Misurazione di quattro sottotipi di cellule NK uterine mediante colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata in donne con ripetuti fallimenti di impianto

Sommario

Questo studio presenta un metodo pionieristico per quantificare i sottogruppi di cellule natural killer uterine durante la finestra di impianto utilizzando tecniche avanzate di colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata.

Abstract

L'immunoistochimica (IHC) svolge un ruolo cruciale nella ricerca biologica e nella diagnosi clinica, essendo il metodo più comunemente usato per identificare e visualizzare gli antigeni tissutali. Tuttavia, i metodi tradizionali di colorazione IHC hanno dei limiti nel distinguere i vari sottotipi di cellule immunitarie. Questa sfida ha spinto gli scienziati a esplorare nuove tecnologie e metodologie per l'identificazione e la differenziazione precise dei sottotipi di cellule immunitarie. Negli ultimi anni, l'IHC multiplex è emerso come una soluzione, che consente il rilevamento simultaneo di più antigeni e la loro visualizzazione all'interno dello stesso campione di tessuto. Le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale nei processi iniziali della gravidanza, tra cui la decidualizzazione, il rimodellamento delle arterie spirali uterine e l'impianto dell'embrione. Diversi sottotipi di cellule uNK mostrano funzioni diverse, consentendo loro di coordinare vari eventi biologici per il successo dello sviluppo embrionale e della gravidanza. Pertanto, una ricerca approfondita sui sottotipi di cellule uNK è essenziale per chiarire i meccanismi di regolazione immunitaria durante la gravidanza. Tali studi forniscono preziose informazioni e nuovi approcci per affrontare condizioni correlate come l'infertilità e l'insufficienza riproduttiva ricorrente. Questo articolo introduce un protocollo dettagliato di colorazione IHC multiplex per lo studio della densità di quattro sottotipi di cellule uNK in campioni endometriali durante la finestra di impianto (WOI). Il protocollo include la preparazione dei campioni, l'ottimizzazione dei marcatori dei sottotipi, l'imaging microscopico e l'analisi dei dati. Questo protocollo di colorazione IHC multiplex offre un'elevata specificità e sensibilità, consentendo il rilevamento simultaneo di diversi sottotipi di cellule uNK, fornendo così ai ricercatori un potente strumento per esplorare le complessità e i meccanismi della regolazione immunitaria durante la gravidanza.

Introduzione

Il primo nato vivo documentato dopo la fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (IVF-ET) è stato riportato nel 1978. Negli ultimi 40 anni, c'è stata una forte domanda di assistenza di FIV-ET tra le coppie sterili¹. Nel 2021, 238.126 pazienti hanno iniziato un totale di 413.776 cicli di fecondazione in vitro negli Stati Uniti. Ciò segna un aumento del 25% dei cicli rispetto a 2 anni prima e un aumento del 135% rispetto al 2012². Questo aumento è principalmente attribuito alla crescente prevalenza dell'infertilità e al ritardo nella pianificazione della gravidanza. I progressi nelle tecniche di coltura embrionale e nei protocolli di superovulazione hanno portato a un aumento del tasso di nati vivi per ciclo ET, raggiungendo il 30%-50% nelle donne di età inferiore ai 40 anni e meno del 30% nelle donne di età superiore ai 40 anni². Tuttavia, nonostante questi progressi, oltre la metà degli embrioni trasferiti non riesce ancora a impiantarsi. Il fallimento ripetuto dell'impianto (RIF), tipicamente definito come fallimento dopo tre o più tentativi consecutivi di trasferimento di embrioni di alta qualità, colpisce il 15% delle donne che si sottopongono a FIV-ET³. Le coppie con RIF sono estremamente vulnerabili e più inclini a sottoporsi a procedure costose e non necessarie che possono esporle a rischi eccessivi⁴. Pertanto, comprendere le cause della RIF e migliorare l'impianto dell'embrione è fondamentale per migliorare il successo della FIV-ET, in particolare per le donne con RIF. La preparazione dell'endometrio è fondamentale per il successo dell'impianto dell'embrione. Questo processo è caratterizzato da un significativo accumulo di cellule natural killer uterine (uNK), che passano dal costituire il 30% dei linfociti totali nell'endometrio durante la fase centrale della secrezione al 70%-80% nella decidua durante l'inizio della gravidanza⁵. In particolare, le cellule uNK differiscono dalle cellule NK periferiche, che sono linfociti citotossici fondamentali per il sistema immunitario innato per causare la morte delle cellule infette attraverso la lisi o l'apoptosi. Sebbene le funzioni esatte delle cellule uNK non siano ancora completamente comprese, diverse linee di evidenza suggeriscono che siano coinvolte nel rimodellamento dell'angiogenesi, nell'invasione del trofoblasto e nello sviluppo fetale⁶. L'associazione tra la percentuale di cellule uNK rispetto alle cellule stromali e RIF ha raccolto un'ampia attrattiva negli ultimi 20 anni. Una recente meta-analisi, che ha incluso 8 studi che hanno coinvolto 604 donne, ha dimostrato che la densità delle cellule CD56+uNK durante la fase medio-luteale è significativamente aumentata nelle donne con RIF rispetto ai controlli fertili⁷. Tuttavia, è importante notare che le caratteristiche delle cellule uNK durante la fase medio-luteale differiscono in modo significativo da quelle delle cellule NK deciduali (dNK). Sebbene le cellule uNK possano differenziarsi ulteriormente in vari sottogruppi di cellule dNK dopo la gravidanza, la misurazione delle cellule uNK da sola non rappresenta accuratamente le cellule dNK⁸. Le cellule uNK subiscono una differenziazione dinamica e svolgono ruoli diversi nel ciclo mestruale e nei processi di decidualizzazione, rendendoli più complessi di quanto possa essere identificato dal solo CD56. Sono necessari più marcatori per ottenere una comprensione completa del comportamento delle cellule uNK durante la preparazione dell'endometrio. Il nostro recente studio ha utilizzato il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per identificare la diversità delle cellule uNK durante i cicli mestruali. I risultati, convalidati utilizzando la citometria a flusso, hanno mostrato la presenza di quattro distinti sottotipi di cellule uNK, ciascuno dei quali mostra cambiamenti dinamici durante il ciclo mestruale⁹. L'analisi dell'arricchimento genico e l'arricchimento funzionale dell'ontologia genica indicano che questi sottogruppi di uNK svolgono funzioni diverse nelle varie fasi delle mestruazioni. Tuttavia, la citometria a flusso non è universalmente accessibile nei laboratori clinici e l'elaborazione immediata di tessuto endometriale fresco per la digestione enzimatica rende impossibile ripetere le fasi sperimentali in caso di errori.

