Articolo metodologico

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

DOI:

10.3791/67258

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18 ottobre 2024

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1Citryll B.V.

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I neutrofili svolgono un ruolo importante nella difesa immunitaria innata utilizzando diverse strategie, tra cui il rilascio di trappole extracellulari dei neutrofili (NET) in un processo denominato NETosi. Tuttavia, negli ultimi due decenni, è diventato chiaro che l'accumulo di NET nei tessuti contribuisce alla fisiopatologia di molteplici malattie infiammatorie e autoimmuni. Pertanto, l'interesse per lo sviluppo di antagonisti di NETosis è aumentato. In concomitanza sono stati sviluppati metodi variabili e non standardizzati per rilevare e analizzare la NETosis, ciascuno con i propri vantaggi e limiti. Qui, descriviamo un metodo di microscopia in tempo reale per la quantificazione del rilascio umano di NET, che consente di studiare la NETosi e l'inibizione di NET in modo ad alto rendimento. L'analisi semi-automatizzata basata sull'area superficiale riconosce i NET e li distingue dai neutrofili attivati senza netting. Dimostriamo che gli induttori non fisiologici della NETosi, lo ionoforo di calcio e il forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA), innescano il rilascio di NET con caratteristiche e cinetiche diverse. Inoltre, dimostriamo che questo approccio consente di studiare il rilascio di NET in risposta a stimoli rilevanti per la malattia, inclusi i complessi immunitari, N-Formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLF), cristalli di urato monosodico e cristalli di pirofosfato di calcio. Per esemplificare l'utilità di questo metodo per studiare gli antagonisti della NETosi, abbiamo utilizzato CIT-013, un inibitore di anticorpi monoclonali di prima classe del rilascio di NET. CIT-013 ha come bersaglio gli istoni citrullinati H2A e H4 e inibisce efficacemente il rilascio di NET con un IC50 di 4,6 nM. Altri anticorpi anti-istone testati mancavano di questa capacità inibitoria della NETosi. Nel complesso, dimostriamo che questo protocollo consente una quantificazione specifica, affidabile e riproducibile ad alto rendimento dei NET, migliorando lo studio delle caratteristiche di rilascio dei NET, della cinetica e della farmacologia degli antagonisti della NETosis.

Introduzione

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I neutrofili sono abbondantemente presenti nel sangue e migrano nei tessuti in seguito a infezione o infiammazione. Svolgono un ruolo importante nella difesa immunitaria innata utilizzando ampie armi per proteggere l'ospite dai microbi. I neutrofili uccidono i patogeni attraverso la fagocitosi, la degranulazione, la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il rilascio di cromatina decondensata dechiamata trappole extracellulari dei neutrofili (NET) mediante un processo chiamato NETosis1. I NET sono strutture extracellulari di cromatina decorate, tra l'altro, con proteine granulari e calprotectina 2,3, e vengono rilasciati dopo stimolazione con un ampio spettro di molecole4. La NETosi può essere ampiamente classificata in due vie principali: NADPH ossidasi dipendente o indipendente 5,6,7. Inoltre, la citrullinazione dell'arginina delle code istoniche N-terminali da parte della peptidil arginina deiminasi 4 (PAD4) è stata strettamente collegata alla NETosi e promuove la decondensazione della cromatina che alla fine porta all'espulsione della cromatina decondensata nell'ambiente extracellulare.

Sebbene il rilascio di NET sia coinvolto nell'eliminazione dei patogeni, numerosi studi hanno dimostrato che il rilascio anomalo e prolungato di NET è legato allo sviluppo di vari disturbi infiammatori, tra cui il danno polmonare acuto8, l'artrite reumatoide (RA)9, la vasculite10 e l'idrosadenite suppurativa11. Il ruolo dannoso dei NET nella malattia è multiforme poiché i NET sono proinfiammatori, sono una fonte di autoantigeni, sono citotossici per i tessuti circostanti, innescano l'immunotrombosi e promuovono la differenziazione degli osteoclasti e l'erosione ossea 9,12,13. L'inibizione farmacologica della via della NETosis da parte di inibitori di PAD4 a piccole molecole dimostra che le terapie mirate alla NETosi hanno un potenziale come trattamento per malattie in cui l'accumulo di NET è un importante fattore di patogenesi14. Invece di colpire l'enzima PAD4, abbiamo utilizzato un anticorpo monoclonale anti-istone umanizzato anti-citrullinato umanizzato NETosis, CIT-013, che si lega specificamente agli istoni citrullinati H2A e H415. CIT-013 ha un duplice meccanismo d'azione unico, inibendo il rilascio di NET e migliorando la fagocitosi NET mediata dai macrofagi16. CIT-013 e le molecole precursori hanno dimostrato efficacia terapeutica in diversi modelli murini di infiammazione associata a NET17.

Per studiare il rilascio di NET, nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi metodi, quali, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, 1) la rilevazione del DNA utilizzando un tracciante di DNA impermeabile alla membrana plasmatica in combinazione con un lettore di piastre immunofluorescente, 2) la rilevazione basata su saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) di DNA e DNA complessato con proteine specifiche di NET nei surnatanti, 3) co-localizzazione di molecole associate a NET con DNA extracellulare tramite immunoistochimica, e 4) approcci di citometria a flusso per rilevare i neutrofili di rete. Tutti questi metodi hanno i loro vantaggi e limiti. Abbiamo sviluppato un approccio ad alto rendimento in tempo reale per la quantificazione microscopica del rilascio di NET umano, che utilizza un colorante di DNA impermeabile alla membrana plasmatica16,18. Il metodo descritto consente di studiare la cinetica e le caratteristiche della NETosi in modo semplice, affidabile e riproducibile e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti della NETosi come CIT-013.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i donatori di sangue hanno dato il consenso informato in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e lo studio è stato condotto secondo le linee guida etiche Citryll per la ricerca umana.

NOTA: Tutte le attività con sangue umano e neutrofili isolati devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Quando le impostazioni del freno e dell'accelerazione per la centrifugazione non sono menzionate nel protocollo, possono essere considerate al massimo.

