Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

Summary

Per lo studio delle risposte delle cellule eccitabili in vitro, il protocollo descrive il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate, nonché i cambiamenti nella tensione transmembrana con estrazione automatizzata dei parametri rilevanti.

Abstract

Le cellule eccitabili come le cellule neuronali e muscolari possono essere bersagli primari nei trattamenti basati sull'elettroporazione in rapida evoluzione. Tuttavia, possono essere influenzati dagli impulsi elettrici anche nelle terapie in cui non sono i bersagli primari, e questo può causare effetti collaterali avversi. Pertanto, per ottimizzare i trattamenti basati sull'elettroporazione di tessuti eccitabili e non eccitabili, è necessario studiare gli effetti degli impulsi elettrici sulle cellule eccitabili, sui loro canali ionici e sull'eccitabilità in vitro. A questo scopo, è stato sviluppato un protocollo per il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate. Con l'uso di un colorante potenziometrico fluorescente, le variazioni della tensione transmembrana sono state monitorate al microscopio a fluorescenza e i parametri rilevanti delle risposte cellulari sono stati estratti automaticamente con un'applicazione MATLAB. In questo modo, le risposte delle cellule eccitabili a diversi impulsi elettrici e l'interazione tra eccitazione ed elettroporazione potrebbero essere valutate in modo efficiente.

Introduction

Nell'elettroporazione, gli impulsi elettrici ad alta tensione causano un aumento della permeabilità della membrana plasmatica per molecole che altrimenti sarebbero scarsamente pervate¹. Le tecniche basate sull'elettroporazione sono oggi ampiamente utilizzate in applicazioni in medicina², biotecnologia³ e tecnologia alimentare⁴.

Le cellule eccitabili come le cellule neuronali e muscolari sono tra gli obiettivi primari nei trattamenti basati sull'elettroporazione in rapida ascesa nel cuore, nel cervello e nei muscoli scheletrici⁵. Inoltre, possono essere influenzati dagli impulsi elettrici anche nelle terapie in cui non sono i bersagli primari, e questo può causare effetti collaterali avversi come dolore, contrazioni muscolari e danni ai nervi⁶. In particolare, gli impulsi elettrici possono causare la stimolazione elettrica delle cellule eccitabili: attivano i canali ionici voltaggio-dipendenti e innescano potenziali d'azione (AP). Tuttavia, a campi elettrici più elevati, la membrana plasmatica delle cellule diventa permeabilizzata e si verifica un'ulteriore corrente ionica attraverso pori/difetti⁷. Questa corrente ionica aggiuntiva influisce sull'eccitabilità cellulare in una complessa interazione tra eccitazione ed elettroporazione. Pertanto, per ottimizzare i trattamenti basati sull'elettroporazione di tessuti eccitabili e non eccitabili, è necessario studiare gli effetti degli impulsi elettrici sulle cellule eccitabili, sui loro canali ionici e sull'eccitabilità in vitro.

In un recente studio⁸, abbiamo esplorato le cellule renali embrionali umane (HEK) geneticamente modificate sviluppate da Cohen et ^al.9,10, come strumento prezioso per studiare l'elettroporazione nelle cellule eccitabili. In queste cellule altrimenti non eccitabili, viene espresso un complemento minimo di canali del sodio e del potassio (Na_V1.5 e K_ir2.1) necessari per l'eccitabilità. L'espressione di K_ir2.1 in queste cellule è controllata da un sistema tet-on indotto da doxiciclina che consente la creazione di due varianti cellulari: cellule S-HEK eccitabili spiking (contenenti Na_V1.5 e K_ir2.1) e cellule NS-HEK non eccitabili non spiking (contenenti solo canali Na_V1.5). Questo ci permette di confrontare gli effetti degli impulsi elettrici su varianti eccitabili e non eccitabili dello stesso tipo di cellule. Rispetto alle cellule eccitabili primarie isolate, alle cellule eccitabili differenziate da cellule staminali embrionali o pluripotenti indotte e alle linee cellulari derivate da tessuti eccitabili, le cellule S-HEK presentano diversi vantaggi: sono facili da maneggiare, coltivare e propagare, hanno canali del sodio e del potassio ben definiti e generano AP robusti⁸.

