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Articolo metodologico

Misurazione di quattro sottotipi di cellule NK uterine mediante colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata in donne con ripetuti fallimenti di impianto

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DOI:

10.3791/67284

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25 ottobre 2024

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1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta un metodo pionieristico per quantificare i sottogruppi di cellule natural killer uterine durante la finestra di impianto utilizzando tecniche avanzate di colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata.

Abstract

L'immunoistochimica (IHC) svolge un ruolo cruciale nella ricerca biologica e nella diagnosi clinica, essendo il metodo più comunemente usato per identificare e visualizzare gli antigeni tissutali. Tuttavia, i metodi tradizionali di colorazione IHC hanno dei limiti nel distinguere i vari sottotipi di cellule immunitarie. Questa sfida ha spinto gli scienziati a esplorare nuove tecnologie e metodologie per l'identificazione e la differenziazione precise dei sottotipi di cellule immunitarie. Negli ultimi anni, l'IHC multiplex è emerso come una soluzione, che consente il rilevamento simultaneo di più antigeni e la loro visualizzazione all'interno dello stesso campione di tessuto. Le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale nei processi iniziali della gravidanza, tra cui la decidualizzazione, il rimodellamento delle arterie spirali uterine e l'impianto dell'embrione. Diversi sottotipi di cellule uNK mostrano funzioni diverse, consentendo loro di coordinare vari eventi biologici per il successo dello sviluppo embrionale e della gravidanza. Pertanto, una ricerca approfondita sui sottotipi di cellule uNK è essenziale per chiarire i meccanismi di regolazione immunitaria durante la gravidanza. Tali studi forniscono preziose informazioni e nuovi approcci per affrontare condizioni correlate come l'infertilità e l'insufficienza riproduttiva ricorrente. Questo articolo introduce un protocollo dettagliato di colorazione IHC multiplex per lo studio della densità di quattro sottotipi di cellule uNK in campioni endometriali durante la finestra di impianto (WOI). Il protocollo include la preparazione dei campioni, l'ottimizzazione dei marcatori dei sottotipi, l'imaging microscopico e l'analisi dei dati. Questo protocollo di colorazione IHC multiplex offre un'elevata specificità e sensibilità, consentendo il rilevamento simultaneo di diversi sottotipi di cellule uNK, fornendo così ai ricercatori un potente strumento per esplorare le complessità e i meccanismi della regolazione immunitaria durante la gravidanza.