1. Isolamento dei neutrofili dal sangue

  1. Raccogliere il sangue periferico da volontari sani in provette di litio-eparina e trasferire il sangue in una provetta fresca da 50 ml.
  2. Sciacquare le provette di litio-eparina con 1x DPBS e trasferirle nella stessa provetta da 50 ml in cui è stato trasferito il sangue. Assicurarsi che il rapporto finale sangue/DPBS sia 1:1. Mescolare sangue e DPBS mediante pipettaggio per ottenere una soluzione omogenea.
  3. Aggiungere 13 mL di soluzione a gradiente di densità a un'altra provetta fresca da 50 mL e aggiungere lentamente (con una pipetta da 25 mL) il sangue diluito 1:1 sopra la soluzione a gradiente di densità fino a un massimo di 50 mL.
  4. Centrifugare a 400 x g e temperatura ambiente (RT) per 40 min con accelerazione e freno minimi.
    NOTA: Si formano strati. Gli strati dall'alto verso il basso sono i seguenti: 1. plasma; 2. cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC); 3. soluzione di gradiente di densità; 4. eritrociti/neutrofili.
  5. Per prima cosa, scartare il plasma con una pipetta da 10 ml e poi scartare il più possibile le PBMC e lo strato di soluzione a gradiente di densità con una pipetta di plastica Pasteur senza disturbare lo strato di eritrociti/neutrofili.
  6. Risospendere delicatamente lo strato eritrocitario/neutrofilo agitando e risospendere con una pipetta da 25 mL in 15 mL di 1x DPBS.
  7. Aggiungere 25 mL di soluzione di Destrano al 6% e NaCl allo 0,9%, mescolare capovolgendo la provetta dieci volte e posizionare la provetta in posizione verticale per 25 minuti a RT.
    NOTA: Si formano strati. Gli strati dall'alto verso il basso sono i seguenti: 1. Neutrofili; 2 eritrociti.
  8. Trasferire lo strato di neutrofili in una provetta fresca da 50 mL con una pipetta da 10 mL e centrifugare per 10 minuti a 500 x g e RT.
    NOTA: Fare attenzione poiché il pellet di neutrofili contiene ancora alcuni eritrociti e non è saldamente attaccato al tubo.
  9. Eliminare il surnatante travasando e risospendere il pellet cellulare con una pipetta da 10 mL in 10 mL di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 e 0,1 mM Na2EDTA; pH = 7,2) e quindi aggiungere immediatamente 40 mL di tampone di lisi ACK.
  10. Incubare a RT capovolgendo continuamente la provetta fino a quando la soluzione diventa traslucida (questo richiede da 1 a 5 minuti e può variare per ogni donatore) e centrifugare per 10 minuti a 350 x g e RT.
  11. Rimuovere il surnatante e aggiungere lentamente e goccia a goccia 5 ml di terreno di coltura contenente L-glutammina integrata con il 10% (v/v) di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina (di seguito denominato terreno di coltura 10%) sopra il pellet di neutrofili senza portare i neutrofili in sospensione. Questo rimuoverà efficacemente la maggior parte degli eritrociti dal pellet di neutrofili.
  12. Agitare delicatamente la provetta da 50 mL fino a quando la maggior parte degli eritrociti, presenti sopra il pellet di neutrofili, sono risospesi nel terreno di coltura al 10%. Successivamente, rimuovere il surnatante travasando il tubo.
  13. Risospendere il pellet di neutrofili in 10 mL di terreno di coltura al 10% e, una volta completamente risospeso, aggiungere fino a 50 mL di terreno di coltura al 10%. Centrifugare per 10 min a 350 x g e RT.
  14. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura al 10%.

2. Colorazione dei neutrofili per verificare la purezza mediante citometria a flusso

  1. Per determinare la concentrazione cellulare, diluire la sospensione di neutrofili in una soluzione di blu di tripano allo 0,4% (rapporto 1:1) e contare i neutrofili con un contatore di cellule in campo chiaro.
    NOTA: È possibile utilizzare anche altri metodi di conteggio.
  2. Trasferire 1 x 105 neutrofili in terreno di coltura al 10% nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti con fondo a V e centrifugare per 3 minuti a 400 x g e RT.
  3. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 50 μL di 1x DPBS integrato con albumina sierica bovina (BSA) all'1% (p/v) e NaN3 allo 0,1% (v/v) (di seguito denominato tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)) contenente blocco del recettore Fc (diluito 50x).
  4. Incubare per 15 minuti a RT e aggiungere 50 μl di tampone FACS contenente 50 anticorpi CD45 di topo coniugati APC-Cy7 diluiti, 600 volte l'anticorpo CD16 di topo coniugato PerCP-Cy5.5 diluito, 133 volte l'anticorpo CD66b di topo coniugato con FITC diluito e 500 volte il colorante di vitalità fissabile diluito eFluor 506.
    NOTA: CD45 è espresso sui leucociti. Il CD66b è espresso esclusivamente nei granulociti. CD16 è altamente espresso nei neutrofili, scarsamente espresso negli eosinofili e non espresso nei basofili.
  5. Incubare per 30 minuti a RT al buio e centrifugare per 3 minuti a 400 x g e RT.
  6. Scartare il surnatante, risospendere i neutrofili in 175 μL di tampone FACS e centrifugare per 3 minuti a 400 x g e RT. Ripetere questo passaggio una volta.
  7. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di neutrofili in 175 μL di tampone FACS. Analizza i campioni utilizzando un sistema di citometria a flusso e il software associato.

3. Analisi della purezza dei neutrofili mediante software di analisi della citometria a flusso

NOTA: L'analisi dei dati della citometria a flusso è stata eseguita utilizzando il software di analisi della citometria a flusso come indicato nella Tabella dei materiali.

  1. Eseguire il gating secondo la seguente procedura passo-passo.
    1. Imposta un intervallo di tempo nel grafico FSC-A rispetto al tempo per selezionare un'area con un flusso di celle corretto.
    2. Imposta un gate di cella nel grafico SSC-A rispetto a FSC-A per selezionare le celle ed escludere i detriti.
    3. Imposta un gate di cella vitale nel grafico FSC-A vs. AmCyan-A per selezionare le celle vitali.
    4. Imposta un gate leucocitario nel grafico FSC-A vs. APC-Cy7 per selezionare le cellule CD45+.
    5. Impostare un gate dei neutrofili nel grafico FITC rispetto a PerCP-Cy5.5 per distinguere tra CD66b+CD16+ (neutrofili), CD66b-CD16+ (eosinofili) e CD66b-CD16- (basofili, monociti e linfociti).
    6. Imposta un singolo gate di cella nel grafico FSC-H vs. FSC-A per selezionare singoli neutrofili.
    7. Determinare la purezza dei neutrofili presentando i singoli neutrofili come frequenza delle cellule (nel cancello cellulare).
      NOTA: Per procedere, la purezza dei neutrofili deve superare l'85%.