Abbiamo progettato un protocollo per il monitoraggio delle variazioni di tensione transmembrana (TMV) innescate da impulsi elettrici di diverse ampiezze con l'uso di un colorante potenziometrico fluorescente. In questo modo, possiamo studiare come l'elettroporazione influisce sulla generazione di AP nelle cellule S-HEK e altri cambiamenti nel TMV sia nelle celle S-HEK che in quelle NS-HEK. In breve, le celle S-HEK o NS-HEK sono esposte a un singolo impulso elettrico di 100 μs ogni 2 minuti e le variazioni relative della fluorescenza vengono registrate per circa 3 s attorno a ciascuna applicazione di impulso. Gli impulsi applicati sono di tensione crescente, innescando prima gli AP nelle celle e, a un campo elettrico più elevato, l'elettroporazione. L'intervallo di 2 minuti tra l'applicazione dell'impulso è stato scelto per ridurre al minimo i possibili effetti cumulativi di impulsi consecutivi, mantenendo gli esperimenti abbastanza brevi da non deteriorare le cellule. L'elaborazione delle immagini è stata automatizzata con un'applicazione MATLAB personalizzata per estrarre parametri rilevanti delle risposte di fluorescenza del colorante potenziometrico, valutando così le variazioni di TMV (AP e depolarizzazione sostenuta dovuta all'elettroporazione) nelle celle S-HEK e NS-HEK.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti e coltura cellulare

1. Preparare il terreno di coltura cellulare integrando il glucosio medio-alto di Dulbecco's Modified Eagle's con il 10% di siero fetale bovino, 2 mM di glutammina, penicillina-streptomicina (penicillina 100 U/mL, streptomicina 100 μg/mL), 2 μg/mL di puromicina, 5 μg/mL di blasticidina e 200 μg/mL di geneticina.
2. Preparare una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 10 mM di Na₂HPO₄ e 1,8 mM di KH₂PO₄, pH 7,4. Filtrarlo attraverso un filtro a membrana sterilizzante con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
3. Preparare la soluzione di Tyrode con 2 mM di KCl, 125 mM di NaCl, 2 mM di CaCl₂, 1 mM di MgCl₂, 10 mM di HEPES, 30 mM di glucosio, pH 7,3. Preparare una soluzione di Tyrode a basso contenuto di potassio con 0,5 mM di KCl, 126,5 mM di NaCl, 2 mM di CaCl₂, 1 mM di MgCl₂, 10 mM di HEPES, 30 mM di glucosio, pH 7,3. Filtrare entrambe le soluzioni attraverso un filtro a membrana sterilizzante con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
4. Preparare 1 mg/mL di soluzione madre di poli-L-lisina aggiungendo 5 mL di PBS in un flaconcino contenente 5 mg di poli-L-lisina.
5. Preparare 2 mg/mL di soluzione madre di doxiciclina in acqua distillata e filtrarla attraverso un filtro a membrana sterilizzante con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
6. Preparare 4 mM di colorante potenziometrico ElectroFluor630 in etanolo puro (aggiungere 25 μl di etanolo puro alla provetta contenente 100 nM - 73 μg di colorante).
7. Coltura di cellule HEK geneticamente modificate in un pallone T25 in 6 mL del terreno di coltura cellulare come descritto in precedenza⁸. Gli ingredienti del terreno di coltura sono sensibili alla luce; Pertanto, mantenere il mezzo al riparo dalla luce (avvolgere il pallone medio in un foglio di alluminio) ed eseguire il passaggio in condizioni di scarsa illuminazione.
8. Far passare le cellule ogni 3-4 giorni seminando 3 x 10⁵ o 5 x 10⁵ cellule in un pallone T25 fresco. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Mantenere le cellule in un matraccio master come cellule NS-HEK non eccitabili senza aggiunta di doxiciclina perché non tollerano l'espressione sostenuta di K_ir2.1. Usa le celle dei passaggi inferiori a 14 negli esperimenti.

