Articolo metodologico

Imaging FRET a singola molecola per l'osservazione delle dinamiche conformazionali della GTPasi dinamina atlastina

DOI:

10.3791/67263

⸱

24 gennaio 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Le funzioni delle proteine della superfamiglia delle dinamine dipendono dai cambiamenti conformazionali associati all'idrolisi del GTP. Viene descritto un sistema utilizzando la tecnica FRET a molecola singola (smFRET) per monitorare la dinamica conformazionale dell'atlastina GTPasi simile alla dinamina in diversi stati di carico nucleotidico.

Abstract

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La rotazione a corpo rigido del dominio medio a tre elicoidali (3HB) rispetto al dominio GTPasi della proteina dinamina atlastina (ATL) è un fattore cruciale della fusione omotipica della membrana all'interno del reticolo endoplasmatico (ER). Le interruzioni di questo processo sono state associate alla paraplegia spastica ereditaria (HSP), una malattia neurodegenerativa. Studi strutturali e biochimici suggeriscono che i cambiamenti conformazionali nell'ATL sono legati all'idrolisi del GTP, ma la visualizzazione in tempo reale di queste dinamiche conformazionali durante il ciclo di idrolisi del GTP rimane impegnativa. Per comprendere meglio i meccanismi meccanici alla base della funzione ATL, è stato utilizzato il trasferimento di energia di risonanza di Förster a singola molecola (smFRET). Tre strategie specifiche sono state impiegate per immobilizzare la regione citosolica N-terminale di ATL1 umano (ATL1cyto) in una camera microfluidica rivestita di streptavidina, facilitando l'applicazione dell'imaging smFRET intramolecolare e intermolecolare. Ciò ha permesso un monitoraggio preciso delle conformazioni proteiche in vari stati di carico dei nucleotidi, fornendo informazioni dirette sui comportamenti molecolari individuali. Questo metodo può essere applicato anche per studiare altre proteine meccanochimiche.

Introduzione

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Nelle cellule eucariotiche, le proteine della superfamiglia della dinamina mediano il rimodellamento delle membrane biologiche, tra cui la tubulazione, la fissione e la fusione della membrana 1,2,3. Le mutazioni in queste proteine portano a una varietà di malattie umane, come le malattie neurodegenerative. I membri della superfamiglia delle dinamine contengono tipicamente un dominio GTPasi, un dominio intermedio costituito da fasci elicoidali, un motivo per il legame della membrana e un dominio effettore GTPasi (GED). Una di queste GTPasi simili alla dinamina è l'atlastina (ATL), che catalizza la fusione omotipica della membrana del reticolo endoplasmatico (ER) per formare una rete 4,5,6,7,8,9,10. Ci sono tre ATL (ATL1-3) nei mammiferi. La molecola ATL è costituita da una regione citosolica N-terminale (ATL cyto), che include un dominio GTPasi e un dominio medio a tre eliche (3HB), seguita da due regioni transmembrana, ma manca del tipico GED. In alternativa, l'ATL contiene una coda C-terminale che svolge un ruolo cruciale nella fusione della membrana 11,12,13.

È stato riportato che l'efficiente fusione di membrana si basa sul riarrangiamento del dominio dipendente dall'idrolisi GTP in ATLcyto 14,15,16,17,18,19,20. Tuttavia, rispetto al complesso SNARE, che utilizza l'energia di ripiegamento derivante dai cambiamenti conformazionali per guidare la fusione eterotipica di membrana21, il processo di fusione omotipica di membrana mediato da ATL e da altre proteine dinaminiche-simili22 specifiche per la fusione rimane sfuggente. Tre strutture cristalline diATL1 cyto umano sono state determinate in diverse condizioni di carico nucleotidico 14,15,16,23. Nelle strutture, i due 3HB nel dimero puntano in direzioni diverse, ma manca ancora un modello completo che spieghi come le dinamiche conformazionali di ATLcyto e la sua attività GTPasi siano accoppiate.

