Utilizzo di Mycobacterium smegmatis come bioindicatore per le condizioni di crescita limitata allo zinco nei micobatteri

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione di terreni limitati da Zn²⁺, vasi di crescita e colture di semi per produrre ribosomi limitati da Zn²⁺ nei micobatteri. Tracce di Zn²⁺ portano a una crescita limitante di Zn²⁺ e descriviamo le caratteristiche morfogeniche utilizzate come bioindicatori per verificare la limitazione di Zn²⁺ in vitro nel batterio modello, Mycobacterium smegmatis, e nel patogeno umano M. tuberculosis.

Abstract

Molti batteri costruiscono ribosomi alternativi in condizioni di crescita limitanti Zn²⁺, sostituendo le proteine ribosomiali leganti Zn²⁺ con paraloghi indipendenti da Zn²⁺. La definizione di un sistema per studiare questi ribosomi alternativi si è rivelata difficile perché la contaminazione da Zn²⁺ in laboratorio è comune. Per affrontare questo problema, gli agenti chelanti vengono talvolta aggiunti ai terreni di crescita, ma questo approccio complica la risposta biologica alla graduale limitazione di Zn²⁺ ed è associato al letargo dei ribosomi. Qui, vengono delineate istruzioni dettagliate per la preparazione dei terreni e le colture di semina per una crescita limitata a Zn²⁺ senza l'aggiunta di chelanti. Seguendo questo metodo, il batterio modello, Mycobacterium smegmatis, subisce la morfogenesi, che dipende da ribosomi alternativi. Poiché la morfogenesi è trattabile e si verifica solo in condizioni limitanti di Zn²⁺, M. smegmatis può essere utilizzato come bioindicatore per verificare le condizioni di crescita biologicamente rilevanti. Vengono descritti tre fenotipi di bioindicatori (densità cellulare, lunghezza cellulare e fluorescenza del coenzima F₄₂₀) che indicano una limitazione di Zn²⁺ nel wild-type e vengono delineati i cambiamenti in questi bioindicatori per un mutante di delezione che non può costruire ribosomi alternativi. Poiché la contaminazione da tracce di Zn²⁺ è difficile da controllare per ogni lotto di terreno e la quantificazione precisa di Zn²⁺ in ogni preparazione di terreno è eccessivamente onerosa, seguire questo fenotipo di bioindicatore è un modo accessibile per convalidare la preparazione di terreni di crescita limitati da Zn²⁺. Per aiutare a identificare le condizioni corrette per la crescita limitante di Zn²⁺ e la produzione alternativa di ribosomi, sono stati profilati cambiamenti nei fenotipi dei bioindicatori anche per preparazioni contaminate da Zn²⁺ o gravemente impoverite di Zn²⁺ di terreni limitati da Zn²⁺. Vengono presentati ulteriori dettagli per ottenere una crescita limitante di Zn²⁺ e una produzione alternativa di ribosomi in M. tuberculosis, insieme al fenotipo bioindicatore associato. Nel complesso, le istruzioni dettagliate e i fenotipi bioindicatori qui descritti aiuteranno a standardizzare la produzione di ribosomi alternativi traduzionalmente attivi nei micobatteri.

Introduzione

Lo ione zinco (Zn²⁺) è un micronutriente essenziale e un componente standard dei mezzi microbiologici. Tuttavia, molti batteri sopportano la limitazione di Zn²⁺ nell'ambiente poiché le condizioni limitanti di Zn²⁺ sono diffuse; soil¹, marine² e nicchie all'interno dell'host³ sono spesso limitate a Zn²⁺. Pertanto, la maggior parte dei batteri ha sviluppato meccanismi per superare la limitazione di Zn²⁺ e preservare la funzione cellulare⁴. I sistemi coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi di Zn²⁺ sono sotto stretto controllo trascrizionale⁵ e sono coinvolti nello scavenging di Zn²⁺ utilizzando sistemi di importazione di Zn²⁺ ad alta affinità, mobilizzando le riserve cellulari di Zn²⁺ e sostituendo alcune proteine leganti Zn²⁺ con paraloghi alternativi indipendenti da Zn²⁺⁶. Un esempio di quest'ultimo è rappresentato dai paraloghi della proteina ribosomiale (RPs) Zn²⁺-indipendente, che sono una caratteristica comune dei regolatori Zn²⁺-responsivi nei batteri⁴. Questi RP indipendenti da Zn²⁺ altamente divergenti si distinguono dai loro paraloghi di legame Zn²⁺ per l'interruzione del motivo CXXC di legame Zn²⁺⁷. Più della metà dei genomi procariotici sequenziati contiene almeno una coppia di RP duplicati dove, in molti di essi, un RP lega Zn²⁺, mentre il suo paralogo non⁸. Mentre la notazione C+/C- (che indica la presenza/assenza del motivo di legame Zn²⁺ ricco di cisteina) è comunemente usata in riferimento a queste coppie di RP paraloghi⁷, gli RP indipendenti da Zn²⁺ sono stati anche descritti come versioni alternative (Alt) dei paraloghi RP primari (Prim), che legano Zn²⁺, poiché gli AltRP servono come RP alternativi per la biogenesi dei ribosomi nello Zn²⁺-condizione limitata in alcuni batteri ed è una parola chiave con una migliore ricercabilità^9,10,11.

Poiché l'espressione di AltRP è strettamente regolata da Zn²⁺, è logico supporre che l'espressione di AltRP offra ridondanza funzionale alle proteine ribosomiali Zn²⁺-dipendenti a fronte della limitazione di Zn²⁺. Infatti, questa caratteristica degli AltRP è stata dimostrata per il batterio del suolo modello Bacillus subtilis, dove la crescita viene salvata durante la limitazione di Zn²⁺ liberando il PrimRP L31 di superficie e sostituendolo con l'AltRP L31^12,13. Tuttavia, alcuni AltRP sono paraloghi ai PrimRP principali, ad esempio S14, il che significa che la loro incorporazione è necessaria durante la biogenesi dei ribosomi^12,13. La ricostruzione del ribosoma con gli AltRP è un programma impegnato e ad alta intensità energetica. Mentre questi AltRP principali possono servire a liberare Zn²⁺ dal ribosoma, è anche possibile che alcuni AltRP abbiano sviluppato una funzione aggiuntiva nell'ambiente limitato da Zn²⁺. Ciò è supportato dall'osservazione che gli AltRP divergono dai loro PrimRP paraloghi; l'omologia di sequenza dei geni AltRP è spesso più alta tra gli omologhi in specie diverse rispetto alla sequenza genica PrimRP legante Zn²⁺ all'interno della stessa specie^7,10. Poiché i geni che codificano AltRP altamente divergenti sono sotto controllo trascrizionale Zn²⁺-dipendente, vengono rimossi dalla pressione selettiva esercitata sui superoperoni ribosomiali strettamente regolati e altamente conservati¹⁴. La pressione selettiva disaccoppiata sull'informazione genetica che codifica il macchinario ribosomiale e gli AltRP espone questi RP a traiettorie evolutive diverse rispetto ai PrimRP omologhi e potrebbe consentire l'evoluzione specifica del lignaggio dello stesso AltRP in diversi batteri^10,15. L'esistenza diffusa di AltRP nei batteri e la regolazione genetica disaccoppiata di questi RP unici solleva un'interessante questione se l'incorporazione di AltRP nei ribosomi batterici conferisca una proprietà speciale ai ribosomi contenenti AltRP (Alt-ribosomi).

I micobatteri sono un gruppo ideale di batteri per studiare le proprietà meccanicistiche degli alt-ribosomi. Innanzitutto, i micobatteri possiedono un operone altRP altamente conservato contenente quattro geni che codificano per AltRP: S14-2, S18-2, L28-2 e L33-2^8,9. Gli AltRP micobatterici sono significativamente diversi dai loro paraloghi PrimRP; in tutte e quattro le coppie PrimRP/AltRP, un dato gene AltRP è più simile in tutte le specie micobatteriche di quanto non lo sia al gene PrimRP nella stessa specie¹⁰. L'evoluzione specifica del lignaggio degli AltRP è evidente anche all'interno dei micobatteri, come evidenziato dagli AltRP S18-2 e L28-2 in Mycobacterium tuberculosis e M. bovis, che contengono sequenze uniche all'estremità C che non sono presenti in altri micobatteri¹⁰. In secondo luogo, questo gruppo di batteri altamente correlati contiene membri non patogeni e patogeni che risiedono in ambienti diversi, dal suolo (ad esempio, M. smegmatis) a una miriade di ospiti: umani (ad esempio, M. tuberculosis), bovini (ad esempio, M. bovis), acquatici (ad esempio, M. marinum) e aviari (ad esempio, M. avium), solo per citarne alcuni. La natura altamente conservata dell'operone altRP nei micobatteri, l'evoluzione specifica del lignaggio di specifici geni AltRP e gli ambienti molto diversi in cui esistono i membri di questo gruppo forniscono un'opportunità unica per analizzare l'evoluzione conservata e specifica del lignaggio della funzione AltRP e le proprietà meccanicistiche degli alt-ribosomi. Nonostante l'abbondanza di AltRP nei genomi procariotici, il ruolo degli AltRP e degli Alt-ribosomi è stato studiato solo in pochi batteri^{9,10,11,12,13,16,17,18,19}. La creazione di un sistema standardizzato con metriche specifiche per convalidare le condizioni di crescita limitanti lo Zn²⁺ nei micobatteri migliorerebbe i risultati sperimentali e farebbe progredire la comprensione degli alt-ribosomi nel campo della ricerca sui ribosomi.