2. Preparazione del campione

1. Rivestimento in poli-L-lisina dei vetrini della camera di copertura
   1. Pipettare 1 mL di PBS in un pozzetto dei vetrini della camera di vetro con coperchio a 2 pozzetti, aggiungere 10 μL di soluzione sterile di poli-L-lisina da 1 mg/mL e mescolare bene con una pipetta.
   2. Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Rimuovere il PBS con poli-L-lisina senza ulteriori lavaggi.
2. Semina delle cellule
   1. Preparare una diluizione 1:10 della soluzione madre di doxiciclina in un terreno di coltura in una provetta da 1,5 mL. Per ogni pozzetto sono necessari 30 μL di diluizione 1:10 di doxiciclina (3 μL di soluzione madre di doxiciclina e 27 μL di terreno di coltura), preparare il volume finale in base al numero totale di pozzetti sperimentali.
   2. Rimuovere il terreno di coltura dal pallone T25 e tripsinizzare le cellule con 2,5 mL di soluzione di tripsina-EDTA in un incubatore di CO₂ a 37 °C per 2 minuti.
   3. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura fresco e, mediante pipettaggio delicato, staccare le cellule dalla superficie. Mescolare bene la sospensione cellulare.
   4. Contare le cellule con un emocitometro e determinare la densità delle cellule in sospensione.
   5. Calcolare il volume di sospensione cellulare tripsinizzata necessaria per stabilire la coltura. Per la coltura di 2 giorni, seminare 2,5 x 10⁵ cellule e per la coltura di 3 giorni, seminare 1 x 10⁵ cellule per pozzetto. Se necessario, regola il numero esatto di celle.
   6. Calcolare il volume del terreno di coltura sottraendo il volume di sospensione cellulare precedentemente calcolato da 1470 μl. I restanti 30 μl rappresentano il volume della diluizione 1:10 della doxiciclina. Il volume totale in ciascun pozzetto sarà di 1500 μL (cellule, doxiciclina e terreno di coltura).
   7. Per preparare campioni con cellule S-HEK eccitabili, pipettare il volume calcolato del terreno di coltura e la sospensione cellulare tripsinizzata in un pozzetto e aggiungere 30 μl di diluizione 1:10 di doxiciclina. Utilizzare solo un pozzetto delle camere a due pozzetti poiché l'esperimento richiede molto tempo (circa 40 minuti). Mescolare bene con un pipettaggio delicato appena prima di inserire le camere nell'incubatore di CO₂ .
   8. Per preparare campioni con cellule NS-HEK non eccitabili, pipettare il volume calcolato di terreno di coltura in un pozzetto e aggiungere il 90% del volume calcolato di sospensione cellulare per le cellule S-HEK senza doxiciclina. Le cellule NS-HEK crescono leggermente più velocemente delle cellule S-HEK.
   9. Incubare le camere in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per 2-3 giorni prima dell'esperimento. Per i campioni con doxiciclina, questo tempo di incubazione è sufficiente a rendere le cellule eccitabili.
3. Etichettatura delle celle
   1. Prima dell'esperimento, pipettare 3 μL di soluzione madre di colorante potenziometrico in una provetta da 1,5 mL e lasciare la provetta aperta a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per consentire all'etanolo di evaporare e al colorante potenziometrico di asciugarsi (circa 15 minuti). Aggiungere 997 μL di terreno di coltura freddo (da un frigorifero a 4 °C) alla provetta e sciogliere il colorante fino a una concentrazione finale di 12 μM.
   2. Rimuovere il terreno di coltura dal pozzetto e aggiungere 1 mL di soluzione colorante potenziometrica alle cellule. Mettetele in frigorifero a 4 °C e incubatele per 20 minuti.
   3. Rimuovere la soluzione colorante potenziometrica e conservarla nel tubo per un ulteriore riutilizzo (per un massimo di sei esperimenti sequenziali in 1 giorno).
   4. Lavare delicatamente le cellule 3 volte con la soluzione di Tyrode e, dopo l'ultimo lavaggio, pipettare 1 mL di soluzione di Tyrode a basso contenuto di potassio nel pozzetto.

