Per lo studio delle risposte delle cellule eccitabili in vitro, il protocollo descrive il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate, nonché i cambiamenti nella tensione transmembrana con estrazione automatizzata dei parametri rilevanti.
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Articolo metodologico
Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule eccitabili come le cellule neuronali e muscolari possono essere bersagli primari nei trattamenti basati sull'elettroporazione in rapida evoluzione. Tuttavia, possono essere influenzati dagli impulsi elettrici anche nelle terapie in cui non sono i bersagli primari, e questo può causare effetti collaterali avversi. Pertanto, per ottimizzare i trattamenti basati sull'elettroporazione di tessuti eccitabili e non eccitabili, è necessario studiare gli effetti degli impulsi elettrici sulle cellule eccitabili, sui loro canali ionici e sull'eccitabilità in vitro. A questo scopo, è stato sviluppato un protocollo per il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate. Con l'uso di un colorante potenziometrico fluorescente, le variazioni della tensione transmembrana sono state monitorate al microscopio a fluorescenza e i parametri rilevanti delle risposte cellulari sono stati estratti automaticamente con un'applicazione MATLAB. In questo modo, le risposte delle cellule eccitabili a diversi impulsi elettrici e l'interazione tra eccitazione ed elettroporazione potrebbero essere valutate in modo efficiente.
Introduzione
Nell'elettroporazione, gli impulsi elettrici ad alta tensione causano un aumento della permeabilità della membrana plasmatica per molecole che altrimenti sarebbero scarsamente pervate1. Le tecniche basate sull'elettroporazione sono oggi ampiamente utilizzate in applicazioni in medicina2, biotecnologia3 e tecnologia alimentare4.
Le cellule eccitabili come le cellule neuronali e muscolari sono tra gli obiettivi primari nei trattamenti basati sull'elettroporazione in rapida ascesa nel cuore, nel cervello e nei muscoli scheletrici5. Inoltre, possono essere influenzati dagli impulsi elettrici anche nelle terapie in cui non sono i bersagli primari, e questo può causare effetti collaterali avversi come dolore, contrazioni muscolari e danni ai nervi6. In particolare, gli impulsi elettrici possono causare la stimolazione elettrica delle cellule eccitabili: attivano i canali ionici voltaggio-dipendenti e innescano potenziali d'azione (AP). Tuttavia, a campi elettrici più elevati, la membrana plasmatica delle cellule diventa permeabilizzata e si verifica un'ulteriore corrente ionica attraverso pori/difetti7. Questa corrente ionica aggiuntiva influisce sull'eccitabilità cellulare in una complessa interazione tra eccitazione ed elettroporazione. Pertanto, per ottimizzare i trattamenti basati sull'elettroporazione di tessuti eccitabili e non eccitabili, è necessario studiare gli effetti degli impulsi elettrici sulle cellule eccitabili, sui loro canali ionici e sull'eccitabilità in vitro.
In un recente studio8, abbiamo esplorato le cellule renali embrionali umane (HEK) geneticamente modificate sviluppate da Cohen et al.9,10, come strumento prezioso per studiare l'elettroporazione nelle cellule eccitabili. In queste cellule altrimenti non eccitabili, viene espresso un complemento minimo di canali del sodio e del potassio (NaV1.5 e Kir2.1) necessari per l'eccitabilità. L'espressione di Kir2.1 in queste cellule è controllata da un sistema tet-on indotto da doxiciclina che consente la creazione di due varianti cellulari: cellule S-HEK eccitabili spiking (contenenti NaV1.5 e Kir2.1) e cellule NS-HEK non eccitabili non spiking (contenenti solo canali NaV1.5). Questo ci permette di confrontare gli effetti degli impulsi elettrici su varianti eccitabili e non eccitabili dello stesso tipo di cellule. Rispetto alle cellule eccitabili primarie isolate, alle cellule eccitabili differenziate da cellule staminali embrionali o pluripotenti indotte e alle linee cellulari derivate da tessuti eccitabili, le cellule S-HEK presentano diversi vantaggi: sono facili da maneggiare, coltivare e propagare, hanno canali del sodio e del potassio ben definiti e generano AP robusti8.