Lo scopo di questo studio è stato, quindi, quello di indagare la misurazione di queste quattro sottopopolazioni di cellule NK utilizzando un test di colorazione multiplex, che fornisce un approccio diagnostico più pratico. Nella colorazione multipla, diversi anticorpi specifici contro ciascun bersaglio sono collegati a diverse etichette di fluorofori che emettono diverse lunghezze d'onda della luce quando eccitati da una specifica lunghezza d'onda della luce. Rispetto al tradizionale metodo di colorazione IHC, questo metodo può confrontare quantitativamente l'abbondanza relativa e la distribuzione di più bersagli in un campione e fornire informazioni sull'interazione e la co-localizzazione di diversi bersagli, consentendoci di identificare diversi sottotipi di cellule uNK. Questo approccio non solo approfondirà la nostra comprensione della relazione tra cellule uNK e RIF, ma fornirà anche spunti per lo studio di altre sottopopolazioni di cellule immunitarie nelle malattie correlate all'endometrio.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca clinica del cluster orientale dell'Università cinese congiunta di Hong Kong-Nuovi Territori (CREC n. rif.: 2022.581). Le donne con RIF sono state reclutate presso l'Assisted Reproductive Technology Center, Prince of Wales Hospital, Chinese University of Hong Kong. La RIF è stata definita come l'incapacità di ottenere una gravidanza clinica dopo il trasferimento di almeno 4 embrioni di buona qualità in un minimo di 3 cicli freschi o congelati in una donna di età inferiore ai 40 anni e¹⁰. Il consenso informato è stato ottenuto dalle partecipanti prima di raccogliere le biopsie endometriali.