Introduzione

Il primo nato vivo documentato dopo la fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (IVF-ET) è stato riportato nel 1978. Negli ultimi 40 anni, c'è stata una forte domanda di assistenza di FIV-ET tra le coppie sterili1. Nel 2021, 238.126 pazienti hanno iniziato un totale di 413.776 cicli di fecondazione in vitro negli Stati Uniti. Ciò segna un aumento del 25% dei cicli rispetto a 2 anni prima e un aumento del 135% rispetto al 20122. Questo aumento è principalmente attribuito alla crescente prevalenza dell'infertilità e al ritardo nella pianificazione della gravidanza. I progressi nelle tecniche di coltura embrionale e nei protocolli di superovulazione hanno portato a un aumento del tasso di nati vivi per ciclo ET, raggiungendo il 30%-50% nelle donne di età inferiore ai 40 anni e meno del 30% nelle donne di età superiore ai 40 anni2. Tuttavia, nonostante questi progressi, oltre la metà degli embrioni trasferiti non riesce ancora a impiantarsi. Il fallimento ripetuto dell'impianto (RIF), tipicamente definito come fallimento dopo tre o più tentativi consecutivi di trasferimento di embrioni di alta qualità, colpisce il 15% delle donne che si sottopongono a FIV-ET3. Le coppie con RIF sono estremamente vulnerabili e più inclini a sottoporsi a procedure costose e non necessarie che possono esporle a rischi eccessivi4. Pertanto, comprendere le cause della RIF e migliorare l'impianto dell'embrione è fondamentale per migliorare il successo della FIV-ET, in particolare per le donne con RIF. La preparazione dell'endometrio è fondamentale per il successo dell'impianto dell'embrione. Questo processo è caratterizzato da un significativo accumulo di cellule natural killer uterine (uNK), che passano dal costituire il 30% dei linfociti totali nell'endometrio durante la fase centrale della secrezione al 70%-80% nella decidua durante l'inizio della gravidanza5. In particolare, le cellule uNK differiscono dalle cellule NK periferiche, che sono linfociti citotossici fondamentali per il sistema immunitario innato per causare la morte delle cellule infette attraverso la lisi o l'apoptosi. Sebbene le funzioni esatte delle cellule uNK non siano ancora completamente comprese, diverse linee di evidenza suggeriscono che siano coinvolte nel rimodellamento dell'angiogenesi, nell'invasione del trofoblasto e nello sviluppo fetale6. L'associazione tra la percentuale di cellule uNK rispetto alle cellule stromali e RIF ha raccolto un'ampia attrattiva negli ultimi 20 anni. Una recente meta-analisi, che ha incluso 8 studi che hanno coinvolto 604 donne, ha dimostrato che la densità delle cellule CD56+uNK durante la fase medio-luteale è significativamente aumentata nelle donne con RIF rispetto ai controlli fertili7. Tuttavia, è importante notare che le caratteristiche delle cellule uNK durante la fase medio-luteale differiscono in modo significativo da quelle delle cellule NK deciduali (dNK). Sebbene le cellule uNK possano differenziarsi ulteriormente in vari sottogruppi di cellule dNK dopo la gravidanza, la misurazione delle cellule uNK da sola non rappresenta accuratamente le cellule dNK8. Le cellule uNK subiscono una differenziazione dinamica e svolgono ruoli diversi nel ciclo mestruale e nei processi di decidualizzazione, rendendoli più complessi di quanto possa essere identificato dal solo CD56. Sono necessari più marcatori per ottenere una comprensione completa del comportamento delle cellule uNK durante la preparazione dell'endometrio. Il nostro recente studio ha utilizzato il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per identificare la diversità delle cellule uNK durante i cicli mestruali. I risultati, convalidati utilizzando la citometria a flusso, hanno mostrato la presenza di quattro distinti sottotipi di cellule uNK, ciascuno dei quali mostra cambiamenti dinamici durante il ciclo mestruale9. L'analisi dell'arricchimento genico e l'arricchimento funzionale dell'ontologia genica indicano che questi sottogruppi di uNK svolgono funzioni diverse nelle varie fasi delle mestruazioni. Tuttavia, la citometria a flusso non è universalmente accessibile nei laboratori clinici e l'elaborazione immediata di tessuto endometriale fresco per la digestione enzimatica rende impossibile ripetere le fasi sperimentali in caso di errori.

Lo scopo di questo studio è stato, quindi, quello di indagare la misurazione di queste quattro sottopopolazioni di cellule NK utilizzando un test di colorazione multiplex, che fornisce un approccio diagnostico più pratico. Nella colorazione multipla, diversi anticorpi specifici contro ciascun bersaglio sono collegati a diverse etichette di fluorofori che emettono diverse lunghezze d'onda della luce quando eccitati da una specifica lunghezza d'onda della luce. Rispetto al tradizionale metodo di colorazione IHC, questo metodo può confrontare quantitativamente l'abbondanza relativa e la distribuzione di più bersagli in un campione e fornire informazioni sull'interazione e la co-localizzazione di diversi bersagli, consentendoci di identificare diversi sottotipi di cellule uNK. Questo approccio non solo approfondirà la nostra comprensione della relazione tra cellule uNK e RIF, ma fornirà anche spunti per lo studio di altre sottopopolazioni di cellule immunitarie nelle malattie correlate all'endometrio.