4. Microscopia con imaging dal vivo

NOTA: Questo test è ottimizzato per più piastre di imaging a 96 pozzetti e vari stimoli e antagonisti NETosis. Il protocollo seguente descrive una visione generale dell'approccio, che può essere specificata utilizzando le tabelle incluse.

  1. Preparare una soluzione di poli-L-lisina allo 0,001% diluendo la poli-L-lisina allo 0,01% in H2O sterile con un rapporto di 1:10.
  2. Aggiungere una soluzione di poli-L-lisina allo 0,001% in ciascun pozzetto e incubare almeno 1 ora a 37 °C.
    NOTA: Il volume per pozzetto dipende dalla piastra di imaging a 96 pozzetti (Tabella 1).
  3. Lavare i pozzetti 3 volte con 200 μL di DPBS per rimuovere l'eccesso di poli-L-lisina. Eseguire tutti i passaggi nella cabina a flusso laminare. Rimuovere il coperchio della piastra e asciugare i pozzetti all'aria aprendo la piastra nella camera a flusso laminare fino a quando non si asciuga (circa 1 ora).
  4. Calcolare il numero di neutrofili necessari per l'esperimento e trasferire un surplus in una provetta da 15 mL. Centrifugare per 10 min a 350 x g e RT.
    NOTA: La quantità di neutrofili in ciascun pozzetto varia in base al tipo di piastra di imaging a 96 pozzetti (Tabella 1). La densità cellulare è ottimizzata per consentire una buona separazione delle singole cellule, necessaria per un'analisi corretta. Se la densità dei neutrofili è troppo alta, le cellule e i NET si sovrapporranno alle cellule adiacenti e ai NET, il che influisce sulla qualità dell'analisi.
  5. Scartare il surnatante e risospendere i neutrofili in un terreno di coltura senza rosso fenolo integrato con FBS al 2% (v/v), penicillina 50 U/mL e streptomicina 50 μg/mL, HEPES 10 mM e CaCl2 1 mM (di seguito denominato tampone per il saggio NET).
  6. Prepara le seguenti soluzioni di lavoro.
    1. Preparare il colorante DNA da 80 nM nel tampone di saggio NET.
    2. Preparare gli stimoli NETosis nel tampone del saggio NET.
    3. Preparare gli antagonisti di NETosis nel tampone di saggio NET.
      NOTA: Tenere presente che le concentrazioni delle soluzioni di lavoro sopra descritte sono 4 volte la concentrazione finale necessaria nel pozzo. Le concentrazioni raccomandate degli stimoli e degli antagonisti della NETosis variano (Tabella 2 e Tabella 3).
  7. Aggiungere 4 volte il colorante di DNA concentrato nel tampone del saggio NET a ciascun pozzetto.
  8. Aggiungere 4 stimoli NETosis concentrati nel tampone del saggio NET ai pozzetti corrispondenti e aggiungere il tampone del saggio NET solo ai pozzetti senza stimolo o ai pozzetti contenenti immunocomplessi rivestiti (cIC; protocollo nella tabella 2).
  9. Aggiungere 4 antagonisti NETosis concentrati nel tampone di saggio NET ai pozzetti corrispondenti. Aggiungere il tampone di saggio NET solo ai pozzetti senza antagonista.
  10. Aggiungere la sospensione di neutrofili a ciascun pozzetto.
    NOTA: Il volume di 4 volte il colorante di DNA concentrato, 4 volte gli stimoli NETosis concentrati nel tampone del saggio NET, 4 volte l'antagonista della NETosi concentrato nel tampone del saggio NET, il numero di neutrofili e il volume della sospensione di neutrofili per pozzetto dipendono dalla piastra di imaging a 96 pozzetti (Tabella 1). Evitare la formazione di bolle durante il pipettaggio.
  11. Centrifugare la piastra per 2 minuti a 100 x g e RT e inserire la piastra di imaging a 96 pozzetti nel sistema di analisi al microscopio su cellule vive posto in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
    NOTA: La condensa può svilupparsi sul fondo della piastra di imaging a 96 pozzetti durante il primo minuto di incubazione. Questo dovrebbe essere rimosso con un fazzoletto.

5. Impostazione del software del sistema di analisi al microscopio su cellule vive per l'acquisizione

NOTA: Le immagini a contrasto di fase e immunofluorescenza sono state acquisite da un sistema di analisi al microscopio su cellule vive controllato dal suo software di analisi.

  1. Aprire il software del sistema di analisi al microscopio su cellule vive e fare clic su Connetti al dispositivo. Inserisci nome utente e password. Fai clic su Pianifica acquisizione e fai clic sul pulsante più (Avvia aggiungi imbarcazione). Successivamente, selezionare Scansione su pianificazione e fare clic su Avanti.
  2. Per creare un nuovo recipiente da zero, selezionare Nuovo nella sezione Crea recipiente e fare clic su Avanti. Selezionare Standard nella sezione Tipo di scansione e fare clic su Avanti.
  3. Selezionare le seguenti impostazioni di scansione e fare clic su Avanti: Cella per cella: Nessuna; Canali immagine: Contrasto di fase e Verde (tempo di acquisizione 100 ms); Obiettivo: 20x.
  4. Selezionare il tipo di imbarcazione appropriato da scansionare nella sezione Selezione imbarcazione e fare clic su Avanti.
    1. Se si utilizza una piastra #1 a 96 pozzetti, selezionare Corning, piastra, 96, N/A, 3603, Corning a 96 pozzetti (Blk/Wht), Micropiastre.
    2. Se si utilizza una piastra #2 a 96 pozzetti, selezionare Nunc, Piastra, 96, N/A, 152028, 96 pozzetti Nunc opt bottom (Blk/Wht), Micropiastre.
  5. Specificare la posizione del recipiente nel cassetto e fare clic su Avanti. Nella sezione Scan Pattern (Pattern di scansione ), selezionare i pozzetti che devono essere scansionati, selezionare il numero di immagini per pozzetto (scansionare 4 immagini per pozzetto per ottenere una panoramica rappresentativa) e fare clic su Next (Avanti).
    NOTA: Non selezionare pozzetti vuoti perché ciò influirà sulla messa a fuoco automatica.
  6. Fornisci informazioni sull'imbarcazione inserendo, tra l'altro, il nome della targa nella sezione del taccuino dell'imbarcazione e fai clic su Avanti. Selezionate Posticipa analisi a un momento successivo nella sezione Impostazione analisi (Analysis Setup ) e fate clic su Avanti (Next).
  7. Definire il programma di scansione per l'imbarcazione nella sezione Pianificazione scansione . Selezionare Crea nuova pianificazione con scansioni a intervalli di e selezionare 1 ora. Selezionare Interrompi scansione e 00:05 ore dopo la prima scansione. Fare clic su Avanti, quindi su Aggiungi a pianificazione quando le informazioni di scansione sono corrette.
    1. Quando è necessario modificare il programma di scansione, fare doppio clic su Pianificazione scansione nella parte superiore dello schermo. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Pianificazione scansione e modificare e regolare come desiderato. Fare clic sull'icona Disco floppy per salvare la pianificazione della scansione.
      NOTA: Quando si esegue l'imaging di più recipienti (piastre) nello stesso esperimento, è possibile aggiungere altri recipienti alla pianificazione di scansione esistente facendo clic sul pulsante più (Avvia aggiungi recipiente), selezionando Scansione su pianificazione e facendo clic su Avanti. Creare un nuovo recipiente da zero (vedere il passaggio 5.2 di questo protocollo), copiare un recipiente esistente o utilizzare un recipiente scansionato in precedenza. Ciò si traduce in una scansione sequenziale alla stessa frequenza e alle stesse impostazioni della lastra precedente.