Zn²⁺ è un micronutriente; pertanto, tracce di contaminazione di Zn²⁺ nelle sostanze chimiche e nell'acqua contribuiscono alla biodisponibilità di Zn²⁺, anche se omesso dalla preparazione del terreno. Le tracce di Zn²⁺ presenti nell'acqua o nelle sostanze chimiche possono variare drasticamente da un laboratorio all'altro, influenzando così l'esito della crescita che limita lo Zn²⁺. Quantificare empiricamente lo [Zn²⁺] in ogni preparazione indipendente di terreni è eccessivamente oneroso per la maggior parte dei laboratori che conducono saggi di crescita di routine, ma un meccanismo per eliminare la possibilità di contaminazione da Zn²⁺ nei terreni di crescita sarebbe intrinsecamente prezioso. A tal fine, qui viene presentato un metodo dettagliato per preparare un terreno limitato da Zn²⁺ chimicamente definito (ZLM), vasi di crescita e colture di semi per la crescita limitante di Zn²⁺ e la produzione di ribosomi alternativi in M. smegmatis e M. tuberculosis. Le caratteristiche morfogeniche chiave (densità cellulare misurata da OD₆₀₀, lunghezza cellulare e fluorescenza del coenzima F₄₂₀) dopo la crescita in ZLM sono utilizzate per verificare che la limitazione di Zn²⁺ sia stata raggiunta. Il coenzima F₄₂₀ è un cofattore della deazaflavina che ha ruoli importanti nel catabolismo e nella difesa contro lo stress ossidativo nei metanogeni e nei micobatteri^20,21. È importante sottolineare che i micobatteri sono autofluorescenti quando eccitati a 420 nm a causa dell'abbondanza di questo cofattore²². Il legame molecolare tra [Zn²⁺] e la fluorescenza F₄₂₀ rimane irrisolto, ma seguire la fluorescenza F₄₂₀ nelle colture è un bioindicatore trattabile e affidabile.

In M. smegmatis, i fenotipi bioindicatori si verificano nei batteri wild-type, ma un mutante di delezione privo dell'operone altRP non subisce lo stesso programma morfogenico e può essere utilizzato come bioindicatore differenziale¹⁰. Sebbene M. tuberculosis non segua lo stesso programma morfogenico di M. smegmatis durante la limitazione di Zn²⁺, M. tuberculosis ha una risposta robusta e globale allo Zn^{Limitazione 2+} e fenotipo bioindicatore chiave che segue questo metodo²³. Pertanto, il sistema qui definito consente di generare ribosomi Prim e Alt- nelle stesse condizioni di crescita (cioè limitazione di Zn²⁺), facilitando la dissezione meccanicistica della funzione dell'alt-ribosoma e il suo ruolo nel plasmare la fisiologia batterica. Questo metodo di crescita è stato utilizzato per risolvere la struttura di Ribosomi Alternativi attivi e dimostrare la loro attività traslazionale in M. smegmatis²⁴. A ulteriore sostegno del fatto che questo metodo di crescita e fenotipo bioindicatore evidenzia la funzionalità biologica degli AltRP durante la limitazione di Zn²⁺, l'espressione di AltRP è necessaria per la morfogenesi Zn²⁺-dipendente e ha un profondo effetto sul trascrittoma e sul proteoma di M. smegmatis^{2+ class="xref">10,25}. Lo stesso metodo, con piccole modifiche nella quantità di inoculo e nel tempo di incubazione, viene utilizzato per generare colture limitate a Zn²⁺ di M. tuberculosis^9,23. Qui, vengono dettagliati i protocolli e i fenotipi dei bioindicatori per ottenere una crescita limitante di Zn²⁺ sia in M. smegmatis che in M. tuberculosis, con particolare attenzione a M. smegmatis poiché questo batterio è più sensibile alla contaminazione da Zn²⁺ nei terreni ed è più ampiamente accessibile rispetto al patogeno a crescita lenta.

Protocollo

NOTA: I ceppi utilizzati in questo studio sono M. smegmatis wild-type mc² 155 (donato dal Dott. Robert Husson, Boston Children's Hospital) e il ceppo di delezione ΔaltRP (proveniente dal laboratorio Prisic¹⁰). Possono essere coltivati in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 1 (BSL1) o in un laboratorio BSL2, a seconda delle normative locali sulla sicurezza biologica e delle risorse disponibili. Qui, il protocollo è descritto per un laboratorio BSL2. Se eseguito in un laboratorio BSL1, una tecnica asettica con becco Bunsen può sostituire la cappa di sicurezza biologica. Inoltre, i ricercatori che desiderano includere altri ceppi o condizioni dovranno calcolare il volume di terreno necessario in base al numero totale di colture analizzate. Manipolare M. tuberculosis patogeno H37Rv (Mtb-H37Rv; donato dal Dott. Robert Husson, Boston Children's Hospital) in un laboratorio BSL3 indossando un respiratore (ad esempio, PAPR o N95). Non riutilizzare fiasche durante la coltivazione di micobatteri altamente virulenti, come Mtb-H37Rv. M. tuberculosis auxotrofo mc²6206 (Mtb-Aux) è attenuato e può essere manipolato in un laboratorio BSL2 (donato dal Dott. William R. Jacobs Jr., Albert Einstein College of Medicine).

1. Preparazione dei flaconi

NOTA: Le condizioni di crescita limitanti per Zn²⁺ vengono ottenute in palloni Erlenmeyer in policarbonato riutilizzabili (autoclavabili) da 250 mL. Non utilizzare palloni in vetro per la crescita limitante in Zn²⁺, oppure investigare e confrontare rigorose procedure di lavaggio acido con i risultati presentati in questo protocollo¹⁹. Palloni nuovi di fabbrica sono adeguati per ottenere condizioni di crescita limitanti per Zn²⁺, ma non mescolare mai palloni nuovi e usati all'interno dello stesso esperimento. Scartare i palloni che mostrano segni di usura (di solito alle saldature) o che sono stati utilizzati più di circa 20 volte. Controllare regolarmente i filtri dei tappi per verificarne il degrado e smaltirli se compromessi. Se presenti, scartare i coperchi dei tappi che si avvitano sulla parte superiore dei tappi e coprono i filtri. Questo metodo descrive le precauzioni adottate per pulire i palloni e prepararli per il riutilizzo.

1. Etichettare in modo permanente i flaconi in modo che lo stesso set venga utilizzato esclusivamente per condizioni di limitazione di Zn²⁺. Etichettare un altro set di flaconi per la crescita in condizioni di abbondanza di Zn²⁺. L'uso di colori diversi per l'etichettatura è utile per evitare di mescolare i flaconi.
2. Non permettere mai che il residuo della coltura si asciughi nei flaconi. Aggiungere acqua immediatamente nei flaconi dopo il decantamento della coltura (ad esempio, 100 mL). Se la coltura non viene raccolta al termine della crescita, svuotare i flaconi versando l'intera coltura in un contenitore per rifiuti liquidi con concentrazione finale di candeggina al 10%, dopo aver registrato i fenotipi del bioindicatore come descritto in questo protocollo.
3. Sottoporre i flaconi all'autoclavaggio con ciclo per liquidi (almeno 121 °C a 15 psi) per 20 minuti, con acqua all'interno e tappi posizionati.
4. Dopo l'autoclavaggio, lavare i flaconi con un detergente non ionico a bassa schiumogenicità e strofinare accuratamente utilizzando una spazzola morbida. Dedicare una spazzola esclusivamente al lavaggio dei flaconi utilizzati per la crescita in condizioni di limitazione di Zn²⁺. Assicurarsi che i flaconi siano puliti, senza residui né detriti. Non strofinare né usare sapone sui tappi; risciacquare delicatamente con acqua deionizzata.
5. Risciacquare accuratamente i flaconi con acqua di rubinetto, seguito da tre risciacqui con acqua deionizzata (tipo II o III) e almeno un ulteriore risciacquo con acqua ultrapura (tipo I) (18,2 MΩ-cm a 25 °C e ≤ 5 ppb di carbonio organico totale).
6. Posizionare i flaconi verticalmente capovolti in modo che l'acqua non possa raccogliersi sul fondo. Non utilizzare rastrelliere da laboratorio standard montate a parete, poiché queste mantengono i flaconi inclinati e permettono la formazione di piccole pozzette d'acqua. Vanno bene anche rastrelliere standard per stoviglie. Lasciare asciugare completamente i flaconi e i tappi.
7. Una volta asciutti, avvitare i tappi sui flaconi e coprire i tappi con carta d'alluminio. Applicare un pezzo di nastro indicatore per autoclave sulla carta d'alluminio per indicare lo stato sterile e proteggere i filtri dei tappi dalla polvere.
8. Sottoporre i flaconi puliti all'autoclavaggio (almeno 121 °C a 15 psi) per 20 minuti, seguito da un vuoto post-ciclo per asciugare il carico (se l'autoclave è dotata di questa funzione). Conservare i flaconi asciutti e protetti dalla polvere.