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Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca clinica del cluster orientale dell'Università cinese congiunta di Hong Kong-Nuovi Territori (CREC n. rif.: 2022.581). Le donne con RIF sono state reclutate presso l'Assisted Reproductive Technology Center, Prince of Wales Hospital, Chinese University of Hong Kong. La RIF è stata definita come l'incapacità di ottenere una gravidanza clinica dopo il trasferimento di almeno 4 embrioni di buona qualità in un minimo di 3 cicli freschi o congelati in una donna di età inferiore ai 40 anni e10. Il consenso informato è stato ottenuto dalle partecipanti prima di raccogliere le biopsie endometriali.

1. Acquisizione ed elaborazione di campioni endometriali

  1. Tempistica della raccolta del campione endometriale
    1. Raccogliere campioni endometriali seguendo un protocollo rigoroso per garantire la coerenza tra i partecipanti allo studio. Per le pazienti con cicli naturali, eseguire l'analisi delle urine a partire dal 9° giorno del ciclo mestruale ed eseguire la biopsia endometriale il 7° giorno dopo il picco di LH (LH+7)11 . Per i pazienti sottoposti a cicli di terapia ormonale sostitutiva (TOS), somministrare 6 mg di estradiolo valerato per via orale al giorno a partire dal giorno 2 del ciclo mestruale.
    2. Valutare lo spessore dell'endometrio mediante ecografia il giorno 13 del ciclo mestruale. Quando lo spessore dell'endometrio raggiunge o supera gli 8 mm, somministrare il progesterone per via transvaginale ed eseguire una biopsia endometriale 5 giorni dopo la somministrazione di progesterone12.
  2. Raccolta e fissazione del campione endometriale: introdurre un campionatore di pipette nella cavità uterina, facendolo avanzare fino alla regione del fondo; Applicare l'aspirazione tirando verso il basso lo stantuffo interno, raschiando contemporaneamente la superficie endometriale attraverso movimenti rotatori e verticali all'interno della cavità uterina. Sciacquare i campioni raccolti con soluzione fisiologica normale per eliminare le secrezioni cervicali e uterine. Misurare i campioni e valutarne le dimensioni. Per campioni di 3 mm x 15-25 mm, immergerli immediatamente in 10 mL di formalina tamponata neutra al 10% e fissarli a temperatura ambiente per 24-48 ore.
  3. Disidratazione: al termine della fissazione, sottoporre i campioni a una sequenza di disidratazione progettata per sostituire l'acqua con etanolo. Per fare ciò, immergere i tessuti in bagni di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% per garantire la completa disidratazione. Dopo il bagno finale di etanolo, eliminare i campioni in xilene per rimuovere eventuali residui di alcol e prepararli per l'infiltrazione di paraffina.
  4. Inclusione: Dopo aver posizionato il tessuto sul fondo dello stampo, sciogliere la paraffina e aggiungerla con cura ai campioni per assicurarsi che il tessuto endometriale sia completamente incapsulato nella matrice di paraffina. Dopo aver riempito gli stampini con cera di paraffina, raffreddarli su un tavolo da congelatore per favorire la solidificazione della cera di paraffina. Una volta che i blocchi di paraffina si induriscono, conservare a temperatura ambiente fino a quando non è necessaria un'ulteriore lavorazione.
    NOTA: Gli stampi utilizzati sono stati scelti appositamente per accogliere le dimensioni dei campioni endometriali ottenuti per consentire al tessuto endometriale di adagiarsi sul fondo senza piegarsi, garantendo così un orientamento ottimale per il successivo sezionamento e senza creare eccessi inutili.
  5. Sezionamento: Per la preparazione al sezionamento, refrigerare i blocchi di paraffina a 4 °C per 2 ore. Tagliare i campioni in sezioni da 4 μm utilizzando un microtomo, quindi appiattire le fette sulla superficie di acqua distillata riscaldata a 42 °C e montarle su vetrini adesivi. Metti le fette su un essiccatore a vetrini per una notte e conservale a temperatura ambiente prima dell'uso.