6. Analisi del saggio NET al microscopio con imaging dal vivo utilizzando il software di analisi al microscopio su cellule vive

NOTA: Il software di analisi al microscopio su cellule vive è stato utilizzato per analizzare le immagini a contrasto di fase e in immunofluorescenza (Tabella dei materiali). Quando non si utilizza questo sistema, è possibile eseguire un'analisi NET simile utilizzando un pacchetto software di dominio pubblico 4,18,19,20.

  1. Aprire il software di analisi al microscopio su cellule vive e fare clic su Connetti al dispositivo. Inserisci nome utente e password e fai clic su Visualizza scansioni recenti. Aprire l'esperimento scelto per l'analisi facendo doppio clic sul nome del recipiente dell'esperimento.
  2. Fare clic su Avvia analisi e selezionare Crea nuova definizione di analisi. Fare clic su Avanti.
  3. Selezionare Analizzatore di base dalla sezione del tipo di analisi e fare clic su Avanti. Nella sezione Canale immagine , selezionare Verde, deselezionare Fase e fare clic su Avanti.
  4. Aprire la finestra Livelli immagine e selezionare Verde e deselezionare Fase. Disattivare la scalabilità automatica nella sezione Verde e impostare manualmente min e max per il canale verde per distinguere le NET dallo sfondo.
    NOTA: Il contrasto di fase può essere attivato e disattivato quando necessario. Ad esempio, per determinare se i NET vengono espulsi nell'ambiente extracellulare.
  5. Aprire la finestra Tempi di scansione dell'imbarcazione e selezionare l'ora di scansione dell'imbarcazione appropriata in cui devono essere presenti i NET. Selezionare un set di immagini che rappresentino la variabilità all'interno dell'esperimento (immagini da pozzetti di controllo positivo con NET e immagini da pozzetti di controllo negativo senza NET). Queste immagini verranno utilizzate per visualizzare in anteprima e perfezionare l'analisi. Fare clic su Avanti.
  6. Aprire la finestra Impostazioni definizione analisi e iniziare a regolare le impostazioni di analisi per il canale verde in modo che le strutture NET vengano delineate senza creare NET falsi positivi o falsi negativi. Utilizzare le seguenti impostazioni e fare clic su Anteprima corrente o Anteprima tutto per applicare le impostazioni rispettivamente all'immagine corrente o a tutte le immagini.
    1. Per Nome oggetto, selezionare NET.
    2. Per la segmentazione, selezionare Nessuna sottrazione di sfondo - Adattivo.
    3. Per la soglia GCU, seleziona un valore compreso tra 3 e 5 (a seconda dell'esperimento).
    4. Per la divisione del bordo, selezionare ON (tra -10 e 0).
    5. Per la pulizia, selezionare Riempimento foro: 100 μm2 e Regola dimensioni: -1 pixel.
    6. Per i filtri, selezionare a seconda dell'esperimento, ma i valori di cut-off consigliati sono: Area: >200 μm2, Intensità media: <24,6, Intensità integrata: >7000.
      NOTA: Le strutture selezionate in base alle impostazioni utilizzate sono evidenziate con il magenta. Passando il mouse su queste strutture si otterranno ulteriori informazioni sui parametri degli oggetti (ad esempio, area, eccentricità, intensità integrata e intensità media), il che aiuta a ottimizzare l'analisi relativa ai criteri di inclusione o esclusione per i parametri NET. Controllare più immagini (da pozzetti di controllo positivi e negativi) per verificare se le impostazioni di analisi sono corrette.
  7. Quando le impostazioni per l'analisi NET sono corrette, fare clic su Avanti. Selezionare i punti temporali e i pozzetti da analizzare nella sezione Tempi e pozzetti di scansione e fare clic su Avanti. Inserire il nome della definizione nella sezione Salva e applica definizione analisi e fare clic su Avanti. Fare clic su Fine quando le informazioni dell'analisi sono verificate e corrette.
    NOTA: Quando si analizzano più piastre o si utilizzano analisi di esperimenti precedenti, avviare l'analisi e selezionare Copia definizione di analisi esistente o Usa definizione di analisi esistente e fare clic su Avanti. Selezionate la definizione di analisi esistente appropriata e fate clic su Avanti (Next). Per la procedura di analisi successiva, andare al passaggio 6.4 se è stata scelta l'opzione Copia definizione analisi esistente o al passaggio 6.7 se è stata selezionata l'opzione Usa definizione analisi esistente .
  8. Aprire l'analisi dell'esperimento facendo clic sull'analisi all'interno dell'imbarcazione di interesse. Apri la finestra Metriche grafico .
  9. Fai clic sul pulsante più (Crea metrica). I dati possono essere presentati come percentuale di confluenza NET (la percentuale dell'area dell'immagine contrassegnata come NET) o percentuale di neutrofili netting (numero di NET diviso per il numero di cellule).
    1. Quando si presentano i dati come percentuale di confluenza netta, selezionare Area nella sezione Metrica e selezionare Confluenza nella sezione Valore . Quando si presentano i dati come neutrofili con compensazione percentuale, selezionare Conteggio oggetti nella sezione Metrica e selezionare Per immagine nella sezione Valore .
    2. Fare clic su OK. Selezionare NETs Area Confluence (%) o NETs Object Count Per Image (Per Image) nella sezione User Defined Metrics (Metriche definite dall'utente ). Selezionare tutti i punti temporali che devono essere analizzati nella sezione Seleziona scansioni . Selezionare tutti i pozzetti che devono essere analizzati nella sezione Seleziona pozzetti e fare clic su Esporta dati.
  10. Selezionare le seguenti impostazioni nella sezione Esportazione grafica .
    1. Seleziona Mostra ogni scansione come una tabella a sé stante (colonne: 1, 2... righe: A, B...).
    2. Seleziona Mostra etichette di righe e colonne.
    3. Selezionare Tutte le scansioni in un file e fare clic su Sfoglia per regolare la posizione e il nome del file.
    4. Seleziona Includi i dettagli dell'esperimento nell'intestazione.
    5. Seleziona Suddividi i dati in singole immagini.
  11. Fare clic su Esporta per esportare i dati come file ".txt", che può essere importato e ulteriormente analizzato in un foglio di calcolo.
    NOTA: Per determinare la percentuale di neutrofili netting, è necessario determinare il numero di neutrofili a t = 0. A tale scopo, continuare con i passaggi seguenti del protocollo.
  12. Vai al passaggio 6.1 per iniziare l'analisi aggiuntiva necessaria per contare il numero di neutrofili per le immagini a t = 0.
    1. Nel passaggio 6.3, selezionare Fase e deselezionare Verde nella sezione del canale dell'immagine.
    2. Al passaggio 6.4, selezionare t = 0 nella sezione dei tempi di scansione dell'imbarcazione.
    3. Al punto 6.5, deselezionare Verde, selezionare Fase e regolare le impostazioni del canale di fase quando necessario.
    4. Nel passaggio 6.6, aggiungere il nome dell'oggetto, selezionare Confluenza classica nella sezione Segmentazione e impostare la regolazione della segmentazione su 0 (sfondo), regolare Riempimento foro su 100 μm2 e regolare l'area su 50 μm2.
    5. Nel passaggio 6.7, selezionare t = 0 nella sezione di selezione delle scansioni.
    6. Nel passaggio 6.8, aprire l'analisi della conta dei neutrofili.
    7. Nel passaggio 6.9, seleziona Conteggio oggetti per immagine (per immagine) nella sezione Metriche definite dall'utente .
    8. Infine, utilizzare il seguente calcolo per generare la percentuale di neutrofili di netting: (numero di NET / numero di neutrofili a t = 0) x 100%.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia ad alto rendimento in tempo reale, in combinazione con un colorante di DNA impermeabile, consente di studiare la cinetica, le caratteristiche e le vie sottostanti della NETosi e consente la valutazione di potenziali inibitori del rilascio di NET. Con questo approccio, i NET sono stati definiti come strutture positive per il colorante di DNA con una superficie significativamente più ampia rispetto alla superficie dei neutrofili sani (Figura 1A), indicando che la cromatina è stata espulsa nell'ambiente extracellulare18. L'analisi basata sull'area superficiale ci ha permesso di distinguere tra NET e neutrofili attivati con integrità della membrana plasmatica compromessa, mostrando una brillante colorazione del DNA intracellulare (Figura 1A).

