerico.
    2. Scegliere uno script per un esperimento di rampa di forza con una velocità di carico della forza di ±1 pN/s.
    3. Assegnare un nome appropriato ai file di dati ed eseguire l'esperimento. I dati verranno salvati nella destinazione specificata per l'analisi (Figura 5).
      NOTA: Durante questo esperimento, la forza viene aumentata e diminuita linearmente tra 0 pN e 17 pN, il che allunga e rilassa il DNA telomerico e rompe i loop di DNA mediati da TRF1/2.
  2. Saggio di salto forzato
    1. Selezionare uno script per eseguire un test di salto forzato.
      NOTA: Vengono applicate varie forze per allungare il DNA telomerorico, ad esempio, "Forza a riposo" (Frest) a 0 pN per 40 s, "Forza di prova" (Ftest) che varia da 2 a 8 pN per 60 s, "Alta forza" (Fhigh) a 10 pN per 30 s e "Forza massima" (Fmax) a 20 pN per 30 s.
    2. Assegnare un nome appropriato ai file di dati ed eseguire l'esperimento. I dati verranno salvati nella destinazione specificata per l'analisi (Figura 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Figura 1A illustra i domini schematici e le strutture di TRF1 e TRF2, costituiti rispettivamente da 439 e 542 amminoacidi, che possono essere espressi nelle cellule procariotiche. La preparazione di TRF1 è stata precedentemente descritta in letteratura41. Qui, forniamo una descrizione completa e risultati rappresentativi della preparazione di TRF2. La Figura 1B mostra la mappa plasmidica utilizzata per esprimere TRF2 in E. coli. Abbiamo valutato l'espressione di TRF2 prima e dopo l'induzione in E. coli, come illustrato nella Figura 1B. I processi di purificazione e di scissione dei tag sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE (Figura 1C). Seguendo questo protocollo, entrambe le proteine leganti i telomeri, TRF1 e TRF2, sono state espresse con successo in E. coli.

Il DNA telomerico, sotto forma di frammenti di restrizione terminale (TRF), è generato da genomi umani utilizzando una combinazione di quattro enzimi di restrizione. Seguendo il diagramma di flusso mostrato nella Figura 2A, abbiamo estratto i genomi dalle cellule umane. Gli enzimi digeriscono selettivamente il DNA genomico lasciando intatto il DNA telomerico a lunghezza intera, fornendo così materiale per saggi a singola molecola. Abbiamo ampiamente testato il preparato di DNA TRF utilizzando varie linee cellulari umane. L'integrità del DNA genomico è stata esaminata utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio, come mostrato nella Figura 2B. I TRF sono stati successivamente analizzati mediante Southern blotting, impiegando oligonucleotidi marcati in fluorescenza complementari alla sequenza di ripetizione telomerica TTAGGG (Figura 2C), seguendo un metodo descritto altrove41,56. In media, la lunghezza dei TRF umani è di circa pochi kilobasi.

I saggi a singola molecola avvengono in una cella a flusso assemblata come descritto nella Figura 3A. Un rivestimento in nitrocellulosa copre la superficie del vetro caricato negativamente, fornendo una matrice idrofila per l'adsorbimento degli anticorpi. La passivazione BSA blocca le aree della matrice nitrocellulosica non legate dagli anticorpi anti-digossigenina. Le perle di polistirene, che non contengono nanoparticelle di ferro, fungono da perle di riferimento. I cavi TRF si formano attraverso interazioni di affinità tra l'anticorpo digossigenina sulla matrice nitrocellulosica e la biotina-streptavidina sulla superficie della microsfera magnetica (Figura 3B). TRF1 o TRF2 vengono introdotti nella cella di flusso, legandosi ai cavi del DNA TRF tramite diffusione libera. Le pinzette magnetiche vengono utilizzate per modulare il campo magnetico, generando forze sulle perle magnetiche per allungare e rilassare i cavi TRF, consentendo così di sondare le interazioni proteina-DNA.

Un saggio meccanico a singola molecola viene progettato sviluppando uno script per controllare i movimenti dei motori delle pinzette magnetiche. Un diagramma di flusso fornisce un approccio strutturato alla creazione di questo script in MatLab per un saggio di una singola molecola utilizzando pinzette magnetiche (Figura 4A). I magneti si muovono lungo l'asse z in un intervallo compreso tra 0 e 25 mm. Le forze sono calcolate in base alle posizioni del magnete, in base alla configurazione del magnete, utilizzando le equazioni descritte in letteratura54. Per una specifica velocità di carico della forza, le posizioni del magnete e le velocità di movimento sono progettate e programmate in MatLab per ottenere il profilo di manipolazione della forza desiderato, come dimostrato nell'esempio del saggio della rampa di forza (Figura 4B-D).