Abbiamo progettato un protocollo per il monitoraggio delle variazioni di tensione transmembrana (TMV) innescate da impulsi elettrici di diverse ampiezze con l'uso di un colorante potenziometrico fluorescente. In questo modo, possiamo studiare come l'elettroporazione influisce sulla generazione di AP nelle cellule S-HEK e altri cambiamenti nel TMV sia nelle celle S-HEK che in quelle NS-HEK. In breve, le celle S-HEK o NS-HEK sono esposte a un singolo impulso elettrico di 100 μs ogni 2 minuti e le variazioni relative della fluorescenza vengono registrate per circa 3 s attorno a ciascuna applicazione di impulso. Gli impulsi applicati sono di tensione crescente, innescando prima gli AP nelle celle e, a un campo elettrico più elevato, l'elettroporazione. L'intervallo di 2 minuti tra l'applicazione dell'impulso è stato scelto per ridurre al minimo i possibili effetti cumulativi di impulsi consecutivi, mantenendo gli esperimenti abbastanza brevi da non deteriorare le cellule. L'elaborazione delle immagini è stata automatizzata con un'applicazione MATLAB personalizzata per estrarre parametri rilevanti delle risposte di fluorescenza del colorante potenziometrico, valutando così le variazioni di TMV (AP e depolarizzazione sostenuta dovuta all'elettroporazione) nelle celle S-HEK e NS-HEK.
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti e coltura cellulare
- Preparare il terreno di coltura cellulare integrando il glucosio medio-alto di Dulbecco's Modified Eagle's con il 10% di siero fetale bovino, 2 mM di glutammina, penicillina-streptomicina (penicillina 100 U/mL, streptomicina 100 μg/mL), 2 μg/mL di puromicina, 5 μg/mL di blasticidina e 200 μg/mL di geneticina.
- Preparare una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 10 mM di Na2HPO4 e 1,8 mM di KH2PO4, pH 7,4. Filtrarlo attraverso un filtro a membrana sterilizzante con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
- Preparare la soluzione di Tyrode con 2 mM di KCl, 125 mM di NaCl, 2 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2, 10 mM di HEPES, 30 mM di glucosio, pH 7,3. Preparare una soluzione di Tyrode a basso contenuto di potassio con 0,5 mM di KCl, 126,5 mM di NaCl, 2 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2, 10 mM di HEPES, 30 mM di glucosio, pH 7,3. Filtrare entrambe le soluzioni attraverso un filtro a membrana sterilizzante con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
- Preparare 1 mg/mL di soluzione madre di poli-L-lisina aggiungendo 5 mL di PBS in un flaconcino contenente 5 mg di poli-L-lisina.
- Preparare 2 mg/mL di soluzione madre di doxiciclina in acqua distillata e filtrarla attraverso un filtro a membrana sterilizzante con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
- Preparare 4 mM di colorante potenziometrico ElectroFluor630 in etanolo puro (aggiungere 25 μl di etanolo puro alla provetta contenente 100 nM - 73 μg di colorante).
- Coltura di cellule HEK geneticamente modificate in un pallone T25 in 6 mL del terreno di coltura cellulare come descritto in precedenza8. Gli ingredienti del terreno di coltura sono sensibili alla luce; Pertanto, mantenere il mezzo al riparo dalla luce (avvolgere il pallone medio in un foglio di alluminio) ed eseguire il passaggio in condizioni di scarsa illuminazione.
- Far passare le cellule ogni 3-4 giorni seminando 3 x 105 o 5 x 105 cellule in un pallone T25 fresco. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Mantenere le cellule in un matraccio master come cellule NS-HEK non eccitabili senza aggiunta di doxiciclina perché non tollerano l'espressione sostenuta di Kir2.1. Usa le celle dei passaggi inferiori a 14 negli esperimenti.
2. Preparazione del campione
- Rivestimento in poli-L-lisina dei vetrini della camera di copertura
- Pipettare 1 mL di PBS in un pozzetto dei vetrini della camera di vetro con coperchio a 2 pozzetti, aggiungere 10 μL di soluzione sterile di poli-L-lisina da 1 mg/mL e mescolare bene con una pipetta.
- Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Rimuovere il PBS con poli-L-lisina senza ulteriori lavaggi.
- Semina delle cellule
- Preparare una diluizione 1:10 della soluzione madre di doxiciclina in un terreno di coltura in una provetta da 1,5 mL. Per ogni pozzetto sono necessari 30 μL di diluizione 1:10 di doxiciclina (3 μL di soluzione madre di doxiciclina e 27 μL di terreno di coltura), preparare il volume finale in base al numero totale di pozzetti sperimentali.
