Un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1

Sommario

I gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1 sono tumori rari e difficili da coltivare. Introduciamo un metodo di espianto semplice e non enzimatico che preserva l'espressione della proteina IDH1-mutante e sostiene le colture per mesi. È importante sottolineare che questa tecnica funziona con i tumori crioconservati, offrendo una risorsa preziosa per la ricerca sul glioma.

Abstract

I gliomi diffusi, i tumori cerebrali primari più diffusi, sono classificati in gradi bassi e alti in base a criteri istopatologici e mutazioni genetiche. I gliomi diffusi di basso grado costituiscono un sottogruppo, che affligge prevalentemente i giovani adulti e predispone ai gliomi di alto grado. Esistono due tipi principali di gliomi diffusi di basso grado: astrocitomi e oligodendrogliomi, ciascuno definito da caratteristiche genetiche e istologiche distinte. Questi tumori presentano tipicamente una variante mutata dell'enzima metabolico IDH1, che interrompe la differenziazione cellulare. Sono eterogenee e comprendono sia cellule staminali proliferative che cellule gliali più differenziate e quiescenti.

I modelli tumorali in vitro specifici per il paziente hanno un potenziale significativo per svelare i meccanismi oncogenici e personalizzare la selezione dei farmaci per la terapia personalizzata. Tuttavia, l'assenza di modelli in vitro affidabili specifici per i gliomi di basso grado con mutazione IDH1 ha ostacolato la ricerca fondamentale e traslazionale. Qui, presentiamo un metodo semplice per coltivare tumori mutanti IDH1 come espianti in terreni definiti senza bisogno di dissociazione enzimatica. Questi espianti possono essere mantenuti per periodi prolungati, mantenendo l'espressione della proteina IDH1-mutante e marcatori per le cellule progenitrici degli oligodendrociti come ASCL1 (MASH1), OLIG1 e OLIG2 e per gli astrociti (GFAP, SOX9). Possono anche essere stabiliti da tumori congelati nel DMSO. Queste colture possono fungere da preziosa piattaforma per lo screening dei farmaci, la videomicroscopia e gli studi genetici, facilitando così i progressi nella comprensione e nel trattamento di questi tumori difficili. Offrono anche il potenziale per derivare linee cellulari mutanti IDH1.

Introduzione

I gliomi diffusi sono i tumori cerebrali primari più frequenti. Questi tumori sono attualmente incurabili nonostante un trattamento molto intenso (chirurgia, radio e chemioterapia)¹. Prove crescenti supportano l'ipotesi che la gliomagenesi abbia origine da cellule staminali adulte o progenitrici gliali residenti nel cervello². Sebbene i glioblastomi rappresentino il tipo più aggressivo, sono prevalenti anche i gliomi diffusi di basso grado (DLGG, tumori di grado 2) (15% dei gliomi diffusi)^1,3. I DLGG crescono lentamente e migrano lungo i tratti della sostanza bianca, un segno distintivo di questa neoplasia "diffusa⁴. Questi DLGG molto spesso si ripresentano nonostante il trattamento, progredendo infine verso tumori maligni di alto grado (gradi 3 e 4)⁵.

DLGG sono caratterizzati da una mutazione missenso nel gene dell'isocitrato deidrogenasi 1 o 2 (IDH1 o IDH2), con conseguente produzione aberrante dell'oncometabolita 2-idrossiglutarato (2HG). Questo interrompe la differenziazione cellulare attraverso disregolazioni epigenetiche⁶. I gliomi con mutazione IDH1 sono ulteriormente classificati in sottotipi: gli astrocitomi hanno tipicamente mutazioni in ATRX e P53, mentre gli oligodendrogliomi sono caratterizzati da delezioni 1p19q⁷. Questi tumori mostrano un'eterogeneità delle cellule tumorali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e l'immunocaratterizzazione hanno rivelato una popolazione diversificata di cellule tumorali, che mostrano fenotipi simili alle cellule staminali, agli astrociti e agli oligodendrociti all'interno di questi tumori^8,9.