Nel modello precedente, le molecole monomeriche di ATL formano dimeri attraverso diverse membrane in modo dipendente dal GTP per guidare la fusione della membrana. Qui, vengono descritte tre strategie per applicare il trasferimento di energia di risonanza di Förster a singola molecola (smFRET) per osservare direttamente e rilevare con precisione il comportamento delle singole molecoledi cito ATL1. smFRET è una potente tecnica ampiamente utilizzata per studiare le dinamiche conformazionali e le interazioni di singole biomolecole in tempo reale, come l'attivazione della β-arrestina24 mediata da GPCR, il rimodellamento della cromatina da parte di Snf225 e i riarrangiamenti del dominio della proteina MxA simile alla dinamina accoppiati con cicli di idrolisi GTP26. Poiché smFRET può rilevare efficacemente solo le variazioni della distanza da ~3 nm a ~8 nm, sono necessari esperimenti smFRET sia intermolecolari che intramolecolari per analizzare in modo completo le conformazioni di ATL1cyto per ogni stato di carico nucleotidico. Abbiamo generato tre costrutti di ATL1cyto con tutte le cisteine native sostituite con alanine e K400 (ATL1cyto-K) o la coppia T51/K400 (ATL1cyto-TK) mutata in cisteina per la marcatura dei fluorofori. Le strategie per immobilizzare ilcitodimero o monomero ATL1 in una camera microfluidica rivestita di streptavidina (Figura 1A) per esperimenti smFRET intermolecolari o intramolecolari sono mostrate nella Figura 1B-D. Questo metodo fornisce maggiori dettagli sulla dinamica conformazionale delle proteine dinaminiche in ogni fase dell'idrolisi del GTP27.

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Protocollo

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I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del vetrino coprioggetto modificato per la camera di immobilizzazione delle proteine

  1. Preparazione
    1. Preparare 50 ml di soluzione piranha (composta da acido solforico concentrato e perossido di idrogeno in un rapporto di 3:1) aggiungendo lentamente perossido di idrogeno all'acido solforico concentrato per evitare temperature eccessive. Mettilo con cura in una cappa aspirante.
    2. Preparare la soluzione di etossido di sodio. Sciogliere 2 g di NaOH in 15 mL di ddH2O, aggiungere 35 mL di etanolo assoluto e mescolare completamente. Lasciare a temperatura ambiente.
    3. Preparare una soluzione ad alto contenuto di sale (0,1 M di NaHCO3 e 0,6 M di K2SO4). Sciogliere completamente e aliquotare 500 μL/provetta. Conservare a -20 °C.
    4. Aliquotare SVA-mPEG e SVA-mPEG-biotina in circa 30 mg per provetta e 3 mg per provetta. Conservare a -20 °C.
    5. Personalizza i vetrini del microscopio (75 mm × 26 mm × 1 mm) con 6 coppie di fori da 1,2 mm di diametro.
  2. Pulizia della superficie del vetrino coprioggetti
    1. Usa le pinzette per raccogliere otto vetrini coprioggetti e metterli in un barattolo per colorare. Aggiungere acetone (~50 mL) per coprire i vetrini, mettere il barattolo di colorazione in un pulitore a ultrasuoni per 30 minuti, quindi sciacquare i vetrini tre volte con ddH2O.
    2. Lavare i vetrini coprioggetti con metanolo come al punto 1.2.1.