2. Ottimizzazione delle condizioni di immunoistochimica multiplex

  1. Convalida IHC: per la convalida dei parametri di colorazione IHC, adottare un approccio sistematico per mettere a punto le condizioni per il recupero dell'antigene, la concentrazione di anticorpi e i tempi di incubazione.
    1. Entro gli intervalli di diluizione raccomandati dal produttore, testare 2-3 concentrazioni per ciascun anticorpo. Ottimizza il recupero dell'antigene confrontando i tamponi a pH 6 e pH 9 e valuta i protocolli di incubazione sia a temperatura ambiente per 1,5 ore che durante la notte a 4 °C.
    2. Valuta meticolosamente ogni condizione, concentrandoti sull'intensità della colorazione, sulla specificità e sul rumore di fondo. Selezionare la combinazione ottimale per ottenere la colorazione più chiara e specifica con un legame non specifico minimo. Questa rigorosa convalida ha garantito la massima accuratezza e riproducibilità nel protocollo IHC.
  2. Colorazione monoplex con amplificazione del segnale della tiramide (TSA): dopo aver determinato i parametri di colorazione ottimali per i singoli anticorpi, ottimizzare l'accoppiamento degli anticorpi con diversi coloranti TSA. Abbina il marcatore con un'espressione più elevata a un colorante con un livello di intensità di fluorescenza inferiore o viceversa. Durante questa fase, apportare modifiche alla concentrazione degli anticorpi e al tempo di incubazione in base all'intensità del segnale di fluorescenza osservata. Se si osserva una colorazione di fondo significativa o non specifica, sostituire il colorante accoppiato13.
  3. Colorazione multiplex TSA: per il protocollo di immunoistochimica multiplex (m-IHC), l'ordine sequenziale di colorazione è stato accuratamente definito secondo principi stabiliti. Per garantire che il processo di multiplexing rifletta la sensibilità e la specificità della colorazione monomarca, gli anticorpi prioritari con livelli di espressione più bassi all'inizio della sequenza di colorazione hanno dato la priorità. Posizionare gli anticorpi che richiedono la riparazione della base per il recupero dell'antigene alla fine della sequenza di colorazione, poiché la riparazione della base è robusta rispetto ai metodi basati sull'acido, che possono, in alcuni casi, amplificare artefatti di colorazione non specifici.
  4. Utilizzando i risultati delle fasi 2.1 e 2.2, decidere gli anticorpi da utilizzare e in quale fase, in base ai requisiti di recupero dell'antigene e alle densità di espressione. Ad esempio, l'anticorpo CXCR4, che richiede una riparazione della base per il recupero dell'antigene, è stato inserito nelle fasi finali della colorazione. Al contrario, all'anticorpo CD49a, che è caratterizzato da una minore densità di espressione, è stata assegnata la prima posizione nella sequenza di colorazione. Massimizza le possibilità di successo del rilevamento e riduce al minimo gli effetti di mascheramento che potrebbero verificarsi nelle fasi successive della procedura di multiplexing.
  5. Per gli anticorpi rimanenti, testare diverse combinazioni durante la fase di ottimizzazione per determinare la sequenza più efficace che bilancia sensibilità e specificità. I risultati di queste analisi comparative guideranno la composizione finale del pannello multiplex, come descritto nella Tabella 1, garantendo che il pannello selezionato fornisca prestazioni ottimali riducendo al minimo lo sfondo.