1. Acquisizione ed elaborazione di campioni endometriali

1. Tempistica della raccolta del campione endometriale
   1. Raccogliere campioni endometriali seguendo un protocollo rigoroso per garantire la coerenza tra i partecipanti allo studio. Per le pazienti con cicli naturali, eseguire l'analisi delle urine a partire dal 9^{° giorno del} ciclo mestruale ed eseguire la biopsia endometriale il 7^° giorno dopo il picco di LH (LH+7)¹¹ . Per i pazienti sottoposti a cicli di terapia ormonale sostitutiva (TOS), somministrare 6 mg di estradiolo valerato per via orale al giorno a partire dal giorno 2 del ciclo mestruale.
   2. Valutare lo spessore dell'endometrio mediante ecografia il giorno 13 del ciclo mestruale. Quando lo spessore dell'endometrio raggiunge o supera gli 8 mm, somministrare il progesterone per via transvaginale ed eseguire una biopsia endometriale 5 giorni dopo la somministrazione di progesterone¹².
2. Raccolta e fissazione del campione endometriale: introdurre un campionatore di pipette nella cavità uterina, facendolo avanzare fino alla regione del fondo; Applicare l'aspirazione tirando verso il basso lo stantuffo interno, raschiando contemporaneamente la superficie endometriale attraverso movimenti rotatori e verticali all'interno della cavità uterina. Sciacquare i campioni raccolti con soluzione fisiologica normale per eliminare le secrezioni cervicali e uterine. Misurare i campioni e valutarne le dimensioni. Per campioni di 3 mm x 15-25 mm, immergerli immediatamente in 10 mL di formalina tamponata neutra al 10% e fissarli a temperatura ambiente per 24-48 ore.
3. Disidratazione: al termine della fissazione, sottoporre i campioni a una sequenza di disidratazione progettata per sostituire l'acqua con etanolo. Per fare ciò, immergere i tessuti in bagni di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% per garantire la completa disidratazione. Dopo il bagno finale di etanolo, eliminare i campioni in xilene per rimuovere eventuali residui di alcol e prepararli per l'infiltrazione di paraffina.
4. Inclusione: Dopo aver posizionato il tessuto sul fondo dello stampo, sciogliere la paraffina e aggiungerla con cura ai campioni per assicurarsi che il tessuto endometriale sia completamente incapsulato nella matrice di paraffina. Dopo aver riempito gli stampini con cera di paraffina, raffreddarli su un tavolo da congelatore per favorire la solidificazione della cera di paraffina. Una volta che i blocchi di paraffina si induriscono, conservare a temperatura ambiente fino a quando non è necessaria un'ulteriore lavorazione.
   NOTA: Gli stampi utilizzati sono stati scelti appositamente per accogliere le dimensioni dei campioni endometriali ottenuti per consentire al tessuto endometriale di adagiarsi sul fondo senza piegarsi, garantendo così un orientamento ottimale per il successivo sezionamento e senza creare eccessi inutili.
5. Sezionamento: Per la preparazione al sezionamento, refrigerare i blocchi di paraffina a 4 °C per 2 ore. Tagliare i campioni in sezioni da 4 μm utilizzando un microtomo, quindi appiattire le fette sulla superficie di acqua distillata riscaldata a 42 °C e montarle su vetrini adesivi. Metti le fette su un essiccatore a vetrini per una notte e conservale a temperatura ambiente prima dell'uso.

2. Ottimizzazione delle condizioni di immunoistochimica multiplex

1. Convalida IHC: per la convalida dei parametri di colorazione IHC, adottare un approccio sistematico per mettere a punto le condizioni per il recupero dell'antigene, la concentrazione di anticorpi e i tempi di incubazione.
   1. Entro gli intervalli di diluizione raccomandati dal produttore, testare 2-3 concentrazioni per ciascun anticorpo. Ottimizza il recupero dell'antigene confrontando i tamponi a pH 6 e pH 9 e valuta i protocolli di incubazione sia a temperatura ambiente per 1,5 ore che durante la notte a 4 °C.
   2. Valuta meticolosamente ogni condizione, concentrandoti sull'intensità della colorazione, sulla specificità e sul rumore di fondo. Selezionare la combinazione ottimale per ottenere la colorazione più chiara e specifica con un legame non specifico minimo. Questa rigorosa convalida ha garantito la massima accuratezza e riproducibilità nel protocollo IHC.
2. Colorazione monoplex con amplificazione del segnale della tiramide (TSA): dopo aver determinato i parametri di colorazione ottimali per i singoli anticorpi, ottimizzare l'accoppiamento degli anticorpi con diversi coloranti TSA. Abbina il marcatore con un'espressione più elevata a un colorante con un livello di intensità di fluorescenza inferiore o viceversa. Durante questa fase, apportare modifiche alla concentrazione degli anticorpi e al tempo di incubazione in base all'intensità del segnale di fluorescenza osservata. Se si osserva una colorazione di fondo significativa o non specifica, sostituire il colorante accoppiato¹³.
3. Colorazione multiplex TSA: per il protocollo di immunoistochimica multiplex (m-IHC), l'ordine sequenziale di colorazione è stato accuratamente definito secondo principi stabiliti. Per garantire che il processo di multiplexing rifletta la sensibilità e la specificità della colorazione monomarca, gli anticorpi prioritari con livelli di espressione più bassi all'inizio della sequenza di colorazione hanno dato la priorità. Posizionare gli anticorpi che richiedono la riparazione della base per il recupero dell'antigene alla fine della sequenza di colorazione, poiché la riparazione della base è robusta rispetto ai metodi basati sull'acido, che possono, in alcuni casi, amplificare artefatti di colorazione non specifici.
4. Utilizzando i risultati delle fasi 2.1 e 2.2, decidere gli anticorpi da utilizzare e in quale fase, in base ai requisiti di recupero dell'antigene e alle densità di espressione. Ad esempio, l'anticorpo CXCR4, che richiede una riparazione della base per il recupero dell'antigene, è stato inserito nelle fasi finali della colorazione. Al contrario, all'anticorpo CD49a, che è caratterizzato da una minore densità di espressione, è stata assegnata la prima posizione nella sequenza di colorazione. Massimizza le possibilità di successo del rilevamento e riduce al minimo gli effetti di mascheramento che potrebbero verificarsi nelle fasi successive della procedura di multiplexing.
5. Per gli anticorpi rimanenti, testare diverse combinazioni durante la fase di ottimizzazione per determinare la sequenza più efficace che bilancia sensibilità e specificità. I risultati di queste analisi comparative guideranno la composizione finale del pannello multiplex, come descritto nella Tabella 1, garantendo che il pannello selezionato fornisca prestazioni ottimali riducendo al minimo lo sfondo.