- Rimuovere il terreno di coltura dal pallone T25 e tripsinizzare le cellule con 2,5 mL di soluzione di tripsina-EDTA in un incubatore di CO2 a 37 °C per 2 minuti.
- Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura fresco e, mediante pipettaggio delicato, staccare le cellule dalla superficie. Mescolare bene la sospensione cellulare.
- Contare le cellule con un emocitometro e determinare la densità delle cellule in sospensione.
- Calcolare il volume di sospensione cellulare tripsinizzata necessaria per stabilire la coltura. Per la coltura di 2 giorni, seminare 2,5 x 105 cellule e per la coltura di 3 giorni, seminare 1 x 105 cellule per pozzetto. Se necessario, regola il numero esatto di celle.
- Calcolare il volume del terreno di coltura sottraendo il volume di sospensione cellulare precedentemente calcolato da 1470 μl. I restanti 30 μl rappresentano il volume della diluizione 1:10 della doxiciclina. Il volume totale in ciascun pozzetto sarà di 1500 μL (cellule, doxiciclina e terreno di coltura).
- Per preparare campioni con cellule S-HEK eccitabili, pipettare il volume calcolato del terreno di coltura e la sospensione cellulare tripsinizzata in un pozzetto e aggiungere 30 μl di diluizione 1:10 di doxiciclina. Utilizzare solo un pozzetto delle camere a due pozzetti poiché l'esperimento richiede molto tempo (circa 40 minuti). Mescolare bene con un pipettaggio delicato appena prima di inserire le camere nell'incubatore di CO2 .
- Per preparare campioni con cellule NS-HEK non eccitabili, pipettare il volume calcolato di terreno di coltura in un pozzetto e aggiungere il 90% del volume calcolato di sospensione cellulare per le cellule S-HEK senza doxiciclina. Le cellule NS-HEK crescono leggermente più velocemente delle cellule S-HEK.
- Incubare le camere in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 2-3 giorni prima dell'esperimento. Per i campioni con doxiciclina, questo tempo di incubazione è sufficiente a rendere le cellule eccitabili.
- Etichettatura delle celle
- Prima dell'esperimento, pipettare 3 μL di soluzione madre di colorante potenziometrico in una provetta da 1,5 mL e lasciare la provetta aperta a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per consentire all'etanolo di evaporare e al colorante potenziometrico di asciugarsi (circa 15 minuti). Aggiungere 997 μL di terreno di coltura freddo (da un frigorifero a 4 °C) alla provetta e sciogliere il colorante fino a una concentrazione finale di 12 μM.
- Rimuovere il terreno di coltura dal pozzetto e aggiungere 1 mL di soluzione colorante potenziometrica alle cellule. Mettetele in frigorifero a 4 °C e incubatele per 20 minuti.
- Rimuovere la soluzione colorante potenziometrica e conservarla nel tubo per un ulteriore riutilizzo (per un massimo di sei esperimenti sequenziali in 1 giorno).
- Lavare delicatamente le cellule 3 volte con la soluzione di Tyrode e, dopo l'ultimo lavaggio, pipettare 1 mL di soluzione di Tyrode a basso contenuto di potassio nel pozzetto.
3. Elettrostimolazione ed elettroporazione
- Configura la sincronizzazione dell'erogazione degli impulsi con l'acquisizione delle immagini utilizzando un segnale TTL dal sistema del microscopio che attiva il generatore di impulsi. Per la generazione di impulsi ad alta tensione, utilizzare un generatore di impulsi personalizzato11 o qualsiasi generatore di impulsi che può essere attivato esternamente con un segnale TTL.
NOTA: Nella configurazione sperimentale presentata, il software LAS X viene utilizzato per l'acquisizione delle immagini, che può essere configurato per inviare un segnale TTL a un orario preselezionato durante un'acquisizione time-lapse. - Posizionare due elettrodi a filo Pt/Ir paralleli, con un diametro di 0,8 mm e una distanza di 5 mm tra i bordi interni, sul fondo della camera e fissare la camera al microscopio.
- Collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Collegare l'uscita del generatore di impulsi a un oscilloscopio utilizzando una sonda di tensione e corrente per consentire la verifica che gli impulsi siano stati erogati correttamente durante l'esperimento.
- Focalizza le celle in campo chiaro. Immagina le celle che si trovano all'incirca al centro tra gli elettrodi.