    3. Aggiungere la soluzione di piranha (passaggio 1.1.1) al barattolo di colorazione e scaldarlo in un bollitore a bagnomaria a 95 °C per 2 ore. Dopo che il barattolo di colorazione si è raffreddato a temperatura ambiente, sciacquare i vetrini coprioggetti almeno sei volte con ddH2O.
    4. Aggiungere la soluzione di etossido di sodio nel barattolo di colorazione, metterla in un pulitore a ultrasuoni per 15 minuti, quindi risciacquare tre volte con ddH2O.
    5. Aggiungere ddH2O al barattolo di colorazione per coprire i vetrini, immergerlo in un pulitore a ultrasuoni per 15 minuti e successivamente risciacquare 3 volte con ddH2O.
  3. Modifica dell'aminosilan della superficie del vetrino.
    1. Fissare i vetrini coprioggetti nel barattolo di colorazione su un banco pulito, asciugarli con azoto e metterli in un altro barattolo di colorazione (asciugato in anticipo).
    2. Cuocere il barattolo di colorazione in un forno di essiccazione a 120 °C per 30 minuti, quindi raffreddare a temperatura ambiente in un essiccatore.
    3. Aggiungere 47,5 mL di metanolo, 2,5 mL di acido acetico e 0,5 mL di 3-Aminopropiltrietossisilano (APTES) nel becher (essiccato in anticipo), mescolare uniformemente, aggiungere al barattolo di colorazione e incubare per 10 minuti.
    4. Sciacquare i vetrini coprioggetti nel barattolo di colorazione con ddH2O almeno tre volte e sonicare per 5 minuti.
    5. Estrarre i vetrini coprioggetti uno per uno, sciacquare con ddH2O, asciugare con azoto e metterli in una capsula di Petri di 10 cm di diametro per prepararli alla modifica PEG.
      NOTA: La modifica APTES deve essere eseguita in un ambiente asciutto.
  4. Modifica della superficie del vetrino coprioggetto con SVA-mPEG-Biotina e SVA-mPEG
    NOTA: La modifica della biotina della superficie del vetrino aiuta a trattenere le proteine biotinilate (o le proteine che si legano alla biotina-anti-His) tramite streptavidina.
    1. Sciogliere completamente SVA-mPEG e SVA-mPEG-Biotina confezionati nella soluzione ad alto contenuto di sale (1 mg corrispondente a 10 μL di soluzione ad alto contenuto di sale). Aggiungere la soluzione SVA-mPEG-Biotina alla soluzione SVA-mPEG con un rapporto di 1:100.
      NOTA: Utilizzare un vortice per agitare la soluzione per assicurarsi che SVA-mPEG o SVA-mPEG-Biotina sia completamente disciolta. La soluzione acquosa SVA-mPEG o SVA-mPEG-Biotina deve essere preparata prima dell'uso.
    2. Far cadere la soluzione di miscela preparata su un vetrino coprioggetti e coprirla con un altro vetrino coprioggetti. Questo processo dovrebbe prevenire la generazione di bolle. Incubare completamente i vetrini coprioggetti con un'umidità adeguata per più di 2 ore o durante la notte.
    3. Separare i vetrini coprioggetti al termine della modifica, sciacquarli con ddH2O e asciugare con azoto. Segnare la superficie del vetrino coprioggetti che non è stata modificata con SVA-mPEG e SVA-mPEG-biotina.
    4. Posizionare con cautela il vetrino coprioggetti modificato in una provetta da microcentrifuga da 50 mL. Conservare a -20 °C dopo l'aspirazione.
      NOTA: Il vetrino coprioggetti modificato può essere conservato sottovuoto per 1 mese.