3. Elettrostimolazione ed elettroporazione

1. Configura la sincronizzazione dell'erogazione degli impulsi con l'acquisizione delle immagini utilizzando un segnale TTL dal sistema del microscopio che attiva il generatore di impulsi. Per la generazione di impulsi ad alta tensione, utilizzare un generatore di impulsi personalizzato¹¹ o qualsiasi generatore di impulsi che può essere attivato esternamente con un segnale TTL.
   NOTA: Nella configurazione sperimentale presentata, il software LAS X viene utilizzato per l'acquisizione delle immagini, che può essere configurato per inviare un segnale TTL a un orario preselezionato durante un'acquisizione time-lapse.
2. Posizionare due elettrodi a filo Pt/Ir paralleli, con un diametro di 0,8 mm e una distanza di 5 mm tra i bordi interni, sul fondo della camera e fissare la camera al microscopio.
3. Collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Collegare l'uscita del generatore di impulsi a un oscilloscopio utilizzando una sonda di tensione e corrente per consentire la verifica che gli impulsi siano stati erogati correttamente durante l'esperimento.
4. Focalizza le celle in campo chiaro. Immagina le celle che si trovano all'incirca al centro tra gli elettrodi.
5. Avvia la prima acquisizione di immagini in fluorescenza in modalità time-lapse con un obiettivo 40x, registrando il segnale di fluorescenza in tutto il campo visivo. La telecamera dovrebbe essere abbastanza veloce da acquisire un chiaro andamento temporale di un potenziale d'azione (idealmente superiore a 25 fotogrammi/s).
   1. Acquisisci 80 immagini in modalità time-lapse, con almeno 25 fotogrammi/s per risolvere l'andamento in tempo reale del potenziale d'azione. La durata totale dell'acquisizione dell'immagine risulta in circa 3 s. Durante l'acquisizione dell'immagine, illuminare le celle con una lunghezza d'onda di eccitazione di 635 nm, un tempo di esposizione di 10 ms e rilevare l'emissione a circa 700 nm. In questa prima acquisizione, non applicare alcun impulso: questa acquisizione verrà utilizzata per correggere le acquisizioni successive per il fotosbiancamento del colorante. Dopo questa acquisizione, attendere 2 minuti.
      NOTA: Questo esperimento utilizza 27,8 fotogrammi/s, ovvero un periodo di 36 ms, che è il tempo dall'inizio della prima acquisizione dell'immagine all'inizio della successiva acquisizione dell'immagine nella registrazione time-lapse).
6. Ogni 2 minuti, registrare un time-lapse come al punto 3.5. Per queste acquisizioni, applicare un singolo impulso di 100 μs al momento dell'acquisizione della decima immagine (a 324 ms). Acquisire immagini con le seguenti tensioni di impulso: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V e 200 V. Stimare il campo elettrico a cui sono esposte le celle come il rapporto tensione-distanza elettrodo applicato (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 e 400 V/cm).
   NOTA: A campi elettrici più bassi, gli impulsi attiveranno potenziali d'azione; A campi elettrici più elevati, innescheranno l'elettroporazione, che si manifesta come una depolarizzazione prolungata. La durata dell'esperimento su ciascun campione di cellule è di circa 40 minuti (20 minuti per la marcatura e 20 minuti per la microscopia).