3. Processo m-IHC

1. Deceratura, idratazione e fissaggio: cuocere le sezioni di tessuto a 60 °C per 2 ore, seguita da immersione sequenziale in xilene I (10 min), xilene II (10 min), etanolo al 100% (5 min), etanolo al 95% (5 min), etanolo all'80% (5 min), etanolo al 75% (5 min), ddH₂O (2 min per 3x), formalina tamponata neutra al 10% (almeno 20 min), e ddH₂O (2 min per 3x).
2. Recupero dell'antigene: aggiungere 200 ml del rispettivo tampone AR6 o AR9, come elencato nella Tabella 1 per ciascun anticorpo, a una cassetta di recupero dell'antigene resistente al calore. Mettere le sezioni nell'apposito tampone per il recupero dell'antigene e scaldare in un forno a microonde ad alta potenza per circa 2 minuti fino all'ebollizione. Successivamente, coprire la cassetta senza stringere, scaldare a bassa potenza per 15 minuti e raffreddare a temperatura ambiente. Sciacquare le sezioni con ddH₂O e PBST.
3. Disegno della barriera idrofobica: Dopo aver rimosso la soluzione in eccesso con carta assorbente, disegnare un cerchio completo attorno al tessuto utilizzando una penna barriera idrofobica.
4. Inattivazione dell'attività enzimatica endogena: trattare le sezioni con perossido di idrogeno al 3% e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBST 3 volte per 2 minuti ciascuno.
5. Blocco di siti non specifici: Dopo l'essiccazione con carta assorbente, applicare una soluzione bloccante (1x Diluente/Blocco di anticorpi) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
6. Incubazione con anticorpo primario: dopo aver rimosso la soluzione bloccante, applicare 150 μl del primo anticorpo primario, CD49a, su ciascun vetrino a una diluizione di 1:1000 in 1x diluente per anticorpi. Incubare come precedentemente ottimizzato nella sezione 2. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini con PBST 3 volte per 2 minuti ciascuno. Per gli anticorpi rimanenti, vedere la Tabella 1 per i rapporti di diluizione specifici.
7. Incubazione con anticorpo secondario: prima di applicare l'anticorpo secondario, utilizzare carta assorbente per rimuovere l'umidità in eccesso per evitare la diluizione del reagente. Aggiungere 4-5 gocce (circa 150 μl) dell'anticorpo secondario 1x Anti-Ms + Rb HRP su ciascun vetrino, seguito da un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. Eseguire tre lavaggi con PBST per 2 minuti ciascuno dopo l'incubazione.
   NOTA: Si prega di notare che l'anticorpo secondario 1x Anti-Ms + Rb HRP è specifico per gli anticorpi primari di coniglio e topo.
8. Amplificazione del segnale con colorante TSA: dopo aver eliminato l'umidità in eccesso, diluire il colorante TSA 1:100 nel diluente di amplificazione. Aggiungere 150 μl di questa soluzione colorante TSA diluita a ciascun vetrino. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBST 3 volte per 2 minuti ciascuno.
9. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.5-3.8 per la procedura TSA utilizzando l'anticorpo e il colorante corrispondenti.
10. Colorazione dei nuclei: dopo aver colorato l'ultimo anticorpo, eliminare i fluorofori non legati cuocendo al microonde sezioni in 200 ml di tampone AR6 all'interno di una cassetta resistente al calore, facendo bollire per 2 minuti, quindi riscaldando a bassa potenza per 15 minuti. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e risciacquare con ddH₂O e PBST. Aggiungere 150 μl di soluzione di lavoro DAPI diluita in PBST (1:10) goccia a goccia, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e risciacquare 2 volte con ddH₂O.
11. Montaggio: Una volta che le sezioni sono state completamente asciugate all'aria in un'area scura per circa 30 minuti, applicare una singola goccia (circa 30 μl) di montante fluorescente anti-quenching e posizionare i vetrini.
    NOTA: Proteggere tutte le operazioni dalla luce dopo la prima applicazione del colorante TSA. L'osservazione tempestiva e l'acquisizione delle immagini sono state essenziali dopo il completamento della colorazione per prevenire l'estinzione della fluorescenza.