2. Preparazione di vetrini per microscopio per camera di immobilizzazione delle proteine

  1. Lavare i vetrini del microscopio come descritto per i vetrini coprioggetti al punto 1.2.
  2. Asciugare i vetrini del microscopio con azoto e metterli in provette da microcentrifuga da 50 ml.
  3. Conservare i vetrini del microscopio come descritto al punto 1.4.4.

3. Espressione e purificazione delle proteine

  1. Preparazione
    1. Plasmidi: clonare il membro della famiglia delle atlastine di interesse o la mutazione patogena di interesse in un vettore di espressione batterica, ad esempio pET-28a, e aggiungere un Avitag27. Introdurre cisteine in posizioni rilevanti mediante mutagenesi sito-specifica (ad esempio, T51C e K400C27).
    2. Preparare i seguenti buffer.
      1. Terreno di coltura Luria-Bertani (LB): Mescolare 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio in 1 L di ddH2O. Autoclave a 121°C per 20 min.
      2. Tampone di lisi: Miscelare 25 mM di HEPES (pH 7,4), 150 mM di KCl, 5 mM di MgCl2, 1 cocktail completo di inibitori della proteasi privi di EDTA, 10 mM di imidazolo e 0,5 mM di TCEP. Conservare a 4 °C.
      3. Tampone di lavaggio: Miscelare 25 mM di HEPES (pH 7,4), 150 mM di KCl, 5 mM di MgCl2, 30 mM di imidazolo e 0,5 mM di Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP). Conservare a 4 °C.
      4. Eluire il tampone: Miscelare 25 mM di HEPES (pH 7,4), 150 mM di KCl, 5 mM di MgCl2, 150 mM di imidazolo e 0,5 mM di TCEP. Conservare a 4 °C.
      5. Tampone di purificazione: 25 mM di HEPES (pH 7,4), 150 mM di KCl, 5 mM di MgCl2, 0,5 mM di TCEP. Conservare a 4 °C.
  2. Purificazione delle proteine
    1. Trasferire i plasmidi27 in cellule di E. coli Rosetta (DE3) (Biomed) utilizzando metodi di shock termico di trasformazione batterica. Sospendere le cellule trasferite nel terreno di coltura LB con l'aggiunta di una concentrazione finale di 50 μg/μL di kanamicina.
      1. Coltura a 37 °C fino a quando l'assorbanza del terreno di coltura a 600 nm è 0,6-0,8. Aggiungere isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) a una concentrazione finale di 50 μM per indurre l'espressione proteica a 16 °C per 20-24 ore.
        NOTA: Il tasso di crescita delle colture cellulari batteriche o di altri microbi può essere monitorato misurando la densità ottica (assorbanza) della coltura di crescita cellulare a 600 nm.
    2. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 4000 × g per 20 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet cellulare con 30 mL di tampone di lisi. Distruggere le celle tre volte utilizzando un frantoio a celle ad alta pressione.
    4. Chiarificare i lisati mediante centrifugazione a 2,00,000 × g per 1 ora a 4 °C utilizzando un rotore per ultracentrifuga.
    5. Isolare la proteina utilizzando una colonna Ni-NTA. Lavare la colonna Ni-NTA con tampone di lavaggio per 5 volumi di colonna. Eluire la proteina con tampone di eluizione per 1 volume di colonna. Raccogliere l'eluato e concentrarlo utilizzando filtri centrifughi a ~ 500 μL.
    6. Inoltre, purificare la proteina mediante cromatografia ad esclusione dimensionale27. Raccogliere l'eluato (500 μl per provetta).
    7. Confermare la proteina bersaglio in base al suo peso molecolare determinato mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)27. Raccogli la proteina bersaglio per ulteriori modifiche.

4. Biotinilazione delle proteine

  1. Preparazione
    1. Preparare le seguenti soluzioni stock.
      1. Sciogliere l'acetato di magnesio tetraidrato (MgOAc·4H2O) in 25 mM di tampone HEPES (pH 7,7) a una concentrazione di 100 mM (10×). Aliquotare 100 μl per provetta e conservare a -20 °C.
      2. Sciogliere l'adenosina 5-trifosfato sale disodico (ATP) in ddH2O a una concentrazione di 100 mM (10×). Regolare il pH a 7,4 utilizzando NaOH. Aliquotare 100 μl per provetta e conservare a -80 °C.
      3. Sciogliere la d-biotina in ddH2O alla concentrazione di 500 μM. Aliquotare 100 μl per provetta e conservare a -20 °C.
      4. Sciogliere la streptavidina in ddH2O ad una concentrazione di 1 mg/mL. Aliquotare 20 μl per provetta e conservare a -20 °C.
    2. Tampone per biotinilazione delle proteine: aggiungere 25 mM di HEPES (pH 7,7), 200 mM di acido L-glutammico di potassio e 0,5 mM di TCEP. Conservare a 4 °C.
    3. Purificare la biotina ligasi BirA e conservare a -80 °C.
  2. Biotinilazione delle proteine
    1. Cambiare il tampone proteico con il tampone di biotinilazione proteica. Per la biotinilazione, miscelare 100 μL di ATP 100 mM, 100 μL di MgOAc 100 mM, 100 μL di d-biotina 500 μM, 10 μL di biotina ligasi BirA da 100 μM, 50 μM di proteina fino al volume finale di 1 mL e incubare per una notte a 4 °C.
    2. Rimuovere la d-biotina libera utilizzando un filtro centrifugo MWCO da 10 K.
    3. Incubare 20 μL di proteina biotinilata con 20 μL di streptavidina 15 μM per 20 minuti con ghiaccio. Rileva l'efficienza della biotinilazione delle proteine mediante SDS-PAGE27.