A differenza del glioblastoma, che beneficia di colture e linee cellulari prontamente disponibili e a lungo termine, esiste una notevole scarsità di strumenti cellulari su misura per studiare i tumori mutanti IDH1¹. Ciò rappresenta un ostacolo significativo all'avanzamento dello sviluppo terapeutico e all'approfondimento della gliomagenesi e della progressione della malattia con mutazione IDH1. Le linee cellulari tradizionali cresciute con il siero, sebbene utilizzate da tempo, replicano in modo inadeguato i tumori originali, mostrando profili trascrizionali alterati. In alternativa, le condizioni di coltura senza siero, sia in modelli tumorali 2D che 3D, preservano più efficacemente i profili trascrizionali delle cellule tumorali e i loro fenotipi in vivo, come l'invasione nel tessuto cerebrale normale^10,11.

Inoltre, le colture cellulari a breve termine derivate dal campione chirurgico di un paziente preservano il profilo molecolare e la diversità cellulare del tumore, rappresentando così meglio i tratti biologici dei tumori rispetto alle linee cellulari¹². In questo articolo, introduciamo un semplice metodo non enzimatico per la coltura di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1 come espianti derivati da resezioni di pazienti freschi o congelati, con l'obiettivo di soddisfare la necessità di migliorare i modelli in vitro per la ricerca e lo sviluppo terapeutico del glioma. Offrono anche il potenziale per derivare linee cellulari mutanti IDH1.

Protocollo

I frammenti tumorali utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti da una collezione ben caratterizzata e approvata dal punto di vista etico, con il consenso dei pazienti. Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del progetto intitolato Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Numero del progetto: RECH/P722/1-5) ed è stata approvata dal consiglio scientifico della biobanca dei tumori il 28 agosto 2023.

1. Preparazione delle piastre di coltura

NOTA: eseguire questi passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture cellulari.

1. Almeno 1 ora prima della coltura, preparare le piastre da 24 pozzetti rivestite con poli-D-lisina (PDL) e laminina.
   1. Diluire 10 mg di polvere di PDL in 100 mL di tampone borato (pH 8,4) per ottenere una concentrazione finale di 100 µg/mL. Dopo la completa dissoluzione, filtrare la soluzione (0,22 µm) per garantirne la sterilità. Il PDL è pronto all'uso; preparare aliquote da 3 mL e conservarle a -20 °C.
   2. Scongelare il tubo di laminina (1-2 mg/mL) a 4 °C per evitare la formazione di gel. Preparare aliquote da 50 µL e conservarle a -20 °C.
      NOTA: Evitare cicli ripetuti di scongelamento e congelamento.
   3. Rivestimento delle pozzetti
      1. Passaggio opzionale: posizionare in ogni pozzetto della piastra da 24 un’ansa sterile da Ø 13 mm, adatta per piastre da coltura cellulare, un’ansa per pozzetto.
         NOTA: Questo passaggio è necessario per successivi esami di immunofluorescenza degli espianti di glioma.
      2. Per il rivestimento dei pozzetti, mescolare 3 mL di soluzione di PDL con 9 mL di PBS 1x e aggiungere 50 µL di laminina. Aggiungere 500 µL di questa soluzione in ogni pozzetto, ottenendo una concentrazione di rivestimento di 1-2 µg/cm². Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente, preferibilmente con agitazione lenta (15 RPM), per almeno 1 ora.
      3. Immediatamente prima della coltura, rimuovere la soluzione di PDL-laminina e risciacquare due volte con PBS 1x sterile.
         NOTA: Evitare che i pozzetti si asciughino.

2. Mezzi

1. Coltivare gli espianti con mutazione IDH1 in un mezzo definito costituito da DMEM/F12 integrato con L-glutammina, insieme a una miscela sostitutiva del siero composta da N2 e B27 senza vitamina A. Utilizzare antibiotici, tra cui ciprofloxacina, gentamicina e fungina, per prevenire contaminazioni batteriche e fungine. Inoltre, aggiungere al mezzo fattori di crescita come eparina, EGF e FGF2, filtrarlo (0,2 µm) e conservarlo fino a 2 settimane a 4 °C.
   NOTA: Per informazioni dettagliate sugli ingredienti e sulla preparazione del mezzo, consultare Tabella 1 e la Tabella dei Materiali.