4. Acquisizione e analisi delle immagini

1. Tempo di esposizione: Cattura le immagini utilizzando un imager che eredita le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione corrispondenti ai fluorofori. Quando si impostano i tempi di esposizione, controllare le diapositive con un'ampia gamma di espressioni di marker per garantire la precisione. Per ogni combinazione di marcatore/filtro, metti a fuoco manualmente le diverse aree della diapositiva. Utilizzare la funzione Esposizione automatica per impostare il tempo di esposizione.
2. Seleziona i filtri in base ai coloranti TSA ed esamina più vetrini per determinare i tempi di esposizione ottimali per canale. Applicare queste impostazioni in modo coerente a tutte le acquisizioni successive per mantenere la comparabilità durante l'imaging.
3. Selezione delle aree di cattura: per garantire un campionamento imparziale tra le sezioni di tessuto e un'inclusione coerente dell'epitelio luminale in ciascun campo analizzato, selezionare casualmente l'area iniziale per l'acquisizione dell'immagine, con il criterio critico della presenza del bordo epiteliale luminale.
4. Dopo l'acquisizione di questo campo iniziale, selezionare sistematicamente le aree successive spostando un campo a sinistra o a destra del punto iniziale (omettendo un campo tra ogni immagine acquisita) mantenendo il bordo epiteliale luminale all'interno dell'inquadratura. Ripetere questo processo per acquisire almeno cinque aree diverse, ciascuna contenente almeno una porzione dell'epitelio luminale, per mantenere una profondità di analisi costante per¹⁴ anni. Questo approccio mirava a includere un minimo di circa 10.000 cellule stromali in tutti i campi catturati per garantire una raccolta dati completa e rappresentativa.
5. Analisi delle immagini
   1. Preparazione dell'immagine: per importare e analizzare immagini multispettrali, accedere prima a File > Apri immagine nell'interfaccia del software per caricare i file e il vetrino in autofluorescenza (AF). Dopo aver caricato le immagini, procedere allo smistamento dei fluorofori facendo clic sul pulsante Seleziona fluori e selezionando la libreria spettrale appropriata. Una volta selezionati tutti i fluorofori, fare clic su OK per confermare la selezione. Per isolare lo spettro AF, utilizzare lo strumento contagocce AF per campionare un'area rappresentativa di tessuto dall'immagine AF, facendo attenzione a escludere eventuali pixel non di tessuto. Dopo il campionamento, fare clic su Prepara immagine o Prepara tutto nell'angolo in basso a sinistra dell'interfaccia¹⁵.
   2. Segmentazione tissutale: avvia il processo di segmentazione delineando manualmente una linea di base di 3-5 regioni per tipo di tessuto all'interno dell'immagine, comprese le aree epiteliali contenenti cellule epiteliali, le aree stromali contenenti cellule stromali e le aree vuote senza contenuto cellulare. Se i risultati iniziali della segmentazione non sono soddisfacenti, annotare manualmente altre regioni per migliorare il set di dati di addestramento, aumentando così l'accuratezza e l'affidabilità delle analisi successive. Questa regolazione dinamica delle regioni e dei parametri garantisce che il software sia in grado di identificare automaticamente strutture simili nell'immagine corrente e in altre immagini importate con maggiore precisione.
      NOTA: L'annotazione iniziale funge da set di dati di addestramento per il software per apprendere le caratteristiche di ciascun componente tissutale. Le capacità di segmentazione del software vengono quindi perfezionate in modo iterativo in base alla complessità e alla variabilità del tessuto.
   3. Segmentazione delle celle: fare clic su Segmenta celle per avviare la segmentazione delle celle. Nell'impostazione Segmentazione cellulare, selezionare Nuclei e membrana. Scegliere DAPI per identificare i nuclei cellulari e regolare l'impostazione dell'intensità per rilevare tutti i nuclei cellulari senza rumore di fondo. Selezionare i segnali CD16, CD49a e CD56 per trovare la membrana e utilizzare questo segnale per assistere nella scissione nucleare. Utilizzare la funzione di suddivisione dei componenti nucleari per distinguere i nuclei vicini.
      NOTA: DAPI evidenzia l'interno delle celle. La funzione di divisione dei componenti nucleari aiuta a distinguere i nuclei cellulari quando sono vicini tra loro o sembrano fusi. Questo passaggio è importante per ottenere una conta cellulare affidabile e mantenere l'integrità dell'analisi.
   4. Fenotipizzazione cellulare: adottare quattro diversi marcatori di superficie cellulare tra cui CD56, CD49a, CXCR4 e CD16 per differenziare diversi sottotipi di cellule NK. Nello schema di fenotipizzazione, etichettare questi quattro marcatori come fenotipi per procedere. Nella sezione Associate View, assegna colori specifici a ciascuno dei fenotipi per l'identificazione. Utilizzando il pulsante Aggiungi, categorizzare le celle in modo che esprimano positivamente o negativamente i marcatori; ad esempio, nel fenotipo CD56, le cellule possono essere etichettate come CD56+ o CD56-. Etichettare manualmente almeno cinque cellule per ogni fenotipo durante il processo di addestramento. Eseguire un'ulteriore etichettatura manuale se la formazione iniziale non produce risultati efficaci.
   5. Dopo aver impostato la configurazione della fenotipizzazione cellulare, ogni cellula nell'immagine indicherà se i quattro marcatori di superficie sono espressi positivamente o negativamente. Esporta i dati risultanti in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
   6. Elaborazione dei dati: importa i dati ottenuti da tutte le immagini in un foglio di calcolo per l'elaborazione. Calcola le percentuali di tutti i sottotipi di cellule uNK rispetto al numero totale di celle nell'immagine. Il conteggio finale delle cellule rappresenta il conteggio medio su più immagini, fornendo una panoramica completa della popolazione di vari sottotipi di cellule uNK all'interno del campione.