2. Preparazione del mezzo privo di Zn²⁺ (ZLM)

NOTA: utilizzare esclusivamente becher di plastica, cilindri graduati e qualsiasi altro materiale per la preparazione dei mezzi. Designare un insieme di attrezzature da laboratorio che venga usato esclusivamente per la preparazione di mezzi limitati in Zn²⁺. Risciacquare accuratamente tutte le attrezzature con acqua ultrapura (tipo I) prima e dopo l'uso. Utilizzare prodotti chimici ad alta purezza e acquistarli dagli stessi fornitori, se possibile.

1. Preparare il mezzo di Sauton limitato in Zn²⁺ senza sali aggiunti di Zn²⁺²⁶ mescolando i seguenti composti con circa 950 mL di acqua ultrapura in un becher di plastica da 1 L contenente una barretta magnetica:
   0,5 g di KH₂PO₄ (0,05%; PM: 136,09)
   0,5 g di MgSO₄ x 7H₂O (0,05%; PM: 246,48)
   2 g di acido citrico anidro (0,2%; PM: 192,12)
   4 g di L-asparagina, 99% (0,4%; PM: 132,12)
   60 mL di glicerolo (6%)
   189 µL di soluzione di citrato ferrico ammonico 1 M (0,005%; PM: 265)
   1. Aggiungere il glicerolo utilizzando una pipetta sierologica monouso da 50 mL in plastica. Risciacquare accuratamente la pipetta aspirando e dispensando su e giù circa 10 volte nel mezzo fino a quando non rimane glicerolo residuo.
      NOTA: Il glicerolo è altamente viscoso e difficile da misurare. In alternativa, il glicerolo può essere versato in un cilindro graduato e risciacquato più volte con circa 30 mL di acqua ultrapura, che vengono poi aggiunti al mezzo. Se si adotta questo metodo, iniziare con un volume inferiore (~600 mL) in modo che il volume finale non superi ~950 mL dopo l’aggiunta del glicerolo e dei risciacqui dal cilindro graduato al mezzo.
2. Portare il volume del mezzo a circa 950 mL e mescolare bene. La L-asparagina richiede alcuni minuti per sciogliersi; attendere finché non rimangono fiocchi bianchi prima di procedere.
   NOTA: La soluzione di citrato ferrico ammonico conferisce al mezzo un colore giallo chiaro.
3. Preparare 15 mL di soluzione fresca di NaOH (~10% p/v) con acqua ultrapura in un contenitore di plastica (ad esempio, un tubo conico da 15 mL).
4. Risciacquare accuratamente un pHmetro con acqua ultrapura prima dell’uso e immergere solo la sonda del pHmetro nel mezzo. Lasciare il pHmetro immerso nel mezzo con leggera agitazione durante la regolazione del pH. Utilizzando una pipetta di trasferimento monouso in plastica, aggiungere la soluzione di NaOH appena preparata fino a raggiungere un pH finale di 7,4.
   NOTA: Il pH iniziale del mezzo è fortemente acido. È necessario un volume elevato di soluzione di NaOH per portare il pH nella zona neutra. Aggiungere inizialmente 4-6 mL di soluzione di NaOH; una volta raggiunto un pH di circa 6,5, aggiungere la soluzione di NaOH goccia a goccia. Non superare il pH obiettivo di 7,4. In caso contrario, non tentare di riaggiustare con HCl o altri acidi: scartare il mezzo. È buona pratica dedicare un pHmetro esclusivamente alla preparazione del mezzo limitato in Zn (ZLM) e non utilizzarlo per misurare il pH di altri mezzi o tamponi che potrebbero contaminare la sonda.
5. Trasferire il mezzo in un cilindro graduato e portarlo al volume finale di 1 L con acqua ultrapura. Sterilizzare il mezzo per filtrazione attraverso un filtro monouso da 0,2 µm montato su un matraccio.
6. Aggiungere in modo asettico 2,5 mL di soluzione di Tween-80 al 20%, sterilizzata per filtrazione (concentrazione finale 0,05%). Conservare a 4 °C al riparo dalla luce per un massimo di 6 mesi.

Crescita in condizioni di limitazione di Zn²⁺ in M. smegmatis

NOTA: A causa della variabilità tra lotti nella quantità di Zn²⁺ presente nel mezzo ZLM, è fondamentale utilizzare lo stesso lotto di mezzo oppure diversi lotti che siano stati accuratamente miscelati insieme per tutte le colture in un esperimento. Oltre al mezzo necessario per l'allestimento delle colture, sono necessari circa 100 mL aggiuntivi per il lavaggio e la normalizzazione delle colture seme.

