Un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1

Sommario

I gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1 sono tumori rari e difficili da coltivare. Introduciamo un metodo di espianto semplice e non enzimatico che preserva l'espressione della proteina IDH1-mutante e sostiene le colture per mesi. È importante sottolineare che questa tecnica funziona con i tumori crioconservati, offrendo una risorsa preziosa per la ricerca sul glioma.

Abstract

I gliomi diffusi, i tumori cerebrali primari più diffusi, sono classificati in gradi bassi e alti in base a criteri istopatologici e mutazioni genetiche. I gliomi diffusi di basso grado costituiscono un sottogruppo, che affligge prevalentemente i giovani adulti e predispone ai gliomi di alto grado. Esistono due tipi principali di gliomi diffusi di basso grado: astrocitomi e oligodendrogliomi, ciascuno definito da caratteristiche genetiche e istologiche distinte. Questi tumori presentano tipicamente una variante mutata dell'enzima metabolico IDH1, che interrompe la differenziazione cellulare. Sono eterogenee e comprendono sia cellule staminali proliferative che cellule gliali più differenziate e quiescenti.

I modelli tumorali in vitro specifici per il paziente hanno un potenziale significativo per svelare i meccanismi oncogenici e personalizzare la selezione dei farmaci per la terapia personalizzata. Tuttavia, l'assenza di modelli in vitro affidabili specifici per i gliomi di basso grado con mutazione IDH1 ha ostacolato la ricerca fondamentale e traslazionale. Qui, presentiamo un metodo semplice per coltivare tumori mutanti IDH1 come espianti in terreni definiti senza bisogno di dissociazione enzimatica. Questi espianti possono essere mantenuti per periodi prolungati, mantenendo l'espressione della proteina IDH1-mutante e marcatori per le cellule progenitrici degli oligodendrociti come ASCL1 (MASH1), OLIG1 e OLIG2 e per gli astrociti (GFAP, SOX9). Possono anche essere stabiliti da tumori congelati nel DMSO. Queste colture possono fungere da preziosa piattaforma per lo screening dei farmaci, la videomicroscopia e gli studi genetici, facilitando così i progressi nella comprensione e nel trattamento di questi tumori difficili. Offrono anche il potenziale per derivare linee cellulari mutanti IDH1.

Introduzione

I gliomi diffusi sono i tumori cerebrali primari più frequenti. Questi tumori sono attualmente incurabili nonostante un trattamento molto intenso (chirurgia, radio e chemioterapia)¹. Prove crescenti supportano l'ipotesi che la gliomagenesi abbia origine da cellule staminali adulte o progenitrici gliali residenti nel cervello². Sebbene i glioblastomi rappresentino il tipo più aggressivo, sono prevalenti anche i gliomi diffusi di basso grado (DLGG, tumori di grado 2) (15% dei gliomi diffusi)^1,3. I DLGG crescono lentamente e migrano lungo i tratti della sostanza bianca, un segno distintivo di questa neoplasia "diffusa⁴. Questi DLGG molto spesso si ripresentano nonostante il trattamento, progredendo infine verso tumori maligni di alto grado (gradi 3 e 4)⁵.

DLGG sono caratterizzati da una mutazione missenso nel gene dell'isocitrato deidrogenasi 1 o 2 (IDH1 o IDH2), con conseguente produzione aberrante dell'oncometabolita 2-idrossiglutarato (2HG). Questo interrompe la differenziazione cellulare attraverso disregolazioni epigenetiche⁶. I gliomi con mutazione IDH1 sono ulteriormente classificati in sottotipi: gli astrocitomi hanno tipicamente mutazioni in ATRX e P53, mentre gli oligodendrogliomi sono caratterizzati da delezioni 1p19q⁷. Questi tumori mostrano un'eterogeneità delle cellule tumorali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e l'immunocaratterizzazione hanno rivelato una popolazione diversificata di cellule tumorali, che mostrano fenotipi simili alle cellule staminali, agli astrociti e agli oligodendrociti all'interno di questi tumori^8,9.