Usando TRF1 come esempio, abbiamo sondato le interazioni telomeriche DNA-proteina con pinzette magnetiche a singola molecola. La configurazione sperimentale può essere configurata come un saggio forza-rampa, come mostrato nella Figura 5A, in cui le curve forza-estensione mostrano caratteristiche a zig-zag durante l'allungamento a causa della rottura delle interazioni proteina-DNA e tracce lisce durante il rilassamento, riflettendo la fibra di DNA senza loop mediati da proteine. La configurazione può anche essere configurata come un saggio di salto di forza, come mostrato nella Figura 5B, C, che ci consente di misurare i cambiamenti nell'estensione e la durata delle interazioni proteina-DNA sotto forze specifiche. Da queste misurazioni è possibile derivare la cinetica di dissociazione dei complessi DNA-proteina telomerici (Figura 5D). Inoltre, la formazione di anse nei complessi DNA-proteina può essere rivelata da cambiamenti nell'estensione (Figura 5E). Inoltre, la concentrazione proteica può essere titolata all'interno di questa configurazione sperimentale del DNA telomerico. Inoltre, l'eterogeneità della lunghezza del DNA telomerico proveniente da cellule umane ci permette di studiare il meccanismo di formazione dell'ansa in telomeri di varie lunghezze (Figura 6).

figure-results-1
Figura 1: L'espressione e la purificazione di TRF1/2. (A) L'architettura dei domini di TRF1 e TRF2. (B) La mappa plasmidica di pET28a-SUMO-TRF2 per l'espressione di TRF2 in E. coli. (C) Analisi SDS-PAGE dei campioni ottenuti nei vari stadi di espressione e purificazione. Corsia 1: non indotta da IPTG. Corsia 2: precipitato indotto da IPTG ottenuto mediante lisi cellulare. Corsia 3: surnatante indotto da IPTG ottenuto dopo lisi cellulare. Corsia 4: Flusso attraverso la colonna Ni. Corsia 5: lavare con tampone a basso contenuto di imidazolo per rimuovere le proteine delle impurità. Corsia 6: Eluizione di 6xHis-SUMO-TRF2 con tampone contenente 300 mM di imidazolo. Corsia 7: Digestione dei tag SUMO da parte dell'enzima proteasi SUMO . Corsia 8: Ripurificazione con colonna di Ni ed eluizione di TRF2 (6xHis e SUMO tag rimossi) con tampone contenente 20 mM di imidazolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Preparazione di frammenti di restrizione terminale (TRF). (A) Diagramma di flusso per la preparazione di TRF da cellule umane. (B) Esame dell'integrità del DNA genomico utilizzando un gel di agarosio all'1% per 5 linee cellulari umane. (C) Analisi TRF eseguita mediante Southern blotting per 5 linee cellulari umane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Preparazione di saggi meccanici a singola molecola. (A) Diagramma di flusso che illustra la preparazione di una cella di flusso per saggi meccanici a singola molecola. (B) Rappresentazione schematica di saggi meccanici a singola molecola mediante pinzette magnetiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Progettazione di un saggio meccanico a singola molecola. (A) Diagramma di flusso per la generazione di uno script per l'esecuzione di un saggio di rampa di forza. (B) Il profilo di movimento dei magneti lungo l'asse z. (C) Il profilo di forza corrispondente al movimento del magnete. (D) La correlazione tra le posizioni dei magneti e le forze risultanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Interazioni DNA-proteina telomerica analizzate da pinzette magnetiche a singola molecola. (A) Le interazioni TRF1-telomeri sono state sondate in saggi di forza-rampa (N = 10) in un tampone contenente 20 mM di HEPES (pH 7,5), 1 mM di EDTA e 100 mM di NaCl a 23 °C. La concentrazione di TRF1 era di 10 nM, con una velocità di carico della forza di ±1 pN/s. (B) Il cavo TRF è stato allungato e rilassato nei saggi di salto forzato. Il protocollo di forza applicato era Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN e Fmax = 20 pN. Le condizioni di buffer e temperatura erano le stesse di (A). Frame rate = 200 Hz. (C) Le interazioni TRF1-telomeri sono state sondate in saggi di salto di forza con una concentrazione di TRF1 di 10 nM. (D) Cinetica di dissociazione dei complessi TRF1-telomeri. Il logaritmo del tasso di dissociazione alle forze testate (media ± SD, n = 206) segue il modello di Kramer-Bell-Evans (curva rossa ed equazione della legenda). Il riquadro mostra il tempo medio di dissociazione (<τ>) a Ftest. (E) Distribuzione delle variazioni di estensione (ΔL) in seguito a eventi di rottura dei complessi TRF1-telomeri. Le curve nere e rosse rappresentano i raccordi gaussiani. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.41. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Il numero e le dimensioni delle anse di DNA formate da TRF1 in un telomero. (A) Dipendenza dalla lunghezza dei telomeri delle dimensioni dell'ansa del DNA (ΔL) a [TRF1] = 20 nM. Le curve rappresentano i raccordi gaussiani. (B) Dipendenza dalla lunghezza dei telomeri di ΔL a [TRF1] = 40 nM. (C) Correlazione tra ΔL e numero di eventi di rottura per telomero, N. La correlazione di ordine zero è r = -0,20, con p < 0,001 (dimensione del campione = 1496). (D) Un cartone animato che illustra un possibile meccanismo che spiega la correlazione negativa tra ΔL e N, suggerendo che TRF1 può compattare un singolo telomero con domini di loop primari in una topologia di ordine superiore. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.41. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Codice MatLab per la generazione di script.m Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Script per la assay.txt a forza costante. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Script per la rampa di forza assay.txt. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Ricette Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo impiega pinzette magnetiche per la manipolazione di TRF a livello di singola molecola 57,58,59. Utilizziamo microsfere magnetiche per separare i TRF dai frammenti di DNA genomico. Dopo la digestione per restrizione, i TRF si legano alle biglie magnetiche, consentendo la loro facile separazione dai frammenti di DNA genomico. Questo approccio consente la manipolazione utilizzando pinzette magnetiche, che possono intrappolare efficacemente le perle magnetiche, a differenza delle pinzette ottiche che sono limitate da problemi di trasparenza. Inoltre, mentre l'AFM può essere utilizzato per la manipolazione di singole molecole, sono necessari ulteriori passaggi per dissociare i TRF dalle perle magnetiche e immobilizzarli tra una superficie di mica e una punta a sbalzo. Al contrario, le pinzette magnetiche offrono un metodo più semplice ed efficiente per la manipolazione di singole molecole di TRF, eliminando la necessità di questi passaggi aggiuntivi41.