1. Eseguire tutti i passaggi in una cappa a sicurezza biologica. Preparare le colture seme 18 h prima dell’allestimento dell’esperimento di crescita. Non utilizzare colture seme troppo cresciute o che formano grumi. Una coltura seme per ceppo è sufficiente.
   1. Aggiungere asetticamente 5 mL di mezzo 7H9-ADC (brodo Middlebrook 7H9 con 0,05% di Tween 80 e arricchimento ADC al 10% [concentrazione finale: 0,5% albumina sierica bovina, 0,2% destrosio, 0,085% NaCl e catalasi opzionale allo 0,0003%]) in un tubo da bioreattore da 50 mL.
   2. Aggiungere asetticamente 10 µL di cellule da stock glicerolato scongelato (preparato secondo²⁶) direttamente nel mezzo. Avvitare il coperchio sul tubo.
   3. Posizionare i tubi saldamente in un incubatore agitato a un angolo di circa 45° in modo che il liquido raggiunga circa metà altezza del tubo durante l’agitazione.
   4. Incubare i tubi a 37 °C con agitazione a 120 rpm per circa 18 h.
2. Verificare le colture seme notturne per assicurarsi che la sospensione sia uniformemente torbida e non presenti grumi significativi. La densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) della coltura notturna dovrebbe essere idealmente compresa tra 0,5 e 0,8.
3. Centrifugare le colture notturne nei tubi da bioreattore utilizzati per la crescita notturna a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Decantare o aspirare il sopranatante e risospendere in 5 mL di ZLM. Ripetere i passaggi di centrifugazione e risospensione per 2 volte, per un totale di tre lavaggi.
   1. Durante i passaggi di centrifugazione, riempire una cuvetta fino all’orlo con etanolo al 70% per sterilizzarla. Lasciare la cuvetta piena in cappa a sicurezza biologica per 10 min e risciacquarla accuratamente 3 volte con ZLM utilizzando una pipetta.
      NOTA: Il processo di normalizzazione cellulare richiede tempo e pratica per essere eseguito in modo efficiente. Normalizzando direttamente le cellule nella cuvetta sterilizzata con etanolo, il processo viene notevolmente accelerato.
   2. Preparare un numero sufficiente di cuvette per il numero di ceppi inclusi nello studio; ad esempio, questo protocollo richiede due cuvette sterilizzate, una per il ceppo selvatico e una per il mutante ΔaltRP.
5. Dopo tre lavaggi con ZLM, risospendere ogni pellet cellulare in 2 mL di ZLM.
6. Effettuare la messa a zero dello spettrofotometro utilizzando 600 µL di ZLM in una cuvetta. La cuvetta non deve essere sterilizzata. Mettere da parte la cuvetta e utilizzarla per la messa a zero dello spettrofotometro prima di normalizzare ogni coltura (ossia, ceppo).
7. Lavorando con un ceppo alla volta, trasferire 600 µL di cellule lavate dal passaggio 3.5 in una cuvetta sterilizzata preparata al passaggio 3.4.1 e misurare l’OD₆₀₀ iniziale. Se l’OD₆₀₀ è superiore a 1, procedere al passaggio 3.8. Se l’OD₆₀₀ è inferiore a 1, seguire i sottopassi 3.7.1 e 3.7.2.
   1. Se la lettura iniziale di OD₆₀₀ del passaggio 3.7 è inferiore a 1, raccogliere tutta la coltura dalla cuvetta, aggiungerla nuovamente alle cellule seme lavate rimanenti nel tubo da centrifuga e centrifugare nuovamente la coltura come al passaggio 3.3. Risospendere la coltura in un volume inferiore rispetto a quello usato al passaggio 3.5 (ad esempio, 1 mL) per ottenere una densità cellulare più elevata e ripetere il passaggio 3.7.
   2. Se l’OD₆₀₀ dopo il passaggio 3.7.1 è ancora inferiore a 1, la coltura non è abbastanza densa; riavviare la procedura dal passaggio 3.1. Incubare le colture per un tempo più lungo o aumentare la quantità di inocolo per l’allestimento delle colture notturne in modo che la densità finale della coltura notturna sia intorno a OD₆₀₀ = 0,5-0,8, come descritto al passaggio 3.2.
8. Calcolare il volume di ZLM da aggiungere ai 600 µL di cellule lavate nella cuvetta per ottenere un OD₆₀₀ pari a 1 utilizzando la seguente equazione e l’OD₆₀₀ misurato al passaggio 3.7:
   Volume di ZLM (μL) = (OD₆₀₀ iniziale - 1) × 600 μL
9. Aggiungere alla cuvetta preparata al passaggio 3.7 il volume di ZLM calcolato al passaggio 3.8, mescolare bene aspirando e dispensando 5-10 volte con la pipetta e rileggere l’OD₆₀₀.
10. Regolare l’OD₆₀₀ entro il 5% di OD₆₀₀ = 1 seguendo i sottopassi indicati di seguito. Utilizzare due pipette, di cui una (di dimensioni P1000) dedicata esclusivamente al mescolamento della coltura per evitare di consumare troppe punte ad ogni aggiustamento.
    1. Se l’OD₆₀₀ è superiore a 1, aggiungere ZLM goccia a goccia (~50 µL alla volta), mescolare bene aspirando e dispensando 5-10 volte e misurare l’OD₆₀₀. Ripetere questo processo secondo necessità finché la coltura non rientra nel 5% di OD₆₀₀ = 1.
    2. Se durante la normalizzazione l’OD₆₀₀ scende al di sotto di 1, aggiungere ulteriori cellule lavate (~20 µL inizialmente) dal passaggio 3.5, mescolare bene aspirando e dispensando 5-10 volte e misurare l’OD₆₀₀. Ripetere questo processo secondo necessità (oppure aggiungere più ZLM come descritto al passaggio 3.10.1 se l’OD₆₀₀ supera 1) finché la coltura non rientra nel 5% di OD₆₀₀ = 1.
    3. Assicurarsi che il volume nella cuvetta non superi ~1,5 mL durante la normalizzazione cellulare per evitare fuoriuscite nello spettrofotometro. Se necessario, rimuovere parte della coltura dalla cuvetta durante la diluizione. Inoltre, assicurarsi che il volume della coltura nella cuvetta sia superiore al minimo richiesto per misurare accuratamente l’OD₆₀₀ con lo spettrofotometro. La maggior parte degli spettrofotometri richiede almeno 600 µL.
11. Ripetere i passaggi di normalizzazione cellulare (3.6 - 3.10) per tutti i ceppi e le condizioni inclusi nello studio.
12. Preparare il numero totale di fiale necessarie per l’esperimento aggiungendo asetticamente 50 mL di ZLM in fiale Erlenmeyer di plastica da 250 mL preparate come descritto al passaggio 1.
13. Inoculare le fiale aggiungendo asetticamente 50 µL della coltura normalizzata a OD₆₀₀ = 1 direttamente dalla cuvetta per ottenere un OD₆₀₀ finale di 0,001 (diluizione 1:1000 dell’inoculo normalizzato).
14. Per le colture coltivate senza limitazione di Zn²⁺ (ossia, mezzo ricco di Zn²⁺, ZRM), aggiungere 30 µL di ZnSO₄ sterile 10 mM (preparato al momento da soluzione madre sterile 1 M) direttamente nei flaconi di coltura per ottenere una concentrazione finale di 6 µM di ZnSO₄.
15. Incubare le fiale a 37 °C con agitazione a 100 rpm per 3 giorni fino alla fase stazionaria (il giorno 0 è il giorno dell’inoculo).
16. Ogni giorno di crescita, utilizzare un microlettore a monocromatore o a filtri per misurare le seguenti metriche di crescita usando 200 µL di coltura in una micropiastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Effettuare le letture della piastra immediatamente dopo il prelievo delle aliquote per evitare il sedimentamento delle cellule.
    NOTA: Non è necessario preriscaldare il microlettore poiché i valori assoluti di fluorescenza sono meno informativi rispetto al rapporto e alle scansioni di fluorescenza, e il piccolo volume misurato si equilibra rapidamente alla temperatura ambiente durante l’allestimento della piastra. La fluorescenza può essere misurata dalla parte superiore o inferiore della piastra se si verifica condensa sul coperchio, anche se i valori di intensità di fluorescenza sono complessivamente inferiori quando letti dal basso.
    1. Densità cellulare (ossia, OD₆₀₀): Per riportare l’OD₆₀₀ ottenuto da un microlettore, generare una curva standard per convertire la lettura dal cammino ottico della micropiastra con volume fisso (ad esempio, 200 µL) al cammino ottico standard di 1 cm.
    2. Fluorescenza del cofattore F₄₂₀ (es 420 nm/em 475 nm): Per microlettori a filtri, utilizzare il set di filtri più vicino (ad esempio, es 430 nm/em 488 nm) e micropiastre nere a 96 pozzetti.
    3. Misurare la fluorescenza di fondo a 375 nm (es 375 nm/em 475 nm).
    4. Se si utilizza un monocromatore, generare una scansione dell’intensità di fluorescenza da es 230 a 440 nm a passi di 5 nm e emissione fissa a 475 nm.
    5. Se si utilizza un monocromatore, calcolare la percentuale di intensità di fluorescenza a 375 nm rispetto a 420 nm utilizzando l’equazione:
       F_375/420 (%) = (F₃₇₅/F₄₂₀) x 100

4. Registrazione e misurazione della lunghezza cellulare

1. Al terzo giorno, visualizzare e registrare la lunghezza delle cellule. Pulire un vetrino e un coprivetrino con un panno senza pelucchi. Pipettare una goccia di 10 µL di coltura sul vetrino e posizionare il coprivetrino direttamente sopra la coltura. Premere delicatamente il coprivetrino in modo che la coltura si espanda e occupi quasi l'intera area sotto il coprivetrino. Preparare i vetrini e osservarli immediatamente per evitare l'essiccamento.
   NOTA: Se la coltura non si espande facilmente, i detriti impediscono un buon contatto e il movimento dell'acqua ostacolerà l'osservazione delle cellule a fuoco. Preparare un nuovo vetrino.
2. Utilizzando un microscopio composto (o in contrasto di interferenza differenziale, vedi sotto) con obiettivo ad immersione in olio da 100x e oculari da 10x (ingrandimento totale 1000x) e un dispositivo fotografico, osservare il vetrino preparato.
   NOTA: Le cellule sono molto più facili da vedere grazie al contrasto fornito dalla microscopia in contrasto di interferenza differenziale (DIC)¹⁰. Utilizzare questo tipo di microscopio per ottenere immagini di alta qualità, se possibile. Per analisi di routine e verifica dello stato di crescita limitato da Zn²⁺, un microscopio ottico composto standard è sufficiente.
3. Scattare immagini di aree del vetrino contenenti più cellule a fuoco, in piano (cioè l'intera lunghezza della cellula è visibile) e non in movimento. Registrare un numero sufficiente di immagini in diverse aree del vetrino (o su più vetrini della stessa coltura) in modo da misurare almeno 100 cellule.
4. Utilizzando lo stesso microscopio e lo stesso obiettivo, acquisire un'immagine di un vetrino di calibrazione.
5. In Fiji²⁷, utilizzare lo strumento linea retta per tracciare una linea lungo la lunghezza del vetrino di calibrazione. Selezionare Analizza > Imposta scala e inserire la distanza e l'unità note della barra di scala. Selezionare Global per applicare la scala a tutte le immagini e le misurazioni future.
6. Aprire una foto al microscopio. Utilizzare lo strumento linea retta per tracciare una linea lungo la lunghezza di una cellula e premere il tasto M sulla tastiera per misurare la cellula. Misurare almeno 100 cellule per ogni coltura.
7. Copiare i dati di lunghezza generati nella finestra popup di Fiji in un software per fogli di calcolo o salvarli come file di valori separati da virgola (.csv) per l'analisi statistica.