5. Marcatura con fluorofori proteici

  1. Preparazione
    1. Sciogliere i fluorofori LD555 (donatore) e LD655 (accettore) in dimetilsolfossido (DMSO) a una concentrazione finale di 5 mM. Conservare a -20 °C.
    2. Preparare il tampone di marcatura: miscelare 25 mM di HEPES (pH 7,4), 150 mM di KCl e 5 mM di MgCl2. Conservare a 4 °C.
    3. Sostituire il tampone proteico con il tampone di etichettatura.
  2. Etichettatura con fluorofori
    1. Per i saggi intramolecolari smFRET, miscelare ATL1cito-TK con LD555 e LD655 in un rapporto di 1:1,2:1,2 con un volume finale di 100 μL (il volume totale dei fluorofori non deve superare 1 μL) e incubare per 5 ore a 4 °C.
    2. Per gli esperimenti intermolecolari smFRET, incubare ATL1cito-K o ATL1cito-T con LD555 in un rapporto di 1:1,2 e contemporaneamente incubare ATL1cito-K biotinilato con LD655 in un rapporto di 1:1,2, per 5 ore a 4 °C (stesso volume di incubazione di 5.2.1).
      NOTA: La co-incubazione di proteine e coloranti consente flessibilità nelle posizioni di marcatura per LD555 (donatore) e LD655 (accettore). Il fatto che LD555 sia marcato come T51C o K400C non influisce sui risultati dell'esperimento FRET. Viene fornito un diagramma schematico del donatore che viene etichettato nel sito T51C (Figura 1C, D).
    3. Rimuovere i fluorofori liberi in eccesso utilizzando le colonne di desalinizzazione a rotazione MWCO7 K 27.
    4. Aggiungere TCEP alle proteine marcate con fluorofori a una concentrazione finale di 0,5 mM.
    5. Rileva l'efficienza di marcatura delle proteine utilizzando uno spettrofotometro. Misurare l'assorbanza delle proteine a 280 nm, l'assorbanza LD555 a 555 nm e l'assorbanza LD555 a 655 nm e calcolare le concentrazioni molari utilizzando rispettivamente i loro coefficienti di estinzione. Efficienza di marcatura delle proteine = (concentrazione molare del colorante fluorescente/concentrazione molare della proteina) x 100%.