A differenza del glioblastoma, che beneficia di colture e linee cellulari prontamente disponibili e a lungo termine, esiste una notevole scarsità di strumenti cellulari su misura per studiare i tumori mutanti IDH1¹. Ciò rappresenta un ostacolo significativo all'avanzamento dello sviluppo terapeutico e all'approfondimento della gliomagenesi e della progressione della malattia con mutazione IDH1. Le linee cellulari tradizionali cresciute con il siero, sebbene utilizzate da tempo, replicano in modo inadeguato i tumori originali, mostrando profili trascrizionali alterati. In alternativa, le condizioni di coltura senza siero, sia in modelli tumorali 2D che 3D, preservano più efficacemente i profili trascrizionali delle cellule tumorali e i loro fenotipi in vivo, come l'invasione nel tessuto cerebrale normale^10,11.

Inoltre, le colture cellulari a breve termine derivate dal campione chirurgico di un paziente preservano il profilo molecolare e la diversità cellulare del tumore, rappresentando così meglio i tratti biologici dei tumori rispetto alle linee cellulari¹². In questo articolo, introduciamo un semplice metodo non enzimatico per la coltura di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1 come espianti derivati da resezioni di pazienti freschi o congelati, con l'obiettivo di soddisfare la necessità di migliorare i modelli in vitro per la ricerca e lo sviluppo terapeutico del glioma. Offrono anche il potenziale per derivare linee cellulari mutanti IDH1.

Protocollo

I frammenti tumorali utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti da una raccolta ben caratterizzata ed eticamente approvata, con il consenso del paziente. Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del progetto intitolato Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Progetto n. RECH/P722/1-5) ed è stato approvato dal consiglio scientifico della biobanca dei tumori il 28 agosto 2023.

1. Preparazione delle piastre di coltura

NOTA: Eseguire questi passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture tissutali.

1. Almeno 1 ora prima della coltura, preparare la poli-D-lisina (PDL) e le piastre a 24 pozzetti rivestite di laminina.
   1. Diluire 10 mg di polvere di PDL in 100 mL di tampone borato (pH 8,4) per una concentrazione finale di 100 μg/mL. Una volta disciolta, filtrare la soluzione (0,22 μm) per la sterilità. PDL è pronto all'uso; preparare 3 mL di aliquote e conservarle a -20 °C.
   2. Scongelare la provetta di laminina da 1-2 mg/mL a 4 °C per evitare la formazione di gel. Preparare aliquote da 50 μl e conservarle a -20 °C.
      NOTA: Evitare di ripetere lo scongelamento e il congelamento.
   3. Rivestimento delle lastre
      1. Passaggio opzionale: posizionare i vetrini coprioggetti sterili Ø, 13 mm, adatti per piastre di coltura cellulare, in una piastra a 24 pozzetti, un vetrino coprioggetti per pozzetto.
         NOTA: Questo passaggio serve per un'ulteriore immunocolorazione degli espianti di glioma.
      2. Per il rivestimento dei pozzetti, mescolare i 3 mL della soluzione PDL in 9 mL di 1x PBS e aggiungere 50 μL di laminina. Aggiungere 500 μl di questa soluzione a ciascun pozzetto per una concentrazione di rivestimento di 1-2 μg/cm². Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente, preferibilmente con oscillazione lenta (15 giri/min), per almeno 1 ora.
      3. Immediatamente prima della coltura, rimuovere la soluzione di PDL-laminina e risciacquare due volte con 1x PBS.
         sterile NOTA: Non lasciare che i pozzetti si asciughino.