Lo ionoforo di calcio (A23187) e la PMA sono comunemente usati per indurre la NETosi in vitro. Nonostante siano stimoli non fisiologici, sono preziosi perché attivano percorsi distinti di NETosi e garantiscono un'induzione coerente di NETosi con bassa variabilità tra i donatori. A23187 innesca l'afflusso di calcio, portando all'attivazione di PAD4 e al rilascio di NET ricchi di istoni citrullinati, mentre il PMA attiva il complesso NADPH ossidasi, con conseguente produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il successivo rilascio di NET con bassi livelli di istoni citrullinati 5,16,21. La velocità e l'entità della risposta alla NETosi dipendono dalla concentrazione di ciascuno stimolo (Figura 1B, C), con A23187 che induce NETosi più rapida e PMA che determina una percentuale più elevata di neutrofili che rilasciano NET (Figura 1D-F). I NET risultanti dalla stimolazione con A23187 (Figura 1D; freccia rossa) erano distinti dai NET indotti da PMA (Figura 1D; freccia gialla) per essere più diffusi oltre la membrana plasmatica dei neutrofili, mentre i NET indotti da PMA rimanevano più adiacenti alla membrana plasmatica dei neutrofili. Inoltre, la stimolazione di A23187 ha portato a neutrofili DNA positivi al colorante permeabile non-netting (Figura 1D; freccia blu), che non hanno espulso il loro DNA nello spazio extracellulare. La rilevazione di neutrofili permeabili non netting DNA dye-positive dipendeva dalla concentrazione di A23187 (Figura 1G) e quasi assente indipendentemente dalla concentrazione di PMA utilizzata per stimolare la NETosi (Figura 1D, H). Oltre a utilizzare gli stimoli non fisiologici della NETosi A23187 e PMA, questo test è adatto anche per studiare i fattori scatenanti della NETosi rilevanti per la malattia. Ad esempio, i neutrofili attivati con gli immunocomplessi solubili (sIC) o i cristalli presenti nella malattia da disposizione del pirofosfato di calcio (CPPD) hanno mostrato un rilascio di NET significativamente aumentato rispetto all'assenza di stimolo. Una tendenza verso livelli elevati di NET è stata osservata quando i neutrofili sono stati attivati con complessi immunitari rivestiti (cIC), fMLP e cristalli di urato monosodico (MSU) (Figura 1I); Tuttavia, per questi stimoli, abbiamo osservato una notevole variazione da donatore a donatore.