3. Preparazione dell'espianto

1. Prima dell'elaborazione del campione, preparare l'area di lavoro e gli strumenti sterili come illustrato in Figura 1A. Sanitizzare una confezione refrigerante spruzzandola con etanolo al 70%. Sterilizzare forbici e pinzette immergendole in etanolo al 70% e risciacquandole con PBS.
2. Trasferire immediatamente il campione tumorale per la coltura sul ghiaccio, idealmente entro 2 h dal prelievo chirurgico (Figura 1B).
   NOTA: Il campione tumorale dovrebbe avere un diametro minimo di 9-10 mm per garantire risultati migliori. Il tessuto viene trasportato senza mezzo di coltura poiché questo metodo è preferito per scopi istologici. L'assenza di liquido previene la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento rapido, preservando così l'integrità del tessuto per eventuali esami istologici successivi.
3. Posizionare la piastra con il campione tumorale sulla confezione refrigerante e risciacquarlo delicatamente con PBS 1X per rimuovere l'eccesso di sangue.
4. Il tumore resecato spesso presenta dimensioni significative e eterogeneità, comprendendo massa tumorale, tessuto infiltrato e componenti non tumorali (Figura 1C). Selezionare porzioni di colore grigio con consistenza morbida o gelatinosa per l'isolamento delle cellule tumorali, poiché tendono a contenere un numero maggiore di cellule tumorali. Al contrario, evitare le aree dure e bianche poiché potrebbero contenere meno cellule tumorali adatte alla coltura (Figura 1D), così come le aree annerite, che probabilmente derivano dall'elettrocoagulazione e potrebbero non fornire risultati affidabili per l'analisi.
5. Trasferire i campioni selezionati in una microprovetta da 1,5 mL o in una cryovial per la trinciatura. Aggiungere 1 mL di mezzo sterile nella microprovetta da 1,5 mL o nella cryovial e trinciare il campione con le forbici sterili fino a ottenere piccoli pezzi (1-2 mm³).
   NOTA: Sono necessari circa 1-2 minuti di trinciatura per ottenere frammenti minuscoli, tipicamente di dimensioni pari a 1-2 mm³ (Figura 1E).
6. Con forbici sterili, tagliare con cura l'estremità di una punta da pipetta blu da 1.000 µL per creare un'apertura larga, di circa 3-4 mm di diametro. Utilizzando questa punta modificata, pipettare 50-200 µL dei frammenti di tessuto trinciato e distribuirli uniformemente in ciascun pozzetto. Poiché i frammenti più piccoli tendono a sedimentare rapidamente, riomogeneizzare delicatamente la sospensione in ogni pozzetto per garantire una distribuzione uniforme.
   ​NOTA: Evitare l'eccessivo affollamento e mantenere un equilibrio non introducendo un numero eccessivo di frammenti in ciascun pozzetto (Figura 1F).
7. Incubare i frammenti tumorali a 37°C in un incubatore con 5% di CO2 e umidità al 100%. Cambiare il mezzo ogni giorno se l'attività metabolica del tumore (indicata dall'ingiallimento rapido del mezzo) e il numero di frammenti in ciascun pozzetto lo richiedono. Durante il cambio del mezzo, procedere con attenzione aspirando delicatamente il mezzo con una pipetta dotata di punta da 200 µL, avendo cura di non disturbare i frammenti tumorali aderenti.