3. Processo m-IHC

  1. Deceratura, idratazione e fissaggio: cuocere le sezioni di tessuto a 60 °C per 2 ore, seguita da immersione sequenziale in xilene I (10 min), xilene II (10 min), etanolo al 100% (5 min), etanolo al 95% (5 min), etanolo all'80% (5 min), etanolo al 75% (5 min), ddH2O (2 min per 3x), formalina tamponata neutra al 10% (almeno 20 min), e ddH2O (2 min per 3x).
  2. Recupero dell'antigene: aggiungere 200 ml del rispettivo tampone AR6 o AR9, come elencato nella Tabella 1 per ciascun anticorpo, a una cassetta di recupero dell'antigene resistente al calore. Mettere le sezioni nell'apposito tampone per il recupero dell'antigene e scaldare in un forno a microonde ad alta potenza per circa 2 minuti fino all'ebollizione. Successivamente, coprire la cassetta senza stringere, scaldare a bassa potenza per 15 minuti e raffreddare a temperatura ambiente. Sciacquare le sezioni con ddH2O e PBST.
  3. Disegno della barriera idrofobica: Dopo aver rimosso la soluzione in eccesso con carta assorbente, disegnare un cerchio completo attorno al tessuto utilizzando una penna barriera idrofobica.
  4. Inattivazione dell'attività enzimatica endogena: trattare le sezioni con perossido di idrogeno al 3% e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBST 3 volte per 2 minuti ciascuno.
  5. Blocco di siti non specifici: Dopo l'essiccazione con carta assorbente, applicare una soluzione bloccante (1x Diluente/Blocco di anticorpi) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  6. Incubazione con anticorpo primario: dopo aver rimosso la soluzione bloccante, applicare 150 μl del primo anticorpo primario, CD49a, su ciascun vetrino a una diluizione di 1:1000 in 1x diluente per anticorpi. Incubare come precedentemente ottimizzato nella sezione 2. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini con PBST 3 volte per 2 minuti ciascuno. Per gli anticorpi rimanenti, vedere la Tabella 1 per i rapporti di diluizione specifici.
  7. Incubazione con anticorpo secondario: prima di applicare l'anticorpo secondario, utilizzare carta assorbente per rimuovere l'umidità in eccesso per evitare la diluizione del reagente. Aggiungere 4-5 gocce (circa 150 μl) dell'anticorpo secondario 1x Anti-Ms + Rb HRP su ciascun vetrino, seguito da un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. Eseguire tre lavaggi con PBST per 2 minuti ciascuno dopo l'incubazione.
    NOTA: Si prega di notare che l'anticorpo secondario 1x Anti-Ms + Rb HRP è specifico per gli anticorpi primari di coniglio e topo.
  8. Amplificazione del segnale con colorante TSA: dopo aver eliminato l'umidità in eccesso, diluire il colorante TSA 1:100 nel diluente di amplificazione. Aggiungere 150 μl di questa soluzione colorante TSA diluita a ciascun vetrino. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBST 3 volte per 2 minuti ciascuno.
  9. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.5-3.8 per la procedura TSA utilizzando l'anticorpo e il colorante corrispondenti.
  10. Colorazione dei nuclei: dopo aver colorato l'ultimo anticorpo, eliminare i fluorofori non legati cuocendo al microonde sezioni in 200 ml di tampone AR6 all'interno di una cassetta resistente al calore, facendo bollire per 2 minuti, quindi riscaldando a bassa potenza per 15 minuti. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e risciacquare con ddH2O e PBST. Aggiungere 150 μl di soluzione di lavoro DAPI diluita in PBST (1:10) goccia a goccia, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e risciacquare 2 volte con ddH2O.
  11. Montaggio: Una volta che le sezioni sono state completamente asciugate all'aria in un'area scura per circa 30 minuti, applicare una singola goccia (circa 30 μl) di montante fluorescente anti-quenching e posizionare i vetrini.
    NOTA: Proteggere tutte le operazioni dalla luce dopo la prima applicazione del colorante TSA. L'osservazione tempestiva e l'acquisizione delle immagini sono state essenziali dopo il completamento della colorazione per prevenire l'estinzione della fluorescenza.