L'inibizione farmacologica della via della NETosis e degli enzimi associati alla NETosi ha dimostrato che le terapie mirate alla NETosi potrebbero essere trattamenti efficaci per le malattie in cui l'accumulo di NET guida significativamente la patologia 14,17,22,23,24. Questo test NET per microscopia in tempo reale è un approccio semplice, affidabile e riproducibile per studiare gli antagonisti della NETosi in modo ad alto rendimento. Per esemplificare ciò, abbiamo utilizzato un anticorpo monoclonale umanizzato di prima classe, CIT-013, che ha come bersaglio gli istoni citrullinati H2A e H4 con elevata affinità15,16. A23187 attiva la via NETosi, dando luogo a NET contenenti istoni citrullinati che vengono successivamente presi di mira da CIT-013 per svolgere la sua funzione inibitoria NETosis16. Infatti, il rilascio NET in risposta ad A23187 è stato completamente inibito da CIT-013 (Figura 2A e Video supplementare 1), con un IC50 di 4,6 nM (Figura 2B). La capacità inibitoria della NETosi di CIT-013 è unica poiché altri anticorpi commerciali che hanno come bersaglio diversi (non) istone citrullinati non sono stati in grado di inibire il rilascio di NET (Figura 2C).

In precedenza, abbiamo dimostrato che una molecola precursore altamente simile di CIT-013 (che differisce da due amminoacidi ma lega epitopi simili con uguale affinità) blocca la NETosi in risposta a stimoli fisiologici come le piastrine attivate, il liquido sinoviale della gotta e il liquido sinoviale dell'artrite reumatoide17. Qui, mostriamo che il rilascio di NET indotto da sIC può essere inibito da CIT-013 (Figura 2D). La rilevanza terapeutica dell'inibizione della NETosi indotta da questo stimolo è evidenziata dal LES, dall'artrite reumatoide e da altre malattie autoimmuni, in cui gli autoanticorpi nel siero o nel liquido sinoviale supportano la formazione di IC, che innesca la NETosi25,26.

Insieme, questi dati dimostrano che questo approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale è adatto per studiare la cinetica e le caratteristiche del rilascio di NET e consente lo studio degli inibitori di NETosi. Sebbene questo metodo sia stato ottimizzato per l'uso di neutrofili umani, con le modifiche potrebbe essere adatto anche per studiare neutrofili di altre specie. I dati generati con questo test sono una pietra miliare del razionale di CIT-013 come terapia potente ed efficace per le malattie guidate da NET.

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Figura 1: Microscopia ad alto rendimento in tempo reale per lo studio del rilascio di NET. I neutrofili isolati dal sangue di volontari sani sono stati stimolati con A23187 o PMA per innescare la via della NETosi. NET è stato visualizzato con la microscopia ad alto rendimento in tempo reale utilizzando un colorante di DNA impermeabile alla membrana plasmatica e quantificato in base all'area superficiale con il software del sistema di analisi al microscopio su cellule vive. (A) Analisi dell'area superficiale di neutrofili sani non stimolati (grigio), NET extracellulari e neutrofili permeabili non netting con colorazione intracellulare del DNA (verde). (B,C) Quantificazione del rilascio di NET nel tempo da neutrofili stimolati con le concentrazioni indicate di A23187 o PMA (n = 2). (D) Immagini rappresentative del rilascio di NET in risposta ad A23187 (frecce rosse) e PMA (frecce gialle) in diversi punti temporali. Esempi di neutrofili permeabili non netting sono indicati con frecce blu. (E) Quantificazione del rilascio di NET nel tempo presentata come percentuale della confluenza NET (n = 5). Le statistiche sono state eseguite su t = 240 min. (F) Quantificazione del rilascio di NET nel tempo presentata come percentuale di neutrofili di compensazione (n = 2). (G, H) Quantificazione dei neutrofili permeabili non netting nel tempo da neutrofili che sono stati stimolati con le concentrazioni indicate di A23187 o PMA (n = 2). (I) Quantificazione del rilascio di NET a t = 240 min indotto da immunocomplessi solubili (sIC), IC rivestiti (cIC), fMLP, cristalli di urato monosodico (MSU) e cristalli presenti nella malattia da disposizione del pirofosfato di calcio (CPPD) (n = 8-28). I risultati sono riportati come media ± errore standard della media. **P < 0,01 e ****P < 0,0001, ANOVA unidirezionale a misure ripetute con il test di confronto multiplo di Dunnett (B), test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn (I). I pannelli A-F sono stati modificati con il permesso di van der Linden et al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: CIT-013 inibisce il rilascio di NET. (A) Quantificazione del rilascio di NET indotto da A23187 a t = 240 min in assenza (No Ab) o presenza di CIT-013 o di anticorpi di controllo isotipo (cIgG). (B) Inibizione dose-dipendente del rilascio di NET indotto da A23187 con CIT-013 a t = 240 min (n = 3). I dati sono stati normalizzati a cIgG (impostato come versione NET al 100%). (C) Quantificazione del rilascio di NET indotto da A23187 a t = 240 min in presenza di concentrazioni indicate di CIT-013, anticorpo anti-istone H4, anticorpo anti-istone H3 #1 o anticorpo H3 anti-istone citrullinato #2 (n = 6). (D) Quantificazione del rilascio di NET a t = 240 min indotto da immunocomplessi solubili (IC) in presenza di CIT-013 o cIgG. I risultati sono riportati come media ± errore standard della media. P < 0,0001, ANOVA unidirezionale a misure ripetute con confronti multipli di Tukey (A) o test di rango con segni a coppie abbinate di Wilcoxon a due code (D). I pannelli A, B e D sono stati modificati con il permesso di van der Linden et al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

piastra a 96 pozzetti #1piastra a 96 pozzetti #2
Volume 0,001% di soluzione di poli-L-lisina per pozzetto50 μl100 μl
Volume di sospensione di neutrofili per pozzetto50 μl87,5 μl
Numero di neutrofili per pozzetto2 x 104 celle3,5 x 104 celle
Volume 4x colorante di DNA concentrato (= 80 nM) nel tampone di saggio NET per pozzetto50 μl87,5 μl
Volume 4 volte gli stimoli NETosis concentrati nel tampone del saggio NET per pozzetto50 μl87,5 μl
Volume 4x antagonisti NETosis concentrati in tampone di saggio NET per pozzetto50 μl87,5 μl

Tabella 1: Volumi e numeri di cellule ottimizzati per diverse piastre di imaging a 96 pozzetti.