2. Mezzi

1. Coltura di espianti IDH1-mutanti in un terreno definito comprendente DMEM/F12 integrato con L-glutammina, insieme a una miscela di siero sostitutivo composta da N2 e B27 senza vitamina A. Utilizzare antibiotici, tra cui ciprofloxacina, gentamicina e fungina, per prevenire la contaminazione batterica e fungina. Inoltre, incorporare i fattori di crescita eparina, EGF e FGF2 nel terreno, filtrarlo (0,2 μm) e conservarlo per un massimo di 2 settimane a 4 °C.
   NOTA: Per i dettagli sugli ingredienti e la preparazione dei supporti, fare riferimento alla Tabella 1 e alla Tabella dei materiali.

3. Preparazione dell'espiantazione

1. Prima dell'elaborazione del campione, preparare l'area di lavoro e gli strumenti sterili come illustrato in Figura 1A. Igienizza un impacco freddo spruzzandolo con etanolo al 70%. Sterilizza forbici e pinze immergendole in etanolo al 70% e risciacquandole con PBS.
2. Trasferire prontamente la resezione del tumore per la coltura su ghiaccio, idealmente entro 2 ore dall'estrazione chirurgica (Figura 1B).
   NOTA: Il campione di tumore deve avere un diametro minimo di 9-10 mm per garantire risultati migliori. Il tessuto viene trasportato senza terreno di coltura poiché questo metodo è preferito per scopi istologici. L'assenza di liquido impedisce la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento rapido, preservando così l'integrità dei tessuti per il successivo esame istologico, se necessario.
3. Posizionare il piatto di coltura con il campione tumorale sopra l'impacco freddo e sciacquarlo delicatamente con 1X PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
4. Il tumore resecato mostra spesso dimensioni ed eterogeneità significative, comprendenti massa tumorale, tessuto infiltrato e componenti non tumorali (Figura 1C). Seleziona le parti che mostrano un colore grigio con una consistenza morbida o gelatinosa per l'isolamento delle cellule tumorali, poiché tendono a contenere più cellule tumorali. Al contrario, evitare le regioni dure e bianche in quanto potrebbero contenere meno cellule tumorali adatte alla coltura (Figura 1D), così come le aree annerite, poiché sono probabilmente il risultato dell'elettrocauterizzazione e potrebbero non fornire risultati affidabili per l'analisi.
5. Trasferire i campioni selezionati in una microprovetta da 1,5 mL o in un crioviale per la macinazione. Aggiungere 1 mL di terreno sterile alla microprovetta da 1,5 mL o al crioviale e tritare il campione con le forbici sterili fino ad ottenere piccoli pezzi (1-2 mm³).
   NOTA: Sono necessari circa 1-2 minuti di taglio per ottenere frammenti minuscoli, tipicamente di 1-2 mm^{di dimensioni 3} (Figura 1E).
6. Con le forbici sterili, tagliare con cura l'estremità di un puntale per pipetta blu da 1.000 μl per creare un'ampia apertura, di circa 3-4 mm di diametro. Utilizzando questo puntale modificato, pipettare 50-200 μl dei frammenti di tessuto tritati e distribuirli uniformemente su ciascun pozzetto. Poiché i pezzi più piccoli tendono a depositarsi rapidamente, riomogeneizzare delicatamente la sospensione in ciascun pozzetto per garantire una distribuzione uniforme><. NOTA: Evitare il sovraffollamento e mantenere l'equilibrio non introducendo un numero eccessivo di frammenti in ogni pozzetto (Figura 1F).
7. Incubare i frammenti tumorali a 37°C in un incubatore al 5% di CO2 con umidità al 100%. Cambiare il terreno ogni giorno se l'attività metabolica del tumore (indicata dal rapido ingiallimento del terreno) e il numero di frammenti in ciascun pozzetto lo richiedono. Durante il cambio del terreno, prestare attenzione aspirando delicatamente il terreno utilizzando una pipetta dotata di un puntale da 200 μl, assicurandosi di evitare di disturbare eventuali frammenti tumorali aderenti.