4. Analisi dei dati

1. Esporta le registrazioni time-lapse in formato tiff.
2. Inserire le registrazioni time-lapse di tutte le tensioni applicate durante un singolo esperimento (un campione di celle) in un'unica cartella. Rinominare le registrazioni time-lapse in modo tale che il campo elettrico E possa essere riconosciuto dall'applicazione MATLAB: Vcm (ad esempio, 126Vcm per 126 V/cm). Le parti rimanenti del nome possono essere arbitrarie. Per l'acquisizione all'inizio dell'esperimento in cui non viene applicato alcun impulso, rinominare utilizzando la frase 000Vcm. Un esempio dei nomi delle registrazioni time-lapse: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, ecc.
3. Apri l'applicazione, che può essere scaricata da
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Fare clic su Seleziona cartella dati per scegliere la cartella contenente le registrazioni time-lapse di un esperimento.
4. Selezionare i pixel da utilizzare per un'ulteriore analisi dei dati. A tale scopo, utilizzare due cursori per determinare la soglia bassa per un'immagine chiara delle membrane (in viola) e la soglia alta per l'eliminazione dei detriti (grandi macchie con elevata fluorescenza) dall'analisi (in verde).
5. Seleziona Analizza dati. Nella scheda Analisi viene visualizzata una tabella con i parametri estratti. Sul lato destro della tabella, per ogni E utilizzato compaiono i grafici della fluorescenza relativa nel tempo. Seleziona i grafici per una data E dal menu a discesa sul lato sinistro sopra la tabella.
6. Esamina tutti i grafici ed esegui la correzione manuale in caso di rilevamento di falsi picchi. Selezionare Cancella picchi AUTO nella parte inferiore della scheda Analisi per cancellare i picchi rilevati automaticamente. Fare clic sul grafico per determinare manualmente un nuovo punto dell'ora di picco.
7. Selezionare Riesegui rilevamento picchi AUTO nella parte inferiore della scheda Analisi per eseguire nuovamente il rilevamento automatico dei picchi. I parametri estratti verranno ora regolati in base al nuovo picco.
8. Seleziona Esporta dati in basso a destra nella scheda Analisi per esportare i dati nella stessa cartella sotto forma di file .mat, file di foglio di calcolo e immagini PNG per ogni E utilizzato.

Results

Con questo protocollo è possibile monitorare otticamente i cambiamenti di TMV nelle cellule eccitabili in vitro innescati da impulsi elettrici e analizzare i segnali di fluorescenza per estrarne i parametri rilevanti.

La configurazione sperimentale è mostrata nella Figura 1A. Un segnale tipico di impulso elettrico di 100 μs utilizzato negli esperimenti è mostrato nella Figura 1B. Le cellule nelle camere poste al microscopio assomigliano tipicamente alle cellule della Figura 1C (immagine in campo chiaro) e della Figura 1D (immagine a fluorescenza). Eseguiamo un esperimento in cui ogni 2 minuti viene applicato un impulso elettrico con tensione crescente alle stesse celle. Si noti che il tempo di interimpulso di 2 minuti potrebbe non essere sufficientemente lungo per consentire la completa richiusura e il recupero delle membrane cellulari, specialmente quando si utilizzano impulsi della massima ampiezza, che sono associati a un'elettroporazione prominente. Pertanto, ci si può aspettare alcuni effetti cumulativi degli impulsi. Per evitare questi effetti cumulativi, il ritardo tra gli impulsi può essere esteso, ma a scapito della riduzione del numero delle ampiezze degli impulsi testate e dell'evitare di tenere le cellule al microscopio troppo a lungo.

Dopo aver acquisito le immagini a fluorescenza negli esperimenti, analizzale con l'applicazione MATLAB personalizzata. Innanzitutto, determinare le soglie di pixel (Figura 2A); Regolando la soglia bassa, otteniamo un'immagine chiara delle membrane intorno alle cellule (in viola) e regolando la soglia alta, rimuoviamo il segnale dei detriti (verde). L'applicazione determina quindi l'intensità media della fluorescenza di tutti i pixel di soglia per ogni impulso consecutivo erogato per ottenere un segnale dipendente dal tempo della variazione relativa della fluorescenza F/F0. Questo segnale viene corretto per il fotobleaching del colorante sottraendo la pendenza della diminuzione lineare di F determinata dalla registrazione time-lapse di controllo in cui non è stato applicato alcun impulso (Figura 2B). Dopo aver corretto il segnale, i parametri delle risposte vengono estratti sotto forma di una tabella in-app e di un grafico del segnale di fluorescenza corretto (Figura 2C). In rari casi, l'algoritmo non rileva un picco evidente o rileva segnali di rumore spuri come falsi positivi. In questi casi, l'utente ha la possibilità di selezionare manualmente il punto corrispondente nel segnale di fluorescenza come picco o di rimuovere il falso picco rilevato (Figura 2D - rimozione di un piccolo picco che è stato rilevato in modo anomalo prima dell'applicazione dell'impulso elettrico).