Soluzione di lavoro di concentrazione (4x concentrato)Concentrazione finale
Ionoforo di calcio (A23187)50 μM12,5 μM
PMA16 nM4 nM
fMLP4 μM1 μM
Cristalli di urato monosodico (MSU)400 μg/mL100 μg/mL
Cristalli della malattia da disposizione del pirofosfato di calcio (CPPD)400 μg/mL100 μg/mL
Immunocomplessi solubili (sIC)1. Aggiungere 5 μg/mL di albumina sierica umana (HSA) in DPBS a 282,5 μg/mL di anticorpo policlonale di coniglio anti-HSA in DPBS.
2. Incubare per almeno 90 minuti a 37 °C.
3. Omogeneizzare mediante vortice e aggiungere 50 μl di soluzione sIC ai pozzetti corrispondenti.
Immunocomplessi rivestiti (cIC)1. Aggiungere 10 μg/mL di HSA in DPBS nei pozzetti corrispondenti della piastra a 96 pozzetti.
2. Incubare per una notte a 4 °C.
3. Lavare i pozzetti 3 volte con 200 μl di Tween-20 allo 0,05% in DPBS (di seguito PBS/0,05% Tween).
4. Ostruire i pozzetti con 200 μL di albumina sierica bovina all'1% (p/v) in PBS/0,05% Tween (di seguito denominato tampone bloccante).
5. Incubare per 120 minuti a temperatura ambiente e agitazione delicata (400 giri/min).
6. Lavare i pozzetti 3 volte con 200 μL di PBS/0,05% Tween.
7. Aggiungere 50 μL di anticorpo policlonale anti-HSA di coniglio nel tampone bloccante ai pozzetti corrispondenti.
8. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente e agitazione delicata (400 giri/min).
9. Lavare i pozzetti 3 volte con 200 μL di PBS/0,05% Tween.
10. Infine, lavare i pozzetti 3 volte con 200 μl di DPBS. I pozzetti sono ora pronti per la fase 4.7 del protocollo.

Tabella 2: Concentrazioni raccomandate per gli stimoli NETosis.

Soluzione di lavoro di concentrazione (4x concentrato)Concentrazione finale
Anticorpo lisozima dell'uovo di gallina (anticorpo di controllo; cIgG)80 nM20 nM
CIT-01380 nM20 nM

Tabella 3: Concentrazioni raccomandate per l'antagonista della NETosis.

Video supplementare 1. I neutrofili sono stati stimolati con A23187 in presenza di cIgG (a sinistra) o CIT-013 (a destra) e il rilascio di NET è stato visualizzato nel tempo utilizzando il colorante di DNA impermeabile alla membrana plasmatica. NET è inibito in presenza di CIT-013. Il film è una sovrapposizione di colorante DNA (verde) e contrasto di fase. Questo video è stato ottenuto con il permesso di van der Linden et al.16. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

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Dalla scoperta dei NET nel 2004, sono state sviluppate molte strategie per studiare sperimentalmente il rilascio di NET in vitro, con la microcopia in immunofluorescenza che è la tecnica più comune per quantificare la NETosi27,28. Sebbene la microscopia sia utile per visualizzare il rilascio di NET, presenta dei limiti poiché la quantificazione microscopica non automatizzata di immagini di punti temporali fissi è piuttosto imprecisa e può soffrire di distorsioni dell'osservatore. Un'altra tecnica utilizzata per studiare il rilascio di NET è la citometria a flusso multispettrale29,30, che misura un gran numero di neutrofili di retinatura e adotta un'analisi imparziale, ma si concentra sui neutrofili nelle prime fasi della NETosi e non quantifica i neutrofili che hanno rilasciato i loro NET. Molti studi sulla cinetica della NETosi utilizzano un colorante di DNA per quantificare il rilascio di NET in combinazione con un lettore di piastre a fluorescenza31. Questa tecnica non è in grado di distinguere i NET dai neutrofili attivati o morenti con colorazione intracellulare del DNA e, pertanto, non è adatta per la quantificazione del rilascio di NET e per lo studio degli antagonisti della NETosi. Quanto sopra sottolinea che gli approcci attualmente in uso per studiare la NETosis sono preziosi ma hanno i loro limiti.

Il metodo di microscopia in tempo reale descritto in questo studio affronta molti problemi riscontrati nelle tecniche precedentemente riportate. Offre una quantificazione NET imparziale, semiautomatica, ad alta produttività, riproducibile e accurata. Infatti, questo approccio riduce al minimo gli artefatti di pipettaggio, come la morfologia allungata dei NET18, ed è in grado di distinguere la NETosi dalla necrosi e dall'apoptosi attraverso la distinta morfologia e cinetica del rilascio del DNA18,32. Inoltre, questo approccio offre l'opportunità di studiare diverse vie biochimiche per la morte cellulare regolata, come la formazione di NET nei neutrofili necroptotici, che generano strutture che soddisfano i criteri funzionali e fenotipici dei NET33.

Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che devono essere seguiti per una quantificazione di successo dei NET. Innanzitutto, il numero corretto di cellule per pozzetto è importante per un'accurata quantificazione NET. Quando la densità dei neutrofili è troppo alta, le cellule e i NET si sovrappongono alle cellule adiacenti e ai NET, il che li rende difficili da distinguere e, di conseguenza, la quantificazione diventa imprecisa. In secondo luogo, è un prerequisito utilizzare una bassa concentrazione di colorante legante il DNA impermeabile alla membrana plasmatica non tossico per colorare i NET quando secreti nell'ambiente extracellulare. I coloranti leganti al DNA permeabili alla membrana plasmatica possono facilmente indurre l'attivazione dei neutrofili o la morte cellulare. In terzo luogo, è necessario eseguire la scansione di più immagini per pozzetto per ottenere una panoramica rappresentativa del rilascio di NET nella popolazione eterogenea di neutrofili. In quarto luogo, l'immagine a contrasto di fase dei neutrofili a t = 0 è necessaria per correggere il numero di neutrofili per immagine e calcolare la percentuale di neutrofili netting.