- Avvia la prima acquisizione di immagini in fluorescenza in modalità time-lapse con un obiettivo 40x, registrando il segnale di fluorescenza in tutto il campo visivo. La telecamera dovrebbe essere abbastanza veloce da acquisire un chiaro andamento temporale di un potenziale d'azione (idealmente superiore a 25 fotogrammi/s).
- Acquisisci 80 immagini in modalità time-lapse, con almeno 25 fotogrammi/s per risolvere l'andamento in tempo reale del potenziale d'azione. La durata totale dell'acquisizione dell'immagine risulta in circa 3 s. Durante l'acquisizione dell'immagine, illuminare le celle con una lunghezza d'onda di eccitazione di 635 nm, un tempo di esposizione di 10 ms e rilevare l'emissione a circa 700 nm. In questa prima acquisizione, non applicare alcun impulso: questa acquisizione verrà utilizzata per correggere le acquisizioni successive per il fotosbiancamento del colorante. Dopo questa acquisizione, attendere 2 minuti.
NOTA: Questo esperimento utilizza 27,8 fotogrammi/s, ovvero un periodo di 36 ms, che è il tempo dall'inizio della prima acquisizione dell'immagine all'inizio della successiva acquisizione dell'immagine nella registrazione time-lapse).
- Acquisisci 80 immagini in modalità time-lapse, con almeno 25 fotogrammi/s per risolvere l'andamento in tempo reale del potenziale d'azione. La durata totale dell'acquisizione dell'immagine risulta in circa 3 s. Durante l'acquisizione dell'immagine, illuminare le celle con una lunghezza d'onda di eccitazione di 635 nm, un tempo di esposizione di 10 ms e rilevare l'emissione a circa 700 nm. In questa prima acquisizione, non applicare alcun impulso: questa acquisizione verrà utilizzata per correggere le acquisizioni successive per il fotosbiancamento del colorante. Dopo questa acquisizione, attendere 2 minuti.
- Ogni 2 minuti, registrare un time-lapse come al punto 3.5. Per queste acquisizioni, applicare un singolo impulso di 100 μs al momento dell'acquisizione della decima immagine (a 324 ms). Acquisire immagini con le seguenti tensioni di impulso: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V e 200 V. Stimare il campo elettrico a cui sono esposte le celle come il rapporto tensione-distanza elettrodo applicato (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 e 400 V/cm).
NOTA: A campi elettrici più bassi, gli impulsi attiveranno potenziali d'azione; A campi elettrici più elevati, innescheranno l'elettroporazione, che si manifesta come una depolarizzazione prolungata. La durata dell'esperimento su ciascun campione di cellule è di circa 40 minuti (20 minuti per la marcatura e 20 minuti per la microscopia).
4. Analisi dei dati
- Esporta le registrazioni time-lapse in formato tiff.
- Inserire le registrazioni time-lapse di tutte le tensioni applicate durante un singolo esperimento (un campione di celle) in un'unica cartella. Rinominare le registrazioni time-lapse in modo tale che il campo elettrico E possa essere riconosciuto dall'applicazione MATLAB: Vcm (ad esempio, 126Vcm per 126 V/cm). Le parti rimanenti del nome possono essere arbitrarie. Per l'acquisizione all'inizio dell'esperimento in cui non viene applicato alcun impulso, rinominare utilizzando la frase 000Vcm. Un esempio dei nomi delle registrazioni time-lapse: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, ecc.
- Apri l'applicazione, che può essere scaricata da
https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Fare clic su Seleziona cartella dati per scegliere la cartella contenente le registrazioni time-lapse di un esperimento. - Selezionare i pixel da utilizzare per un'ulteriore analisi dei dati. A tale scopo, utilizzare due cursori per determinare la soglia bassa per un'immagine chiara delle membrane (in viola) e la soglia alta per l'eliminazione dei detriti (grandi macchie con elevata fluorescenza) dall'analisi (in verde).
- Seleziona Analizza dati. Nella scheda Analisi viene visualizzata una tabella con i parametri estratti. Sul lato destro della tabella, per ogni E utilizzato compaiono i grafici della fluorescenza relativa nel tempo. Seleziona i grafici per una data E dal menu a discesa sul lato sinistro sopra la tabella.
- Esamina tutti i grafici ed esegui la correzione manuale in caso di rilevamento di falsi picchi. Selezionare Cancella picchi AUTO nella parte inferiore della scheda Analisi per cancellare i picchi rilevati automaticamente. Fare clic sul grafico per determinare manualmente un nuovo punto dell'ora di picco.