Utilizzando l'applicazione MATLAB, possiamo ottenere immagini delle risposte TMV agli impulsi elettrici sia in celle S-HEK eccitabili (Figura 3A) che in celle NS-HEK non eccitabili (Figura 3B). Vengono estratti i seguenti parametri di risposta (Tabella 1): numero di picchi (NoPeaks), tempo medio picco-picco (quando viene rilevato più di un picco, MPPT), risposta massima (MR), tempo al primo picco (TtFP) e tempo dal picco al 25%, 50%, 75% e 90% di recupero (T25, T50, T75, T90, rispettivamente). Questi parametri consentono la valutazione delle risposte a diversi impulsi elettrici (ad esempio, determinare il numero di picchi innescati da impulsi elettrici di diverso E, Figura 3C) e l'interazione tra eccitazione ed elettroporazione.

Figura 1: La configurazione, la forma d'onda e le cellule S-HEK. (A) L'immagine della camera sul tavolino del microscopio. (B) Esempio della forma d'onda di un impulso utilizzato nello studio (tensione (U) nel tempo). (C, D) L'immagine delle celle S-HEK ((C): campo chiaro, (D): fluorescenza), barra della scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Applicazione per l'analisi dei dati. (A) L'immagine dell'interfaccia dell'applicazione - soglia. (B) Il grafico del segnale grezzo e corretto della variazione di fluorescenza. (C) L'immagine dell'interfaccia dell'applicazione - dati estratti. (D) Correzione manuale del rilevamento dei picchi (rimozione di un piccolo picco che è stato rilevato in modo anomalo prima dell'applicazione dell'impulso elettrico, contrassegnato da una freccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi. (A, B) Attivazione di cambiamenti nel TMV in (A) S-HEK eccitabile e (B) NS-HEK non eccitabile con impulsi elettrici di 100 μs di diverse ampiezze, risultati di esperimenti rappresentativi. Per chiarezza, vengono mostrate solo le risposte agli impulsi selezionati nella sequenza di impulsi applicata. (C) I parametri delle risposte TMV attivate dagli impulsi da 100 μs di diverse ampiezze: l'esempio mostra il numero di picchi. I risultati sono espressi come media ± SE, numero di esperimenti: N = 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Indice	Forza E (V/cm)	Nessun picco (-)	Produttore di energia MPPT (manoscritti)	SIGNOR (-)	TtFP (manoscritti)	T25 (manoscritti)	T50 (manoscritti)	T75 (manoscritti)	T90 (manoscritti)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

Tabella 1: Parametri delle risposte TMV attivate dagli impulsi di 100 μs di diverse ampiezze.

Discussion

Le cellule S-HEK sono un modello cellulare semplice eccitabile con canali del sodio e del potassio ben definiti, Na_V1.5 e K_ir2.1⁹. Questo ci permette di eseguire studi approfonditi su come le cellule eccitabili rispondono agli impulsi elettrici applicati e di collegare i dati sperimentali con modelli matematici basati sulle ben note caratteristiche teoriche dei canali espressi nelle celle S-HEK. Nel nostro precedente studio⁸, abbiamo descritto le risposte di queste cellule a impulsi di 100 μs di E crescente sia sperimentalmente che teoricamente. A E più basso, le cellule S-HEK rispondono con potenziali d'azione singoli o multipli, mentre a E più alto, gli AP si prolungano e si trasformano in una depolarizzazione sostenuta. Poiché la depolarizzazione sostenuta è chiaramente visibile anche in una versione non eccitabile di queste celle (NS-HEK), è attribuita all'elettroporazione e all'aumento associato della corrente ionica non selettiva.