Sebbene questo approccio di microscopia in tempo reale e ad alto rendimento presenti molti vantaggi rispetto ad altri saggi di rilevamento NET, ci sono dei limiti a questo metodo poiché, per quanto ne sappiamo, non sono disponibili coloranti fluorescenti per rilevare componenti NET aggiuntivi per confermare il rilascio di NET. Gli anticorpi marcati con fluorescenza per rilevare ulteriori componenti NET possono essere utilizzati, ma potrebbero avere effetti indesiderati poiché i complessi anticorpo-immunità influenzano l'attivazione dei neutrofili e possibilmente la NETosi. Pertanto, preferiamo non utilizzare anticorpi aggiuntivi in questa configurazione di test e consigliamo invece di utilizzare stimoli che inducono NETosi ben noti. Quando vengono utilizzati stimoli NETosis non ancora stabiliti, si consiglia l'uso di un ELISA per rilevare il DNA complessato con proteine specifiche di NET come gli istoni citrullinati prima del test di imaging dal vivo. In secondo luogo, la variabilità intra e inter-assay può derivare dalla variabilità da donatore a donatore, con neutrofili provenienti da donatori sani che rispondono in modo diverso a vari stimoli di NETosi a causa dell'eterogeneità all'interno della popolazione sana. Per ridurre al minimo la variazione del saggio, i neutrofili devono essere isolati entro 1 ora dal sangue appena prelevato e utilizzati immediatamente nell'esperimento poiché i neutrofili hanno vita breve e non possono essere crioconservati. Inoltre, è importante che venga convalidato e adottato un protocollo di isolamento dei neutrofili per ridurre al minimo l'attivazione dei neutrofili. I neutrofili sono cellule sensibili e possono modificare la loro reattività agli stimoli durante il processo di purificazione a causa di stress meccanico e di altro tipo. Lo stato di attivazione dei neutrofili e il rilascio di NET possono essere influenzati dal tipo di ago, dalle provette di raccolta del sangue utilizzate, dalla temperatura di incubazione, dalla velocità di centrifugazione e dal tempo che intercorre tra la raccolta del sangue e l'isolamento dei neutrofili 34,35,36,37. Un ulteriore metodo di isolamento dei neutrofili che può essere preso in considerazione è descritto da Krémer et al.36 utilizzando un metodo di selezione immunomagnetica negativa senza lisi dei globuli rossi. Questo metodo assomiglia ai neutrofili intatti nel sangue intero e potrebbe essere adatto per prevenire qualsiasi attivazione dei neutrofili durante il processo di purificazione. Tutto quanto sopra dovrebbe servire a mettere in guardia il campo sul fatto che i dati provenienti da diversi gruppi di ricerca devono essere confrontati con grande attenzione.

Nel complesso, il metodo di microscopia ad alto rendimento in tempo reale descritto consente una quantificazione accurata dei NET in modo riproducibile ed efficiente e può essere utilizzato per studiare le caratteristiche, l'entità e la cinetica del rilascio di NET e consente lo studio dell'attività degli antagonisti di NETosis. Come esempio di quest'ultimo, abbiamo utilizzato l'istone umanizzato anti-citrullinato H2A e l'anticorpo monoclonale H4 CIT-013, che è attualmente in fase di sviluppo clinico.

Dichiarazioni

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Gli autori sono dipendenti di Citryll e hanno interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Paul Vink per aver gestito parte del progetto riguardante il metodo di microscopia con imaging dal vivo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A-23187 Acido libero (calcimicina)Thermo FisherA1493
Cloruro di ammonio (NH4Cl)Sigma AldrichA9434
Lisozima d'uovo anti-gallina (anticorpo di controllo; cIgG)CrownBioC0001
Anticorpo CD45 anti-umano coniugato APC-Cy7 (Clone 2D1)Biolegend368515Utilizzare a 1 µ g/mL
concentrazione finale BD FACSCantoTM II system + software FACSDiva (versione 8.0.1) BDn/a Sistema dicitometria a flusso
Albumina sierica bovina (BSA) Frazione VRoche10735108001
CaCl2 (1 M)VWRE506
Malattia da disposizione del pirofosfato di calcio (CPPD) cristalli InvivoGenlrl-cppd
Cellometro Auto T4 Contatore di cellule a campo chiaro + software di analisi (versione 3.3.9.5)Nexcelom Biosciencen/aContatore cellulare in campo chiaro
CIT-013Citryll B.V.n/a
Piastra nera a 96 pozzetti Costar, fondo trasparente Corning3603Piastra a 96 pozzetti #1
Destrano T500Pharmacosmos551005009006
DPBS (1x)Gibco14190-144
Siero fetale bovino (FBS)SerenaS-FBS-SA-015
Ficoll GE Healthcare17-1440-02Soluzione a gradiente
di densità Anticorpo CD66b anti-umano coniugato con FITC (Clone G10F5)eBioscience17-0666-42Utilizzare a 1,5 & micro; g/mL concentrazione finale
Colorante di vitalità fissabile eFluor 506eBioscience65-0866-14
Software di analisi per citometria a flussoFLowJoVersione 10.8.0
fMLPSigma Aldrich47729-10MG-F
HEPES (1M)Gibco15630-080
Albumina sierica umana (HSA)VWR31020
Umana TruStain FcX Biolegend422302blocco recettore Fc
Piastra IBIDI a 96 pozzetti, fondo trasparente IBIDI89626piastra a 96 pozzetti #2
IncuCyte SX3 + software di analisi (versione 2022B Rev1) Satoriusn/aSistema di analisi microscopica su cellule vive
Cristalli di urato monosodicoInvivoGentlrl-msu
Anticorpo anti-istone H3 (citrullina R2 + R8 + R17) di topo Cayman17939Clone 11D3; indicato come #1
Topo anti-istone H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) anticorpo (Clone KM-2)Anticorpi assolutiAb01681-2.0
Na2EDTASigma AldrichE5134
NaCl (0.9%)B. Braun25900
Penicillina (5000 U/mL) - Streptomicina (5000 µ g/mL)Gibco15070-063
Anticorpo CD16 anti-umano coniugato di topo PerCP-Cy5.5 (Clone 3G8)Biolegend302027Uso a 0,33 µ g/mL concentrazione finale
PMASigma AldrichP1585
Anticorpo anti-HSA di coniglio policlonaleSigma AldrichA0433-2ml
Poli-L-lisina (0,01%)Sigma AldrichP4832
Bicarbonato di potassio (KHCO3)Sigma Aldrich237205
Anticorpo anti-istone di coniglio H3 (citrullina R2 + R8 + R17) Abcamab281584Multiclonale; indicato come #2
RPMI 1640 con supplemento GlutaMAXTMGibco61870-010Terreno di coltura contenente L-glutammina
RPMI 1640 senza rosso fenolo.Gibco11835-030Terreno di coltura senza rosso fenolo
Azide di sodio (NaN3)Sigma AldrichS2002
Sterile H2OGibco15230204
Sytox Green Nucleid Acid Stain Thermo FisherS7020Colorante DNA
Soluzione di blu di tripano (0,4%)Gibco15250-061
Tween-20Sigma AldrichP1379
Provette di sangue Vacutainer Li-Eparina (17 UI/mL)BD367526

Riferimenti

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