Figura 1: Procedura di coltura di espianti tumorali. È stata ottenuta una resezione di glioma di basso grado diffuso da un paziente di 44 anni diagnosticato con astrocitoma di grado II secondo la classificazione WHO 2021. Il tumore presentava una mutazione nel gene IDH1 (esone 4 c.395 G>A, p.Arg132His) e una mutazione nel gene TP53 (esone 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), insieme all'assenza di colorazione per ATRX. Non sono state rilevate mutazioni nei siti di legame Ets/TCF (C250T e C228T) del gene TERT. (A) La superficie di lavoro comprende un pacchetto refrigerante, che fornisce un ambiente atto a minimizzare il degrado del campione e a mantenere la vitalità dei componenti biologici. Queste precauzioni sono importanti per preservare la qualità e l'integrità del tessuto. (B) Il trasporto del campione dall'ospedale al laboratorio deve essere effettuato su ghiaccio. (C) Frammento di resezione tumorale. Le frecce indicano le parti più adatte alla coltura. (D) La dissezione del tumore viene eseguita per selezionare la parte più rilevante da tritare. Secondo la nostra esperienza, la sostanza bianca generalmente ha minori probabilità di generare espianti di successo. (E) Frammenti tumorali di circa 1-2 mm³ di diametro in un tubo da 15 mL dopo essere stati tritati meccanicamente con forbici. (F) Viene mostrato il numero di frammenti tumorali necessari per una corretta semina nelle pozzette di una piastra a 24 pozzette. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Criopreservazione e scongelamento del tessuto tumorale tritato

NOTA: La criopreservazione garantisce una copia di sicurezza in caso di contaminazione e perdita di colture di espianti o per elaborare in un secondo momento i campioni tumorali.

1. Criopreservazione: Preparare il mezzo di congelamento (soluzione al 20% v/v di DMSO) aggiungendo 2 mL di DMSO a 8 mL di mezzo di coltura cellulare.
2. Combinare un volume della sospensione tumorale tritata con un volume uguale del mezzo di congelamento al 20% di DMSO per ottenere una concentrazione finale del 10% di DMSO. Pipettare delicatamente la miscela su e giù per assicurare un'accurata miscelazione, quindi distribuire circa 1 mL nei cryovials.
3. Trasferire rapidamente i cryovials in un contenitore criogenico per una riduzione graduale della temperatura, seguita da un'incubazione notturna a -80 °C prima dello stoccaggio finale in azoto liquido.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito immediatamente dopo che le cellule sono state poste nel mezzo di congelamento, poiché alcuni crioprotettori, come il DMSO, possono risultare dannosi se le cellule sono esposte a temperatura ambiente per un periodo superiore al necessario.
4. Scongelamento: Rimuovere i cryovials dall'azoto liquido e posizionarli immediatamente in un bagno a 37 °C fino a quando circa l'80% delle cellule si sarà scongelato.
5. Per rimuovere il DMSO, pipettare rapidamente la sospensione in un tubo da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di PBS 1x preriscaldato e centrifugare a 300 × g per 5 min.
6. Rimuovere il soprannatante e ripetere il lavaggio con PBS 1X seguito da centrifugazione (passaggio 4.5). Aspirare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet, e aggiungere la quantità appropriata di mezzo per trasferire le cellule in una piastra da 24 pozzetti precoata con PDL-Laminina, quindi posizionarla nell'incubatore.
7. Dopo 24 h, verificare che le cellule si siano attaccate. Dopo alcuni giorni, rimuovere i frammenti non aderenti sostituendo il mezzo di coltura.

5. Passaggio della coltura

NOTA: una volta ottenuti, gli espianti possono essere utilizzati per videomicroscopia o immunomarcatura. In alternativa, se le cellule tumorali hanno migrato fuori dall'espianto e appaiono sane, l'espianto può essere sottoposto a passaggio mediante dissociazione enzimatica e reinserito in pozzetti per ulteriori esperimenti. Tuttavia, è importante notare che questo protocollo non è progettato per passaggi ripetuti. Generalmente, può essere effettuato un solo passaggio prima che le cellule tumorali diventino senescenti o muoiano. Non tutte le colture di espianti porteranno a un passaggio riuscito.