Mantenere l'integrità del DNA genomico e dei TRF è fondamentale, poiché la manipolazione di una singola molecola dipende da TRF intatti. Utilizzando una pinzetta magnetica, allunghiamo e rilassiamo i TRF tenendo le loro due estremità per sondare le interazioni proteina-DNA. La misurazione accurata della forza su biglie magnetiche è fondamentale per i saggi meccanici a singola molecola54. Pertanto, i magneti di forma cubica dovrebbero essere allineati parallelamente o ortogonalmente al percorso della luce della fotocamera in pinzette magnetiche (NOTA sotto il passaggio 4.3.3), garantendo una precisa registrazione tridimensionale della posizione del cordone secondo le equazioni stabilite54,60. L'offset del magnete è fondamentale per determinare le loro posizioni e le forze risultanti sulle perline magnetiche. Utilizziamo il vetro di copertura #2 con uno spessore di circa 0,2 mm per coerenza o regoliamo l'offset nell'equazione per diversi vetri di copertura54. Il frame rate è fondamentale per catturare la dinamica delle interazioni proteina-DNA, richiedendo un tempo morto dell'otturatore pari a zero per i dati completi sul movimento del cordone. I movimenti motori, codificati da uno script, sono fondamentali per la progettazione di saggi meccanici a singola molecola. I parametri critici come la velocità di carico della forza, le forze e la durata devono essere impostati e ottimizzati in modo iterativo. Le concentrazioni proteiche utilizzate nei saggi a singola molecola richiedono un'ampia titolazione per determinare il livello ottimale per lo studio delle interazioni proteina-DNA. Il test iniziale della forza può essere eseguito utilizzando saggi di forza-rampa con spettroscopia di forza, mentre i saggi di salto di forza valutano le forze di interesse a un livello costante.