Figura 1: Procedura di coltura di espianti tumorali. Una resezione diffusa di glioma di basso grado è stata ottenuta da un paziente di 44 anni con diagnosi di astrocitoma di grado II secondo la classificazione dell'OMS 2021. Il tumore presentava una mutazione IDH1 (esone 4 c.395 G>A, p.Arg132His) e una mutazione TP53 (esone 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), insieme all'assenza di colorazione ATRX. Non sono state rilevate mutazioni nei siti di legame Ets/TCF (C250T e C228T) del gene TERT. (A) La superficie di lavoro è costituita da un pacco freddo, che fornisce un ambiente che riduce al minimo la degradazione del campione e mantiene la vitalità dei componenti biologici. Queste precauzioni sono importanti per preservare la qualità e l'integrità del tessuto. (B) Il trasporto del campione dall'ospedale al laboratorio deve essere effettuato su ghiaccio. (C) Frammento di resezione tumorale. Le frecce mostrano le parti più adatte per la cultura. (D) La dissezione del tumore viene eseguita per selezionare la parte più rilevante da tritare. Nella nostra esperienza, la sostanza bianca ha generalmente meno probabilità di generare espianti di successo. (E) Frammenti tumorali di circa 1-2 mm³ di diametro in una provetta da 15 mL dopo essere stati tritati meccanicamente con le forbici. (F) Il numero di pezzi tumorali necessari per la corretta semina è mostrato per i pozzetti su una piastra a 24 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Crioconservazione e scongelamento del tumore tritato

NOTA: La crioconservazione garantisce il backup in caso di contaminazione e perdita di colture di espianti o per elaborare i campioni tumorali in un secondo momento.

1. Crioconservazione: Preparare il terreno di congelamento (soluzione di DMSO al 20% v/v) aggiungendo 2 mL di DMSO a 8 mL di terreno di coltura cellulare.
2. Combinare 1 volume della sospensione tumorale tritata con un volume uguale di terreno di congelamento al 20% di DMSO per ottenere una concentrazione finale del 10% di DMSO. Pipettare con cura la miscela su e giù per garantire una miscelazione completa, quindi erogare circa 1 ml nei crioviali.
3. Trasferire rapidamente i crioviali in un contenitore criogenico per una graduale riduzione della temperatura, seguita da un'incubazione notturna a -80 °C prima dello stoccaggio finale in azoto liquido.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito immediatamente dopo che le cellule sono state poste nel mezzo di congelamento, poiché alcuni crioprotettori, come il DMSO, possono essere dannosi se le cellule vengono esposte ad essi a temperatura ambiente più a lungo del necessario.
4. Scongelamento: Togliere i crioviali dall'azoto liquido e metterli immediatamente a bagnomaria a 37 °C fino a quando circa l'80% delle cellule non si è scongelato.
5. Per rimuovere il DMSO, pipettare rapidamente la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di 1x PBS preriscaldato e centrifugare a 300 × g per 5 minuti.
6. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio con 1X PBS seguito dalla centrifugazione (passaggio 4.5). Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet, e aggiungere la quantità appropriata di terreno da trasferire in una piastra prerivestita PDL-Laminin a 24 pozzetti e posizionare nell'incubatore.
7. Dopo 24 ore, verificare che le celle siano attaccate. Dopo alcuni giorni, rimuovere i frammenti non aderenti sostituendo i terreni di coltura.

5. Passaggio della cultura

NOTA: Una volta stabiliti, gli espianti possono essere utilizzati per la videomicroscopia o l'immunocolorazione. In alternativa, se le cellule tumorali sono migrate fuori dall'espiante e appaiono sane, l'espiante può essere fatto passare attraverso la dissociazione enzimatica e riseminato in pozzetti per ulteriori sperimentazioni. Tuttavia, è importante notare che questo protocollo non è progettato per il passaggio ripetuto. In genere, è possibile tentare un solo passaggio prima che le cellule tumorali diventino senescenti o muoiano. Non tutte le colture di espianti porteranno a un passaggio di successo.