4. Acquisizione e analisi delle immagini

  1. Tempo di esposizione: Cattura le immagini utilizzando un imager che eredita le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione corrispondenti ai fluorofori. Quando si impostano i tempi di esposizione, controllare le diapositive con un'ampia gamma di espressioni di marker per garantire la precisione. Per ogni combinazione di marcatore/filtro, metti a fuoco manualmente le diverse aree della diapositiva. Utilizzare la funzione Esposizione automatica per impostare il tempo di esposizione.
  2. Seleziona i filtri in base ai coloranti TSA ed esamina più vetrini per determinare i tempi di esposizione ottimali per canale. Applicare queste impostazioni in modo coerente a tutte le acquisizioni successive per mantenere la comparabilità durante l'imaging.
  3. Selezione delle aree di cattura: per garantire un campionamento imparziale tra le sezioni di tessuto e un'inclusione coerente dell'epitelio luminale in ciascun campo analizzato, selezionare casualmente l'area iniziale per l'acquisizione dell'immagine, con il criterio critico della presenza del bordo epiteliale luminale.
  4. Dopo l'acquisizione di questo campo iniziale, selezionare sistematicamente le aree successive spostando un campo a sinistra o a destra del punto iniziale (omettendo un campo tra ogni immagine acquisita) mantenendo il bordo epiteliale luminale all'interno dell'inquadratura. Ripetere questo processo per acquisire almeno cinque aree diverse, ciascuna contenente almeno una porzione dell'epitelio luminale, per mantenere una profondità di analisi costante per14 anni. Questo approccio mirava a includere un minimo di circa 10.000 cellule stromali in tutti i campi catturati per garantire una raccolta dati completa e rappresentativa.
  5. Analisi delle immagini
    1. Preparazione dell'immagine: per importare e analizzare immagini multispettrali, accedere prima a File > Apri immagine nell'interfaccia del software per caricare i file e il vetrino in autofluorescenza (AF). Dopo aver caricato le immagini, procedere allo smistamento dei fluorofori facendo clic sul pulsante Seleziona fluori e selezionando la libreria spettrale appropriata. Una volta selezionati tutti i fluorofori, fare clic su OK per confermare la selezione. Per isolare lo spettro AF, utilizzare lo strumento contagocce AF per campionare un'area rappresentativa di tessuto dall'immagine AF, facendo attenzione a escludere eventuali pixel non di tessuto. Dopo il campionamento, fare clic su Prepara immagine o Prepara tutto nell'angolo in basso a sinistra dell'interfaccia15.
    2. Segmentazione tissutale: avvia il processo di segmentazione delineando manualmente una linea di base di 3-5 regioni per tipo di tessuto all'interno dell'immagine, comprese le aree epiteliali contenenti cellule epiteliali, le aree stromali contenenti cellule stromali e le aree vuote senza contenuto cellulare. Se i risultati iniziali della segmentazione non sono soddisfacenti, annotare manualmente altre regioni per migliorare il set di dati di addestramento, aumentando così l'accuratezza e l'affidabilità delle analisi successive. Questa regolazione dinamica delle regioni e dei parametri garantisce che il software sia in grado di identificare automaticamente strutture simili nell'immagine corrente e in altre immagini importate con maggiore precisione.
      NOTA: L'annotazione iniziale funge da set di dati di addestramento per il software per apprendere le caratteristiche di ciascun componente tissutale. Le capacità di segmentazione del software vengono quindi perfezionate in modo iterativo in base alla complessità e alla variabilità del tessuto.
    3. Segmentazione delle celle: fare clic su Segmenta celle per avviare la segmentazione delle celle. Nell'impostazione Segmentazione cellulare, selezionare Nuclei e membrana. Scegliere DAPI per identificare i nuclei cellulari e regolare l'impostazione dell'intensità per rilevare tutti i nuclei cellulari senza rumore di fondo. Selezionare i segnali CD16, CD49a e CD56 per trovare la membrana e utilizzare questo segnale per assistere nella scissione nucleare. Utilizzare la funzione di suddivisione dei componenti nucleari per distinguere i nuclei vicini.
      NOTA: DAPI evidenzia l'interno delle celle. La funzione di divisione dei componenti nucleari aiuta a distinguere i nuclei cellulari quando sono vicini tra loro o sembrano fusi. Questo passaggio è importante per ottenere una conta cellulare affidabile e mantenere l'integrità dell'analisi.
    4. Fenotipizzazione cellulare: adottare quattro diversi marcatori di superficie cellulare tra cui CD56, CD49a, CXCR4 e CD16 per differenziare diversi sottotipi di cellule NK. Nello schema di fenotipizzazione, etichettare questi quattro marcatori come fenotipi per procedere. Nella sezione Associate View, assegna colori specifici a ciascuno dei fenotipi per l'identificazione. Utilizzando il pulsante Aggiungi, categorizzare le celle in modo che esprimano positivamente o negativamente i marcatori; ad esempio, nel fenotipo CD56, le cellule possono essere etichettate come CD56+ o CD56-. Etichettare manualmente almeno cinque cellule per ogni fenotipo durante il processo di addestramento. Eseguire un'ulteriore etichettatura manuale se la formazione iniziale non produce risultati efficaci.
    5. Dopo aver impostato la configurazione della fenotipizzazione cellulare, ogni cellula nell'immagine indicherà se i quattro marcatori di superficie sono espressi positivamente o negativamente. Esporta i dati risultanti in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
    6. Elaborazione dei dati: importa i dati ottenuti da tutte le immagini in un foglio di calcolo per l'elaborazione. Calcola le percentuali di tutti i sottotipi di cellule uNK rispetto al numero totale di celle nell'immagine. Il conteggio finale delle cellule rappresenta il conteggio medio su più immagini, fornendo una panoramica completa della popolazione di vari sottotipi di cellule uNK all'interno del campione.