- Selezionare Riesegui rilevamento picchi AUTO nella parte inferiore della scheda Analisi per eseguire nuovamente il rilevamento automatico dei picchi. I parametri estratti verranno ora regolati in base al nuovo picco.
- Seleziona Esporta dati in basso a destra nella scheda Analisi per esportare i dati nella stessa cartella sotto forma di file .mat, file di foglio di calcolo e immagini PNG per ogni E utilizzato.
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Risultati
Con questo protocollo è possibile monitorare otticamente i cambiamenti di TMV nelle cellule eccitabili in vitro innescati da impulsi elettrici e analizzare i segnali di fluorescenza per estrarne i parametri rilevanti.
La configurazione sperimentale è mostrata nella Figura 1A. Un segnale tipico di impulso elettrico di 100 μs utilizzato negli esperimenti è mostrato nella Figura 1B. Le cellule nelle camere poste al microscopio a...
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Discussione
Le cellule S-HEK sono un modello cellulare semplice eccitabile con canali del sodio e del potassio ben definiti, NaV1.5 e Kir2.19. Questo ci permette di eseguire studi approfonditi su come le cellule eccitabili rispondono agli impulsi elettrici applicati e di collegare i dati sperimentali con modelli matematici basati sulle ben note caratteristiche teoriche dei canali espressi nelle celle S-HEK. Nel nostro precedente studio8...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia slovena per la ricerca e l'innovazione (ARIS) nell'ambito del programma di ricerca P2-0249, del programma infrastrutturale I0-0022 e del progetto di ricerca J2-2503. Il lavoro è stato in parte sostenuto dall'ARIS e dall'Università di Lubiana attraverso il finanziamento di programmi di ricerca per start-up. Il lavoro è stato in parte sostenuto dall'Unione Europea e da ARIS attraverso i finanziamenti NextGenerationEU e NOO nell'ambito del progetto MN-0023. Il lavoro è stato in parte sostenuto dall'Unione Europea attraverso l'ERC Starting Grant (n. 101115323 - REINCARNATION) e la borsa di studio Marie Skłodowska-Curie (n. 893077 - EPmIC). I punti di vista e le opinioni espressi sono, tuttavia, solo quelli dell'autore o degli autori e non riflettono necessariamente quelli dell'Unione Europea o del Consiglio Europeo della Ricerca. Né l'Unione europea né l'autorità che concede l'aiuto possono essere ritenuti responsabili per tali questioni. Gli autori ringraziano il gruppo composto da Adam E. Cohen dell'Università di Harvard per aver gentilmente fornito le cellule HEK tet-on spiking e Duša Hodžić per il suo aiuto nel laboratorio di coltura cellulare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta da 1,5 mL | Ratiolab | 5615000 | |
| pozzetti Nunc Lab-Tek II Camerato #1.5 Sistema tedesco di vetro di copertura | Thermo Fisher Scientific | ||
| ADP305 Sonda di tensione differenziale | Teledyne LeCroy | ||
| AP015 Sonda di corrente | Teledyne LeCroy | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Incubatore a CO2 | PHCbi | MCO -230AICUV | |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich/Merck | D9891 | |
| Dulbecco' s Aquila Modidata' s Medium high glucose growth medium | Sigma-Aldrich/Merck | D5671 | |
| ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)sonde | potenziometriche | 31795 | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich/Merck | F2442 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Glutammine | Sigma-Aldrich/Merck | G7513 | |
| Cappa a flusso laminare | Iskra Pio | MC 15-2 | |
| MATLAB | Mathworks | ||
| Penicillina– streptomicina | Sigma-Aldrich/Merck | P07681 | |
| Po-L-lisina bromidrato | Sigma-Aldrich/Merck | P9155-5MG | |
| Generatore di impulsi | Su | vedi riferimento11 | |
| Puromicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| T25 25cm² Pallone per coltura tissutale | TPP | 90026 | |
| Cellule HEK Tet-on spiking | Type Culture Collection ATCC | CRL-3479 | |
| Thunder Imager Sistema di cellule vive per microscopia a fluorescenza | Leica Microsystems | ||
| Soluzione tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich/Merck | T3924 | |
| WavePro 7300A Oscilloscopio | Teledyne LeCroy |
Riferimenti
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- McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
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Ristampe e permessi