1. Per il passaggio, rimuovere i vecchi terreni, sciacquare con 1X PBS e aggiungere (125 μL) 0,05% di tripsina-EDTA ai pozzetti e incubare per 3-4 minuti a 37 °C, seguiti dall'aggiunta di 6,5 μL di inibitore della tripsina, 12 μL di 20 mM CaCl₂ (diluizione finale a 2 mM) e 1 μL di DNAsi I.
   NOTA: Il tempo di incubazione necessario per la dissociazione può variare a seconda della coltura. È importante verificare se le celle si sono staccate dopo almeno 3 minuti. In genere, l'espiante può non essere completamente dissociato in una sospensione di una singola cellula e spesso vengono trattenuti piccoli grappoli, che possono generare nuove colture di espianto.
2. Con un p1000 impostato su 500-600 μl, sciacquare delicatamente per disaggregare gli espianti. Evitare la formazione di bolle.
3. Aggiungere 5 mL di 1x PBS e centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet in un terreno fresco preriscaldato e contare per la semina.
4. Identifica le colture con il potenziale per generare linee cellulari osservando le cellule in divisione al microscopio a contrasto di fase. Queste cellule in divisione hanno tipicamente una morfologia arrotondata e cromosomi visibili, come mostrato in Figura 2A.

Risultati

Dopo alcuni giorni, alcuni frammenti tumorali aderiranno alle superfici del pozzetto, iniziando la crescita delle cellule dagli espianti. Il tempo che intercorre tra la placcatura iniziale e la comparsa delle cellule tumorali in crescita è diverso da campione a campione. Le colture iniziali contengono spesso detriti cellulari sostanziali, rendendo difficile valutare la presenza di cellule vitali. Di conseguenza, la coltura deve essere mantenuta per un minimo di 4 settimane. Una volta che le cellule iniziano a crescere, s...

Discussione

Lo sviluppo di modelli in vitro e preclinici per gliomi di basso grado con mutazione IDH1 è particolarmente impegnativo a causa della lenta crescita di questi tumori e della complessità della replicazione delle estese alterazioni genomiche ed epigenomiche causate dalla mutazione IDH. Inoltre, queste cellule tumorali infiltrative interagiscono attivamente con le cellule circostanti, comprese le cellule immunitarie, endoteliali, gliali e neuronali, facendo potenzialmente affidamento su di esse per la sopravvivenza. Questa ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-ASCL1	BD Pharmingen&commercio;		Diluizione 556604 1:500
Diluizione HPA001906 Anti-ATRX	Sigma-Aldrich		1:100
Diluizione Anti-CD68	Agilent	M081401-2	1:500
Diluizione 1:500 Anti-GFAP	Aves Labs	AB_2313547	Diluizione 1:500
Anticorpi Fujifilm Wako	Anticorpi 019-19741	Dilizione 1:1000
Anticorpo monoclonale di topo Anti-IDH1 (R132H)	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Pharmingen&commercio;	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Sistemi®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Diluizione 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	Diluizione EPR14335-78	1:100
Integratore di B-27 (50x), meno vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Albumina sierica bovina (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacina HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	Contenitore per congelamento cellulare, per fiale criogeniche da 12 x 1 mL o 2 mL
Vetrino coprioggetto Ø, 13 mm	Karl Hecht™ Assistente&commercio;
Dimetil Solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, senza glutammina	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAsi I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm Piatto per colture cellulari trattato	con TC Corning®
Falcon 24 pozzetti a fondo piatto trasparente	Corning®	353047	Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC, con coperchio, sterile
Fungin	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
EGF umano	PeproTech	AF-100-15-1MG
FGF umano-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutammina	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Integratore (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Siero acrodisc 37 mm filtro per siringa con GF/0.2 &; m Supor	PALL Corporation	4525
Inibitore della tripsina	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	25300054
Microscopio Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopio	per epifluorescenza a campo largo dritto	Zeiss