5. Modifiche per la coltivazione di M. tuberculosis (Mtb) limitato per Zn²⁺

NOTA: A differenza di Mtb-H37Rv, Mtb-Aux non è in grado di sintetizzare L-leucina e D-pantotenato, e questi supplementi vengono aggiunti al terreno²⁸. La supplementazione per Mtb-Aux non influisce sulla limitazione di Zn²⁺, e entrambi i ceppi mostrano fenotipi simili in ZLM²³. Questo protocollo è una modifica di un protocollo precedentemente pubblicato²³; la differenza principale consiste nel fatto che le colture vengono fatte crescere per 8 giorni invece di 10 per ridurre l'aggregazione e favorire l'arricchimento di cellule singole, necessario per applicazioni successive come l'infezione dei macrofagi. Per ulteriori differenze minori, si prega di fare riferimento alla pubblicazione originale²³. Il metodo di inoculo differisce da quello di M. smegmatis a causa dell'inoculo molto più elevato necessario per avviare la crescita di M. tuberculosis.

1. Per Mtb-Aux, aggiungere un'ulteriore supplementazione di 50 µg/mL di L-leucina e 48 µg/mL di D-pantotenato in tutti i mezzi. Sterilizzare per filtrazione soluzioni stock 1000x di 50 mg/mL di L-leucina e 48 mg/mL di D-pantotenato di calcio mediante filtro da 0,2 µm e aggiungerle ai mezzi sterilizzati.
2. Aggiungere asetticamente 1 mL di cellule da stock glicerolato scongelato a 4 mL di 7H9-ADC in un tubo rotondo da 14 mL con tappo a scatto (per Mtb-Aux) o in un tubo da bioreattore da 50 mL (per Mtb-H37Rv).
3. Incubare a 37 °C senza agitazione fino a quando la coltura raggiunge un OD₆₀₀ ~1. Ci vorrà circa 1 settimana. Aerare la coltura una volta al giorno aprendo il tubo all'interno di una cappa a sicurezza biologica e pipettando alcune volte per mescolare.
4. Innestare 1 mL della coltura statica in 50 mL di 7H9-ADC in un flacone di plastica ventilato da 250 mL. Una coltura da 50 mL in 7H9-ADC è sufficiente per triplicati biologici per ceppo e condizione (ad esempio, ceppo selvatico in ZLM e ZRM). Prestare attenzione ad evitare grandi aggregati (cioè grandi ammassi di cellule) lasciando riposare la coltura per 5-10 minuti prima dell'innesto, permettendo agli aggregati di sedimentare sul fondo del tubo e prelevando la coltura dalla parte superiore.
   NOTA: L'innesto con grandi aggregati produce colture grumose, il che influisce sulla normalizzazione e riproducibilità delle colture.
5. Incubare a 37 °C con agitazione a 100 rpm fino a quando la coltura raggiunge un OD₆₀₀ compreso tra 0,5 e 0,8 (fase logaritmica media). Ci vorranno 3-5 giorni.
6. Trasferire la coltura in un tubo conico da 50 mL e pellettare le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante aspirando 40 mL con una pipetta serologica ed eliminando il resto del soprannatante con una micropipetta P1000.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ridurre il trascinamento di Zn²⁺ dal mezzo 7H9-ADC.
7. Risospendere il pellet in 5 mL di ZLM e portare il volume totale della coltura a 50 mL nel tubo conico con ZLM.
8. Ripetere la centrifugazione a 3.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Rimuovere il soprannatante. Risospendere il pellet cellulare a un volume finale di 50 mL come descritto al punto 5.7.
9. Misurare l'OD₆₀₀ delle cellule seme lavate e calcolare il volume necessario per ottenere un OD₆₀₀ iniziale di 0,05 (Mtb-H37Rv) o 0,08 (Mtb-Aux) in 50 mL utilizzando la seguente equazione:
   
   NOTA: La crescita di Mtb-Aux con un OD₆₀₀ iniziale di 0,05 è inconsistente; pertanto, si utilizza un OD₆₀₀ più alto, pari a 0,08, per garantire una crescita costante.
10. Aliquotare il volume di coltura seme calcolato al punto 5.9 in un nuovo tubo conico da 50 mL e portare il volume a 50 mL con ZLM. Versare la coltura lavata e normalizzata dal tubo conico in flaconi Erlenmeyer di plastica preparati come descritto al punto 1. Ripetere utilizzando lo stesso tubo conico per tutti i replicati biologici per ogni ceppo e condizione.
11. Per le colture cresciute senza limitazione di Zn²⁺ (cioè in mezzo ricco di Zn²⁺, ZRM), aggiungere direttamente ai flaconi di coltura 30 µL di ZnSO₄ sterile 10 mM per ottenere una concentrazione finale di 6 µM di ZnSO₄.
12. Incubare i flaconi di coltura a 37 °C con agitazione a 100 rpm per 8 giorni. Misurare l'OD₆₀₀ e la fluorescenza di F₄₂₀ durante tutta la crescita come descritto al punto 3. Scartare le colture se risultano grumose nei primi giorni di crescita (cioè la coltura non appare torbida e presenta aggregati diffusi).
    NOTA: Idealmente, le colture devono essere prevalentemente planctoniche (cioè prive di grandi aggregati visibili ad occhio nudo) durante i primi giorni di crescita. Le colture di Mtb, specialmente quelle in ZLM, diventano progressivamente più grumose durante la crescita, e la presenza di aggregati galleggianti sulla superficie del mezzo sotto forma di fiocchi è attesa alla fase logaritmica avanzata²³.

Risultati

Fenotipi bioindicatori di M. smegmatis
wild-type M. smegmatis colture cresciute in ZLM che raggiungono Zn²⁺-limitazione della crescita presentano tre fenotipi principali di bioindicatore rispetto alle cellule coltivate in condizioni di Zn²⁺-condizioni di replezione: [1] diminuzione dell'OD₆₀₀, [2] cellule allungate e [3] riduzione del picco di fluorescenza a 420 nm. Il mutante privo di AltRPs (ΔaltRP) non ha lo stesso Zn²⁺dipendente dalla morfogenesi come il tipo selvatico^10, e il suo fenotipo unico in Zn²⁺- i mezzi limitati possono essere utilizzati come bioindicatore differenziale. Pertanto, tutti e tre i parametri bioindicatori devono essere valutati inizialmente nel tipo selvatico cresciuto in ZRM e in ZLM. Se lo Zn atteso²⁺-si osserva un fenotipo selvatico limitato, il ΔaltRP Il ceppo con delezione dovrebbe quindi essere valutato. La crescita in ZLM non raggiunge sempre lo Zn²⁺condizioni limitate, che è proprio la ragione per cui sono necessari i bioindicatori. Selvatici unici e ΔaltRP fenotipi bioindicatori verificano che lo Zn biologicamente rilevante²⁺sono state raggiunte condizioni di limitazione. Quando le colture cresciute in ZLM non raggiungono Zn²⁺limitazione della crescita dovuta allo Zn²⁺ contaminazione nel mezzo o nei contenitori di coltura (ZLM-C), questi fenotipi bioindicatori saranno meno pronunciati, come mostrato in Figura 1 e Figura 2. Al contrario, se la concentrazione di Zn²⁺ in ZLM è troppo basso, la crescita è compromessa dallo Zn²⁺ esaurimento (ZLM-D), evidente nella bassa torbidità della coltura e nei fenotipi alterati dei bioindicatori, descritto anche in Figura 1 e Figura 2.