Risultati

Per mantenere la coerenza nei tempi di raccolta dei campioni endometriali per le donne sottoposte al ciclo naturale, è stato eseguito un test delle urine per rilevare con precisione il picco dell'ormone luteinizzante (LH), con biopsie endometriali condotte 7 giorni dopo il picco di LH. Per le donne sottoposte a cicli di terapia ormonale sostitutiva, i campioni sono stati programmati esattamente 5 giorni dopo l'inizio dell'integrazione di progesterone. Per quantificare diversi sottotipi di cellule NK nell'endometrio, è stata impiegata la colorazione m-IHC. Uno schema schematico della procedura sperimentale è illustrato nella Figura 1.

L'ottimizzazione della procedura sperimentale è fondamentale per ottenere risultati di colorazione m-IHC di alta qualità per garantire l'accuratezza e la coerenza dei risultati dell'esperimento. Inizialmente, l'IHC è stato impiegato per determinare la concentrazione di anticorpi appropriata, con la selezione delle soluzioni di recupero dell'antigene AR6 o AR9. Per gli anticorpi come CD56, CD16 e CD49, si raccomanda una soluzione di recupero dell'antigene con pH 6, mentre per l'anticorpo CXCR4 sono stati ottenuti risultati di colorazione superiori utilizzando una soluzione di riparazione dell'antigene con un pH di 9 rispetto a un tampone con pH 6. Una volta determinati i parametri, tra cui il rapporto di diluizione degli anticorpi, il tempo di incubazione e le condizioni di recupero dell'antigene, è possibile selezionare il colorante TSA più adatto in base all'affinità dell'anticorpo. Un colorante con una debole luminosità di fluorescenza dovrebbe essere selezionato per completare l'elevata affinità dell'anticorpo. I dati di riferimento sulla potenza del segnale dei coloranti TSA sono riportati nella Tabella 2. Dopo il completamento del test TSA monoplex, è possibile determinare l'ordine del multiplex TSA. Dato che i quattro anticorpi sono progettati per identificare diversi sottotipi di cellule uNK, la co-localizzazione tra gli anticorpi è inevitabile. Per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale e prevenire l'interferenza tra le frazioni fluorescenti, è stata impiegata la seguente strategia: selezionare le frazioni fluorescenti con lunghezze d'onda il più distanti possibile, confrontare la posizione e il numero di segnali positivi del multiplex TSA con quelli del monoplex TSA per garantirne l'identità (Figura 2) e garantire uno sfondo chiaro (Figura 3)¹⁶.

Dopo l'ottimizzazione e il completamento delle procedure di colorazione m-IHC, la workstation di imaging è stata impiegata per l'acquisizione delle immagini e il software di analisi delle immagini è stato applicato per l'analisi approfondita delle immagini (Figura 4). Per la classificazione delle cellule uNK sono stati utilizzati metodi sia tradizionali che innovativi. La classificazione tradizionale divide le cellule NK in due categorie, CD56+CD16- e CD56+CD16+¹⁷, in base al livello di espressione di CD16. Sulla base di queste basi, abbiamo cercato di delineare ulteriormente l'eterogeneità delle cellule NK utilizzando una nuova strategia di classificazione. Utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) della nostra ricerca precedente, abbiamo isolato singole cellule NK mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) ed eseguito il sequenziamento dell'RNA per catturare i profili trascrittomici di ciascuna cellula. La nostra analisi ha rivelato quattro distinti sottotipi di cellule NK: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) e NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Questi sottotipi erano caratterizzati dall'espressione differenziale di CD49a e CXCR4, con CD56 che fungeva da marcatore universale per tutte le cellule NK. CD49a è stato rilevato specificamente nei sottotipi NK1 e NK2, mentre CXCR4 era presente nei sottotipi NK2 e NK4. Per convalidare questa classificazione, abbiamo eseguito un'analisi di citometria a flusso per garantire l'accuratezza del nostro metodo di sottotipizzazione (Figura 5)⁹. La proporzione di ciascun sottotipo di cellula uNK è presentata come percentuale rispetto al numero totale di cellule stromali.

Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro dell'analisi delle cellule NK endometriali. Le fasi principali includono l'acquisizione e la raccolta dell'endometrio, l'ottimizzazione del pannello m-IHC, la colorazione m-IHC dell'endometrio e l'acquisizione e l'analisi dell'immagine. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative per la quantificazione di biomarcatori tramite colorazione DAB, TSA monoplex e TSA multiplex. Le immagini rappresentative per ciascuno degli anticorpi colorati da DAB (pannelli di sinistra), TSA monoplex IHC (pannelli centrali) e TSA multiplex IHC (pannelli di destra) hanno dimostrato una deviazione minima attraverso lo sviluppo di m-IHC. Le immagini IHC simulate dalla TSA sottostanti imitano altamente le corrispondenti immagini in campo chiaro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati sperimentali dopo la colorazione m-IHC dell'endometrio. (A) Un'immagine non miscelata è stata acquisita utilizzando l'imager con ingrandimento 200x. (B) Ulteriore ingrandimento di questa immagine non miscelata. (C-F) Le immagini sono state osservate nei canali TSA dye 570 (CD16), TSA dye 650 (CD56), TSA dye 620 (CXCR4) e TSA dye 520 (CD49a) dopo aver dismescolato utilizzando il software di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi delle immagini colorate con m-IHC. Le immagini sono state analizzate utilizzando le funzioni del software di imaging (A) segmentazione tissutale, (B) segmentazione cellulare e (C) fenotipo cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi dei sottotipi delle cellule NK endometriali. (A) Le cellule NK endometriali convenzionali possono essere classificate in cellule CD56+CD16-NK e cellule CD56+CD16+NK in base all'espressione di CD16. (B) L'innovativo metodo di analisi dei sottotipi ha classificato le cellule NK endometriali in quattro categorie: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) e NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ciclo di colorazione	Marcatore	Clone	Società	Prodotto	Diluizione degli anticorpi	Buffer AR	Fluoroforo
1	CD49a	CL7207	Novus Biologicals	NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56	CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16	SP175	abcam	ab183354	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4	44716	Ricerca e Sviluppo	Visualizzazione MAB172	1:100	AR9	TSA 620

Tabella 1: Elenco delle concentrazioni degli anticorpi e del colorante TSA utilizzati nell'm-IHC.

Fluoroforo	Mantra
Colorante TSA 520	Alto
Colorante TSA 540	Medio
Colorante TSA 570	Medio
colorante TSA 620	Medio
Colorante TSA 650	Alto
Colorante TSA 690	Basso

Tabella 2: Coloranti TSA e corrispondente intensità di fluorescenza.

Discussione

L'impianto dell'embrione comporta una complessa interazione tra l'embrione e l'endometrio. Lo stato immunologico dell'omeostasi endometriale gioca un ruolo fondamentale nel determinare la ricettività endometriale. Durante la WOI, la popolazione leucocitaria predominante nell'endometrio è costituita dalle cellule NK. Circa il 90% delle cellule uNK mostra un'elevata espressione di CD56 ma manca di CD16. Tuttavia, un sottogruppo minore di cellule uNK assomiglia alle cellule NK del sangue periferico, mostrando una bassa espressione di CD56 ma un'espressione positiva di CD16¹⁸. Questi due sottotipi di cellule uNK dimostrano funzioni distinte. Il sottotipo CD56+CD16- contribuisce principalmente alla produzione di citochine, al rimodellamento vascolare e alle interazioni con le cellule del trofoblasto, che sono cruciali per stabilire e mantenere la gravidanza. Al contrario, il sottotipo CD56+CD16+ mostra una citotossicità più elevata. Utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, il nostro recente studio ha ulteriormente classificato le cellule uNK in quattro sottoinsiemi, suddividendo ulteriormente le cellule NK regolatorie CD56+CD16 in tre sottopopolazioni in base ai loro fenotipi e funzioni specifici⁹. Il sottogruppo NK1, caratterizzato da CD56+CD49a+CXCR4-, è coinvolto nel rimodellamento tissutale. Il sottogruppo NK2, identificato da CD56+CD49a+CXCR4+, regola la risposta immunitaria. Il sottogruppo NK3, contrassegnato da CD56+CD49a-CXCR4-, interagisce con i trofoblasti. Il sottogruppo NK4, che presenta CD56+CD49a-CXCR4+, condivide somiglianze con le cellule NK CD56+CD16+, mostrando funzioni citotossiche⁹. Nel presente studio, per la prima volta, abbiamo stabilito con successo un protocollo per identificare questi quattro distinti sottogruppi di cellule NK utilizzando la colorazione m-IHC.