L'uso del colorante potenziometrico fluorescente si è rivelato un modo molto efficace per studiare gli AP e l'elettroporazione in celle eccitabili. Rispetto ai metodi elettrofisiologici classici, come il patch clamp, le misurazioni ottiche sono molto più convenienti, efficienti in termini di tempo e non richiedono particolari competenze tecniche. Inoltre, l'uso di impulsi elettrici ad alta tensione non interferisce con le misurazioni, che possono diventare un problema nelle misure di patch clamp¹². Tuttavia, i principali svantaggi di questo protocollo sono legati alla natura del colorante. A causa del suo fotosbiancamento, il segnale di fluorescenza catturato deve essere corretto. Il colorante si diffonde spontaneamente nella cellula, quindi il segnale dalle membrane diminuisce con il tempo. Per questo motivo, il colorante è adatto per il monitoraggio dei potenziali d'azione e di altri cambiamenti a breve termine nel TMV (~3 s in questi esperimenti). Poiché il colorante consente l'imaging raziometrico¹³, tale imaging potrebbe evitare alcuni problemi con la diffusione del colorante, ma a scapito di una minore velocità di imaging raggiungibile. In questa configurazione sperimentale, l'imaging raziometrico sarebbe troppo lento per catturare correttamente la forma dei potenziali d'azione. Inoltre, le variazioni misurate nella fluorescenza del colorante forniscono informazioni qualitative sulla variazione del TMV; Tuttavia, il colorante può essere calibrato per consentire misurazioni quantitative.

L'analisi automatizzata delle immagini con un'applicazione MATLAB personalizzata ci consente di analizzare una grande quantità di dati e di estrarre in modo efficiente le caratteristiche preziose delle risposte TMV in un breve periodo di tempo. L'applicazione è configurata per catturare il segnale di fluorescenza dalle membrane di tutte le cellule nel campo visivo. Ciò migliora il rapporto segnale/rumore, ma a scapito della perdita di informazioni su come cambia il TMV a livello di singola cella. Nella configurazione sperimentale data, il segnale proveniente dalle singole celle era troppo rumoroso per consentire misurazioni utili. Inoltre, le membrane delle cellule adiacenti erano difficili da distinguere. Tuttavia, le cellule HEK esprimono endogenamente giunzioni gap attraverso le quali sono collegate elettricamente. La modellazione matematica, presentata nel precedente studio⁸, ha dimostrato che, a causa delle loro connessioni elettriche, le celle all'interno del campo visivo sono abbastanza vicine da innescare AP simultaneamente. Inoltre, l'AP viene propagato lungo il monostrato cellulare ad alta velocità (circa 34 mm/s, stimato sulla base dell'imaging con ingrandimento dell'obiettivo 5x)^8,9. Considerando la lunghezza laterale del campo visivo (~0,33 mm), l'AP percorrerebbe questa lunghezza in circa 10 ms, che è più breve del nostro periodo di acquisizione dell'immagine. Pertanto, l'effetto di propagazione AP non può essere visto con questo ingrandimento e velocità di registrazione. Tuttavia, la propagazione dell'AP dagli elettrodi al campo visivo può causare un ritardo tra l'impulso applicato e l'AP⁸ catturato.

Nel precedente studio⁸, così come in questa pubblicazione, sono stati descritti gli effetti di impulsi di durata di 100 μs sull'interazione tra eccitabilità ed elettroporazione. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per studiare impulsi elettrici con altri parametri (di diversa durata, tensione, numero, frequenza di ripetizione o forma) o altre celle eccitabili.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta da 1,5 mL	Ratiolab	5615000
pozzetti Nunc Lab-Tek II Camerato #1.5 Sistema tedesco di vetro di copertura	Thermo Fisher Scientific
ADP305 Sonda di tensione differenziale	Teledyne LeCroy
AP015 Sonda di corrente	Teledyne LeCroy
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific
Incubatore a CO2	PHCbi	MCO -230AICUV
Doxiciclina	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco' s Aquila Modidata' s Medium high glucose growth medium	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)sonde	potenziometriche	31795
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
Glutammine	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Cappa a flusso laminare	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
Penicillina– streptomicina	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Po-L-lisina bromidrato	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG
Generatore di impulsi	Su		vedi riferimento11
Puromicina	Thermo Fisher Scientific
T25 25cm² Pallone per coltura tissutale	TPP	90026
Cellule HEK Tet-on spiking	Type Culture Collection ATCC	CRL-3479
Thunder Imager Sistema di cellule vive per microscopia a fluorescenza	Leica Microsystems
Soluzione tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Oscilloscopio	Teledyne LeCroy