La densità cellulare è un parametro significativo della carenza di Zn²⁺. Le colture cresciute in ZRM raggiungono costantemente un'elevata torbidità (superiore a un OD₆₀₀ di 5) dopo 72 h, talvolta con aggregazione, e appaiono visibilmente più gialle rispetto alle colture cresciute in ZLM (dati non mostrati; Figura 1A). La carenza di Zn²⁺ limita la crescita (indicata da una riduzione dell'OD₆₀₀) di tutti i ceppi rispetto alla condizione con Zn²⁺ in abbondanza, e il ceppo ΔaltRP presenta una densità cellulare inferiore rispetto al ceppo selvatico (Figura 1A). La crescita in condizioni di carenza di Zn²⁺ in ZLM produce costantemente un OD₆₀₀ superiore a 3,5 e inferiore a 5 nel ceppo selvatico, e inferiore a 3 nel ceppo ΔaltRP (Figura 1A). Le colture cresciute in ZLM con contaminazione da Zn²⁺ (ZLM-C) raggiungono una densità cellulare simile (OD₆₀₀ superiore a 5) a quella delle colture in condizioni di abbondanza di Zn²⁺ cresciute in ZRM (Figura 1A). Se la [Zn²⁺] in ZLM è troppo bassa, le colture risultano gravemente carenti di Zn²⁺ (ZLM-D), e la crescita è compromessa, come dimostrato dalla ridotta densità cellulare nelle colture selvatiche (OD₆₀₀ inferiore a 3; Figura 1A). La densità cellulare del ceppo selvatico (3,5 < OD₆₀₀ < 5) dovrebbe essere il primo parametro fenotipico indicatore biologico per verificare le condizioni di carenza di Zn²⁺. Solo le colture selvatiche che raggiungono la densità cellulare attesa devono essere considerate, e l'analisi del ceppo ΔaltRP deve essere effettuata solo dopo aver verificato il fenotipo indicatore biologico di carenza di Zn²⁺ nel ceppo selvatico.

Colture in fase stazionaria di tipo selvatico coltivate in ZLM limitato per Zn²⁺ sono allungate con una lunghezza cellulare media di circa 9 µm, mentre Zn²⁺-le colture complete cresciute in ZRM sono corte, con una lunghezza cellulare media di circa 3 µm (Figura 1B). Colture di tipo selvatico cresciute in ZLM con Zn²⁺ la contaminazione (ZLM-C) non si allunga completamente ma è leggermente più lunga dello Zn²⁺- cellule complete con una lunghezza media della cellula di 5 µm. Bioindicazione dello Zn²⁺ la contaminazione in interi lotti di ZLM indica una possibile contaminazione durante la preparazione, mentre nelle colture individuali (ad es. fiasche) indica contaminazione dovuta a un lavaggio inadeguato delle fiasche o alla preparazione della coltura. Colture di tipo selvatico cresciute in ZLM fortemente prive di Zn²⁺ (ZLM-D) presentano un allungamento meno pronunciato con una lunghezza cellulare media di circa 7 µm (Figura 1B). Il fenotipo allungato di tipo selvatico non viene osservato nel ΔaltRP ceppo, e ΔaltRP cellule limitate per Zn²⁺ hanno una lunghezza cellulare media di circa 5 µm (Figura 1B). Figura 2 mostra immagini rappresentative di cellule coltivate in diverse preparazioni di ZLM o ZRM (dopo il passaggio 2) e visualizzate mediante microscopio ottico composto. Dopo il passaggio 4, cellule provenienti da numerosi campi in immagini come quelle mostrate in Figura 2 vengono utilizzati per calcolare la lunghezza media delle cellule delle colture mostrate in Figura 1B. Il fenotipo allungato di tipo selvatico è specifico per lo Zn²⁺-condizioni limitanti; l'allungamento cellulare non viene osservato quando le colture sono in presenza di Zn²⁺-ricco o gravemente carente di Zn²⁺-depletato (Figura 1B e Figura 2).

Il fenotipo dell'indicatore biologico con ridotta fluorescenza di F₄₂₀ è meglio osservabile nelle scansioni di fluorescenza (Figura 1C). La diminuzione della fluorescenza del cofattore F₄₂₀ viene quantificata calcolando la percentuale di intensità di fluorescenza a 375 nm (fondo) rispetto a 420 nm (autofluorescenza del cofattore F₄₂₀) come descritto al passaggio 3.16.5, espressa come F_375/420. Per lettori di piastre monocromatici privi della capacità di scansione fluorescente, letture puntuali a 375 nm e 420 nm (entrambe con emissione a 475 nm) sono adatte per calcolare F_375/420. Le colture di tipo selvatico coltivate in condizioni complete di Zn²⁺ (cioè in ZRM) presentano valori altamente riproducibili di F_375/420 intorno al 17% (Figura 1D). La riduzione della fluorescenza di F₄₂₀ nelle colture limitate in Zn²⁺ cresciute in ZLM è indicata da un aumento di F_375/420 fino a circa il 27% (Figura 1D). La fluorescenza di F₄₂₀ nella ceppa ΔaltRP limitata in Zn²⁺ è notevolmente più bassa rispetto al tipo selvatico nella stessa condizione, ed è visivamente evidente nelle scansioni di fluorescenza (Figura 1C). Il valore di F_375/420 è più variabile nella ceppa ΔaltRP limitata in Zn²⁺, con un intervallo compreso tra circa il 50% e l'80% (Figura 1D). Le colture cresciute in ZLM ma che mostrano un'indicazione biologica di contaminazione da Zn²⁺ (ZLM-C) presentano una riduzione di F_375/420 fino a circa il 21%, mentre le colture prive di Zn²⁺ (ZLM-D) hanno un valore di F_375/420 intorno al 35% (Figura 1D).

In sintesi, tre fenotipi bioindicatori devono essere valutati nei ceppi di tipo selvaggio e ΔaltRP per verificare lo stato di carenza di Zn²⁺ delle colture cresciute in ZLM. I bioindicatori dovrebbero essere i seguenti in caso di crescita biologicamente rilevante limitata da Zn²⁺: [1] l'OD₆₀₀ del tipo selvaggio è compreso tra 3,5 e 5, mentre quello del ceppo ΔaltRP è inferiore a 3; [2] le cellule di tipo selvaggio hanno una lunghezza di circa 10 µm, mentre quelle del ceppo ΔaltRP sono lunghe circa la metà; [3] il valore F_375/420 del ceppo ΔaltRP è elevato, ovvero superiore al 50%.

Fenotipi bioindicatori di M. tuberculosis
M. tuberculosis in condizioni di carenza di Zn²⁺ non mostra lo stesso programma morfogenetico di M. smegmatis. In particolare, non vi è alcuna differenza nell'OD₆₀₀ tra colture ricche di Zn²⁺ e colture limitate in Zn²⁺, e le colture carenti di Zn²⁺ non presentano alcun fenotipo morfologico evidente, cioè non si allungano²³. Analogamente, in M. tuberculosis non si osserva un fenotipo bioindicatore di deplezione di Zn²⁺ (ovvero una ridotta densità cellulare) come avviene in M. smegmatis. Le colture limitate in Zn²⁺ mostrano un maggiore aggregamento rispetto a quelle ricche di Zn²⁺, sebbene entrambe le condizioni risultino notevolmente aggregate al decimo giorno (osservato sia in Mtb-H37Rv che in Mtb-Aux). Il principale fenotipo bioindicatore della limitazione di Zn²⁺ in M. tuberculosis è la riduzione della fluorescenza massima di F₄₂₀, come precedentemente riportato²³. I risultati qui presentati si riferiscono a colture cresciute per 8 giorni anziché 10, al fine di minimizzare l'aggregamento. Una ridotta fluorescenza di F₄₂₀ è evidente nelle colture limitate in Zn²⁺, sia utilizzando lettori di piastre monocromatici (Figura 3) che basati su filtri. Per i lettori di piastre a filtri, utilizzando Mtb-H37Rv, le colture limitate in Zn²⁺ (cioè cresciute in ZLM) presentano valori di fluorescenza grezza pari a circa il 50% rispetto alle colture ricche di Zn²⁺ (cioè cresciute in ZRM; dati non mostrati). Utilizzando un lettore di piastre monocromatico in modalità di lettura dal fondo e Mtb-Aux, le colture ricche di Zn²⁺ mostrano un valore di F_375/420 di circa il 75%, mentre le colture di ZLM contaminate con Zn²⁺ presentano valori simili. La riduzione della fluorescenza di F₄₂₀ nelle colture limitate in Zn²⁺ cresciute in ZLM si riflette in un valore di F_375/420 superiore al 100%. Il ceppo ΔaltRP limitato in Zn²⁺ mostra una crescita e una fluorescenza di F₄₂₀ simili a quelle del ceppo selvatico limitato in Zn²⁺ (Figura 3) e non risulta utile come bioindicatore in M. tuberculosis, a differenza di quanto osservato in M. smegmatis (Figura 1). Pertanto, è consigliabile testare i mezzi destinati alla coltivazione di M. tuberculosis utilizzando il ceppo a crescita rapida M. smegmatis.