La colorazione IHC convenzionale e la citometria a flusso sono i metodi più comunemente usati per identificare le cellule immunitarie, ciascuno con i propri punti di forza e limiti¹⁹. Sebbene l'IHC convenzionale sia ampiamente utilizzato in ambito clinico grazie alla sua facile accessibilità, deve affrontare sfide nel rilevare contemporaneamente più antigeni e quantificare i segnali positivi. Ciò rappresenta un ostacolo significativo nella caratterizzazione accurata dei fenotipi delle cellule immunitarie, che spesso richiedono l'uso di più marcatori per una misurazione precisa. D'altra parte, la citometria a flusso è in grado di rilevare contemporaneamente più marcatori cellulari, ma richiede un grande volume di campioni freschi e non fornisce informazioni spaziali sulla posizione delle cellule all'interno del tessuto. In particolare, le cellule immunitarie endometriali non sono uniformemente disperse in tutto il tessuto endometriale; ad esempio, le cellule uNK sono più densamente aggregate vicino allo strato basale dell'endometrio rispetto alle aree vicino alla cavità luminale²⁰. Queste limitazioni dell'IHC convenzionale e della citometria a flusso possono essere affrontate attraverso l'm-IHC e la piattaforma di analisi delle immagini coniugata con algoritmi di apprendimento automatico per ottenere la segmentazione dei tessuti, la segmentazione cellulare e l'identificazione di cellule positive. Questo approccio migliora l'efficienza analizzando decine di migliaia di cellule in pochi minuti, riduce al minimo la distorsione dell'osservatore identificando automaticamente le cellule positive e consente un'analisi più accurata utilizzando più marcatori. Inoltre, elimina la necessità di campioni freschi e consente esperimenti in batch o analisi ripetute quando necessario.

Condurre una valutazione completa dei fenotipi delle cellule uNK utilizzando la tecnica m-IHC può fornire una comprensione più profonda della correlazione tra le cellule uNK e l'impianto dell'embrione, nonché dei loro cambiamenti nelle donne con RIF. Oltre alle cellule uNK, anche altre cellule immunitarie endometriali contribuiscono all'omeostasi immunitaria locale. Ad esempio, i linfociti T regolatori (cellule Treg) mantengono la tolleranza immunitaria rilasciando fattori inibitori, come IL-10 e TGF-β, che sopprimono l'attività delle cellule Th1 e Th2²¹. La differenziazione dei macrofagi M2, regolata da steroidi e citochine Th2, contribuisce allo stato di immunotolleranza aumentando l'attività dell'arginasi e inibendo la produzione di ossido nitrico²². Inoltre, le cellule dendritiche (DC) si differenziano in cellule tollerogeniche mature all'interno dell'utero, rilasciando fattori come sFLT1 e TGF-β1 che regolano la neogenesi vascolare e inibiscono la funzione delle cellule T CD8+, mantenendo così l'omeostasi immunitaria e supportando lo sviluppo embrionale¹⁸. Simili alle cellule uNK, anche queste cellule immunitarie sono eterogenee e un singolo marcatore non può identificare con precisione i loro fenotipi. L'applicazione di m-IHC per la valutazione di sottogruppi di cellule uNK illustra il potenziale per l'identificazione di sottogruppi di queste cellule immunitarie endometriali.

Oltre all'endometrio, questo metodo può essere applicato a vari tessuti per identificare i fenotipi delle cellule immunitarie. Quando lo si applica su altri tessuti, sono necessari solo piccoli aggiustamenti per garantire una colorazione ottimale. Inoltre, se i ricercatori intendono sostituire alcuni marcatori, il pannello originale può essere modificato per soddisfare i requisiti sperimentali specifici. La versatilità e la flessibilità di questo pannello lo rendono uno strumento adattabile per lo studio di diversi tessuti o di diversi sottogruppi di cellule.

Questa tecnologia non solo facilita la comprensione dei cambiamenti dettagliati nelle cellule immunitarie endometriali per sezionare il meccanismo alla base della non ricettività endometriale, ma fornisce anche il potenziale per lo sviluppo di test diagnostici. La relativa facilità di ottenere e conservare blocchi e sezioni di paraffina ha aperto la strada all'uso diffuso di questa tecnica. Con i pannelli di colorazione standardizzati, gli ospedali possono sfruttare la tecnologia di colorazione automatizzata in combinazione con sofisticati algoritmi software per migliorare significativamente l'efficienza delle loro procedure di analisi. I vantaggi della tecnologia m-IHC la rendono un'opzione praticabile per le pratiche cliniche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Anticorpi primari
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Anticorpi primari
CD16	abcam	ab183354	Anticorpi primari
CXCR4	R& D	MAB172	Anticorpi primari
Diluente di amplificazione	Akoya Biosciences	serie FP1498	Tampone di diluizione fluoroforo
Diluenti anticorpali	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluire l'anticorpo
Soluzione tamponata con citrato, pH 6,0 /9,0 (10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Soluzione per il recupero dell'antigene
inForm Software avanzato di analisi delle immagini	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Software di analisi dati
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Imaging spettrale
a microonde	Akoya Biosciences	inverter	Stripping a microonde
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Reagenti fluorescenti a base di tiramide adatti
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Reagenti fluorescenti a base di tiramide adatti
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Reagenti fluorescenti a base di tiramide adatti
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Reagenti fluorescenti adatti a base di tiramide Vetrini
rivestiti di poli-L-lisina Fisher	Technologies	120-550-15	Vetrini per uso istologico di routine
PolyHRP	Perkin Elmer	ad	Anticorpi secondari
Invitrogen™   Fluoromount-G&commercio; Mezzo di montaggio	ThemoFisher Science	495802	Installazione
spettrale DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Colorazione con acido nucleico