6. Imaging FRET a molecola singola

  1. Preparazione
    1. Preparare il tampone di incubazione: miscelare 25 mM di HEPES (pH 7,4), 150 mM di KCl e 5 mM di MgCl2. Conservare a 4 °C.
    2. Preparare 1 mg/mL di streptavidina (disciolta in ddH2O) e 1 mg/mL di anticorpo anti-His biotinilato per l'immobilizzazione delle proteine.
    3. Preparare 25 mM di acido benzoico (pH 7,4; disciolto nel tampone come descritto in 7.1.1) e 100 mM di protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) (disciolto in una soluzione di glicerina al 40%) per ridurre al minimo il fotosbiancamento durante gli esperimenti smFRET.
    4. Preparare 100 mM di guanosina 5'-difosfato sale sodico (GDP), guanosina 5'-O-[gamma-tio]trifosfato (GTPγS) e AlCl3 disciolte in ddH2O. Preparare 1 M di soluzione madre NaF disciolta in ddH2O.
    5. Estrarre il vetrino coprioggetti e il vetrino da microscopio conservati sottovuoto e incollarli con cura insieme con nastro biadesivo personalizzato su un banco pulito. Installare tubi flessibili e punte per formare una camera microfluidica con sei canali27.
      NOTA: Non esporre il vetrino coprioggetti modificato all'aria per lunghi periodi di tempo. Preparare la camera microfluidica27 prima di iniziare gli esperimenti smFRET.
  2. Correzione della mappatura
    NOTA: Durante l'esperimento, i segnali di fluorescenza devono essere raccolti rispettivamente dai canali donatore e accettore. A causa dell'uso di microscopi, possono verificarsi lievi deviazioni nei campi di monitoraggio dei canali donatori e accettori. Al fine di ridurre la deviazione nei campi di monitoraggio, è necessario eseguire la calibrazione della mappatura prima di iniziare l'esperimento.
    1. Mescolare accuratamente il 10% di particelle di polistirene (diametro 3 μm), aggiungere 10 μL di particelle a un vetrino da microscopio (non modificato) e coprire con un vetrino coprioggetti (non modificato).
    2. Seleziona un campo visivo con il maggior numero possibile di particelle di polistirolo. Cattura un video in campo luminoso utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF).
      NOTA: Per l'imaging ad alta risoluzione è stato utilizzato un obiettivo a immersione in olio ad alta apertura numerica (100x). Per gli esperimenti smFRET, i segnali sono stati catturati a intervalli di 30 ms utilizzando una fotocamera EMCCD.
    3. Utilizzare uno script personalizzato per allineare la posizione centrale della stessa particella di polistirene nel canale donatore e nel canale accettore e salvare il file mappa come file txt. Il codice MATLAB personalizzato utilizzato in questo studio è disponibile all'indirizzo https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Immobilizzazione delle proteine nella camera
    1. Per gli esperimenti intermolecolari smFRET, mescolare ATL1cito-K marcato con LD555 oATL1 cito-T eATL1 cito-K-biotina marcato con LD655 a un rapporto di 1:1 con una concentrazione finale di 1 mM di GTPγS o GDP/AlF4-, e incubare per 1 ora su ghiaccio per dimerizzare la proteina.
    2. Per gli esperimenti intermolecolari smFRET ATL1cito-T e ATL1cito-K , mescolare ATL1cito-T marcato con LD555 eATL1 cito-K-biotina marcato con LD655 a un rapporto di 1:1 con una concentrazione finale di 1 mM di GTPγS o GDP/AlF4-, e incubare per 1 ora su ghiaccio per ottenere proteine dimerizzate.
    3. Per i saggi intramolecolari smFRET, incubare ilcito-TK ATL1 marcato con LD555 e LD655 con 1 mM di GDP per 1 ora su ghiaccio prima di eseguire gli esperimenti smFRET in condizioni di GDP.
    4. Per gli esperimenti intermolecolari smFRET, incubare 10 μg/mL di streptavidina (diluita con 200 μL di tampone di incubazione) per 10 minuti per immobilizzare le proteine. Per i saggi intramolecolari smFRET, aggiungere 10 μg/mL di anticorpo anti-His biotinilato (diluito con 200 μL di tampone di incubazione) e incubare per 10 minuti per immobilizzare le proteine. Lavare il canale una volta con un tampone di incubazione prima di aggiungere ogni soluzione.
    5. Diluire il dimero ATL1 a ~0,3 nM o il monomero a ~1 nM in un tampone di incubazione da 200 μL e incubare per 10 minuti per immobilizzare le proteine nel canale. Lavare due volte il canale con il tampone di incubazione. Aggiungere acido benzoico e PCD al canale a una concentrazione finale di 2,5 mM (diluito con 200 μL di tampone).
      NOTA: Per simulare i diversi stadi delle molecole dicito ATL1 nel processo di idrolisi del GTP, il nucleotide (GDP, GTPγS e GDP/AlF4-) è stato aggiunto a una concentrazione finale di 1 mM ai tamponi in ogni passaggio dopo aver immobilizzato la proteina nel canale. L'addizione di GTPγS imita il legame di GTP, l'addizione di GDP/AlF4 imita l'idrolisi di GTP, l'addizione di GDP imita il rilascio di Pi e l'apo sate rappresenta il rilascio di GDP.
  4. Imaging smFRET
    1. Regolare il piano focale. Utilizzare le manopole di messa a fuoco grossolana e fine, regolare il piano focale per mettere a fuoco il campione. In questo caso, è stato utilizzato un sistema di messa a fuoco automatizzato per ottenere la messa a fuoco ottimale.
    2. Impostare la fonte di eccitazione. Utilizzare il laser a 532 nm come sorgente luminosa di eccitazione. Regolare la potenza del laser a un livello adeguato per eccitare i fluorofori. In questo caso, è stata utilizzata una potenza laser di 20-40 mW.
    3. Collegare la fotocamera EMCCD al microscopio. Impostare la fotocamera in modo che registri a un intervallo di fotogrammi di 30 ms. Assicurarsi che la fotocamera sia impostata per acquisire immagini in modalità a 16 bit per dati ad alta risoluzione.
    4. Registra il filmato, assicurandoti che la messa a fuoco rimanga costante durante l'acquisizione. Estendere il tempo di irradiazione laser a 532 nm il più a lungo possibile fino a quando la maggior parte delle molecole fluorescenti non si spegne durante la registrazione dei segnali di fluorescenza.
    5. Salva i filmati registrati in formato TIFF a 16 bit per ulteriori analisi.