Figura 1: Fenotipi bioindicatori di M. smegmatis coltivati in condizioni di limitazione di Zn²⁺ e effetto della contaminazione da Zn²⁺ e della deplezione di Zn²⁺ sui fenotipi. Esempi rappresentativi del fenotipo bioindicatore mostrati in ciascun pannello provengono dalle stesse colture a 72 h. Gli esempi di risultati di crescita in condizioni di contaminazione da Zn²⁺ (ZLM-C), limitazione di Zn²⁺ (ZLM-L) e deplezione di Zn²⁺ (ZLM-D) derivano da preparazioni indipendenti di terreni, tutte eseguite seguendo lo stesso metodo di preparazione descritto in questo protocollo (passaggio 2). I fenotipi rappresentativi delle ceppi selvatico limitato per Zn²⁺ e ΔaltRP provengono dallo stesso lotto di ZLM. Tutti i ceppi e le condizioni includono tre replicati biologici (n=3). (A) Curve di crescita che mostrano la densità ottica rilevata a 600 nm (OD₆₀₀) e la riduzione della densità cellulare in condizioni di limitazione e deplezione di Zn²⁺. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard tra i replicati. (B) Lunghezza cellulare dei ceppi selvatico e ΔaltRP che evidenzia il fenotipo allungato del ceppo selvatico in condizioni di limitazione di Zn²⁺. Il grafico a scatola e baffi mostra la distanza interquartile, i valori minimo e massimo e la lunghezza mediana delle cellule in µm. (C) Scansioni di fluorescenza rappresentative delle colture che mostrano una riduzione del picco di fluorescenza F₄₂₀ in condizioni di limitazione di Zn²⁺ e una fluorescenza F₄₂₀ ulteriormente ridotta nel ceppo ΔaltRP limitato per Zn²⁺. È mostrata una sola coltura rappresentativa tra i triplicati biologici per ciascuna preparazione di terreno. Le scansioni di fluorescenza utilizzano un intervallo di eccitazione da 230 nm a 440 nm con incrementi di 5 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 475 nm. Il pannello in alto a sinistra all'interno del grafico principale è un ingrandimento dei ceppi selvatico limitato per Zn²⁺ e ΔaltRP, per evidenziare la riduzione del picco di fluorescenza a 420 nm nel ceppo ΔaltRP limitato per Zn²⁺. Le unità degli assi sono le stesse del grafico principale. Tutte le legende sono identiche a quelle di (A). (D) Quantificazione della riduzione della fluorescenza del cofattore F₄₂₀, calcolata come percentuale di F_375/420. Le percentuali sono state calcolate a partire dai valori ottenuti dalle scansioni di fluorescenza in (C). Il grafico a scatola e baffi mostra la distanza interquartile, i valori minimo e massimo e le percentuali mediane. Le abbreviazioni che indicano lo stato relativo allo Zn²⁺ del terreno, riportate tra parentesi dopo il tipo di terreno, sono: R = terreno arricchito in Zn²⁺, C = terreno contaminato con Zn²⁺, L = terreno limitato in Zn²⁺, D = terreno depletato di Zn²⁺; altre abbreviazioni sono: WT = ceppo selvatico, a.u. = unità arbitrarie. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative al microscopio di M. smegmatis a 72 h. Le immagini provengono da colture mostrate nella Figura 1. Le cellule sono state osservate mediante microscopio ottico composto con un ingrandimento totale di 1000x, utilizzando un obiettivo a immersione in olio da 100x. Le barre della scala corrispondono a 10 µm. Le abbreviazioni che indicano lo stato relativo allo Zn²⁺ del mezzo, riportate tra parentesi dopo il tipo di mezzo, sono: R = mezzo ricco di Zn²⁺, C = mezzo contaminato con Zn²⁺, L = mezzo limitato in Zn²⁺, D = mezzo privo di Zn²⁺; altre abbreviazioni: WT = ceppo di tipo selvaggio. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Perdita del fenotipo dell'indicatore biologico F₄₂₀ in M. tuberculosis limitato da Zn²⁺, dimostrata da scansioni di fluorescenza rappresentative di Mtb auxotrofico mc²6206 (Mtb-Aux). Esempi di risultati di crescita contaminati da Zn²⁺ e limitati da Zn²⁺ provengono da preparazioni indipendenti di terreno. I ceppi selvatici limitati da Zn²⁺ e ΔaltRP provengono dallo stesso lotto di ZLM. Tutti i ceppi e le condizioni presentano tre repliche biologiche (n=3). Nel grafico è mostrata una sola coltura rappresentativa delle tre repliche biologiche per ciascuna preparazione di terreno e ceppo. Le scansioni di fluorescenza sono state effettuate in modalità di lettura inferiore dopo 8 giorni di crescita, utilizzando un intervallo di lunghezza d'onda di eccitazione da 230 nm a 440 nm con incrementi di 5 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 475 nm. Le abbreviazioni che indicano lo stato relativo allo Zn²⁺ del terreno, riportate tra parentesi dopo il tipo di terreno, sono: R = terreno ricco di Zn²⁺, C = terreno contaminato da Zn²⁺, L = terreno limitato in Zn²⁺, D = terreno esaurito di Zn²⁺; altre abbreviazioni sono: WT = ceppo selvatico, a.u. = unità arbitrarie. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Un importante contributo al divario di conoscenza sulle basi meccanicistiche degli alt-ribosomi è la difficoltà di raggiungere condizioni limitanti di Zn²⁺ in vitro. La contaminazione da tracce di Zn²⁺ in laboratorio è comune; pertanto, è difficile ottenere condizioni di crescita riproducibili limitate da Zn²⁺. La contaminazione da Zn²⁺ può provenire da diverse fonti, sebbene la fonte più significativa e comune di contaminazione e variabilità provenga dall'acqua ultrapura utilizzata per risciacquare gli strumenti di laboratorio e produrre i terreni. I sistemi di acqua ultrapura devono essere sottoposti a una corretta manutenzione e devono essere risciacquati per 1 minuto prima di risciacquare gli strumenti di laboratorio o utilizzare l'acqua per i mezzi. I palloni che non sono stati lavati o risciacquati bene con acqua ultrapura possono causare la contaminazione da Zn²⁺ , e ciò sarà evidente dall'aumento della densità cellulare in alcuni palloni ma non in altri dello stesso lotto di ZLM. I palloni nuovi di zecca possono essere utilizzati per valutare se la fonte di contaminazione da Zn²⁺ proviene da palloni o terreni riutilizzati. La contaminazione da Zn²⁺ nella ZLM deve essere risolta aumentando il risciacquo degli elementi utilizzati per produrre i terreni e un set designato di materiali per la preparazione della ZLM. Se nessuna di queste misure si dimostra efficace nel raggiungere i fenotipi bioindicatori attesi, lo [Zn²⁺] nell'acqua ultrapura e ZLM dovrebbe essere quantificato per escludere la possibilità che la fonte d'acqua sia contaminata da Zn²⁺. Come riportato in precedenza, lo [Zn²⁺] di ZLM è compreso tra 115 ± 37 nM²³ e concentrazioni inferiori a 70 nM e superiori a 150 nM di solito portano a fenotipi contaminati da Zn²⁺ e Zn²⁺, rispettivamente. Tuttavia, una buona preparazione del terreno è solo uno dei fattori che influenzano il risultato e può verificarsi uno Zn²⁺ inadeguato o eccessivo a causa di una preparazione impropria dell'inoculo e/o della coltura, ovvero di una scarsa decantazione del terreno pieno di Zn²⁺ durante le fasi di lavaggio. Tutte le colture di M. smegmatis qui incluse sono state preparate allo stesso modo: sono inclusi gli esiti di crescita contaminati da Zn²⁺ (ZLM-C) e Zn²⁺ impoveriti (ZLM-D) per evidenziare la variabilità che può verificarsi tra diversi lotti di terreni utilizzando lo stesso sistema di acqua ultrapura, anche quando gli esperimenti vengono eseguiti correttamente.

Per garantire che la coltura di cellule in ZLM produca fenotipi di bioindicatori limitanti Zn²⁺ riproducibili, è importante etichettare in modo univoco i flaconi, utilizzarli sempre per la stessa condizione (ad esempio, con ZLM o ZRM), tenere traccia dei flaconi su più usi e smaltire i flaconi che sono alla fine del loro ciclo di vita o che continuano a produrre fenotipi di bioindicatori contaminati da Zn²⁺ con ZLM. Una corretta preparazione dell'inoculo è molto importante per ottenere una crescita che limita lo Zn²⁺, poiché il carry-over di Zn²⁺ da cellule del seme non adeguatamente lavate è una fonte comune di contaminazione da Zn²⁺ che può essere difficile da analizzare da ZLM contaminato da Zn²⁺. Le colture di M. smegmatis devono essere analizzate e raccolte dopo 72 ore di crescita in ZLM (e ZRM coltivate in parallelo). La morfogenesi e i fenotipi dei bioindicatori sono pronunciati da 48-72 h; pertanto, la valutazione o la raccolta di colture per la limitazione di Zn²⁺ troppo presto (o troppo tardi) potrebbe non produrre il fenotipo bioindicatore completo. Le colture impoverite in Zn²⁺ mostreranno lunghezze cellulari simili a quelle contaminate da Zn²⁺; quindi, la fluorescenza F₄₂₀ e OD₆₀₀ dovrebbero essere utilizzate per differenziare i due. Allo stesso modo, le colture contaminate da Zn²⁺ potrebbero non crescere sempre meglio dei batteri limitati da Zn²⁺, ma la fluorescenza F₄₂₀ e la lunghezza cellulare del tipo selvatico e del mutante ΔaltRP dovrebbero rivelare se viene raggiunta la condizione limitata da Zn²⁺.