1. Per il passaggio, rimuovere il vecchio mezzo, lavare con PBS 1X e aggiungere (125 µL) di tripsina-EDTA 0,05% alle pozzette, quindi incubare per 3-4 min a 37 °C, seguito dall'aggiunta di 6,5 µL di inibitore della tripsina, 12 µL di CaCl₂ 20 mM (diluizione finale a 2 mM) e 1 µL di DNAasi I.
   NOTA: Il tempo di incubazione necessario per la dissociazione può variare a seconda della coltura. È importante verificare se le cellule si sono staccate dopo almeno 3 minuti. In genere, l'espianto potrebbe non essere completamente dissociato in una sospensione monocellulare e spesso vengono mantenuti piccoli aggregati, che possono generare nuove colture di espianti.
2. Utilizzando una pipetta p1000 impostata su 500-600 µL, lavare delicatamente per disgregare gli espianti. Evitare la formazione di bolle.
3. Aggiungere 5 mL di PBS 1X e centrifugare per 5 min a 300 × g. Aspirare il sopranatante, risospendere il pellet nel mezzo fresco preriscaldato e contare le cellule per la semina.
4. Identificare le colture con potenziale di generare linee cellulari osservando le cellule in divisione al microscopio a contrasto di fase. Queste cellule in divisione presentano tipicamente una morfologia arrotondata e cromosomi visibili, come mostrato in Figura 2A.

Risultati

Dopo alcuni giorni, alcuni frammenti tumorali aderiranno alle superfici delle pozzette, avviando la migrazione cellulare dagli espianti. Il tempo trascorso tra il primo allestimento della coltura e la comparsa di cellule tumorali in crescita varia da campione a campione. Le colture iniziali contengono spesso una notevole quantità di detriti cellulari, rendendo difficile valutare la presenza di cellule vitali. Di conseguenza, la coltura deve essere mantenuta per un minimo di 4 settimane. Una volta che le cellule iniziano ...

Discussione

Lo sviluppo di modelli in vitro e preclinici per i gliomi di basso grado con mutazione IDH1 è particolarmente complesso a causa della crescita lenta di questi tumori e della difficoltà di riprodurre le estese alterazioni genomiche ed epigenomiche indotte dalla mutazione IDH. Inoltre, queste cellule tumorali infiltrative interagiscono attivamente con le cellule circostanti, inclusi i linfociti, le cellule endoteliali, le cellule gliali e i neuroni, dai quali potrebbero dipendere per la sopravvivenza. Questo complesso intr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-ASCL1	BD Pharmingen&commercio;		Diluizione 556604 1:500
Diluizione HPA001906 Anti-ATRX	Sigma-Aldrich		1:100
Diluizione Anti-CD68	Agilent	M081401-2	1:500
Diluizione 1:500 Anti-GFAP	Aves Labs	AB_2313547	Diluizione 1:500
Anticorpi Fujifilm Wako	Anticorpi 019-19741	Dilizione 1:1000
Anticorpo monoclonale di topo Anti-IDH1 (R132H)	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Pharmingen&commercio;	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Sistemi®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Diluizione 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	Diluizione EPR14335-78	1:100
Integratore di B-27 (50x), meno vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Albumina sierica bovina (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacina HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	Contenitore per congelamento cellulare, per fiale criogeniche da 12 x 1 mL o 2 mL
Vetrino coprioggetto Ø, 13 mm	Karl Hecht™ Assistente&commercio;
Dimetil Solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, senza glutammina	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAsi I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm Piatto per colture cellulari trattato	con TC Corning®
Falcon 24 pozzetti a fondo piatto trasparente	Corning®	353047	Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC, con coperchio, sterile
Fungin	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
EGF umano	PeproTech	AF-100-15-1MG
FGF umano-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutammina	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Integratore (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Siero acrodisc 37 mm filtro per siringa con GF/0.2 &; m Supor	PALL Corporation	4525
Inibitore della tripsina	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	25300054
Microscopio Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopio	per epifluorescenza a campo largo dritto	Zeiss

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