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Risultati

Per mantenere la coerenza nei tempi di raccolta dei campioni endometriali per le donne sottoposte al ciclo naturale, è stato eseguito un test delle urine per rilevare con precisione il picco dell'ormone luteinizzante (LH), con biopsie endometriali condotte 7 giorni dopo il picco di LH. Per le donne sottoposte a cicli di terapia ormonale sostitutiva, i campioni sono stati programmati esattamente 5 giorni dopo l'inizio dell'integrazione di progesterone. Per quantificare diversi sottotipi di cellule NK nell'endometrio, è st...

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Discussione

L'impianto dell'embrione comporta una complessa interazione tra l'embrione e l'endometrio. Lo stato immunologico dell'omeostasi endometriale gioca un ruolo fondamentale nel determinare la ricettività endometriale. Durante la WOI, la popolazione leucocitaria predominante nell'endometrio è costituita dalle cellule NK. Circa il 90% delle cellule uNK mostra un'elevata espressione di CD56 ma manca di CD16. Tuttavia, un sottogruppo minore di cellule uNK assomiglia alle cellule NK del sangue pe...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Il presente studio è stato sostenuto dal Fondo per la salute e la ricerca medica (10210956).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CD49aNovus BiologicalsNBP2-76478Anticorpi primari
CD56LeicaNCL-L-CD56-504Anticorpi primari
CD16abcamab183354Anticorpi primari
CXCR4R& DMAB172Anticorpi primari
Diluente di amplificazioneAkoya Biosciencesserie FP1498Tampone di diluizione fluoroforo
Diluenti anticorpaliAkoya BiosciencesARD1001EADiluire l'anticorpo
Soluzione tamponata con citrato, pH 6,0 /9,0 (10x)Akoya BiosciencesA6001/A9001Soluzione per il recupero dell'antigene
inForm Software avanzato di analisi delle immaginiAkoya BiosciencesinForm Tissue Finder Software 2.2.6Software di analisi dati
Mantra WorkstationsAkoya BiosciencesCLS140089Imaging spettrale
a microondeAkoya BiosciencesinverterStripping a microonde
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001KReagenti fluorescenti a base di tiramide adatti
TSA 620Akoya BiosciencesFP1495001KReagenti fluorescenti a base di tiramide adatti
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001KReagenti fluorescenti a base di tiramide adatti
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001KReagenti fluorescenti adatti a base di tiramide Vetrini
rivestiti di poli-L-lisina FisherTechnologies120-550-15Vetrini per uso istologico di routine
PolyHRPPerkin ElmeradAnticorpi secondari
Invitrogen™   Fluoromount-G&commercio; Mezzo di montaggioThemoFisher Science495802Installazione
spettrale DAPIAkoya BiosciencesFP1490AColorazione con acido nucleico
ampio spettro ARH1001EA

Riferimenti

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