Si possono incontrare alcune sfide quando si adatta questo protocollo. Se TRF1 o TRF2 non sono espressi in E. coli, iniziare con uno studio su piccola scala, lisare le cellule e analizzare le proteine tramite SDS-PAGE e colorazione, confermando con Western Blot utilizzando anticorpi tag specifici. Si dovrebbe verificare il costrutto e il plasmide per garantire una clonazione corretta senza mutazioni, frameshift o codoni di stop prematuri e verificare l'idoneità del promotore per E. coli. L'espressione dovrebbe essere ottimizzata testando diversi ceppi di E. coli (ad esempio, BL21(DE3), Rosetta), regolando la temperatura di crescita (15-25 °C), il tempo di induzione (2-16 ore) e la concentrazione di IPTG (0,1-1 mM). I corpi di inclusione devono essere affrontati analizzando i pellet cellulari prima e dopo la sonicazione. Si dovrebbe affrontare il bias del codone con ceppi che forniscono tRNA rari o ottimizzazione del codone. Prova diversi terreni di crescita (LB, TB, autoinduzione) e migliora l'aerazione regolando la velocità di agitazione e il volume di coltura. Per problemi di tossicità, utilizzare promotori strettamente regolati o vettori con un numero di copie inferiore e aggiungere glucosio (0,2%) per reprimere l'espressione del promotore lac permeabile. Mantenere l'integrità del plasmide con un'adeguata selezione degli antibiotici e garantire il rilascio completo delle proteine ottimizzando il metodo di lisi cellulare61,62.

Se non vengono trovati cavi TRF nei saggi a singola molecola, una possibilità è che non sia stato utilizzato abbastanza DNA genomico iniziale. Prova a utilizzare 500 ng di DNA genomico equivalente di TRF per impostare un saggio meccanico a singola molecola. I problemi persistenti con la ricerca di cavi TRF nelle pinzette magnetiche potrebbero essere dovuti a tempi di digestione eccessivamente lunghi del DNA genomico. Mantenere la procedura di digestione al di sotto delle 12 ore per evitare l'attività delle stelle. Inoltre, la formazione di G-quadruplex alla sporgenza a singolo filamento del DNA telomerico potrebbe inibire la ricottura di oligonucleotidi marcati con biotina per legarsi a biglie magnetiche. Per evitare ciò, mantenere le concentrazioni di ioni potassio o sodio al di sotto di 1 mM per evitare la formazione di G-quadruplex e aumentare la probabilità di formare cavi TRF nella configurazione a singola molecola. Inoltre, l'aumento della temperatura di riscaldamento durante la fase di ricottura (passaggio 3.2.5) aiuta a destabilizzare i G-quadruplex e facilita il legame degli oligonucleotidi marcati con biotina ai TRF.

In presenza di proteine TRF1 o TRF2, i legami del DNA TRF potrebbero diventare strettamente compattati e troppo difficili da allungare nelle pinzette magnetiche a causa dell'abbondanza di siti di legame sul telomero per queste proteine. La titolazione delle concentrazioni proteiche può aiutare a identificare i livelli ottimali per i saggi meccanici a singola molecola. L'affinità di legame proteina-DNA può essere valutata utilizzando saggi EMSA o SPR per determinare la costante di dissociazione (Kd), che può quindi informare le concentrazioni appropriate per i saggi a singola molecola.

La quantità limitata di TRF generati dal DNA genomico potrebbe frenare l'efficienza dei saggi a singola molecola. Di conseguenza, la raccolta di dati su singole molecole può richiedere più tempo rispetto all'utilizzo di costrutti di DNA telomerico sintetizzati artificialmente. Tuttavia, l'utilizzo di telomeri provenienti direttamente dal genoma umano offre diversi vantaggi che il DNA telomerico artificiale, comunemente preparato da plasmidi nei batteri o con metodi PCR, non può offrire. Un vantaggio è che i TRF umani sono di lunghezza eterogenea, consentendo l'esame della dipendenza dalla lunghezza dei telomeri nelle interazioni proteina-DNA. Al contrario, il DNA telomerico artificiale è solitamente di lunghezza uniforme e la generazione di DNA telomerico artificiale di varie lunghezze richiederebbe molto tempo e lavoro. Inoltre, i TRF umani contengono sequenze originali di cellule, inclusi marcatori naturali come modifiche, mutazioni e danni. Ciò consente lo studio delle interazioni proteina-DNA in condizioni fisiologiche o patologiche, cosa che non è possibile con il DNA telomerico artificiale.

Questo protocollo è essenziale per gli studi nel campo della biologia dei telomeri a livello di singola molecola e può potenzialmente favorire la scoperta di farmaci mirati ai telomeri.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [Grant 32071227 to Z.Y.], dalla Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 to Z.Y.) e dallo State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Tianjin University) [Grant pilab2210 to Z.Y.].

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-digossigeninaRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
Soluzione di estrazione del DNAG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP miscelaNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  perlineThermo Fisher Scientific65305Perline di streptavidina
Dynabeads MyOne perline ThermoFisher Scientific65001Perline di streptavidina
EtanoloTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanoloTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamicinaThermo Fisher ScientificEN0523
Frammento di Klenow (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlSoftware di programmazione grafica 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrofotometro
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., LtdSA005025
Membrana in nitrocellulosaABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinasi KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Acetato di sodioSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteasiBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

References

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