Lo stesso vale per M. tuberculosis, poiché la perdita del fenotipo del bioindicatore F₄₂₀ nelle colture limitate da Zn²⁺ è pronunciata tra 8-10 giorni di crescita in ZLM. Sebbene M. tuberculosis non mostri un forte fenotipo bioindicatore limitato a Zn²⁺ come M. smegmatis, il metodo di crescita qui presentato è stato utilizzato per associare la perdita del fenotipo bioindicatore F₄₂₀ con la crescita limitata da Zn²⁺ utilizzando saggi funzionali e trascrittomica sia nei ceppi virulenti che attenuati di M. tuberculosis (rif.²³e dati non pubblicati). Pertanto, seguire la fluorescenza F₄₂₀ è un modo accessibile per monitorare e verificare le condizioni biologiche limitanti Zn²⁺ in M. tuberculosis. È importante notare che il meccanismo che porta alla riduzione della fluorescenza di F₄₂₀ durante le condizioni limitanti di Zn²⁺ rimane irrisolto, così come la distinzione se la ridotta fluorescenza è dovuta a una diminuzione dell'abbondanza del pool di coenzimi nel suo complesso o a uno spostamento nel suo stato redox poiché solo la forma ossidata emette fluorescenza²⁹.

Come dimostrato qui, la preparazione dei terreni limitanti lo Zn²⁺ è sfumata e ci sono numerosi fattori che possono influenzare l'efficace concentrazione di ioni Zn²⁺ nel terreno anche quando si segue lo stesso protocollo e si utilizzano gli stessi reagenti. Tracce di Zn²⁺ nella ZLM consentono una crescita e un'espressione sufficienti del fenotipo Zn²⁺-limitante. Questa graduale diminuzione di Zn²⁺ per ottenere la limitazione è simile al modello di Wayne dell'ipossia in cui l'ossigeno viene gradualmente consumato dai batteri cresciuti in un pallone chiuso³⁰. Poiché sia l'ipossia che i fenotipi limitati da Zn²⁺ dipendono dalla crescita batterica, se non c'è abbastanza ossigeno, o in questo modello, Zn²⁺, nell'inoculo o nel mezzo, i batteri smetteranno di crescere prima che siano in grado di sottoporsi al relativo programma morfogenico. Pertanto, mentre la contaminazione da Zn²⁺ è un problema più evidente quando si desidera raggiungere la limitazione di Zn²⁺ , la deplezione di Zn²⁺ potrebbe anche presentare un problema a causa della compromissione della crescita e del mancato innesco dipendente da Zn²⁺ durante la crescita attiva. Inoltre, l'utilizzo di monocromatori o lettori di piastre basati su filtri con modalità di lettura dall'alto o dal basso per l'intensità della fluorescenza influisce leggermente sulla percentuale F_375/420 calcolata. Pertanto, i valori di ciascun laboratorio potrebbero non essere direttamente confrontabili con quelli presentati qui, ma dovrebbero essere simili e seguire le stesse tendenze. Pertanto, i metodi e le procedure per produrre ZLM che produce una crescita limitante di Zn²⁺ dovrebbero essere ottimizzati per ogni laboratorio e sistema di acqua ultrapura, e i fenotipi di bioindicatori qui presentati dovrebbero essere utilizzati come standard per definire le condizioni limitanti di Zn²⁺.

A causa della difficoltà di standardizzare e riprodurre le condizioni di crescita limitate da Zn²⁺, un approccio accessibile per aggirare la contaminazione da Zn²⁺ consiste nell'aggiungere un agente chelante ai terreni preparati senza aggiunta di Zn²⁺. Tuttavia, questo approccio confonde la vera risposta biologica alla limitazione di Zn²⁺, creando spesso un ambiente affamato di Zn²⁺ e altri micronutrienti. Anche gli agenti chelanti specifici per Zn²⁺ hanno dimostrato di sovraregolare la risposta alla carenza di ferro, oltre alla risposta trascrizionale Zn²⁺-dipendente in M. tuberculosis²³. Inoltre, l'uso di agenti chelanti richiede un'attenta titolazione e tempistica per evitare un ambiente gravemente affamato di Zn²⁺ che non riflette la risposta biologica durante il passaggio da condizioni di Zn²⁺ completo a Zn²⁺ limitato o la crescita prolungata in ambienti con limitata disponibilità di Zn²⁺ libero. Infine, l'aggiunta di agenti chelanti potrebbe non essere compatibile con le applicazioni a valle (ad esempio, macrofagi o infezioni animali). Sono state tratte conclusioni fondamentalmente diverse sulla forma e la funzione degli alt-ribosomi ottenuti con agenti chelanti rispetto alla graduale deplezione di Zn²⁺ in colture in crescita attiva^17,24. Qui sono evidenziati diversi fenotipi derivanti da differenze relativamente minori nella purezza dell'acqua in diversi lotti di terreni, anche quando la procedura viene eseguita correttamente. Il sistema quantificabile, riproducibile e biologicamente rilevante per la generazione di alt-ribosomi qui presentato, cioè in colture wild-type limitate a Zn²⁺ senza l'aggiunta di chelanti, offre un metodo standardizzato che sarà fondamentale per unificare i contributi in tutto il campo verso una migliore comprensione della biologia alternativa dei ribosomi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistemi di filtrazione sottovuoto da 1000 mL, Standard Line	VWR	10040-440
Palloni per agitatori Erlenmeyer da 125 mL	Greiner Bio-One	679501
Provette per coltura da 14 mL, plastica, con tappi a doppia posizione VWR		60818-725
Palloni per agitatore Erlenmeyer da 250 mL	Greiner Bio-One	679502
40X-1000X Composto biologico binoculare da laboratorio Microscopio	Omax	M82EZ
Provette per bioreazione da 50 mL, sterili	VWR	76211-286
Provette per centrifuga ad alte prestazioni da 50 mL con tappi a bandiera	VWR	89039-656
Detergente in polvere a bassa schiuma Alcojet	Alconox	1404
Citrato di ferro (III) ammonio, marrone	Thermo Scientific	AAA1119930	MW: 265 g/mol, per la soluzione 1M aggiungere 1,325 g a 5 mL di acqua ultrapura; conservare al riparo dalla luce a 4 C
Albumina sierica bovina	Thermo Scientific	J10857-A1
Calcio D-Pantotenato	Thermo Scientific	AC243300050
Catalasi	Sigma-Aldrich	C1345-10G
Acido citrico anidro, cristallino	Fisher Scientific	BP339-500
Destrosio anidro	Fisher Scientific	D14-500
Difco Middlebrook 7H9 Brodo	BD Diagnostics	271310
DiluFotometro OD600 per la determinazione della densità cellulare e dei saggi di Bradford	Implen	OD600-10
GENios FL Lettore di micropiastre	Tecan		Fuori produzione
Glicerolo	Fisher Scientific	G33-4
Infinite M200 PRO Lettore di micropiastre multimodale	Tecan	LGE140213-20BL
L-Asparagina	Thermo Scientific	AAB2147336
L-Leucina	Thermo Scientific	A1231122
Macrofire SP CCD camera	Optronics		Per l'uso con il microscopio Olympus
Solfato di magnesio eptaidrato	VWR	97062-134
Milli-Q Direct 8 Sistema di purificazione dell'acqua	Millipore	C85358
Moticam X3	Motic		Fuori produzione, sostituito da Moticam X5 Plus; per l'uso con microscopio composto
Acido oleico	Thermo Scientific	031997-14
Microscopio verticale Olympus BX51	Fuori		produzione, sostituito da BX53M
Fosfato di potassio, monobasico	Fisher Scientific	BP362-500
Cuvette di plastica monouso semi-micro su due lati	VWR	97000-590
Cloruro di sodio, cristallo	VWR	VW1494-01
idrossido di sodio	Fisher Scientific	S318-500
Tween 80	MP Biomedicals	103170
Solfuro di zinco eptaidrato, cristallino/ACS	MP Biomedicals	219145290