7. Acquisizione e analisi dei dati

  1. Caricare il file txt della mappa per la correzione prima di estrarre le traiettorie FRET dai filmati registrati. Selezionate le traiettorie FRET e salvate tutti i dati delle traiettorie FRET in formato txt per ulteriori analisi.
  2. Estrai i dati dai file txt e calcola i valori FRET utilizzando gli script fatti in casa in Matlab2022a. Il codice MATLAB personalizzato è disponibile all'indirizzo https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    NOTA: Il valore FRET viene calcolato utilizzando l'equazione ILD655/(γILD555+ILD655). ILD555 e ILD655 rappresentano rispettivamente le intensità di fluorescenza LD555 e LD655. γ è un parametro ottenuto dalla formula γ = FA/FD. FA rappresenta il decremento dell'intensità dell'accettore e FD è l'incremento dell'intensità del donatore.
  3. Adatta i dati smFRET di GaussAmp in Origin 2022 per ottenere l'istogramma di distribuzione.
    NOTA: Per i dati con più stati FRET (i dati in condizione GTPγS in smFRET intermolecolare o i dati di smFRET intramolecolare in condizione GDP o Apo), è possibile utilizzare l'adattamento multi-picco.

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Risultati

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Gli esperimenti smFRET sono stati eseguiti su un microscopio TIRF catturando l'intensità di fluorescenza dei fluorofori ogni 30 ms. Nella Figura 2A-C sono mostrate immagini rappresentative dimolecole di cito ATL1 marcate con LD555 (donatore) e/o LD655 (accettore) in assenza o presenza di nucleotidi diversi. Sono state registrate le intensità di fluorescenza dei due fluorofori su singole particelle e sono state estratte centinaia di traiettorie FRE...

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Discussione

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La tecnologia FRET si basa sul trasferimento di energia tra due coloranti fluorescenti (donatore e accettore). Nel caso della loro vicinanza reciproca (di solito 1-10 nm), il donatore eccitato trasferisce la sua energia all'accettore, con conseguente diminuzione dell'intensità della fluorescenza del donatore e aumento dell'intensità della fluorescenza dell'accettore.

Negli esperimenti smFRET, le molecole vengono diluite a concentrazioni molto basse e immobiliz...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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X.B. è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32371287), dai Fondi per la Ricerca di Base per le Università Centrali (63223043 e 63233053) e dal Talent Training Project presso l'Università di Nankai (035-BB042112). Y.L. è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (12022409 e T2221001) e dal CAS Key Research Program of Frontier Sciences (ZDBS-LY-SLH015). L.M. è sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (32271274 e 31770812).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtri centrifughi 10 KAmiconUFC901096
3-amminopropiltrietossisilano (APTES) Sigma-Aldrich440140
Rotore
Laser 532 nmLaser Olympus
640 nmOlympus
7 K MWCOThermo Scientific89882
Adenosina 5-trifosfato sale disodico (ATP)Roche11140965001
Acido benzoicoSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinilato anti Anticorpo HisBioss Anticorpibs-0287R-bio
d-biotinaSigma-AldrichB4501
Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTARoche11873580001
Telecamera EMCCDAndorIX897
Guanosina 5′-difosfato sale sodico (GDP)Sigma-Aldrich  G7127
Guanosina 5'-O-[gamma-tio]trifosfato (GTPγ S)Roche10220647001
Obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numericaNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, immersione in olio
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
Acido L-glutammico potassioSigma-AldrichG1501
Acetato di magnesio tetraidratoSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Vetro di copertura del microscopioFisherbrand18834 ( 24 mm & tempi; 60 mm)
VetriniPersonalizzato, (75 mm & volte; 26 mm & volte; 1 mm) con 6 coppie di fori passanti da 1,2 mm
di diametro mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginSoftwareOrigin https://www.originlab.com/
Particelle di polistireneQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-diossigenasiSigma-AldrichP8279
StreptavidinaSangon BiotechA610492
Superdex 200 Aumento (10/300 GL)Cytiva28990944
Microscopio TIRFNikonTi2
Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP)Thermo75259
45 Ti Colonne di desalinizzazione a rotazione per microscopio

Riferimenti

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Single Molecule FRETConformational DynamicsAtlastin GTPaseGTP HydrolysisProtein ImmobilizationIntramolecular FRETIntermolecular FRETEndoplasmic Reticulum FusionTotal Internal ReflectionEMCCD Camera

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